TW201533243A - 評估拉帕替尼於肝癌療效的方法與ＨＢｘ及／或ＥｒｂＢ３基因表現程度作爲分子指標之用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種評估拉帕替尼於肝癌療效之方法，係包含：由肝癌患者取得一肝癌檢體；於體外測定一分子指標於該肝癌檢體之表現程度；對照正常檢體中該分子指標之表現程度；依據該分子指標於該肝癌檢體之表現程度，作為預測拉帕替尼於肝癌療效之判斷依據；其中，該分子指標係為HBx基因及/或ErbB3基因。

Description

評估拉帕替尼於肝癌療效的方法與 HBx 及/或 ErbB3 基因表現程度作為分 子指標之用途
本發明係關於一種評估拉帕替尼於肝癌療效的方法，特別是一種利用HBx基因表現程度及/或ErbB3基因表現程度作為分子指標，以評估拉帕替尼於肝癌患者之療效的方法，本發明另關於以該HBx基因表現程度及/或該ErbB3基因表現程度作為分子指標之用途。
肝癌是一種常見的惡性腫瘤，被認為與B型肝炎、肝硬化、酗酒或黃麴毒素等因子相關；其中，許多肝癌患者係由B型肝炎惡化而來。B型肝炎病毒係具有HBx基因(係如SEQ ID NO：1所示)，會在患者體內表現HBx蛋白質(其胺基酸序列係如SEQ ID NO：2所示)，並且該HBx蛋白質在B型肝炎惡化為肝癌的致癌機制中扮演非常重要的角色。
一般而言，肝癌若於早期發現(如腫瘤小於5公分)，能夠以手術切除，而具有良好預後；然而肝癌早期並無明顯症狀，故許多患者被發現罹患肝癌時，多已惡化為致死率相當高的肝癌後期。肝癌的分子機制複雜，即使目前有用以治療肝癌之習知肝癌治療藥物(如蕾莎瓦，sorafenib)，但很多肝癌病人對習知肝癌治療藥物具有抗藥性，故其對肝癌的治療效果並不好；因此，開發新的肝癌治療標靶藥物實屬必要。
拉帕替尼(lapatinib)是一種習知乳癌治療藥物，其為一種小分子抑制劑，廣泛使用於乳癌患者，惟，拉帕替尼是否能夠適用於其他 癌症之治療仍屬未知。
在拉帕替尼於肝癌的適用性之臨床試驗中，發現拉帕替尼對部份肝癌病患並無療效，但是拉帕替尼對一特定族群卻具有療效，至於該特定族群之特性仍待進一步研究。據此，若能找出一分子指標，以定義該特定族群，使拉帕替尼能適用於肝癌治療，並提供一方法以篩檢出對拉帕替尼具有敏感性的肝癌患者，將可以提供肝癌治療一個新的方向。
本發明之主要目的，係提供一種評估拉帕替尼於肝癌療效之方法，藉由偵測肝癌檢體之分子指標的表現程度，以選擇適用拉帕替尼治療的肝癌族群者。
本發明之再一目的，係提供一種以HBx基因表現程度及/或ErbB3基因表現程度作為分子指標之用途，係以HBx基因表現程度及/或ErbB3基因表現程度作為分子指標，以篩檢適用對拉帕替尼具有敏感性的肝癌病患者。
為達到前述發明目的，本發明所運用之技術手段及藉由該技術手段所能達到之功效包含有：一種評估拉帕替尼於肝癌療效之方法，係包含：由肝癌患者取得一肝癌檢體；於體外測定一分子指標於該肝癌檢體之表現程度；對照正常檢體中該分子指標之表現程度；依據該分子指標於該肝癌檢體之表現程度，作為預測拉帕替尼於肝癌療效之判斷依據；其中，該分子指標係為HBx基因或ErbB3基因。
本發明之評估拉帕替尼於肝癌療效之方法，其中，較佳係以即時聚合酶連鎖反應法偵測該肝癌檢體之分子指標表現程度。
一種以HBx基因表現程度作為分子指標之用途，其中，HBx基因表現程度係用以預測拉帕替尼於肝癌之療效，其中，該HBx基因表現 程度係指該HBx基因之mRNA表現程度或蛋白質表現程度。
一種以ErbB3基因表現程度作為分子指標之用途，其中，ErbB3基因表現程度係用以預測拉帕替尼於肝癌之療效，其中，該ErbB3基因表現程度係指該ErbB3基因之mRNA表現程度或蛋白質表現程度。
