TW201534727A - 用於癌症治療之對adi-peg20抗體交叉反應性降低之精胺酸去亞胺酶 - Google Patents
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Abstract
本發明大體上係關於經分離之精胺酸去亞胺酶(ADI)蛋白質(其與抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性比ADI-PEG 20降低,但其功能性特徵則與ADI-PEG 20類似或比其更好)、包含該等ADI蛋白質之組合物、及治療精胺酸依賴性疾病或相關疾病(諸如癌症)之相關方法。
Description
本申請案主張2013年3月15日申請之美國臨時申請案第61/790,833號的優先權,其以全文引用之方式併入本文中。
與本申請案相關之序列表以文字格式而非紙製複本提供,且藉此以引用之方式併入本說明書中。含有序列表之文字檔案的名稱為POLA_003_01TW_ST25.txt。文字檔案為約117KB,創建於2014年3月12日。
本發明大體上係關於精胺酸去亞胺酶(ADI)蛋白質,包括與ADI-PEG 20抗體之交叉反應性降低的ADI蛋白質。該等ADI蛋白質適用於治療精胺酸依賴性或相關之疾病,諸如癌症。
胺基酸去除療法可為一些形式之癌症的有效治療。迄今為止,存在與此方法相關之一個已知臨床實例,其利用天冬醯胺酶來減少天冬醯胺之循環量且抑制蛋白質合成。此治療尤其對急性淋巴母細胞白血病有效(Avramis 2005,Viera Pinheiro 2004)。急性淋巴母細胞白血
病細胞需要胺基酸天冬醯胺以用於生長和增殖。相反,大多數正常人類細胞能夠合成天冬醯胺,且不受天冬醯胺耗竭影響。因此,用天冬醯胺酶減少血清天冬醯胺可在不損害正常細胞、組織及宿主的情況下選擇性殺死癌細胞。已核准來源於大腸桿菌(E.coli)之天冬醯胺酶形式用於人類使用。然而,天冬醯胺酶僅見於微生物中;此使其在人類中具有高度免疫原性,且亦在注射之後具有較短血清半衰期(Avramis 2005)。為使天冬醯胺酶成為更有效之藥物,藉由將來源於大腸桿菌之天冬醯胺酶與聚乙二醇(PEG)一起調配以減少此酶之免疫原性及相關過敏性反應來使此等缺點減到最少。另外,PEG極大地延長天冬醯胺酶之循環半衰期,其降低治療之頻率及療法之總成本。核准使用PEG調配之天冬醯胺酶且以商標名Oncaspar®(Oncaspar® 2011,Avramis 2005,Viera Pinheiro 2004,Fu 2007,Zeidan 2008)出售。
精胺酸為用於人類及小鼠之另一種非必需胺基酸(綜述參見Rogers 1994)。在人類中,精胺酸可在兩個步驟中藉助於克雷布斯(Krebs)(尿素)循環酶精胺基丁二酸合成酶(ASS,L-瓜胺酸:L-天冬胺酸接合酶[AMP-形成],EC 6.3.4.5)及精胺基丁二酸裂解酶(ASL,L-精胺基丁二酸精胺酸裂解酶,EC 4.3.2.)自瓜胺酸合成(Haines 2011,Wu 2009,Morris 2006,Husson 2003,Tapiero 2002,Rogers 1994)。ASS催化瓜胺酸及天冬胺酸轉化為精胺基丁二酸鹽,其隨後藉由ASL轉化為精胺酸及反丁烯二酸。人類之精胺酸缺乏膳食不誘發高氨血症、乳清酸尿症,亦不改變成年人類中全身氧化氮(NO)合成之速率(Tapiero 2002,Castillo 1995,Rogers 1994,Carey 1987,Barbul 1986,Snyderman 1959,Rose 1949)。儘管早產嬰兒似乎需要精胺酸(Wu 2004),但精胺酸量與嬰兒、兒童及年輕人之年齡無關(Lücke 2007)。在1992年,Takaku及Sugimura單獨地報告人類黑色素瘤及肝細胞癌(HCC)細胞系似乎需要精胺酸以用於生長。其他研究顯示經聚
乙二醇化之ADI對黑色素瘤及肝腫瘤之治療有效且幾乎沒有不良作用。
ADI-PEG 20治療需要經一段時間使用多次劑量。在多次治療之後,可能出現可限制治療之持續有效性的抗ADI-PEG 20抗體。因此,在此項技術中需要對用於治療之抗ADI-PEG20抗體交叉反應性降低的ADI以改善及延長精胺酸耗竭療法之療效。本發明提供用於治療癌症之此及其他優點。
參考文獻:Avramis VI, Panosyan EH. 2005. Clin Pharmacokinet 44:367-393;Barbul A. 1986. J Parenteral Enteral Nutr 10:227-238;Carey GP等人1987. J Nutr 117:1734-1739;Castillo L等人1995. Am J Physiol 268(內分泌學新陳代謝31):E360-367;Fu CH, Sakamoto KM. 2007. Expert Opin Pharmacother 8:1977-1984;Haines RJ等人2011. Int J Biochem Mol Biol 2:8-23;Husson A等人2003. Eur J Biochem 270:1887-1899;Lücke T等人2007. Clin Chem Lab Med 45:1525-1530;Morris SM Jr. 2006. Am J Clin Nutr 83(增刊):598S-512S;Rogers QR. 1994. In Proceedings from a Symposium Honoring Willard J. Visek-from Ammonia to Cancer and Gene Expression.特別出版物86-1994年4月,Agriculture Experiment Station, University of Illinois, 211 Mumford Hall, Urbana, IL 61801,第9-21頁;Tapiero H等人2002. Biomed Pharmacother 56:439-445, 2002;Viera Pinheiro JP, Boos J. 2004. Br J Haematol 125:117-127;Wu G等人2009. Amino Acids 37:153-168;Wu G等人2004. J Nutr Biochem 15:442-451;Zeidan A等人2008. Expert Opin Biol Ther 9:111-119)。
本發明之一個態樣提供一種經分離之精胺酸去亞胺酶,其中該經分離之精胺酸去亞胺酶與患者抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性降
低。亦包括治療或醫藥組合物,該等治療或醫藥組合物包含經分離之精胺酸去亞胺酶或其具有ADI活性之片段、及醫藥學上可接受之載劑。在某些實施例中,該組合物為無菌的且/或實質上不含熱原質(諸如內毒素)。在一個實施例中,該與患者抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性降低的經分離之精胺酸去亞胺酶不來自人類黴漿菌(M.hominis)。在另一個實施例中,該與患者抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性降低的經分離之精胺酸去亞胺酶來自表1中所列之生物體。在某些實施例中,該與患者抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性降低的經分離之精胺酸去亞胺酶的一或多種特性與ADI-PEG 20之彼等特性類似或比其更好。就此而言,該一或多種特性包括(但不限於)Kcat、Km、最佳pH值、穩定性、活體內蛋白質水解穩定性、或不需要未存在於血液中之離子或輔因子、或其任何組合。在一個實施例中,該與患者抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性降低的經分離之精胺酸去亞胺酶與人類黴漿菌精胺酸去亞胺酶相比具有至少20個表面殘基變化。在另一個實施例中,該與患者抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性降低的經分離之精胺酸去亞胺酶與人類黴漿菌精胺酸去亞胺酶相比具有介於20與135個之間的表面殘基變化、介於40與100個之間的表面殘基變化、介於30與60個之間的表面殘基變化、介於80與100個之間的表面殘基變化、或介於100與120個之間的表面殘基變化。
在另一個實施例中,該與患者抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性降低的經分離之精胺酸去亞胺酶來自精胺酸黴漿菌(M.arginini)、關節炎黴漿菌(M.arthritidis)、海豹腦黴漿菌(M.phocicerebrale)、貓黴漿菌(M.gateae)、海豹黴漿菌(M.phocidae)、鴿嘴黴漿菌(M.columbinum)、愛阿華黴漿菌(M.iowae)、鱷魚黴漿菌(M.crocodyli)、短吻鱷黴漿菌(M.alligatoris)、奧氏嗜熱鹽絲菌(H.orenii)或牛分枝桿菌(M.bovis)。與患者抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性降低的說明性
精胺酸去亞胺酶包含闡述於SEQ ID NO:2-32中之任一者中的胺基酸序列。
在另一個實施例中,該與患者抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性降低的經分離之精胺酸去亞胺酶已經修飾以移除至少一個聚乙二醇化位點。在該與患者抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性降低的精胺酸去亞胺酶的另一個實施例中,至少一個離胺酸殘基已由胺基酸取代修飾。就此而言,在某些實施例中,至少5個離胺酸殘基、至少10個離胺酸殘基或至少20個離胺酸殘基已由胺基酸取代修飾。
在另一個實施例中,該與患者抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性降低的精胺酸去亞胺酶藉助於連接子共價結合至PEG分子上。就此而言,該與患者抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性降低的精胺酸去亞胺酶可共價結合至一或多個PEG分子上,諸如結合至約1至約10個或約2至約8個PEG分子上。該等PEG分子可為直鏈或分支鏈PEG分子,且總重量平均分子量可為約1,000至約40,000,或總重量平均分子量可為約10,000至約30,000。在其中該PEG藉助於連接子共價結合至本發明之ADIr的彼等實施例中,該連接子可包含丁二醯基、醯胺基、醯亞胺基、胺基甲酸根、酯基、環氧基、羧基、羥基、碳水化合物、酪胺酸基、半胱胺酸基、組胺酸基、亞甲基、或其任何組合。在一個實施例中,該丁二醯基之來源為丁二酸丁二醯亞胺酯。
本發明之另一個態樣提供一種編碼本文所描述的經分離之精胺酸去亞胺酶的聚核苷酸、包含該聚核苷酸之載體、及包含該等載體之經分離之宿主細胞。
本發明之另外一個態樣提供一種組合物,該組合物包含如本文所描述的與患者抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性降低的經分離之精胺酸去亞胺酶、及生理學上可接受之載劑。在某些實施例中,該等組合物進一步包含化學治療劑。例示性化學治療劑包括(但不限於)多烯
紫杉醇(docetaxel)、卡鉑(carboplatin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、吉西他濱(gemcitabine)、順鉑(cisplatin)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)及依維莫司(everolimus)。
本發明之另一個態樣提供一種治療癌症、改善癌症之症狀、或抑制癌症之進展的方法,其包含向有需要之患者投與治療有效量的包含如本文所描述的與患者抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性降低的經分離之精胺酸去亞胺酶、及生理學上可接受之載劑的組合物,藉此治療該癌症、改善該癌症之該等症狀、或抑制該癌症之該進展。在某些實施例中,該有需要之患者已確定具有抗ADI-PEG 20抗體。在另一個實施例中,該癌症係選自由以下各者組成之群:肝細胞癌、黑色素瘤(包括轉移性黑色素瘤)、胰臟癌、前列腺癌、小細胞肺癌、間皮瘤、淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、肝腫瘤、肉瘤、白血病、急性骨髓白血病、復發性急性骨髓白血病、乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胃癌(gastric cancer)、神經膠質瘤、多形性神經膠質母細胞瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、腦癌、頭頸癌、子宮頸癌、睾丸癌及胃癌(stomach cancer)。
本發明之另一個態樣提供一種治療癌症、改善癌症之症狀、或抑制癌症之進展的方法,其包含向有需要之患者投與治療有效量的包含ADI-PEG 20之組合物,及在一段時間之後向該患者投與包含如本文所描述的與患者抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性降低的經分離之精胺酸去亞胺酶、及生理學上可接受之載劑的組合物,藉此治療該癌症、改善該癌症之該等症狀、或抑制該癌症之該進展。就此而言,該段時間可藉由偵測該患者中抗ADI-PEG 20抗體之預定含量及/或量測或以其他方式觀測該患者中之ADI活性來確定,其中該包含與患者抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性降低的經分離之精胺酸去亞胺酶的組合物在偵測該等抗ADI-PEG 20抗體之該預定含量及/或量測或觀測該
患者中ADI活性之預定程度之後投與。
亦包括本文所描述的經分離之精胺酸去亞胺酶蛋白質,其用於製備或製造用於治療癌症、改善癌症之症狀、或抑制癌症之進展的藥劑。
本發明之實施例係關於所選擇之ADI酶,其在一些實施例中經工程改造以具有少量表面離胺酸殘基且經由穩定連接子而與PEG接合。所選擇之ADI酶係基於ADI酶之有益特性而選自來自不同生物之大量ADI酶。此等特性包括酶經由將精胺酸經ADI轉化為瓜胺酸及氨以在人類血液中確立及維持低精胺酸濃度的能力。另外,所選擇之ADI分子對抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性與ADI-PEG 20相比降低,該等抗體可能由患者先前使用ADI-PEG 20治療產生。
在某些實施例中,本發明中之酶經聚乙二醇化以提供針對腎臟清除作用及蛋白質水解之保護,以及降低免疫原性或抗原性。為增加聚乙二醇化之有效性,對酶之修飾可經工程改造以減少表面離胺酸殘基之數量,且因此限制可供使用之PEG連接位點的數量。此提供在殘餘離胺酸連接殘基處更完全及均勻之聚乙二醇化。
經選擇以將甲氧基-PEG連接至ADI之PEG連接子經選擇以提供化學上穩定之連接。預期此將增加分子之生物活性壽命。化學上穩定之連接子亦將消除水解,且減少可在連接至酶表面上之脫聚乙二醇化連接子上發生的免疫反應。
此等累積說明產生一或多種自患者血液有效移除精胺酸而不由來自先前精胺酸耗竭療法之抗ADI-PEG 20抗體抵消或清除的分子。該等分子經聚乙二醇化以延遲因其自身免疫原性所致的抵消及清除。
此等因素將允許其代替ADI-PEG 20或除ADI-PEG 20之外進行使用(例如作為後續藥物)以延長精胺酸耗竭療法,且因此增加精胺酸耗竭治療作為抗癌治療之有效性。