本發明之評估拉帕替尼於肝癌療效之方法，係於體外檢測肝癌檢體中之HBx基因表現程度及/或ErbB3基因表現程度，藉由其與正常檢體之差異，以評估拉帕替尼於肝癌患者之療效，醫者可以針對合適族群之肝癌患者投以拉帕替尼，以提升拉帕替尼於肝癌之治療效果，為本發明之功效。
本發明之以HBx基因表現程度及/或ErbB3基因表現程度作為分子指標之用途，係藉由偵測肝癌檢體中之HBx基因表現程度及/或ErbB3基因表現程度，以評估選擇適用拉帕替尼治療的肝癌族群，進而達到提升拉帕替尼治療肝癌療效之功效。
第1a圖：以西方墨點法偵測Hep3B及Hep3Bx細胞株之HBx蛋白質表現程度。
第1b圖：投予不同濃度拉帕替尼後，Hep3B及Hep3Bx細胞株的存活度折線圖。
第2圖：投予不同濃度拉帕替尼後，Hep3B及Hep3Bx細胞株之sub-G1期波峰面積佔所有波峰面積總和的百分比量化柱狀圖。
第3圖：投予不同濃度拉帕替尼後，以西方墨點法偵測Hep3B及Hep3Bx細胞株之細胞凋亡訊號表現程度。
第4a圖：以西方墨點法偵測轉殖myc-HBx表現質體與否的Hep3B細胞株，其HBx蛋白質表現程度。
第4b圖：投予不同濃度拉帕替尼後，表現HBx蛋白質與否的Hep3B細胞株的存活度折線圖。
第4c圖：轉殖myc-HBx表現質體與空質體的Hep3B細胞株之結晶紫染色結果。
第5a圖：以西方墨點法偵測感染pDEST-V5-HBx病毒載體與pDEST-V5空載體的Hep3B細胞株，其HBx蛋白質表現程度。
第5b圖：投予拉帕替尼後，感染pDEST-V5-HBx病毒載體與pDEST-V5空載體的Hep3B細胞株的存活度柱狀圖。
第6a圖：分別轉殖空質體、野生型及突變型的B型肝炎病毒全基因體質體之Hep3B細胞株，續以西方墨點法偵測HBx蛋白質表現程度。
第6b圖：分別轉殖空質體、野生型及突變型的B型肝炎病毒全基因體質體之HepG2細胞株，續以西方墨點法偵測HBx蛋白質表現程度。
第6c圖：分別轉殖空質體、野生型及突變型的B型肝炎病毒全基因體質體之Hep3B及HepG2細胞株，續經結晶紫染色結果。
第7圖：Hep3B、Hep3Bx、HepG2及HepG2x細胞株以西方墨點法偵測細胞中表皮生長因子受體酪胺酸酶家族蛋白質(包含表皮生長因子受體、ErbB2、ErbB3及ErbB4)之表現程度與其磷酸化程度。
第8圖：以反轉錄-即時聚合酶連鎖反應法檢測Hep3B及Hep3Bx細胞株之表皮生長因子受體酪胺酸酶家族蛋白質之相對mRNA表現程度量化柱狀圖。
第9a圖：以不同劑量之myc-HBx表現質體轉殖至Hep3B細胞株，續以西方墨點法偵測HBx蛋白質表現程度與ErbB3蛋白質表現程度之間的關係。
第9b圖：以反轉錄-聚合酶連鎖反應法檢測感染不同劑量pDEST-V5-HBx病毒載體之Hep3B及HepG2細胞株之ErbB3之mRNA 表現程度。
第9c圖：以西方墨點法偵測感染不同劑量pDEST-V5-HBx病毒載體之Hep3B細胞株之HBx蛋白質與ErbB3之蛋白質表現程度結果。
第9d圖：以西方墨點法偵測轉殖空質體、野生型及突變型的B型肝炎病毒全基因體質體之Hep3B細胞株，其HBx蛋白質表現程度與ErbB3之蛋白質表現程度。
第9e圖：以siRNA默化HBx mRNA之表現後，觀察ErbB3蛋白質表現程度。
第10圖：以即時聚合酶連鎖反應法檢測肝癌檢體之ErbB3 mRNA表現程度。
第11a圖：以西方墨點法偵測轉殖pDsRed-ErbB3表現質體之Hep3B細胞株，其ErbB3蛋白質之表現程度。
第11b圖：投予拉帕替尼後，轉殖pDsRed-ErbB3表現載體與否的Hep3B細胞株之顯微鏡觀察結果。