正常細胞生長不需要精胺酸,因為其可自瓜胺酸以由ASS及ASL催化之兩步製程合成精胺酸。相反,某些癌症不表現ASS。某些癌症不表現ASL,而其他癌症可減少ASS及/或ASL之表現或可不表現ASS及/或ASL。因此,此等癌症對精胺酸為營養缺陷型的。此可利用代謝差異以開發治療此等形式之癌症的安全及有效療法。ADI經由精胺酸二水解酶路徑催化精胺酸轉化為瓜胺酸,且可因此用於消除精胺酸。
除非特定指示與此相反,否則本發明之實踐將採用此項技術之技能內的病毒學、免疫學、微生物學、分子生物學及重組型DNA技術之習知方法,其中許多出於說明之目的而描述於下文中。該等技術在文獻中完全解釋。參見例如Current Protocols in Protein Science,Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons,New York,N.Y.(2009);Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology,第3版,Wiley & Sons,1995;Sambrook及Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版,2001);Maniatis等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982);DNA Cloning:A Practical Approach,第I及II卷(D.Glover編);Oligonucleotide Synthesis(N.Gait編,1984);Nucleic Acid Hybridization(B.Hames及S.Higgins編,1985);Transcription and Translation(B.Hames及S.Higgins編,1984);Animal Cell Culture(R.Freshney編,1986);Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)及其他類似參考文獻。
如本說明書及所附申請專利範圍中所用,除非本文內容另外明
確規定,否則單數形式「一個/一種(a)」、「一個/一種(an)」及「該(the)」包括複數個參考物。
在本說明書通篇中,除非本文另有規定,否則字語「包含(comprise)」或諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」之變型應理解為暗示包含所陳述之要素、或整數、或要素或整數之群,但不排除任何其他要素、或整數、或要素或整數之群。
「約」意謂相對於參考之數量、程度、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度,數量、程度、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度變化如30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%一般多。
「在統計學上顯著」意謂結果不太可能偶然發生。統計學上之顯著性可藉由此項技術中已知之任何方法來測定。顯著性之常用量測值包括p值,其為若虛無假設為真則所觀測事件將發生之頻率或機率。若所獲得之p值小於顯著水準,則駁回虛無假設。在簡單情況下,顯著水準定義為p值為0.05或0.05以下。
除非另外明確說明,否則本說明書中之各實施例在加以必要修正後應用於每一其他實施例。
重組型DNA、寡核苷酸合成、及組織培養及轉化(例如電穿孔、脂質體轉染)可使用標準技術。酶促反應及純化技術可根據製造商之說明書或如通常在此項技術中所實現或如本文所描述來進行。此等及相關之技術及程序一般而言可根據此項技術中熟知之習知方法及如在本說明書通篇中所引用及論述之各種一般及更特定參考文獻中所描述來進行。除非提供特定定義,否則本文所描述的與分子生物學、分析化學、合成有機化學、及醫學及醫藥化學相關所利用之命名法、及該等學科之實驗室程序及技術為此項技術中熟知且常用之彼等。標準技術可用於重組型技術、分子生物學、微生物學、化學合成、化學分
析、醫藥之製備、調配及遞送、以及患者治療。
「患者」或「個體」係指動物,在某些實施例中係指哺乳動物,且在一個特定實施例中係指人類。
「生物相容性」係指材料或化合物一般而言對生物學功能無害,且不產生任何程度的不可接受之毒性(包括過敏原性及疾病病況)。
術語「參考序列」一般而言係指另一個序列與之進行比較的一個核酸編碼序列或胺基酸序列。以參考序列之形式包括本文所描述之所有多肽及聚核苷酸序列,包括藉由名稱所描述之彼等序列及描述於表及序列表中之彼等序列。
在本發明通篇中,可使用以下縮寫:PEG,聚乙二醇;ADI,精胺酸去亞胺酶;SS,丁二酸丁二醯亞胺酯;SSA,丁二醯亞胺基丁二醯亞胺;SPA,丙酸丁二醯亞胺酯;NHS,N-羥基丁二醯亞胺;ASS1或ASS,精胺基丁二酸合成酶;ASL,精胺基丁二酸裂解酶。
在本發明中,編碼ADI之聚核苷酸可來源、選殖、分離、合成、或產生自任何來源,包括例如微生物、重組型生物技術或其任何組合。舉例而言,精胺酸去亞胺酶可選殖自黴漿菌屬(Mycoplasma)、梭菌屬(Clostridium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、疏螺旋體屬(Borrelia)、腸球菌屬(Enterococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)及/或梨形鞭毛蟲屬(Giardia)之微生物。在某些實施例中,精胺酸去亞胺酶係選殖自關節炎黴漿菌(Mycoplasma arthritidis)、肺炎黴漿菌(Mycoplasma pneumoniae)、人類黴漿菌(Mycoplasma hominis)、精胺酸黴漿菌(Mycoplasma arginini)、化膿性鏈球菌(Steptococcus pyogenes)、肺炎鏈球菌(Steptococcus pneumoniae)、伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、阿氏疏螺旋體(Borrelia afzelii)、腸梨形鞭毛蟲(Giardia intestinalis)、產氣莢膜芽胞
梭菌(Clostridium perfringens)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、米酒乳酸桿菌(Lactobacillus sake)或其任何組合。在其他實施例中,精胺酸去亞胺酶選殖自表1中所列之物種。詳言之,本發明中所使用之ADI可包含SEQ ID NO:1-32中之任一者的胺基酸序列或其具有ADI活性(例如能夠將精胺酸代謝為瓜胺酸及氨)之變異體或片段或擴展物。序列表中所提供之序列中的一些不表示全長ADI蛋白質序列。因此,在某些實施例中,可在本文所提供之序列的任一末端處添加另外之胺基酸殘基以形成具有ADI活性之全長蛋白質。待添加之特定胺基酸可由技術人員基於已知ADI序列之比對來確定。該等ADI分子可使用已知技術來合成。舉例而言,在SEQ ID NO:26-32中提供說明性「擴展」ADI(r)。
在某些實施例中,將如本文所描述之ADI酶與來源於人類黴漿菌之基準ADI-PEG 20分子相比。如本文所用,「ADI-PEG 20」係指此項技術中已知且描述於例如US6183738;US6635462;Ascierto PA等人(2005)Pegylated arginine deiminase treatment of patients with metastatic melanoma:results from phase I and II studies.J Clin Oncol 23(30):7660-7668;Izzo F等人(2004)Pegylated arginine deiminase treatment of patients with unresectable hepatocellular carcinoma:results from phase I/II studies.J Clin Oncol 22(10):1815-1822;Holtsberg FW等人(2002),Poly(ethylene glycol)(PEG)conjugated arginine deiminase:effects of PEG formulations on its pharmacological properties.J Control Release 80(1-3):259-271;Kelly等人,(2012)British Journal of Cancer 106,324-332中之ADI分子。如將由熟習此項技術者所識別,此分子為經聚乙二醇(PEG 20,000)化的來源於人類黴漿菌之ADI酶,且相對於野生型人類黴漿菌ADI酶具有兩個取代(K112E;P210S)。
自大量ADI酶篩選如本文所描述之精胺酸去亞胺酶,且該等酶與來自患者之抗ADI-PEG 20抗體的反應性程度降低。抗ADI-PEG 20抗體可出現在用ADI-PEG 20治療之個體中,且可使用已知方法來量測。對於抗ADI-PEG 20抗體之反應性可例如使用ELISA或熟習此項技術者已知之其他相似分析來測定。
就此而言,ADI-PEG 20可用作評估對患者抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性程度的比較。在統計學上顯著低於ADI-PEG 20對患者抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性程度的交叉反應性程度可適用於本文中。在某些實施例中,如本文所描述之精胺酸去亞胺酶對抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性較低或對其不具有交叉反應性。在另一個實施例中,對抗ADI-PEG 20抗體之反應性與使用ADI-PEG 20之反應性相比的任何降低可為有益的,因為此ADI酶將改良需要精胺酸耗竭療法之患者的治療選項。因此,如本文所描述之精胺酸去亞胺酶對患者抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性與ADI-PEG 20對該等抗體之反應性相比降低。
本文所用之「ADIr」係指對抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性與ADI-PEG 20對該等抗體之反應性相比降低(reduced)的本發明之ADI酶。「ADIr」命名法用於區分本文中所識別之分子與如此項技術中已知之ADI及ADI-PEG 20。
本發明之ADIr酶的特徵或特性與ADI-PEG 20之彼等特徵或特性類似或比其更好,從而為有效癌症治療而降低及維持低血液精胺酸量。該等特性包括Kcat、Km、最佳pH值、穩定性、活體內蛋白質水解穩定性、及不需要未存在於血液中之離子或輔因子、或其任何組合。在某些實施例中,如本文所描述之ADIr的特性為ADI-PEG 20之類似特性的約或至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、
85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。在其他實施例中,本文所描述之ADIr的特性為所比較ADI-PEG 20之特定特性的約或至少約100%、105%、110%、120%、140%、150%、160%、180%、200%、220%、240%、250%、260%、280%、300%、320%、340%、350%、360%、400%、420%、450%、460%、500%、520%、550%或更高。
因此,在某些實施例中,ADIr之Kcat為ADI-PEG 20之Kcat的約或至少約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更好。在某些實施例中,ADIr之Kcat為ADI-PEG 20Kcat之約或至少約100%、105%、110%、120%、125%、140%、150%、160%、180%、200%、220%、240%、250%、260%、280%、300%、320%、340%、350%、360%、400%、420%、450%、460%、500%、520%、550%或更高倍數。在某些實施例中,本文所描述之ADIr酶或包含該等ADIr酶之組合物的Kcat為約0.5秒-1至約15秒-1,且在另一個實施例中為約1秒-1至約12秒-1、約1秒-1至約10秒-1、約1.5秒-1至約9秒-1、約2秒-1至約8秒-1、或約2.5秒-1至約7秒-1。在某些實施例中,組合物中之ADIr或ADIr-PEG的Kcat為約2.5秒-1至約7.5秒-1。在一些實施例中,組合物中之ADIr或ADIr-PEG的Kcat為約2.5秒-1、約3秒-1、約3.5秒-1、約4秒-1、約4.5秒-1、約5秒-1、約5.5秒-1、約6秒-1、約6.5秒-1、約7秒-1、約7.2秒-1、約7.5秒-1、約8秒-1、約10秒-1、約15秒-1、約20秒-1、約25秒-1、約30秒-1、約35秒-1、約40秒-1、約45秒-1、約50秒-1、約55秒-1、約60秒-1、約65秒-1、約70秒-1、約75秒-1、約80秒-1、約85秒-1、約90秒-1、約95秒-1、或約100秒-1。
因此,在某些實施例中,ADIr之Km為ADI-PEG 20之Km的約或
至少約5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更好。因此,在某些實施例中,ADIr之Km為ADI-PEG 20之Km的約或至少約100%、105%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、180%、200%、220%、240%或250%。在一個實施例中,ADIr或其經聚乙二醇化之調配物的Km為約0.5μM至約50μM、或約1.6μM至約48μM、或約0.5μM至約15μM,且在另一個實施例中為約1μM至約12μM、約1μM至約10μM、約1.5μM至約9μM、約1.5μM至約8μM、或約1.5μM至約7μM。在某些實施例中,組合物中之ADIr或ADIr-PEG的Km為約1.5μM至約6.5μM。在一些實施例中,ADIr或其經聚乙二醇化之調配物的Km為約1.5μM、約1.6μM、約2μM、約2.5μM、約3μM、約3.5μM、約4μM、約4.5μM、約5μM、約5.5μM、約6μM、約6.5μM、約7μM、約8μM、約9μM、約10μM、約12μM、約14μM、約15μM、約16μM、約18μM、約20μM、約22μM、約24μM、約25μM、約26μM、約28μM、約30μM、約32μM、約34μM、約35μM、約36μM、約38μM、約40μM、約42μM、約44μM、約45μM、約46μM、約48μM、或約50μM。
在某些實施例中,ADIr在接近人類血液之生理pH值的pH值下起作用。因此,在一個實施例中,ADIr在約4至約10.8、或約6至約8、或約6.5至約7.5之pH值下起作用。在一個實施例中,ADIr在約pH 7.4下具有良好酶活性。
在某些實施例中,ADIr在長期儲存期間具有穩定性,且在人體治療期間具有溫度及蛋白質水解穩定性。在其他實施例中,ADIr之活性不需要未存在於血液中之離子或輔因子。
在某些實施例中,本文所描述之ADIr一般而言具有與人類黴漿菌足夠不同之胺基酸序列,以使得存在將減少或消除用於抗ADI-PEG 20抗體之抗原位點的表面殘基變化。在一個實施例中,在所選擇之ADIr分子與個體中現有抗ADI-PEG 20抗體之間將不存在交叉反應性,且在個體中將生成全新的免疫反應,而非對人類黴漿菌ADI之現有反應的成熟。因此,在一個實施例中,如本文所描述之ADIr具有與如SEQ ID NO:1中所闡述之人類黴漿菌ADI的20%-85%序列一致性。在某些實施例中,如本文所描述之ADIr與人類黴漿菌ADI具有甚至更低之序列一致性百分比,諸如10%或15%一致性。在另一個實施例中,如本文所描述之ADIr與人類黴漿菌ADI具有20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%或甚至83%一致性,且對抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性仍降低。
在一個實施例中,如本文所描述之ADIr與人類黴漿菌ADI相比具有約25-140個表面殘基變化。表面殘基可自人類黴漿菌ADI之晶體結構識別,且來自其他生物之ADI表面殘基可藉由序列同源性來確定。如本文所描述之ADIr與人類黴漿菌ADI(參見SEQ ID NO:1)相比可具有約25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或
約140個表面殘基變化。
在另一個實施例中,如本文所描述之ADIr與人類黴漿菌ADI相比具有約25-140個殘基變化。該等殘基變化不必僅為表面胺基酸殘基之變化。該等殘基變化(或添加或缺失)可在分子之任一末端處或可在ADI之任何殘基處,以使得經修飾之ADI具有如本文所描述之所需ADI活性。待變化之殘基可自人類黴漿菌ADI之晶體結構識別,且來自其他生物之ADI殘基可藉由序列同源性來確定。如本文所描述之ADIr與人類黴漿菌ADI(參見SEQ ID NO:1)相比可具有約25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或約140個胺基酸殘基變化。
自大量ADI酶,表1列舉24種ADIr酶以及其相對於人類黴漿菌ADI之序列一致性百分比。根據文獻,人類黴漿菌、精胺酸黴漿菌及關節炎黴漿菌ADI胺基酸序列緊密相關,且此等酶具有良好催化特性。最近,已發現具有與此三種酶緊密相關之序列的另外之ADI酶。已識別相關性更遠之黴漿菌ADI酶,儘管關於其所知較少。且存在相關性甚至更遠的來自細菌及其他來源之ADI酶。
在某些實施例中,本文中所識別的來自多個所選擇之物種的ADIr酶具有表面離胺酸殘基(在某些實施例中多至30個或30個以上)。然而,在某些實施例中,ADIr酶可具有少得多的表面離胺酸殘基,諸如在牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)ADI的情況下僅2個離胺酸殘基,或甚至無離胺酸殘基(參見例如來自分枝桿菌(Mycobacterium sp.)MCS之ADI;GenBank編號ABG10381)。因此,本文所識別的與抗
ADI-PEG 20抗體之交叉反應性降低的ADIr酶具有約0、1、2、3、4、5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或更多個表面離胺酸殘基。
術語「多肽」、「蛋白質」及「肽」可互換使用,且意謂不限於任何特定長度之胺基酸聚合物。術語不排除修飾,諸如豆蔻醯化、硫酸化、糖基化、磷酸化、及信號序列之添加或缺失。術語「多肽」或「蛋白質」意謂一或多個胺基酸鏈,其中各鏈包含藉由肽鍵共價連接之胺基酸,且其中該多肽或蛋白質可包含複數個藉由肽鍵非共價及/或共價連接在一起之鏈(該等鏈具有天然蛋白質(亦即藉由天然產生之且特定言之非重組型之細胞產生的蛋白質)或經基因改造之或重組型細胞的序列),且包含具有天然蛋白質之胺基酸序列的分子、或具有對天然序列之一或多個胺基酸進行之缺失、添加及/或取代的分子。術語「多肽」及「蛋白質」特定地涵蓋本發明之ADIr蛋白質,或具有對該等ADIr蛋白質之一或多個胺基酸進行之缺失、添加及/或取代的序列。在某些實施例中,多肽為「重組型」多肽,該多肽由包含一或多個重組型DNA分子之重組型細胞產生,該等重組型DNA分子典型地由將不可見於細胞中的異源聚核苷酸序列或聚核苷酸序列之組合製成。
本文所提及的術語「經分離之蛋白質」意謂個體蛋白質(1)不含典型地將與之一起可見於自然界中的至少一些其他蛋白質,(2)基本上不含來自相同來源(例如來自相同物種)之其他蛋白質,(3)由來自不同物種之細胞表現,(4)已與在自然界中與之相關之聚核苷酸、脂質、碳水化合物或其他材料中的至少約50%分離,(5)不與在自然界中與該「經分離之蛋白質」相關的蛋白質部分相關(藉由共價或非共價
相互作用),(6)與在自然界中與之不相關之多肽可操作地相關(藉由共價或非共價相互作用),或(7)不出現在自然界中。此經分離之蛋白質可由染色體組DNA、cDNA、mRNA或其他RNA編碼,可為合成來源,或其任何組合。在某些實施例中,經分離之蛋白質實質上不含可見於其天然環境中且將干擾其用途(治療、診斷、預防性、研究或其他)的蛋白質或多肽或其他污染物。
術語「變異體」包括與本文所特定揭示之參考多肽(例如SEQ ID NO:1-32)的不同之處在於一或多個取代、缺失、添加及/或插入的多肽。變異多肽具有生物活性,亦即其繼續具有參考多肽之酶或結合活性。該等變異體可由例如遺傳多形現象及/或由人類操控產生。
在許多情況下,生物活性變異體將含有一或多個保守取代。「保守取代」為其中一個胺基酸被另一個具有相似特性之胺基酸取代,因此熟習肽化學技術者可預期該多肽之二級結構及親水性質實質上不會改變。如上文所述,可在本發明之聚核苷酸及多肽的結構中進行修飾,而仍獲得編碼具有所需特徵之變異體或衍生多肽的功能性分子。
舉例而言,在蛋白質結構中,某些胺基酸可在不會顯著損失與諸如抗體之抗原結合區或受質分子上之結合位點的結構之相互結合能力下被其他胺基酸取代。因為由蛋白質之相互作用能力及性質界定該蛋白質之生物功能活性,所以可在蛋白質序列及(當然)其基本DNA編碼序列中進行某些胺基酸序列取代,而仍然獲得具有類似特性之蛋白質。因此預期可在不顯著損失其效用下,可在所揭示之組合物的肽序列或編碼該等肽之相應DNA序列中進行各種變化。
在進行該等變化中,可考慮胺基酸之親水指數。相關技藝中一般已理解胺基酸親水指數在賦予蛋白質相互作用生物功能中之重要性(Kyte及Doolittle,1982,以引用之方式併入本文中)。公認胺基酸之相對親水特性促成所得蛋白質之二級結構,該二級結構隨後界定蛋白質
與其他分子(例如酶、受質、受體、DNA、抗體、抗原及其類似物)之相互作用。各胺基酸已基於其疏水性及電荷特徵而指定親水指數(Kyte及Doolittle,1982)。此等值為:異白胺酸(+4.5);纈胺酸(+4.2);白胺酸(+3.8);苯丙胺酸(+2.8);半胱胺酸(+2.5);甲硫胺酸(+1.9);丙胺酸(+1.8);甘胺酸(-0.4);蘇胺酸(-0.7);絲胺酸(-0.8);色胺酸(-0.9);酪胺酸(-1.3);脯胺酸(-1.6);組胺酸(-3.2);麩胺酸(-3.5);麩醯胺(-3.5);天冬胺酸(-3.5);天冬醯胺(-3.5);離胺酸(-3.9);及精胺酸(-4.5)。此項技術中已知某些胺基酸可經具有相似親水指數或評分之其他胺基酸取代,而仍產生具有相似生物活性之蛋白質,亦即仍可獲得生物功能上等效之蛋白質。在進行該等變化中,用親水指數在±2內之胺基酸進行取代較佳,用親水指數在±1內之彼等胺基酸進行取代尤佳,且用親水指數在±0.5內之彼等胺基酸進行取代甚至更尤佳。
在此項技術中亦應理解類似胺基酸之取代可基於親水性來有效進行。美國專利4,554,101(特定地以全文引用之方式併入本文中)陳述蛋白質之最大局部平均親水性(如由其鄰接胺基酸之親水性所控制)與該蛋白質之生物學特性相關。如在美國專利4,554,101中詳述,已為胺基酸殘基指定以下親水性值:精胺酸(+3.0);離胺酸(+3.0);天冬胺酸(+3.0±1);麩胺酸(+3.0±1);絲胺酸(+0.3);天冬醯胺(+0.2);麩醯胺酸(+0.2);甘胺酸(0);蘇胺酸(-0.4);脯胺酸(-0.5±1);丙胺酸(-0.5);組胺酸(-0.5);半胱胺酸(-1.0);甲硫胺酸(-1.3);纈胺酸(-1.5);白胺酸(-1.8);異白胺酸(-1.8);酪胺酸(-2.3);苯丙胺酸(-2.5);色胺酸(-3.4)。應理解一個胺基酸可經取代為另一個具有相似親水性值之胺基酸,而仍獲得生物學上等效且尤其免疫學上等效之蛋白質。在該等變化中,用親水性值在±2內之胺基酸進行取代為較佳的,用親水指數在±1內之彼等胺基酸進行取代為尤佳的,且用親水指數在±0.5內之彼等胺基酸進行取代為甚至更尤佳的。
如上文所概述,胺基酸取代因此一般而言係基於胺基酸側鏈取代基之相對相似性,例如其疏水性、親水性、電荷、大小及其類似形式。將各種前述特徵考慮在內之例示性取代為熟習此項技術者所熟知的,且包括:精胺酸及離胺酸;麩胺酸及天冬胺酸;絲胺酸及蘇胺酸;麩醯胺酸及天冬醯胺;以及纈胺酸、白胺酸及異白胺酸。
胺基酸取代可進一步基於殘基之極性、電荷、可溶性、疏水性、親水性、及/或兩性的相似性來進行。舉例而言,帶負電之胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸;帶正電之胺基酸包括離胺酸及精胺酸;而具有相似親水性值之不帶電極性頭基的胺基酸包括白胺酸、異白胺酸及纈胺酸;甘胺酸及丙胺酸;天冬醯胺及麩醯胺酸;以及絲胺酸、蘇胺酸、苯丙胺酸及酪胺酸。可代表保守變化之其他胺基酸基團包括:(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr;(2)cys、ser、tyr、thr;(3)val、ile、leu、met、ala、phe;(4)lys、arg、his;及(5)phe、tyr、trp、his。
變異體亦可(或可替代地)含有非保守變化。在一個較佳實施例中,變異多肽與天然序列的不同之處在於少於約10、9、8、7、6、5、4、3、2個胺基酸或甚至1個胺基酸的取代、缺失或添加。變異體亦可(或可替代地)由例如胺基酸之缺失或添加來修飾,該等胺基酸對多肽之免疫原性、二級結構、酶活性及/或親水性質影響最小。
總體而言,變異體將顯示對參考多肽序列(例如SEQ ID NO:1-32)的約或至少約30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%之相似性或序列一致性或序列同源性。此外,涵蓋與天然或母體序列的不同之處在於約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100或100個以上胺基酸之添加(例如C末端添加、N末端添
加、兩者)、缺失、截斷、插入或取代但保持母體或參考多肽序列之特性或活性的序列。
在一些實施例中,變異多肽與參考序列的不同之處在於至少一個但小於50、40、30、20、15、10、8、6、5、4、3或2個胺基酸殘基。在其他實施例中,變異多肽與參考序列的不同之處在於約或至少0.5%或1%但小於20%、15%、10%或5%的殘基。(若此比較需要比對,則應針對最大相似性比對序列。來自缺失或插入之「環」突序列或錯配視為差異。)
術語「多肽片段」係指具有天然產生或重組產生之多肽的胺基末端缺失、羧基末端缺失及/或內部缺失或取代的多肽。在某些實施例中,多肽片段可包含至少5至約400個胺基酸長的胺基酸鏈。應瞭解在某些實施例中,片段為至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350或400個胺基酸長。尤其適用之多肽片段包括功能性結構域,包括本文所描述之ADIr的催化性ADI結構域。在ADIr的情況下,適用之片段包括(但不限於)催化結構域及α-螺旋結構域。
用於與ADI接合的許多活化之PEG共價結合至離胺酸殘基上。連接至ADI上之PEG分子通常比連接至離胺酸殘基的少得多。連接之數量及分佈兩者在分子之間可為不均勻的。僅將在小部分ADI分子中修飾任何特定離胺酸殘基。此位點修飾不均勻性及較低PEG佔有率可導致藥物表徵及在抗原位點處PEG屏蔽有效性的問題。因此,在某些實施例中,如本文所描述的所選擇之ADIr酶藉由將離胺酸置換為其他殘基類型來修飾,以減少離胺酸殘基之數量。此產生經更均勻聚乙二醇
化之蛋白質,且增加殘餘離胺酸殘基處之PEG佔有率。選擇變為其他殘基之特定離胺酸殘基將經選擇以保持酶活性。預期此更均勻之聚乙二醇化使得針對血液中蛋白質水解之保護增加且自患者抗體屏蔽抗原位點增加。
在某些實施例中,本發明之ADIr可如美國專利第6,635,462號中所描述來修飾。詳言之,對ADIr之一或多個天然產生之胺基酸殘基的修飾可提供更易於複性及調配之酶,藉此改良ADIr及包含該ADIr之治療組合物的製造。在一個實施例中,本發明之ADIr經修飾以移除一或多個離胺酸殘基(例如該離胺酸可經另一個胺基酸或其類似物、或一個非天然胺基酸取代)。詳言之,在一個實施例中,ADIr經修飾為在相當於SEQ ID NO:1(人類黴漿菌ADI)之112、374、405或408的位置或此等位置之一或多者的組合處不含離胺酸。在另一個實施例中,ADIr經修飾以不含一或多個離胺酸,舉例而言,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或更多個離胺酸殘基(若存在)可經另一個胺基酸或其類似物、或一個非天然胺基酸取代。在一個實施例中,ADIr例如在與SEQ ID NO:1之位置7、88、137、209及380相當的位置處具有經取代之5個離胺酸。在另一個實施例中,ADIr例如在相當於SEQ ID NO:1之位置7、9、59、88、115、116、137、178、209及380的位置處具有經取代之10個離胺酸。在又另一個實施例中,ADIr例如在相當於SEQ ID NO:1之位置7、9、59、66、88、91、93、115、116、137、141、178、209、279的位置處及在SEQ ID NO:1之位置380處具有經取代之15個離胺酸。在一個實施例中,ADIr例如在相當於SEQ ID NO:1之位置7、9、56、59、66、88、91、93、96、115、116、137、141、178、209、254、279、325、326、380及406的位置處包含經取代之21個離胺酸。
天然ADIr可見於微生物中,且為免疫原性的且自患者之循環快
速清除。此等問題可藉由修飾ADIr來解決。因此,本發明提供藉由修飾劑修飾之ADIr,該修飾劑包括(但不限於)大分子聚合物、蛋白質、肽、多醣或其他化合物。如本文所描述之精胺酸去亞胺酶與修飾劑可藉由共價鍵或非共價相互作用連接,以形成穩定接合物或穩定組合物來達成所需效果。在某些實施例中,經修飾之ADIr保持未經修飾之ADIr的生物活性,且活體內半衰期比未經修飾之ADIr更長且抗原性更低。在某些實施例中,經修飾之ADIr保持未經修飾之ADIr的生物活性的至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。一般而言,經修飾之ADIr保持足以用於治療用途之生物活性。
在一個實施例中,修飾劑可為具有生物相容性且可增加血液中ADIr之半衰期的聚合物或蛋白質或其片段。修飾劑可與ADIr化學偶合或在適用情況下藉助於融合蛋白表現而連接至ADIr上。
大分子聚合物可包括非肽大分子聚合物,其在某些實施例中可具有其自身之生物活性。適合之聚合物包括(但不限於)聚烯醇化合物、聚醚化合物、聚乙烯吡咯啶酮、聚胺基酸、二乙烯醚與順丁烯二酸酐之共聚物、N-(2-羥丙基)-甲基丙烯醯胺、多醣、聚氧乙烯化之多元醇、肝素或其片段、聚烷基乙二醇及其衍生物、聚烷基乙二醇與其衍生物之共聚物、聚(乙烯基乙醚)、α,β-聚[(2-羥乙基)-DL-天冬醯胺]、聚羧酸酯、聚氧乙烯-甲醛、聚丙烯醯嗎啉、胺基化合物與氧化烯烴之共聚物、聚透明質酸、聚環氧乙烷、乙二酸與丙二酸之共聚物、聚(1,3-二氧雜環戊烷)、乙烯與順丁烯二醯肼共聚物、聚唾液酸、環糊精等。在某些實施例中,聚合物為聚乙二醇。