第11c圖：投予拉帕替尼後，轉殖pDsRed-ErbB3表現質體與否的Hep3B細胞株之螢光顯微鏡觀察結果。
第11d圖：投予拉帕替尼後，轉殖pDsRed-ErbB3表現質體與否的Hep3B細胞株之細胞存活度量化柱狀圖。
第12a圖：投予控制組及ErbB3 siRNA之Hep3Bx細胞株之ErbB3蛋白質表現程度。
第12b圖：投予控制組及ErbB3 siRNA之Hep3Bx細胞株之結晶紫染色結果。
為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下： 本發明之評估拉帕替尼於肝癌療效之方法，係包含：由肝癌患者取得一肝癌檢體；於體外測定一分子指標於該肝癌檢體之表現程度；對照正常檢體中該分子指標之表現程度；依據該分子指標於該肝癌檢體之表現程度，作為預測拉帕替尼於肝癌療效之判斷依據；其中，該分子指標係為HBx基因或ErbB3基因。
詳而言之，上述肝癌檢體係來自肝癌患者的肝臟癌化組織，較佳係可以利用經皮穿刺生檢(pacutaneous biopsy)、經頸動脈生檢(transjugulan biopsy)及腹腔鏡檢查(laparoscopic biopsy)等方式，取得肝臟癌化組織，以進行後續檢驗；又或者，該肝癌檢體亦可以透過外科手術方式，自肝癌患者之體內取得，此為本領域具有通常知識者之慣常手段，在此不再贅述。
上述取出之肝癌檢體，係可以於體外檢測HBx基因及/或ErbB3基因之表現程度，該表現程度係指該HBx基因及/或該ErbB3基因之mRNA表現程度或蛋白質表現程度：例如，可以利用對HBx蛋白質及/或ErbB3蛋白質具有專一性之抗體進行組織切片染色，又或者，可以自該肝癌檢體中萃取總蛋白質，再利用對該HBx蛋白質及/或該ErbB3蛋白質具有專一性之抗體進行西分墨點法或ELISA，進而可以得知該HBx蛋白質及/或該ErbB3蛋白質於該肝癌檢體之表現程度；此外，更可以萃取該肝癌檢體之總RNA，以北方墨點法，利用對特定mRNA具有專一性之探針偵測HBx mRNA及/或ErbB3 mRNA表現程度，或是將總RNA反轉錄為cDNA後，再以基因表現晶片或即時聚合酶連鎖反應偵測該HBx mRNA及/或該ErbB3 mRNA的表現程度，上述均為本領域具有通常知識者所廣泛應用之技術手段，在此不多行贅述。
再者，比較HBx基因及/或ErbB3基因，於肝癌檢體及正常檢體之表現程度差異，係可以供預測拉帕替尼於肝癌患者之療效：例如， 肝癌檢體中若具有人體不應表現之HBx基因的基因表現時，該肝癌患者係適用於投予拉帕替尼，此時，拉帕替尼於該肝癌患者之肝癌細胞係具有較佳毒殺效果；又或者，相較於正常檢體，肝癌檢體中具有較高之ErbB3的基因表現程度時，該肝癌患者亦適用於拉帕替尼之投藥，意即，此時拉帕替尼對於該肝癌患者具有較佳之治療效果。
據此，藉由上述方法，肝癌患者係可以依照其肝癌檢體之HBx基因及/或ErbB3基因之表現程度高低，區分為適用投予拉帕替尼之患者，及不適用投予拉帕替尼之患者，醫者則可以挑選合適患者投予拉帕替尼作為抗肝癌藥物，因而可以提升拉帕替尼於肝癌患者之治癒率。
為驗證HBx基因及ErbB3基因之表現程度可以作為分子指標，以預測肝癌對拉帕替尼的敏感性，接著進行實驗以進行確認。
以下實驗中之肝癌細胞，係為Hep3B、Hep3Bx、HepG2及HepG2x等細胞株，其中，該Hep3Bx及該HepG2x細胞株為分別由該Hep3B或該HepG2細胞株衍生而來，係為可以穩定表現HBx蛋白質的細胞株；該等細胞株培養皆培養於37℃之控溫培養箱中，使用之培養液為DME/F12加上10%胎牛血清(FBS)；不同濃度的拉帕替尼則配製於二甲基亞碸(DMSO)溶液中。