如本文所用之聚烯醇化合物包括(但不限於)聚乙二醇(包括單甲氧基聚乙二醇、單羥基聚乙二醇)、聚乙烯醇、聚烯丙醇、聚丁烯醇及其類似物,及其衍生物(諸如脂質)。
聚醚化合物包括(但不限於)聚烷二醇(HO((CH2)xO)nH)、聚丙二醇、聚氧乙烯(HO((CH2)2O)nH)、聚乙烯醇((CH2CHOH)n)。
聚胺基酸包括(但不限於)一種胺基酸之聚合物或兩種或兩種以上胺基酸之共聚物,例如聚丙胺酸或聚離胺酸、或其嵌段共聚物。
多醣包括(但不限於)聚葡萄糖及其衍生物(例如硫酸葡聚糖)、纖維素及其衍生物(包括甲基纖維素及羧甲基纖維素)、澱粉及其衍生物、聚蔗糖等。
在本發明之一個特定實施例中,藉由與蛋白質或肽偶合來修飾ADIr,其中一或多個蛋白質或肽直接或間接連接至ADIr上。蛋白質可為天然存在之蛋白質或其片段,包括(但不限於)天然存在之人類血清蛋白質或其片段,諸如甲狀腺素結合蛋白、甲狀腺素運載蛋白、a1-酸糖蛋白、運鐵蛋白、纖維蛋白原、免疫球蛋白、Ig Fc區、白蛋白、及其片段。「片段」意謂小於整個蛋白質但保持該蛋白質所需功能的蛋白質之任何部分。如本文所描述之ADIr可藉助於共價鍵直接或間接連接至蛋白質上。直接連接意謂ADIr之一個胺基酸藉助於肽鍵或二硫橋鍵直接連接至修飾用蛋白質之一個胺基酸上。間接連接係指在ADIr與修飾用蛋白質之間藉助於其間原先存在之化學基團或經由生物學或化學手段添加之特定化學基團的連接,或上述連接之組合。
在一個特定實施例中,藉由與PEG共價連接來修飾ADIr。用PEG共價修飾(在存在或不存在連接子之情況下)的ADIr在下文可稱為「ADIr-PEG」。當與未經修飾之ADIr相比時,ADIr-PEG保持其大部分酶活性,免疫原性或抗原性小得多,循環半衰期極大延長,且在治療腫瘤中有效得多。
「聚乙二醇」或「PEG」係指環氧乙烷與水之縮合聚合物(呈分支鏈或直鏈形式)的混合物,由通式H(OCH2CH2)nOH表示,其中n為至少4。「聚乙二醇」或「PEG」與數字字尾組合使用以指示其大致重
量平均分子量。舉例而言,PEG5,000係指總重量平均分子量為約5,000之PEG;PEG12,000係指總重量平均分子量為約12,000之PEG;而PEG20,000係指總重量平均分子量為約20,000之PEG。
在本發明的一個實施例中,PEG之總重量平均分子量為約1,000至約50,000;在一個實施例中為約3,000至約40,000,且在另一個實施例中為約5,000至約30,000;在某些實施例中為約8,000至約30,000;在其他實施例中為約11,000至約30,000;在其他實施例中為約12,000至約28,000;在另其他實施例中為約16,000至約24,000;且在其他實施例中為約18,000至約22,000;在另一個實施例中為19,000至約21,000,且在一個實施例中PEG之總重量平均分子量為約20,000。一般而言,分子量為30,000或30,000以上之PEG難以溶解,且調配產物之產量可減少。PEG可為分支鏈或直鏈。一般而言,增加PEG之分子量降低ADIr之免疫原性。具有描述於此實施例中之分子量的PEG可與ADIr及視情況選用之生物相容性連接子結合使用以治療癌症,包括例如急性骨髓白血病(諸如復發性急性骨髓白血病)、乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胃癌、神經膠質瘤、多形性神經膠質母細胞瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎癌、膀胱癌、子宮癌、腦癌、頭頸癌、子宮頸癌、睾丸癌、胃癌及食道癌。
在本發明之另一個實施例中,PEG之總重量平均分子量為約1,000至約50,000;在某些實施例中為約3,000至約30,000;在其他實施例中為約3,000至約20,000;在一個實施例中為約4,000至約12,000;在另其他實施例中為約4,000至約10,000;在其他實施例中為約4,000至約8,000;在另其他實施例中為約4,000至約6,000;且在另一個實施例中為約5,000。PEG可為分支鏈或直鏈,且在某些實施例中為直鏈。具有描述於此實施例中之分子量的PEG可與ADIr及視情況選用之生物相容性連接子結合使用以治療移植物抗宿主疾病(GVHD)
或癌症。
雖然ADIr-PEG為本文所描述的說明性經修飾之ADIr,但如將由技術人員所識別,ADIr可由其他聚合物或適當分子修飾以得到所需效果,尤其降低抗原性及增加血清半衰期。
ADIr可在存在或不存在連接子之情況下共價結合至修飾劑(諸如PEG)上,儘管一個較佳實施例利用連接子。
用於將ADIr共價連接至修飾劑(例如PEG)上的連接子可為任何生物相容性連接子。如上文所論述,「生物相容性」指示化合物或基團為無毒的且可在活體外或活體內利用而不引起損傷、病(sickness)、疾病(disease)或死亡。修飾劑(諸如PEG)可例如藉助於醚鍵、硫醇鍵或醯胺鍵而結合至連接子上。連接子基團包括例如丁二醯基、醯胺基、醯亞胺基、胺基甲酸根、酯基、環氧基、羧基、羥基、碳水化合物、酪胺酸基、半胱胺酸基、組胺酸基、亞甲基、及其組合。在一個實施例中,生物相容性連接子之來源為丁二酸丁二醯亞胺酯(SS)。其他適合之連接子來源可包括氧基羰基咪唑基(包括例如羰基咪唑(CDI))、硝基苯基(包括例如碳酸硝基苯酯(NCP)或碳酸三氯苯酯(TCP))、三氟乙磺酸根、醛基、異氰酸根、乙烯基碸基、或一級胺。在另一個實施例中,連接子衍生自SS、SPA、SCM或NHS;在某些實施例中,使用SS、SPA或NHS,而在其他實施例中,使用SS或SPA。因此,在某些實施例中,潛在連接子可由以下各者形成:甲氧基-PEG丁二酸丁二醯亞胺酯(SS)、甲氧基-PEG戊二酸丁二醯亞胺酯(SG)、甲氧基-PEG碳酸丁二醯亞胺酯(SC)、甲氧基-PEG丁二醯亞胺乙酸酯(succinimidyl carboxymethyl ester,SCM)、甲氧基-PEG2 N-羥基丁二醯亞胺(NHS)、甲氧基-PEG丁酸丁二醯亞胺酯(SBA)、甲氧基-PEG丙酸丁二醯亞胺酯(SPA)、甲氧基-PEG丁二醯亞胺基戊二醯胺、及甲氧基-PEG丁二醯亞胺基丁二醯胺。
可替代地,ADIr可經由胺基、硫氫基、羥基或羧基直接偶合至修飾劑(諸如PEG)上(亦即在沒有連接子的情況下)。
可使用此項技術中已知之方法藉助於生物相容性連接子將ADIr共價結合至PEG上,如例如由以下各者所描述:Park等人,Anticancer Res.,1:373-376(1981);及Zaplipsky及Lee,Polyethylene Glycol Chemistry:Biotechnical and Biomedical Applications,J.M.Harris編,Plenum出版社,NY,第21章(1992),其揭示內容藉此以全文引用之方式併入本文中。
將PEG連接至ADIr上增加ADIr之循環半衰期。一般而言,PEG連接至ADIr之一級胺上。如熟習此項技術者應已知的,選擇PEG或其他修飾劑在ADIr上之連接位點藉由在蛋白質之活性結構域內位點中之每一者的作用來確定。PEG可連接至ADIr之一級胺上而不產生酶活性之實質損失。舉例而言,存在於ADIr中之離胺酸殘基為如本文所描述之ADIr可藉助於生物相容性連接子(諸如SS、SPA、SCM、SSA及/或NHS)而連接至PEG的所有可能點。如鑒於本發明將為熟習此項技術者顯而易見的,PEG亦可連接至ADIr上之其他位點。
1至約30個PEG分子可共價結合至ADIr上。在某些實施例中,ADIr由一個PEG分子修飾。在其他實施例中,ADIr由超過一個PEG分子修飾。在一個實施例中,ADIr由約1至約10個或約7至約15個PEG分子修飾,而在一個實施例中,由約2至約8個或約9至約12個PEG分子修飾。在另一個實施例中,ADIr由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個PEG分子修飾。在一個特定實施例中,ADIr由每ADIr 4.5-5.5個PEG分子修飾。在另一個實施例中,ADIr由5±1.5個PEG分子修飾。
在另一個實施例中,ADIr中約15%至約70%之一級胺基由PEG修飾,在一個實施例中,精胺酸去亞胺酶中約20%至約65%,約25%至
約60%,或在某些實施例中,約30%至約55%,或45%至約50%,而在其他實施例中,約50%之一級胺基由PEG修飾。當PEG共價結合ADIr之末端時,可能需要僅利用1個PEG分子。增加ADIr上PEG單元之數量增加該酶之循環半衰期。然而,增加ADIr上PEG單元之數量降低該酶之比活性。因此,如鑒於本發明將為熟習此項技術者顯而易見的,需要在該兩者之間達成平衡。
在本發明中,生物相容性連接子之常見特徵為其藉助於丁二醯亞胺基連接至精胺酸去亞胺酶之一級胺上。一旦與ADIr偶合,SS-PEG在緊鄰PEG處具有酯鍵,該酯鍵可使此位點對血清酯酶敏感,該血清酯酶可在身體中使PEG自ADIr釋放。SPA-PEG及PEG2-NHS不具有酯鍵,因此其對血清酯酶不敏感。
在某些實施例中,在本發明中使用生物相容性連接子。連接至蛋白質上之PEG可為直鏈,如用SS-PEG、SPA-PEG及SC-PEG,或可使用分支鏈PEG,如用PEG2-NHS。
在某些實施例中,位於或鄰接於酶之催化區處的與ADIr相關之聚乙二醇化位點經修飾。出於本發明之目的,片語「聚乙二醇化位點」可定義為ADI或可由聚乙二醇共價修飾之ADIr的任何位點或位置。「聚乙二醇化位點」可視為位於或鄰接酶之催化區處,其中該位點之聚乙二醇化導致該酶之催化活性顯著降低。該等位點之聚乙二醇化在傳統上已導致酶失去活性。舉例而言,來自人類黴漿菌之ADI具有處於112位置處之離胺酸,該離胺酸可視為處於或鄰接酶之催化區處。將PEG連接至處於112位置處之此離胺酸上可使酶失去活性。另外,來自人類黴漿菌之ADI具有處於397位置處之半胱胺酸,該半胱胺酸可視為處於或鄰接酶之催化區處。對處於397位置處之半胱胺酸進行胺基酸取代可使酶失去活性。詳言之,用丙胺酸、組胺酸、精胺酸、絲胺酸、離胺酸或酪胺酸取代處於397位置處之半胱胺酸可導致
所有可檢測到之酶活性的損失。來自人類黴漿菌之ADI亦具有位於接近此保守半胱胺酸處之三個離胺酸,詳言之Lys374、Lys405及Lys408。將PEG連接至Lys374、Lys405、Lys408或其組合上可使酶失去活性。
應理解來源於其他生物之ADIr亦可具有對應於來自人類黴漿菌之ADI之112位置的聚乙二醇化位點。另外,來自一些生物之ADI可具有對應於與來自人類黴漿菌之ADI之112位置相同之一般位置的離胺酸。離胺酸在來自該等生物之ADI中的位置為技術人員已知的,且描述於美國專利第6,635,462號中。
因此,在一個實施例中,本發明提供ADIr之多肽鏈中的某些胺基酸取代。此等胺基酸取代提供在由修飾劑修飾時(例如在聚乙二醇化後)活性損失較少的經修飾之ADIr。藉由消除處於或鄰接於酶之催化區處的聚乙二醇化位點或其他已知修飾位點,可在不損失活性的情況下達成最佳修飾(例如聚乙二醇化)。
應理解本發明之其他實施例係基於以下理解:精胺酸去亞胺酶之某些結構特徵可阻止或干擾在藉助於重組技術而產生時的恰當及快速複性。詳言之,此等結構特徵妨礙或阻止酶在重組產生期間採取活性構形。出於本發明之目的,片語「活性構形」可定義為允許未經修飾或經修飾之精胺酸去亞胺酶之酶活性的三維結構。活性構形對催化精胺酸轉化為瓜胺酸而言可尤其為必需的。片語「結構特徵(structural characteristic)」可定義為由特定胺基酸或胺基酸組合產生的多肽鏈之任何特點(trait)、性質(quality)或特性(property)。舉例而言,精胺酸去亞胺酶可含有在正常肽鏈中導致彎曲或扭結且因此阻礙酶在酶複性期間採取活性構形的胺基酸。詳言之,來自人類黴漿菌之精胺酸去亞胺酶具有處於210位置處之脯胺酸,該脯胺酸可在肽鏈中導致彎曲或扭結,使得在重組產生期間使該酶複性更加困難。應理解
來源於其他生物之精胺酸去亞胺酶亦可具有對應於來自人類黴漿菌之精胺酸去亞胺酶之210位置的位點。
本發明因此又提供野生型精胺酸去亞胺酶之多肽鏈中的某些胺基酸取代。該等胺基酸取代可消除精胺酸去亞胺酶之肽鏈中有問題的結構特徵。該等胺基酸取代提供經修飾之精胺酸去亞胺酶的複性改良。此等胺基酸取代使得可能使用減少量的緩衝劑來對經修飾之精胺酸去亞胺酶進行快速複性。此等胺基酸取代亦可增加經複性的經修飾之精胺酸去亞胺酶的產率。在本發明之一個實施例中,經修飾之精胺酸去亞胺酶具有處於P210或等效殘基處之胺基酸取代。如上文所提及,來源於人類黴漿菌之精胺酸去亞胺酶具有位於210位置處的胺基酸脯胺酸。雖然不限制本發明,但目前咸信胺基酸脯胺酸存在於位置210處在正常多肽鏈中導致彎曲或扭結,該彎曲或扭結增加使精胺酸去亞胺酶複性(亦即再摺疊)之難度。對位置210處之脯胺酸進行取代使得可能使用減少量之緩衝劑來對經修飾之精胺酸去亞胺酶進行快速複性。對位置210處之脯胺酸的取代亦可增加經複性的經修飾之精胺酸去亞胺酶的產率。在一個實施例中,位置210處之脯胺酸經絲胺酸取代。應理解根據本發明之此態樣,可在位置210處進行其他取代。其他取代之實例包括Pro210取代為Thr210、Pro210取代為Arg210、Pro210取代為Asn210、Pro210取代為Gln210、或Pro210取代為Met210。藉由消除與野生型精胺酸去亞胺酶之位置210的胺基酸相關的彼等結構特徵,可達成酶之恰當再摺疊。
本發明之方法可涉及活體外或活體內應用。在活體外應用(包括細胞培養應用)的情況下,可向培養物中之細胞中添加本文所描述之化合物,且隨後培育。本發明之化合物亦可用於使用此項技術中熟知之抗體產生技術來促進單株及/或多株抗體之產生。如熟習此項技術者將顯而易見的,單株及/或多株抗體可隨後用於多種診斷應用。
本發明之化合物的活體內投與手段將視預定應用而變化。以純形式或以適當醫藥組合物形式投與本文所描述之ADIr組合物可藉助於投與用於起相似作用之藥劑的任一已接受之模式來進行。醫藥組合物可藉由將ADIr(例如ADIr-PEG、ADIr-PEG 20)與適當的生理學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑組合來製備,且可調配為固態、半固態、液態或氣態形式之製劑,諸如錠劑、膠囊、散劑、顆粒劑、軟膏、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠、微球體及氣霧劑。另外,其他醫藥學上活性之成分(包括如本文中其他地方所描述之其他抗癌劑)及/或適合之賦形劑(諸如鹽、緩衝劑及穩定劑)可(但不必)存在於組合物內。投藥可藉由多種不同途徑來達成,包括經口、非經腸、經鼻、靜脈內、皮內、皮下或局部。投藥模式視待治療或預防之病狀的性質而定。因此,ADIr-PEG(例如ADIr-PEG 20)可經口、鼻內、腹膜內、非經腸、靜脈內、淋巴內、瘤內、肌肉內、組織間、動脈內、皮下、眼內、滑膜內、經上皮及經皮投與。在投藥之後,減緩、抑制、預防或延遲癌症之進展及/或癌轉移的量視為有效的。在某些實施例中,本文之ADIr組合物使患者中值存活時間增加統計學上顯著之量。在一個實施例中,本文所描述之ADIr治療使患者之中值存活時間增加4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、15週、20週、25週、30週、40週或更長。在某些實施例中,ADIr治療使患者中值存活時間增加1年、2年、3年或更長。在一個實施例中,本文所描述之ADIr治療使無疾病進展之存活期增加2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週或更長。在某些實施例中,本文所描述之ADIr治療使無疾病進展之存活期增加1年、2年、3年或更長。
在某些實施例中,如由活腫瘤量之統計學上之顯著減少(例如腫瘤塊減少至少10%、20%、30%、40%、50%或更多)或由掃描尺寸之改變(例如統計學上顯著減少)所指示,投與量足以導致腫瘤消退。在
某些實施例中,投與量足以導致疾病穩定。在其他實施例中,投與量足以導致熟練臨床醫生已知之特定疾病指示的症狀在臨床上相關減輕。
在某些實施例中,投與量足以抑制NO合成、抑制血管生成,及/或足以誘導腫瘤細胞中之凋亡,或其任何組合。NO合成、血管生成及凋亡可使用此項技術中已知之方法來量測,參見例如Current Protocols in Immunology or Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,N.Y.(2009及目前最新);Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology,第3版,Wiley & Sons,1995;及其他類似參考文獻。在一個特定實施例中,投與量抑制NO合成,且抑制黑色素瘤及補體之生長,加強或協同加強如本文所描述之其他化學療法(諸如順鉑)。相應地,本發明之一個實施例提供一種藉由與順鉑組合投與ADIr-PEG 20來治療黑色素瘤之方法,其中該治療耗盡內源性氧化氮(NO)。
治療之精確劑量及持續時間隨治療中之疾病而變化,且可使用已知測試方案憑經驗確定,或藉由測試在此項技術中已知之模型系統中的組合物且自其推斷來確定。亦可進行受到控制之臨床試驗。劑量亦可隨待減輕之病狀的嚴重性而變化。醫藥組合物一般經調配及投與以在使非所需副作用減至最小的同時發揮治療學上適用之作用。組合物可一次投與,或可分成多個較小劑量以在各時間間隔處投與。對任何特定個體,可根據個人需要隨時間調節具體劑量方案。
ADIr組合物可單獨或與其他已知癌症治療(諸如放射療法、化學療法、移植、免疫療法、激素療法、光動力療法等)組合投與。組合物亦可與抗生素組合投與。
ADIr組合物亦可單獨或與ADI-PEG 20療法組合投與。在某些實施例中,如本文所描述之ADIr用於已用ADI-PEG 20治療且已出現抗
ADI-PEG 20抗體之患者。該等患者不再受益於ADI-PEG 20治療,因為該酶由抗體抵消。因此,在某些實施例中,本發明提供一種治療癌症、改善癌症之症狀、或抑制癌症之進展的方法,其包含向有需要之患者投與治療有效量的包含ADI-PEG 20之組合物,及在一段時間之後向該患者投與包含如本文所描述之ADIr的組合物,藉此治療該癌症、改善該癌症之該等症狀、或抑制該癌症之該進展。
在該方法之一個實施例中,該段時間藉由偵測患者中抗ADI-PEG 20抗體之預定含量來確定,其中該包含ADIr之組合物在偵測該等抗ADI-PEG 20抗體之該預定含量之後投與。在某些實施例中,可確立抗ADI-PEG 20抗體在待用ADI-PEG 20及本發明之ADIr治療的患者中的臨限含量或預定含量。可使用此項技術中已知之方法(例如使用受試者操作特徵(Receiver Operator Characteristic)曲線或「ROC」曲線)來確立抗ADI-PEG 20抗體之「預定臨限含量」(亦稱為「預定含量」或「預定截止值」)或有時稱為預定截止。在一個實施例中,認為甚至極低含量之抗ADI-PEG 20抗體足以保證將治療自ADI-PEG 20轉換為本發明之ADIr-PEG。在某些實施例中,將決定何時終止ADI-PEG 20治療及開始用本發明之ADIr-PEG治療的抗ADI-PEG 20之適當含量可由熟練臨床醫生來確定。
在一些實施例中,該段時間藉由偵測或以其他方式觀測患者中之ADI活性來確定,其中該組合物在偵測或觀測ADI活性之預定程度之後投與。在特定實施例中,組合物在偵測或觀測患者中之ADI活性程度降低之後投與。ADI活性可例如藉由分析生物樣本之至少一個ADI活性指標來直接量測,或例如藉由觀測ADI-PEG 20治療之所需或預定效果來間接量測。在某些實施例中,將決定何時終止ADI-PEG 20治療及開始用本發明之ADIr-PEG治療的ADI活性之適當程度可由熟練臨床醫生來確定。
投與此等及相關醫藥組合物之典型途徑因此包括(但不限於)經口、局部、經皮、吸入、非經腸、舌下、頰內、經直腸、經陰道及鼻內。如本文所用之術語非經腸包括皮下注射、靜脈內、肌肉內、胸骨內注射或輸注技術。
根據本發明某些實施例的醫藥組合物之調配法應使得在向患者投與該組合物後,其中所包含之活性成分可被生物利用。將投與個體或患者之組合物可呈一或多種劑量單位形式,其中舉例而言,錠劑可為單一劑量單位,而本文所描述的氣溶膠形式之ADIr組合物的容器可保存複數個劑量單位。製備該等劑型之實際方法係熟習此項技術者已知或咸了解者;舉例而言,參見Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版(Philadelphia College of Pharmacy and Science,2000)。根據本文中之教示,待投與之組合物在任何情況下均將含有治療有效量的本發明之ADIr-PEG(諸如ADIr-PEG 20),以用於治療所關注之疾病或病狀。在某些實施例中,醫藥或治療組合物為無菌及/或無熱原質。
醫藥組合物可呈固體或液體形式。在一個實施例中,載劑(群)為顆粒狀,使得組合物呈例如錠劑或散劑形式。載劑(群)可為液體,同使得組合物呈例如口服油、注射液或適用於例如吸入投與的氣溶膠。當欲用於經口投藥時,醫藥組合物一般而言為固體或液體形式,其中半固體、半液體、懸浮液及凝膠形式均包括在本文視為固體或液體之形式內。
呈固體組合物用於經口投藥時,醫藥組合物可調配成散劑、顆粒劑、壓縮錠劑、丸劑、膠囊、口嚼錠、粉片或其類似物。該固體組合物典型地含有一或多種惰性稀釋劑或可食性載劑。另外,可存在以下一或多者:黏合劑,諸如羧甲基纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素、黃蓍膠(gum tragacanth)或明膠;賦形劑,諸如澱粉、乳糖或糊
精;崩解劑,諸如海藻酸、海藻酸鈉、澱粉羥基乙酸鈉(primogel)、玉米澱粉及其類似物;潤滑劑,諸如硬脂酸鎂或氫化植物油(Sterotex);滑動劑,諸如膠態二氧化矽;甜味劑,諸如蔗糖或糖精;調味劑,諸如胡椒薄荷、水楊酸甲酯或柑橘調味劑;及著色劑。當醫藥組合物呈膠囊(例如明膠膠囊)形式時,其除以上類型之材料之外還可含有諸如聚乙二醇或油之液體載劑。
醫藥組合物可呈液體形式,例如酏劑、糖漿、溶液、乳液或懸浮液。舉兩個例子而言,液體可用於經口投藥或用於藉由注射遞送。當欲用於經口投藥時,較佳組合物除本發明之化合物之外還含有甜味劑、防腐劑、染料/著色劑及香味增強劑中之一或多者。在意欲藉由注射投與之組合物中,可包括界面活性劑、防腐劑、濕潤劑、分散劑、懸浮劑、緩衝劑、穩定劑及等張劑中之一或多者。
液體醫藥組合物不論其為溶液、懸浮液或其他類似形式,均可包括以下佐劑中之一或多者:無菌稀釋劑,諸如注射用水、鹽水溶液(在某些實施例中,生理鹽水)、林格氏溶液(Ringer's solution)、等張氯化鈉、不揮發性油(諸如可充當溶劑或懸浮介質之合成單或二甘油酯)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶劑;抗細菌劑,諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯;抗氧化劑,諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉;螯合劑,諸如乙二胺四乙酸;緩衝劑,諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽;及用於調節張力之試劑,諸如氯化鈉或右旋糖。非經腸製劑可封裝於由玻璃或塑膠製成的安瓿、拋棄式注射器或多劑量小瓶中。生理鹽水為較佳佐劑。可注射醫藥組合物較佳為無菌的。
欲用於非經腸或經口投藥之液體醫藥組合物應含有一定量如本文所揭示之ADIr(諸如ADIr-PEG 20),使得獲得適合之劑量。典型地,此量為組合物中至少0.01% ADIr。當欲用於經口投藥時,此量可在0.1%與約70%組合物重量之間變化。某些經口醫藥組合物含有介於
約4%與約75%之間的ADIr-PEG。在某些實施例中,製備本發明之醫藥組合物及製劑以使得非經腸劑量單位在稀釋之前含有介於0.01重量%與10重量%之間的ADIr-PEG。
醫藥組合物可欲用於局部投藥,在此情況下載劑可適合地包含溶液、乳液、軟膏或凝膠基質。舉例而言,基質可包含以下各者中之一或多者:石蠟脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蠟、礦物油、稀釋劑(諸如水及醇)及乳化劑及穩定劑。增稠劑可存在於醫藥組合物中以用於局部投藥。若欲用於經皮投藥,則組合物可包括經皮貼片或離子電滲療法(iontophoresis)裝置。醫藥組合物可欲以例如栓劑形式用於經直腸投藥,該栓劑將在直腸中熔化且釋放藥物。用於經直腸投藥之組合物可含有油性基質作為適合之無刺激性賦形劑。該等基質包括(但不限於)羊毛脂、可可脂及聚乙二醇。
醫藥組合物可包括各種材料,該等材料改變固體或液體劑量單位之物理形式。舉例而言,組合物可包括形成圍繞活性成分之包覆殼層之材料。形成包覆殼層之材料典型地為惰性的,且可選自例如糖、蟲膠及其他腸溶包覆劑。可替代地,活性成分可裝入明膠膠囊中。呈固體或液體形式之醫藥組合物可包括結合至ADIr-PEG上且藉此幫助遞送化合物之藥劑。可起此種作用的適合之藥劑包括單株或多株抗體、一或多種蛋白質或一種脂質體。醫藥組合物可基本上由可以氣溶膠形式投與之劑量單位組成。術語氣溶膠用於表示在具有膠態性質之彼等系統至由加壓封裝組成之系統範圍內的多種系統。遞送可藉由液化或壓縮氣體或藉由分配活性成分的適合之泵系統進行。氣溶膠可以單相、雙相或三相系統形式遞送以遞送活性成分。氣溶膠之遞送包括必需容器、活化劑、閥門、子容器及其類似物,其在一起可形成套組。一般熟習此項技術者在不進行過度實驗的情況下即可確定較佳氣溶膠。
醫藥組合物可藉由醫藥技術中熟知之方法來製備。舉例而言,意欲藉由注射投與之醫藥組合物可藉由將包含如本文所描述之ADIr-PEG及視情況選用之鹽、緩衝劑及/或穩定劑中之一或多者的組合物與無菌蒸餾水組合以形成溶液來製備。可添加界面活性劑以促進形成均勻溶液或懸浮液。界面活性劑為與ADIr-PEG組合物非共價相互作用以促進ADIr-PEG在水性遞送系統中之溶解或均勻懸浮的化合物。
組合物可以治療有效量投與,該治療有效量將視包括以下各者之多種因素而變化:所採用之特定化合物(例如ADIr-PEG)的活性;化合物之代謝穩定性及作用持續時間;患者之年齡、體重、一般健康狀況、性別及膳食;投藥模式及時間;排泄速率;藥物組合;特定病症或病狀之嚴重性;及經歷療法之個體。
本發明化合物之一的治療有效量為對抑制腫瘤生長有效之量。一般而言,以較小劑量起始治療,該等劑量可以較小增量增加,直至達成該等情況下之最佳效果。一般而言,本發明之化合物的治療劑量可為一週兩次至約每兩週一次,每次約1至約200mg/kg。舉例而言,該劑量可為呈2ml靜脈內注射形式一週一次約1mg/kg至每3天一次約20mg/kg。在另一個實施例中,該劑量可為約每3天一次、約一週一次、約一週兩次或約每2週一次投與約50IU/m2至約700IU/m2。在某些實施例中,該劑量可為約每3天一次、約一週一次、約一週兩次或約每2週一次投與的約50IU/m2、60IU/m2、70IU/m2、80IU/m2、90IU/m2、100IU/m2、110IU/m2、120IU/m2、130IU/m2、140IU/m2、150IU/m2、160IU/m2、170IU/m2、180IU/m2、190IU/m2、200IU/m2、210IU/m2、220IU/m2、230IU/m2、240IU/m2、250IU/m2、260IU/m2、270IU/m2、280IU/m2、290IU/m2、300IU/m2、310IU/m2、約320IU/m2、約330IU/m2、340IU/m2、約350IU/m2、360IU/m2、370IU/m2、380IU/m2、390IU/m2、400IU/m2、410IU/m2、
420IU/m2、430IU/m2、440IU/m2、450IU/m2、500IU/m2、550IU/m2、600IU/m2、620IU/m2、630IU/m2、640IU/m2、650IU/m2、660IU/m2、670IU/m2、680IU/m2、690IU/m2或約700IU/m2。在某些實施例中,劑量可由熟練臨床醫生按需要改變。
ADIr-SS-PEG5,000之最佳劑量可為約一週兩次,而ADIr-SS-PEG20,000之最佳劑量可為約一週一次至約每兩週一次。在某些實施例中,ADIr-SS-PEG20,000之最佳劑量可為約一週兩次。
ADIr-PEG可在注射之前與磷酸鹽緩衝鹽水溶液或熟習此項技術者已知的任何其他適當之溶液混合。在一個實施例中,包含ADIr-PEG之液體組合物包含在適量注射用水(例如約1ml或約2ml)中的約10至約12mg ADIr、約20至約40mg聚乙二醇、1.27mg +5%磷酸二氫鈉、USP;約3mg +5%磷酸氫二鈉,USP;7.6mg +5%氯化鈉,USP;pH值為約6.6至約7。在一個實施例中,包含ADIr-PEG之液體組合物包含組胺酸-HCl,且在某些實施例中,組合物緩衝劑為約0.0035M組胺酸-HCl至約0.35M組胺酸-HCl。在一個特定實施例中,在包含0.035M組胺酸-HCl(pH 6.8)與0.13M氯化鈉的緩衝劑中調配組合物。在另一個實施例中,在包含0.02M磷酸鈉緩衝劑(pH 6.8)與0.13M氯化鈉的緩衝劑中調配組合物。
在一個實施例中,包含ADIr或ADIr-PEG之組合物的pH值為約5至約9,約6至約8,或約6.5至約7.5。在一些實施例中,包含ADIr之組合物的pH值為約6.8±1.0。
在一個實施例中,包含ADIr-PEG之組合物中的游離PEG介於1%-10%之間,且在另一個實施例中小於總PEG之7%,小於6%,小於5%,小於4%,小於3%,小於2%或小於1%。在某些實施例中,包含ADIr-PEG之組合物中的未經修飾之ADIr小於約1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%或小於0.1%。一般而言,包
含ADIr-PEG之組合物的總雜質小於或等於約4%、3%、2%、1.5%、1%或0.5%。在一個實施例中,內毒素極限滿足陳述於USP中之需求,亦即50EU/mL。
在一個實施例中,包含ADIr或ADIr-PEG之組合物中的游離硫氫基大於約90%。在一些實施例中,包含ADIr或ADIr-PEG之組合物中的游離硫氫基為約91%、約92%、約93%、約94%或約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更大。
在一個實施例中,組合物中之ADIr或ADIr-PEG的Km為約0.1μM或0.5μM至約15μM,且在另一個實施例中為約1μM至約12μM、約1μM至約10μM、約1.5μM至約9μM、約1.5μM至約8μM、或約1.5μM至約7μM。在某些實施例中,組合物中之ADIr或ADIr-PEG的Km為約1.0μM至約10μM、或約1.5μM至約6.5μM。在一些實施例中,組合物中之ADIr或ADIr-PEG的Km為約、至少約或小於約0.1μM、約0.5μM、約1.0μM、約1.5μM、約2μM、約2.5μM、約3μM、約3.5μM、約4μM、約4.5μM、約5μM、約5.5μM、約6μM、約6.5μM、或約7μM、或約8μM、或約9μM、或約10μM。