(A)Hep3B及Hep3Bx細胞株之細胞存活度實驗
首先請參照第1a圖所示，為確認HBx蛋白質於Hep3B及Hep3Bx細胞株中之表現，分別將5×106個該Hep3B及該Hep3Bx細胞株溶解於0.2mL之RIPA緩衝液中得到該細胞溶解液，並以抗HBx蛋白質抗體(1：1000，購自Abcam)進行HBx蛋白質表現之偵測，另以抗tubulin抗體(1：10000，購自Sigma)作為內部控制組。經由西方墨點法驗證，該Hep3Bx細胞株的確表現大量該HBx蛋白質，而該Hep3B細胞株中之該HBx蛋白質則不表現。
接著，係將Hep3B及Hep3Bx細胞株以細胞存活度檢測法(MTT cell viability assay)，檢測兩種細胞株對不同濃度(0、0.1、0.5、1、5、10μM)的拉帕替尼之敏感性。首先，於96孔盤分別植入該Hep3B及該Hep3Bx細胞株(細胞數量為每孔中5000~10000個細胞)，於37℃培養24小時使細胞貼盤後，投予不同濃度拉帕替尼，續於37℃培養72小時後，於每孔0.1mL之培養液中加入0.025mL MTT溶液(濃度為0.001mg MTT溶於1mL之1×PBS中)，並繼續於37℃培養4小時後，吸去上清液，加入0.1mL DMSO溶解MTT結晶，續以波長570nm測量各孔之訊號。一般而言，細胞粒線體中之琥珀酸去氫酶能將MTT還原為紫色結晶，因此當紫色MTT結晶越多，訊號就越強，表示存活細胞越多，據此觀察該Hep3B及該Hep3Bx細胞株之存活度。
請參照第1b圖所示，投予不同濃度拉帕替尼後肝癌細胞株的存活度結果。未表現HBx蛋白質的Hep3B細胞株至施予5μM拉帕替尼時，存活度才開始下降；然而有表現該HBx蛋白質的Hep3Bx細胞株對拉帕替尼的敏感度明顯增加，在施予0.1μM拉帕替尼時，存活度就開始顯著下降，表示該Hep3Bx細胞株對拉帕替尼敏感，拉帕替尼可在該Hep3Bx細胞株中產生明顯的毒殺效果。
(B)Hep3B及Hep3Bx細胞株之細胞週期實驗
為探討施予拉帕替尼後，Hep3B及Hep3Bx細胞株的細胞週期狀態，接著以流式細胞儀進行觀察。將該Hep3B及該Hep3Bx細胞株分別培養在3.5cm培養盤中，待細胞長至5~6分滿時，加入3mL新鮮培養液，並加入不同濃度之拉帕替尼(0、0.03、0.1、0.3、1、3μM)，繼續於37℃中培養120小時。接著，將該Hep3B及該Hep3Bx細胞株分別懸浮於3mL 75%酒精中(濃度為1.5×105細胞/mL)，置於-20℃固定至少2小時，之後離心移除上清液，並加入0.5mL的PI緩衝液置於37℃反應30分鐘， 並分別以流式細胞儀偵測細胞週期。本實驗係觀察細胞週期中之sub-G1期波峰，當sub-G1期波峰越高，表示細胞凋亡(apoptosis)現象越明顯。
請參照第2圖所示，為投予不同濃度拉帕替尼後，Hep3B及Hep3Bx肝癌細胞株中sub-G1期之波峰面積佔所有波峰面積總和的百分比量化柱狀圖。投予不同濃度的拉帕替尼並不會驅使Hep3B細胞株停留於sub-G1期，然而，表現HBx蛋白質之該Hep3Bx細胞株中，隨著投予越高濃度的拉帕替尼，就有越多的Hep3Bx細胞株停留於sub-G1期；此結果表示拉帕替尼會誘發該Hep3Bx細胞株進行細胞凋亡。
(C)以西方墨點法偵測Hep3B及Hep3Bx細胞株之細胞凋亡訊號實驗
為確認拉帕替尼會促進Hep3B及Hep3Bx細胞株之細胞凋亡，續將該Hep3B及該Hep3Bx細胞株培養於3.5cm培養盤上，待培養至5~6成滿時，於3mL新鮮培養液中外加不同濃度拉帕替尼(0、0.03、0.1、0.3、1μM)，繼續培養120小時後，依前述方法分別得到細胞溶解液，並以抗PARP抗體(1：1000，購自Cell Signaling)及抗Caspase3(1：1000，購自Cell Signaling)進行分析，另以抗actin抗體(1：10000，購自Sigma)作為內部控制組。