在一個實施例中,組合物中之ADIr或ADIr-PEG的Kcat為約0.5秒-1至約80秒-1、或約0.5秒-1至約70秒-1、或約0.5秒-1至約60秒-1、或約0.5秒-1至約50秒-1、或約0.5秒-1至約40秒-1、或約0.5秒-1至約30秒-1、或約0.5秒-1至約20秒-1、或約0.5秒-1至約15秒-1,且在另一個實施例中為約0.5秒-1至約80秒-1、或約1秒-1至約80秒-1、或約5秒-1至約80秒-1、或約10秒-1至約80秒-1、或約20秒-1至約80秒-1、或約30秒-1至約80秒-1、或約40秒-1至約80秒-1、或約50秒-1至約80秒-1、或約60秒-1至約80秒-1、或約70秒-1至約80秒-1、或約1秒-1至約12秒-1、約1秒-1至約10秒-1、約1.5秒-1至約9秒-1、約2秒-1至約8秒-1、或約2.5秒-1至約7秒-1。在某些實施例中,組合物中之ADIr或ADIr-PEG的Kcat為約2.5秒-1至約7.5秒-1。
在一些實施例中,組合物中ADIr或ADIr-PEG的Kcat為約2.5秒-1、約3秒-1、約3.5秒-1、約4秒-1、約4.5秒-1、約5秒-1、約5.5秒-1、約6秒-1、約6.5秒-1、約7秒-1、約7.5秒-1或約8秒-1、約10秒-1、約15秒-1、約20秒-1、約25秒-1、約30秒-1、約35秒-1、約40秒-1、約45秒-1、約50秒-1、約55秒-1、約60秒-1、約65秒-1、約70秒-1、約75秒-1、約80秒-1、約85秒-1、約90秒-1、約95秒-1、或約100秒-1。
在一個實施例中,組合物中之ADIr或ADIr-PEG的導電性(在此項技術中亦稱為比導電率)為約5mS/cm至約20mS/cm,且在其他實施例中為約5mS/cm至約15mS/cm、約7mS/cm至約15mS/cm、約9mS/cm至約15mS/cm、或約10mS/cm至約15mS/cm。在一些實施例中,組合物中之ADIr或ADIr-PEG的導電性為約9mS/cm、約10mS/cm、約11mS/cm、約12mS/cm或約13mS/cm、約14mS/cm或約15mS/cm。在某些實施例中,組合物中之ADIr或ADIr-PEG的導電性為約13mS/cm±1.0mS/cm。
在一個實施例中,組合物中之ADIr或ADIr-PEG的重量莫耳滲透濃度為約50mOsm/kg至約500mOsm/kg、約100mOsm/kg至約400mOsm/kg、約150mOsm/kg至約350mOsm/kg、約200mOsm/kg至約350mOsm/kg、或約250mOsm/kg至約350mOsm/kg。在某些實施例中,組合物中之ADIr或ADIr-PEG的重量莫耳滲透濃度為約300±30mOsm/kg。
在一個實施例中,蛋白質濃度為約11.0±1.0mg/mL。在某些實施例中,蛋白質濃度介於約8與約15mg/mL之間。在另一個實施例中,蛋白質濃度為約8、9、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、或15mg/mL。
在一個實施例中,酶比活性介於約5.0與90IU/mg之間或介於約5與55IU/mg之間,其中1IU定義為在一分鐘內於37℃下將1μmol精胺
酸轉化為1μmol瓜胺酸及1μmol氨的酶量,且效能為100±20IU/mL。在另一個實施例中,酶比活性為約5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9.0、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、35、40、45、50、55、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100±2.0IU/mg。在一個特定實施例中,酶比活性為9±2.0IU/mg。
本發明的包含ADIr-PEG之組合物亦可與投與一或多種其他治療劑(包括ADI-PEG 20)同時,在此之前或在此之後進行投與。該組合療法可包括投與含有本發明之一種化合物及一或多種另外之活性劑的單個醫藥劑量調配物,以及以其自身各別醫藥劑量調配物形式投與本發明的包含ADIr-PEG(例如ADIr-PEG 20)之組合物及各活性劑。舉例而言,如本文所描述之ADIr-PEG及其他活性劑可以單個經口劑量組合物形式(諸如錠劑或膠囊)一起向患者投與,或各藥劑以各別經口劑量調配物形式投與。類似地,如本文所描述之ADIr-PEG及其他活性劑可以單個非經腸劑量組合物形式(諸如在鹽水溶液或其他生理學上可接受之溶液中)一起向患者投與,或各藥劑藉由相同或不同途徑(例如一個藉由注射,一個藉由經口)以各別非經腸劑量調配物形式投與。在使用各別劑量調配物的情況下,包含ADIr-PEG及一或多種另外之活性劑的組合物可在基本上相同時間(亦即同時)投與,或在分別錯開之時間(亦即依次且按任何次序)投與;組合療法理解為包括所有此等方案。
因此,在某些實施例中,亦涵蓋與一或多種另外之治療劑組合投與本發明之ADIr組合物。在此項技術中可接受該等治療劑作為用於如本文所描述特定疾病病況(諸如特定癌症或GVHD)的標準治療。所
涵蓋之例示性治療劑包括細胞激素、生長因子、類固醇、NSAID、DMARD、抗發炎劑、化學治療劑、放射線治療劑、自體吞噬抑制劑或其他活性及輔助劑。
在某些實施例中,本文所揭示之ADIr組合物可與多種化學治療劑結合投與。化學治療劑之實例包括烷基化劑,諸如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺(CYTOXANTM);烷基磺酸鹽,諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan);氮丙啶,諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa);乙烯亞胺及甲基三聚氰胺,包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三伸乙基磷醯胺(trietylenephosphoramide)、三伸乙基硫代磷醯胺(triethylenethiophosphoramide)及三甲密胺(trimethylolomelamine);氮芥(nitrogen mustard),諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷醯胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、氮芥氧化物鹽酸鹽、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、膽固醇對苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥(uracil mustard);亞硝基脲(nitrosurea),諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine);抗生素,諸如阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycins)、放線菌素D(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、
6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycins)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎那黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin);抗代謝物,諸如甲胺喋呤(methotrexate)及5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物,諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤(methotrexate)、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤類似物,諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫米嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine);嘧啶類似物,諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、脫氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU;雄激素,諸如卡魯睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內脂(testolactone);抗腎上腺類,諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);葉酸補充劑,諸如亞葉酸(frolinic acid);乙醯葡醛酯(aceglatone);醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside);胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid);安吖啶(amsacrine);貝斯布西(bestrabucil);比生群(bisantrene);艾達曲克(edatraxate);得弗伐胺(defofamine);秋水仙胺(demecolcine);地吖醌(diaziquone);艾福米辛(elformithine);依利醋銨(elliptinium acetate);依託格魯(etoglucid);硝酸鎵;羥基脲
(hydroxyurea);蘑菇多醣(lentinan);氯尼達明(lonidamine);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌達醇(mopidamol);尼曲吖啶(nitracrine);噴司他丁(pentostatin);凡那明(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);鬼臼酸(podophyllinic acid);2-乙基醯肼;丙卡巴肼(procarbazine);PSK.RTM.;雷佐生(razoxane);西佐喃(sizofiran);鍺螺胺(spirogermanium);細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亞胺醌(triaziquone);2,2',2"-三氯三乙胺;尿烷(urethan);長春地辛(vindesine);達卡巴嗪(dacarbazine);甘露氮芥(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛矛醇(mitolactol);哌泊溴烷(pipobroman);加西托星(gacytosine);阿拉伯糖苷(arabinoside)(「Ara-C」);環磷醯胺;噻替派;類紫杉醇(taxoid),例如紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL®,Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)及多烯紫杉醇(TAXOTERE®,Rhne-Poulenc Rorer,Antony,France);苯丁酸氮芥(chlorambucil);吉西他濱(gemcitabine);6-硫代鳥嘌呤(6-thioguanine);巰基嘌呤;甲胺喋呤;鉑類似物,諸如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin);長春鹼(vinblastine);鉑;依託泊苷(etoposide)(VP-16);異環磷醯胺;絲裂黴素C;米托蒽醌(mitoxantrone);長春新鹼(vincristine);長春瑞賓(vinorelbine);溫諾平(navelbine);諾凡特龍(novantrone);替尼泊苷(teniposide);柔紅黴素(daunomycin);胺基喋呤(aminopterin);希羅達(xeloda);伊班膦酸鹽(ibandronate);CPT-11;拓撲異構酶抑制劑RFS 2000;二氟甲基鳥胺酸(difluoromethylomithine,DMFO);視黃酸衍生物,諸如TargretinTM(貝瑟羅汀(bexarotene))、PanretinTM(亞利崔托寧(alitretinoin));ONTAKTM(迪夫托斯地尼介白素(denileukin diftitox));艾斯帕米辛(esperamicin);卡培他濱(capecitabine);及以上任一者的醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。在此定義中亦包括起
調控或抑制激素對腫瘤之作用的作用的抗激素劑,諸如抗雌激素,包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷諾昔酚(raloxifene)、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene,Fareston);及抗雄激素,諸如氟他胺(flutamide)、尼魯胺(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙立德(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)。其他化學治療劑包括索拉非尼(sorafenib)及其他蛋白激酶抑制劑,諸如阿法替尼(afatinib)、阿西替尼(axitinib)、貝伐單抗(bevacizumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、克卓替尼(crizotinib)、達沙替尼(dasatinib)、埃羅替尼(erlotinib)、福他替尼(fostamatinib)、吉非替尼(gefitinib)、伊馬替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、蘭瓦替尼(lenvatinib)、木利替尼(mubritinib)、尼羅替尼(nilotinib)、帕尼單抗(panitumumab)、帕佐泮尼(pazopanib)、哌加他尼(pegaptanib)、蘭比珠單抗(ranibizumab)、魯克索替尼(ruxolitinib)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、凡德他尼(vandetanib)、維羅非尼(vemurafenib)及舒尼替尼(sunitinib);西羅莫司(sirolimus)(雷帕黴素(rapamycin))、依維莫司(everolimus)及其他mTOR抑制劑。亦涵蓋以上任一者的醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物以用於本文中。
在某些實施例中,本文所揭示之ADIr組合物可與多種自體吞噬抑制劑結合投與。在一些較佳實施例中,自體吞噬抑制劑係選自由以下各者組成之群:氯奎寧、3-甲基腺嘌呤、羥氯奎寧(hydroxychloroquine)(Plaquenil.TM.)、巴伐洛黴素A1(bafilomycin A1)、5-胺基-4-咪唑甲醯胺核糖苷(AICAR)、岡田井酸(okadaic acid)、自體吞噬抑制性藻類毒素(其抑制2A型或1型蛋白質磷酸酶)、cAMP類似物、及增加cAMP含量、腺苷、N6-巰基嘌呤核糖苷、渥曼青黴素(wortmannin)及長春鹼之藥物。另外,亦可使用抑制自體吞噬
必需之蛋白質的表現的反義RNA或siRNA,諸如ATG5。