請參照第3圖所示，係以西方墨點法偵測Hep3B細胞株及Hep3Bx細胞株中之細胞凋亡訊號，即活化態之PARP蛋白質(cleaved PARP蛋白質)與活化態之Caspase3蛋白質(cleaved Caspase3蛋白質)的表現程度。投予不同濃度的拉帕替尼並不會造成該Hep3B細胞株中之cleaved PARP蛋白質與cleaved Caspase3蛋白質表現程度增加，然而，表現HBx蛋白質之該Hep3Bx細胞株中，隨著投予越高濃度的拉帕替尼，該Hep3Bx細胞株中就有越高的cleaved PARP蛋白質與cleaved Caspase3蛋白質表現程度，表示細胞凋亡的現象增加。此結果再次證實拉帕替尼會誘發該 Hep3Bx細胞株進行細胞凋亡。
為進一步驗證改變肝癌細胞中之HBx蛋白質表現程度後，是否會影響肝癌細胞對拉帕替尼之敏感性，接著將HBx基因以短暫性轉殖或病毒感染的方式，迫使Hep3B細胞株表現該HBx蛋白質，以觀察其對拉帕替尼的敏感性。
(D)以短暫性轉殖HBx之Hep3B細胞株進行細胞存活度實驗
本實驗係以具有如SEQ ID NOs：5及6所示序列之引子對構築C端帶有myc標記之myc-HBx表現質體(空質體為pcDNA6/myc-His A載體，購自Invitrogen，以表現myc-HBx之質體)作為實驗組，並以空質體作為對照組。以1：1之比例混合欲轉染之質體DNA及TransIT2020轉染試劑(DNA之微克數：轉染試劑之微升數)，並加入於無血清新鮮培養液中，於室溫反應30分鐘後，將該myc-HBx表現質體與空質體轉殖進入Hep3B細胞株。
請參照第4a圖所示，為確認myc-HBx表現質體確實表現於Hep3B細胞株，依前述方法分別得到細胞溶解液，並以抗myc抗體(1：5000，購自Sigma)偵測各組細胞溶解液之myc-HBx表現程度，並以抗tubulin抗體(1：10000，購自Sigma)作為內部控制組。本實驗結果顯示，該HBx蛋白質僅表現於轉殖該myc-HBx表現質體的該Hep3B細胞株中，轉殖空質體的該Hep3B細胞株則不表現該HBx蛋白質。
請參照第4b圖所示，係為施予不同濃度拉帕替尼(0、0.5、1、5、10、20μM)後，轉殖myc-HBx表現質體與空質體的Hep3B細胞株的存活度結果。本實驗方法係同上述。在本實驗中，轉殖空質體的Hep3B細胞株至施予5μM拉帕替尼時，存活度才開始顯著下降；然而轉殖該myc-HBx表現質體的該Hep3B細胞株，對拉帕替尼的敏感度明顯增加，在 施予1μM拉帕替尼時，存活度就開始顯著下降。
接著，將1μg之myc-HBx表現質體與空質體分別以轉染試劑轉殖至培養於6孔盤中之Hep3B細胞株中(細胞數量為1×105)。進行轉殖5小時後，更換2mL的新鮮培養液，並添加最終濃度為1μM拉帕替尼作為實驗組，並以DMSO作為對照組，於37℃中繼續培養120小時後，吸去上清液，加入濃度為10mg/mL之結晶紫30%酒精溶液(crystal violet)，固定染色15~30分鐘後，對染色之貼盤活細胞進行觀察。其中，結晶紫係一種將細胞核染色的染料，可藉由結晶紫對細胞核染色後，觀察貼盤的活細胞比例。
請參照第4c圖所示，為轉殖myc-HBx表現質體與空質體的Hep3B細胞株經結晶紫染色的結果。在施予DMSO的對照組中，不論是轉殖該myc-HBx表現質體與空質體的Hep3B細胞株，都有明顯的結晶紫染色現象，表示施予DMSO不造成該Hep3B細胞株的毒殺作用；然而，在施予拉帕替尼的實驗組中，雖然轉殖空質體的該Hep3B細胞株發生輕微的毒殺現象，但轉殖該myc-HBx表現質體的該Hep3B細胞株幾乎全被殺死。此結果表示轉殖該myc-HBx表現質體的該Hep3B細胞株對拉帕替尼的敏感性明顯增加，因而產生明顯的毒殺效果。