在一個實施例中,ADIr-PEG與一或多種治療劑之組合互補、相加、或協同地起作用。就此而言,本文描述互補或協同性藥劑,其包括能夠與如本文所提供之ADIr-PEG互補或協同地起作用的治療劑(例如化學治療劑、自體吞噬抑制劑、mTOR抑制劑、或用於治療癌症、GVHD或如本文所描述之發炎性腸病的任何其他治療劑),其中該互補或協同作用顯示為可偵測效果之量值比在存在化學治療劑但不存在ADIr-PEG組合物時及/或在存在ADIr-PEG但不存在化學治療劑時可偵測的效果更大(亦即相對於適當控制條件以統計學上顯著之方式)。用於量測協同作用及互補作用的方法為此項技術中已知的(參見例如Cancer Res 2010年1月15日70;440)。
如本文所描述包含ADIr及視情況選用之其他治療劑的組合物可在用於治療癌症之治療方法及用於預防癌症癌轉移之方法中使用。因此,本發明提供用於治療多種不同癌症、改善其症狀、或抑制其進展或對其進行預防的方法。在另一個實施例中,本發明提供用於治療GVHD、改善GVHD之症狀、或抑制GVHD之進展的方法。詳言之,本發明提供用於治療患者中之癌症或GVHD、改善其症狀、或抑制其進展的方法,該等方法包含視情況在用ADI-PEG 20治療之後(尤其在患者出現抗ADI-PEG 20抗體的情況下)向該患者投與治療有效量的如本文所描述之ADIr組合物,藉此治療該癌症或GVHD、改善其症狀、或抑制其進展。因此,本文所描述之ADIr組合物可向罹患發炎性腸病(例如克隆氏病(Crohn's disease);潰瘍性結腸炎)、GVHD或包括但不限於以下各者之癌症的個人投與:肝細胞癌、白血病(例如急性骨髓白血病及復發性急性骨髓白血病)、黑色素瘤(包括轉移性黑色素瘤)、肉瘤(包括(但不限於)轉移性肉瘤、子宮平滑肌肉瘤)、胰臟癌、前列腺癌(諸如(但不限於)激素難治性前列腺癌)、間皮瘤、淋巴性白血
病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、小細胞肺癌、乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胃癌(gastric cancer)(包括(但不限於)胃腺癌)、神經膠質瘤、多形性神經膠質母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、神經母細胞瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎癌(包括(但不限於)腎細胞癌)、膀胱癌、子宮癌、食道癌、腦癌、頭頸癌(包括(但不限於)頭部和頸部之鱗狀細胞癌;舌癌)、子宮頸癌、睾丸癌、膽囊、膽管癌、及胃癌。
在另一個實施例中,本發明提供一種治療患者中之癌症、改善其症狀、或抑制其進展的方法,該方法包含向該患者投與如本文所描述包含ADIr及視情況選用之一或多種其他治療劑的組合物,其中該癌症缺乏ASS、ASL或兩者。就此而言,ASS或ASL缺乏症可為如由mRNA表現或蛋白質表現所量測之表現降低,或可為蛋白質活性之降低,且一般而言包含如由技術人員所測定的統計學上顯著之表現或活性降低。ASS或ASL表現或活性降低可為與已知無癌症之適當對照樣本中的表現或活性相比,表現或活性降低約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或更多。在某些實施例中,ASS或ASL表現或活性與非癌症對照樣本中之表現或活性相比降低至少二分之一。
在某些實施例中,ASS或ASL之表現或活性降低係由ASS或ASL啟動子之甲基化或ASS或ASL啟動子之抑制產生的。在另一個實施例中,ASS或ASL之表現或活性降低係由DNA突變(例如一或多個點突變、小缺失、插入及其類似突變)或導致基因缺失之染色體異常產生的。在一個實施例中,癌症為ASS或ASL陰性的,意謂未觀測到表現或活性。
ASS或ASL表現或活性之降低可使用此項技術中已知之任何方法來量測,諸如(但不限於)定量PCR、免疫組織化學、酶活性分析(例如量測瓜胺酸轉化為精胺基丁二酸鹽之轉化率或精胺基丁二酸鹽轉化為
精胺酸及反丁烯二酸鹽之轉化率的分析)及其方法。
因此,本發明提供用於治療患者中之癌症、改善其症狀、或抑制其進展的方法,該等方法包含向該患者投與包含如本文所描述之ADIr的組合物,其中該癌症展現ASS或ASL或兩者之表現或活性降低,其中該癌症包括(但不限於)肝細胞癌、白血病(例如急性骨髓白血病及復發性急性骨髓白血病)、黑色素瘤(包括轉移性黑色素瘤)、肉瘤(包括(但不限於)轉移性肉瘤、子宮平滑肌肉瘤)、胰臟癌、前列腺癌(諸如(但不限於)激素難治性前列腺癌)、間皮瘤、淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、小細胞肺癌、乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胃癌(gastric cancer)(包括(但不限於)胃腺癌)、神經膠質瘤、多形神經膠質母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、神經母細胞瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎癌(包括(但不限於)腎細胞癌)、膀胱癌、子宮癌、食道癌、腦癌、頭頸癌(包括(但不限於)頭部和頸部之鱗狀細胞癌;舌癌)、子宮頸癌、睾丸癌、膽囊、膽管癌、及胃癌(stomach cancer)。
文獻中之各種研究已顯示在以下腫瘤中缺乏ASS:急性骨髓性白血病(AML)、膀胱腫瘤、乳房腫瘤、結腸直腸腫瘤、胃部(gastric)腫瘤、神經膠質母細胞瘤、HCC、淋巴瘤、黑色素瘤、間皮瘤、非小細胞肺部腫瘤、卵巢腫瘤、胰腺腫瘤、前列腺腫瘤、腎腫瘤、肉瘤及小細胞肺部腫瘤。相應地,本文特定涵蓋單獨或與其他治療(包括首先用ADI-PEG 20治療)組合使用ADIr-PEG來治療此等ASS缺乏性癌症。
本發明進一步提供用於治療患者中之癌症、改善其症狀、或抑制其進展的方法,該等方法包含與自體吞噬抑制劑組合向該患者投與包含如本文所描述之ADIr(例如ADIr-PEG且尤其ADIr-PEG 20)的組合物。在一個實施例中,本發明提供用於治療患者中之癌症的方法,其包含與自體吞噬抑制劑組合向該患者投與治療有效量的包含如本文所描述之ADIr的組合物,其中該癌症為胰臟癌或小細胞肺癌。
在某些實施例中,本發明提供治療之方法,其中投與包含本文所描述之ADIr的組合物使血漿中之精胺酸耗盡至少一個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月或更長。在另一個實施例中,本發明提供治療之方法,其中投與包含本文所描述之ADIr的組合物在在偵測到抗ADI-PEG 20抗體後終止用ADI-PEG 20治療之後使血漿中之精胺酸耗盡至少一個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月或更長。
篩檢及選擇與患者抗ADI-PEG20抗體之交叉反應性較低的ADI酶
此實例描述篩檢及選擇與患者抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性較低的ADI酶。
白大量ADI酶,表1列舉針對相對於人類黴漿菌ADI之序列一致性百分比而選擇的24種ADI酶。根據文獻,人類黴漿菌、精胺酸黴漿菌及關節炎黴漿菌ADI胺基酸序列緊密相關,且此等酶具有良好催化特性。更近一些,已發現具有與此三種酶緊密相關之序列的另外之ADI酶。已識別相關性更遠之黴漿菌ADI酶,儘管關於其所知較少。存在相關性甚至更遠的來自細菌及其他來源之ADI酶。
在公共數據庫中可獲得之若干蛋白質序列可能未必為全長ADI序列。在彼等情況下,公開可獲得之序列在需要形成全長ADI的情況下基於已知ADI序列而擴展。在某些情況下,ADI蛋白質在其他地方修飾(例如C251S取代)。在SEQ ID NO:26-32中提供此等經合成之ADI序列,且對應於以下各者的經擴展及/或修飾之ADI序列:精胺酸黴漿菌(C251S)、關節炎黴漿菌(C251S)、海豹腦黴漿菌、貓黴漿菌、海豹黴漿菌、奧氏嗜熱鹽絲菌及牛分枝桿菌。
來自多種生物之多種ADI酶經表徵以確定預期何種酶將(甚至在存在抗ADI-PEG 20抗體之情況下)在患者血液中移除及維持低精胺酸濃度。表2(以下)列舉所研究的自表1所選擇之ADI酶子集。如下詳
述,來自此等研究之資料顯示,基於序列一致性而與人類黴漿菌緊密相關的來自多個物種之ADI具有足夠良好之酶催化特性,且與抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性降低。
ADI製備. 選殖、表現及純化重組型ADI酶以用於根據如例如以下各者中所描述之標準方案來進行測試:Gallego等人,PLOS One,7(10):e47886,2012;Monstadt及Holldorf,Biochem.J.273:739-745,1990;Joo Noh等人,Molecules and Cells.13:137-143,2002;及Sugimura等人,Infection and Immunity.58:2510-2515,1990。
人類抗ADI-PEG20抗體純化. 自已在臨床研究期間接受ADI-PEG20之患者的血漿樣本中純化抗ADI-PEG20抗體。將來自如藉由ELISA分析所測定針對ADI-PEG20已達到高效價(效價>/=4)的8個不同患者的總共60ml血漿合併。使用兩步純化,蛋白質「A」層析(GE Healthcare),繼而為ADI親和性層析。獲得約20mg經純化之抗體,且在-80℃下以等分試樣形式儲存直至需要。
ADI酶分析. 精胺酸去亞胺酶(ADI)催化L-精胺酸轉化為L-瓜胺酸及氨。可藉由比色端點分析(參見例如Knipp及Vasak,Analytical Biochem.286:257-264,2000)來偵測L-瓜胺酸之量,且與已知量之L-瓜胺酸的標準曲線相比來計算ADI之比活性(表示為IU/mg蛋白質)。1IU酶活性定義為在所測試之pH值及溫度下每分鐘產生1μmol瓜胺酸的酶量。標準分析條件在37℃下於生理HEPES緩衝劑(PHB)(50mM HEPES、160mM NaCl、pH 7.4)(Lang及Zander,Clin Chem Lab Med.37:563-571,1999)加0.1% BSA中進行。所有樣本及標準物在條件允許的情況下一式兩份或一式三份地進行。
Km及Kcat值藉由使用上述活性分析之變型來測定。如同活性分析,所有反應在37℃下於PHB加0.1% BSA中進行。考慮到活性差異,對ADI或ADIr構築體中之每一者調節酶濃度、反應時間及受質濃
度範圍。總體而言,使用2nM酶、5分鐘反應時間及0-160μM精胺酸作為開始條件。當最佳化該等條件時,尤其關注所消耗之受質的量相對於向反應添加之總受質的百分比。偵測下限為1μM瓜胺酸,而定量下限為2μM。瓜胺酸標準曲線涉及每一個培養板,且用於定量由酶促反應產生之瓜胺酸。
亦進行活性分析以評估在存在抗ADI-PEG20之情況下的酶活性(抗體抵消曲線)。如上文所述且在存在800nM、400nM、200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM及0nM抗ADI-PEG20抗體之情況下進行此等分析。
計算. 計算在各反應孔中產生之瓜胺酸濃度(μM),且使用瓜胺酸標準曲線來進行平均。隨後以μM/min/50nM ADI為單位計算各反應之速度。藉由將此值乘以「IU」因子(自ADI之分子量及反應體積來計算IU因子)來計算比活性(IU/毫克或微莫耳產物/分鐘/毫克ADI)。結果概述於下表2中。
此等資料顯示與人類黴漿菌ADI高度同源(約50%-100%一致性)之ADI酶維持極佳催化活性。亦顯示如由在存在抗ADI-PEG 20抗體之情況下的酶活性所量測的,例如相對於人類黴漿菌之親和性,該等酶對患者抗ADI-PEG 20抗體之親和性降低。相應地,此等ADI酶對用於單獨或在ADI-PEG 20治療之後用於治療癌症以延長及/或增加精胺酸耗竭療法之有效性的療法可具有治療效用。
可組合上述各種實施例以提供其他實施例。本說明書中所提及及/或本申請資料表單中所列出之所有美國專利、美國專利申請公開案、美國專利申請案、外國專利、外國專利申請案及非專利出版物均以全文引用之方式併入本文中。實施例之態樣必要時可經修改以採用各種專利、申請及公開案之概念來提供又其他實施例。
可鑒於以上實施方式來對實施例進行此等及其他變化。一般而言,在以下申請專利範圍中,所用術語不應解釋為將申請專利範圍限制於本說明書及申請專利範圍中所揭示之特定實施例,而應解釋為包括所有可能之實施例以及該申請專利範圍有權要求的等效物之全部範疇。相應地,申請專利範圍不受本發明限制。
<110> 開曼群島商普拉瑞斯集團
<120> 用於癌症治療之對ADI-PEG 20抗體交叉反應性降低之精胺酸去亞胺酶
<130> POLA-003/011W
<150> US 61/790,833
<151> 2013-03-15
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 409
<212> PRT
<213> 人類黴漿菌
<400> 1
<210> 2
<211> 392
<212> PRT
<213> 海豹腦黴漿菌
<400> 2
<210> 3
<211> 410
<212> PRT
<213> 精胺酸黴漿菌
<400> 3
<210> 4
<211> 409
<212> PRT
<213> 關節炎黴漿菌
<400> 4
<210> 5
<211> 408
<212> PRT
<213> 口腔黴漿菌
<220>
<221> misc_feature
<222> (201)..(201)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (263)..(263)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (272)..(272)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (294)..(294)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 5
<210> 6
<211> 391
<212> PRT
<213> 貓黴漿菌
<400> 6
<210> 7
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<212> PRT
<213> 海豹黴漿菌
<400> 7
<210> 8
<211> 401
<212> PRT
<213> 鴿嘴黴漿菌
<400> 8
<210> 9
<211> 407
<212> PRT
<213> 愛阿華黴漿菌
<400> 9
<210> 10
<211> 402
<212> PRT
<213> 鱷魚黴漿菌
<400> 10
<210> 11
<211> 430
<212> PRT
<213> 醱酵黴漿菌
<400> 11
<210> 12
<211> 452
<212> PRT
<213> 滲透黴漿菌
<400> 12
<210> 13
<211> 408
<212> PRT
<213> 雞敗血性黴漿菌
<400> 13
<210> 14
<211> 402
<212> PRT
<213> 短吻鱷黴漿菌
<400> 14
<210> 15
<211> 438
<212> PRT
<213> 肺炎黴漿菌
<400> 15
<210> 16
<211> 409
<212> PRT
<213> 快速移動黴漿菌
<400> 16
<210> 17
<211> 411
<212> PRT
<213> 化膿性鏈球菌
<400> 17
<210> 18
<211> 408
<212> PRT
<213> 糞腸球菌
<400> 18
<210> 19
<211> 403
<212> PRT
<213> 山羊黴漿菌
<400> 19
<210> 20
<211> 410
<212> PRT
<213> 奧氏嗜熱鹽絲菌
<400> 20
<210> 21
<211> 411
<212> PRT
<213> 金黃色葡萄球菌
<400> 21
<210> 22
<211> 417
<212> PRT
<213> 變形假單胞菌
<400> 22
<210> 23
<211> 417
<212> PRT
<213> 惡臭假單胞菌
<400> 23
<210> 24
<211> 418
<212> PRT
<213> 繡色假單胞菌
<400> 24
<210> 25
<211> 402
<212> PRT
<213> 牛分枝桿菌
<400> 25
<210> 26
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 添加有側接合成殘基之精胺酸黴漿菌精胺酸去亞胺酶
<400> 26
<210> 27
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 添加有側接合成殘基之關節炎黴漿菌精胺酸去亞胺酶
<400> 27
<210> 28
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 添加有側接合成殘基之海豹腦黴漿菌精胺酸去亞胺酶
<400> 28
<210> 29
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 添加有側接合成殘基之貓黴漿菌精胺酸去亞胺酶
<400> 29
<210> 30
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 添加有側接合成殘基之海豹黴漿菌精胺酸去亞胺酶
<400> 30
<210> 31
<211> 411
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 添加有側接合成殘基之奧氏嗜熱鹽絲菌黴漿菌精胺酸去亞胺酶
<400> 31
<210> 32
<211> 404
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 添加有側接合成殘基之牛分枝桿菌精胺酸去亞胺酶
<400> 32
Claims (68)
- 一種治療組合物,其包含經分離之精胺酸去亞胺酶或其具有ADI活性之片段、及醫藥學上可接受之載劑,其中該經分離之精胺酸去亞胺酶與患者抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性已降低。
- 如請求項1之治療組合物,其中該經分離之精胺酸去亞胺酶不來自人類黴漿菌(M.hominis)。
- 如請求項2之治療組合物,其中該經分離之精胺酸去亞胺酶係來自表1中所列之生物體。
- 如請求項1之治療組合物,其中該經分離之精胺酸去亞胺酶的一或多種特性與ADI-PEG 20之彼等特性類似或比其更好。
- 如請求項4之治療組合物,其中該一或多種特性為Kcat、Km、最佳pH值、穩定性、活體內蛋白質水解穩定性、或不需要未存在於血液中之離子或輔因子、或其任何組合。
- 如請求項1之治療組合物,其中該經分離之精胺酸去亞胺酶與人類黴漿菌精胺酸去亞胺酶相比具有至少20個表面殘基變化。
- 如請求項1之治療組合物,其中該經分離之精胺酸去亞胺酶與人類黴漿菌精胺酸去亞胺酶相比具有介於20至135個之間的表面殘基變化。
- 如請求項1之治療組合物,其中該經分離之精胺酸去亞胺酶與人類黴漿菌精胺酸去亞胺酶相比具有介於40至100個之間的表面殘基變化。
- 如請求項1之治療組合物,其中該經分離之精胺酸去亞胺酶與人類黴漿菌精胺酸去亞胺酶相比具有介於30至60個之間的表面殘基變化。
- 如請求項1之治療組合物,其中該經分離之精胺酸去亞胺酶與人 類黴漿菌精胺酸去亞胺酶相比具有介於80至100個之間的表面殘基變化。
- 如請求項1之治療組合物,其中該經分離之精胺酸去亞胺酶與人類黴漿菌精胺酸去亞胺酶相比具有介於100至120個之間的表面殘基變化。
- 如請求項1之治療組合物,其中該經分離之精胺酸去亞胺酶係來自精胺酸黴漿菌(M.arginini)、關節炎黴漿菌(M.arthritidis)、海豹腦黴漿菌(M.phocicerebrale)、貓黴漿菌(M.gateae)、海豹黴漿菌(M.phocidae)、鴿嘴黴漿菌(M.columbinum)、愛阿華黴漿菌(M.iowae)、鱷魚黴漿菌(M.crocodyli)、短吻鱷黴漿菌(M.alligatoris)、奧氏嗜熱鹽絲菌(H.orenii)或牛分枝桿菌(M.bovis)。
- 如請求項1之治療組合物,其中該經分離之精胺酸去亞胺酶包含闡述於SEQ ID NO:2至32中任一者的胺基酸序列。
- 如前述請求項中任一項之治療組合物,其中該經分離之精胺酸去亞胺酶已經修飾以移除至少一個聚乙二醇化位點。
- 如前述請求項中任一項之治療組合物,其中至少一個離胺酸殘基已經過胺基酸取代修飾。
- 如請求項15之治療組合物,其中至少5個離胺酸殘基已經過胺基酸取代修飾。
- 如請求項15之治療組合物,其中至少10個離胺酸殘基已經過胺基酸取代修飾。
- 如請求項15之治療組合物,其中至少15個離胺酸殘基已經過胺基酸取代修飾。
- 如請求項15之治療組合物,其中至少20個離胺酸殘基已經過胺基酸取代修飾。
- 如前述請求項中任一項之治療組合物,其中該精胺酸去亞胺酶藉助於連接子共價結合至PEG分子上。
- 如請求項20之治療組合物,其中該精胺酸去亞胺酶共價結合至超過一個PEG分子上。
- 如請求項20之治療組合物,其中該精胺酸去亞胺酶共價結合至約1至約10個PEG分子上。
- 如請求項20之治療組合物,其中該精胺酸去亞胺酶共價結合至約2至約8個PEG分子上。
- 如請求項20之治療組合物,其中該等PEG分子為直鏈或分支鏈PEG分子。
- 如請求項20之治療組合物,其中該PEG之總重量平均分子量為約1,000至約40,000。
- 如請求項20之治療組合物,其中該PEG之總重量平均分子量為約10,000至約30,000。
- 如請求項20的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中該連接子為丁二醯基、醯胺基、醯亞胺基、胺基甲酸根、酯基、環氧基、羧基、羥基、碳水化合物、酪胺酸基、半胱胺酸基、組胺酸基、亞甲基、或其任何組合。
- 如請求項27之治療組合物,其中該丁二醯基之來源為丁二酸丁二醯亞胺酯。
- 一種經分離之精胺酸去亞胺酶,或其具有ADI活性之片段,其中該經分離之精胺酸去亞胺酶與患者抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性已降低。
- 如請求項29的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中該經分離之精胺酸去亞胺酶不來自人類黴漿菌。
- 如請求項30的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中該經分離之精胺 酸去亞胺酶係來自表1中所列之生物體。
- 如請求項29的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中該經分離之精胺酸去亞胺酶的一或多種特性與ADI-PEG 20之彼等特性類似或比其更好。
- 如請求項32的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中該一或多種特性為Kcat、Km、最佳pH值、穩定性、活體內蛋白質水解穩定性、或不需要未存在於血液中之離子或輔因子、或其任何組合。
- 如請求項29的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中該經分離之精胺酸去亞胺酶與人類黴漿菌精胺酸去亞胺酶相比具有至少20個表面殘基變化。
- 如請求項29的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中該經分離之精胺酸去亞胺酶與人類黴漿菌精胺酸去亞胺酶相比具有介於20至135個之間的表面殘基變化。
- 如請求項29的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中該經分離之精胺酸去亞胺酶與人類黴漿菌精胺酸去亞胺酶相比具有介於40至100個之間的表面殘基變化。
- 如請求項29的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中該經分離之精胺酸去亞胺酶與人類黴漿菌精胺酸去亞胺酶相比具有介於30至60個之間的表面殘基變化。
- 如請求項29的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中該經分離之精胺酸去亞胺酶與人類黴漿菌精胺酸去亞胺酶相比具有介於80至100個之間的表面殘基變化。
- 如請求項29的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中該經分離之精胺酸去亞胺酶與人類黴漿菌精胺酸去亞胺酶相比具有介於100至120個之間的表面殘基變化。
- 如請求項29的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中該經分離之精胺 酸去亞胺酶係來自精胺酸黴漿菌、關節炎黴漿菌、海豹腦黴漿菌、貓黴漿菌、海豹黴漿菌、鴿嘴黴漿菌、愛阿華黴漿菌、鱷魚黴漿菌、短吻鱷黴漿菌、奧氏嗜熱鹽絲菌或牛分枝桿菌。
- 如請求項29的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中該經分離之精胺酸去亞胺酶包含闡述於SEQ ID NO:2至32中任一者的胺基酸序列。
- 如前述請求項中任一項的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中該經分離之精胺酸去亞胺酶已經過修飾以移除至少一個聚乙二醇化位點。
- 如前述請求項中任一項的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中至少一個離胺酸殘基已經過胺基酸取代修飾。
- 如請求項43的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中至少5個離胺酸殘基已經過胺基酸取代修飾。
- 如請求項15的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中至少10個離胺酸殘基已經過胺基酸取代修飾。
- 如請求項15的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中至少15個離胺酸殘基已經過胺基酸取代修飾。
- 如請求項15的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中至少20個離胺酸殘基已經過胺基酸取代修飾。
- 如前述請求項中任一項的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中該精胺酸去亞胺酶藉助於連接子共價結合至PEG分子上。
- 如請求項20的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中該精胺酸去亞胺酶共價結合至超過一個PEG分子上。
- 如請求項20的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中該精胺酸去亞胺酶共價結合至約1至約10個PEG分子上。
- 如請求項20的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中該精胺酸去亞胺 酶共價結合至約2至約8個PEG分子上。
- 如請求項20的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中該等PEG分子為直鏈或分支鏈PEG分子。
- 如請求項20的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中該PEG之總重量平均分子量為約1,000至約40,000。
- 如請求項20的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中該PEG之總重量平均分子量為約10,000至約30,000。
- 如請求項20的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中該連接子為丁二醯基、醯胺基、醯亞胺基、胺基甲酸根、酯基、環氧基、羧基、羥基、碳水化合物、酪胺酸基、半胱胺酸基、組胺酸基、亞甲基、或其任何組合。
- 如請求項27的經分離之精胺酸去亞胺酶,其中該丁二醯基之來源為丁二酸丁二醯亞胺酯。
- 一種聚核苷酸,其編碼如前述請求項中任一項的經分離之精胺酸去亞胺酶。
- 一種載體,其包含如請求項57之聚核苷酸。
- 一種經分離之宿主細胞,其包含如請求項58之載體。
- 如前述請求項中任一項之治療組合物,其進一步包含化學治療劑。
- 如請求項60之治療組合物,其中該化學治療劑係選自由以下各者組成之群:多烯紫杉醇(docetaxel)、卡鉑(carboplatin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、吉西他濱(gemcitabine)、順鉑(cisplatin)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)及依維莫司(everolimus)。
- 一種治療癌症、改善癌症之症狀、或抑制癌症之進展的方法,其包括向有此需要之患者投與治療有效量的如前述請求項中任 一項之治療組合物,藉此治療該癌症、改善該癌症之該等症狀、或抑制該癌症之該進展。
- 如請求項62之方法,其中該有此需要之患者已確定具有抗ADI-PEG 20抗體。
- 如請求項62或63之方法,其中該癌症係選自由以下各者組成之群:肝細胞癌、黑色素瘤、轉移性黑色素瘤、胰臟癌、前列腺癌、小細胞肺癌、間皮瘤、淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、肝腫瘤、肉瘤、白血病、急性骨髓白血病、復發性急性骨髓白血病、乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胃癌(gastric cancer)、神經膠質瘤、多形性神經膠質母細胞瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、腦癌、頭頸癌、子宮頸癌、睾丸癌及胃癌(stomach cancer)。
- 一種治療癌症、改善癌症之症狀、或抑制癌症之進展的方法,其包括向有此需要之患者投與治療有效量的包含ADI-PEG 20之組合物,及在一段時間之後向該患者投與如前述請求項中任一項之治療組合物,藉此治療該癌症、改善該癌症之該等症狀、或抑制該癌症之該進展。
- 如請求項65之方法,其中該段時間係藉由偵測該患者中抗ADI-PEG 20抗體之預定含量來決定,其中該治療組合物在偵測該等抗ADI-PEG 20抗體之該預定含量之後投與。
- 如請求項65之方法,其中該段時間藉由偵測該患者中之ADI活性來決定,其中該治療組合物在偵測ADI活性之預定或降低程度之後投與。
- 一種如前述請求項中任一項之經分離之精胺酸去亞胺酶的用途,其用於製造用以治療癌症、改善癌症之症狀、或抑制癌症之進展的藥劑。
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