(E)以HBx病毒感染之Hep3B細胞株進行細胞存活度實驗
除了以短暫性轉殖的方式改變Hep3B細胞株表現HBx蛋白質的特性，本實驗另以病毒感染的方式，探討該HBx蛋白質表現與否對拉帕替尼毒殺Hep3B細胞株的影響。
本實驗另以如SEQ ID NOs：7及8所示之引子對進行pDEST-V5-HBx質體之構築；並於3.5cm培養皿中種植2×105顆Hep3B細胞株，隔天以100病毒感染劑量(MOI)之病毒液進行感染，續於16小時 後置換新鮮培養液，並於4天後進行後續實驗。
為確認pDEST-V5-HBx病毒載體確實表現於Hep3B細胞株，請參照第5a圖所示，係為以西方墨點法偵測感染該pDEST-V5-HBx病毒載體與空病毒載體的Hep3B細胞株中HBx蛋白質表現程度。實驗結果顯示該HBx蛋白質僅表現於感染該pDEST-V5-HBx病毒載體的該Hep3B細胞株中，感染該空病毒載體的該Hep3B細胞株則不表現該HBx蛋白質。
接著請參照第5b圖所示，係為投予濃度為1μM之拉帕替尼後，感染pDEST-V5-HBx病毒載體與空病毒載體的Hep3B細胞株的存活度結果。本實驗方法係同上述。在施予DMSO的對照組中，不論是感染該pDEST-V5-HBx病毒載體與該空病毒載體的Hep3B細胞株，都有明顯的結晶紫染色現象，表示施予DMSO不造成該Hep3B細胞株的毒殺作用；然而，在施予拉帕替尼的實驗組中，感染該空病毒質體的該Hep3B細胞株仍無細胞毒殺現象，但感染該pDEST-V5-HBx病毒載體的該Hep3B細胞株存活度僅剩約六成。此結果表示感染該pDEST-V5-HBx病毒載體的該Hep3B細胞株對拉帕替尼的敏感性明顯增加，而造成明顯的毒殺效果。
綜合上述結果，原本未表現HBx蛋白質的Hep3B細胞株，在經由質體之短暫性轉殖或是病毒感染之方式而被迫表現該HBx蛋白質後，皆可以改變該Hep3B細胞株中的分子機制，使表現該HBx蛋白質的該Hep3B細胞株對拉帕替尼敏感，而使拉帕替尼對表現該HBx蛋白質的該Hep3B細胞株產生明顯的毒殺效果。
(F)以B型肝炎病毒全基因體質體轉殖之Hep3B及HepG2細胞株進行細胞存活度實驗
由於除了HBx蛋白質之外，B型肝炎病毒還能表現如表面蛋白質等其他蛋白質，故為了確認單就該HBx蛋白質之表現即足以決定Hep3B細胞株對拉帕替尼的敏感性，接著以空質體(不含B型肝炎病毒全 基因體的質體)、野生型(具有HBx基因)及突變型(僅剔除該HBx基因)的B型肝炎病毒全基因體質體來進行實驗(上述空質體、野生型及突變型B型肝炎病毒全基因體質體係取自JOURNAL OF VIROLOGY,May 2005,vol.79.No.9,p.5548-5556)。本實驗係利用短暫性轉殖方式，迫使Hep3B及HepG2細胞株皆分別表現該空質體及野生型與突變型的該B型肝炎病毒全基因體質體。轉殖方法係同上述。
請一併參照第6a及第6b圖所示，分別為Hep3B及HepG2細胞株各自轉殖空質體、野生型及突變型的B型肝炎病毒全基因體質體後，以西方墨點法偵測HBx蛋白質表現結果。在轉殖該空質體及突變型該B型肝炎病毒全基因體質體後，該Hep3B細胞株(第6a圖)及該HepG2細胞株(第6b圖)中皆不表現該HBx蛋白質；但在轉殖野生型該B型肝炎病毒全基因體質體後，該Hep3B細胞株明顯表現該HBx蛋白質，而該HepG2細胞株表現之該HBx蛋白質較微量。
接著，將Hep3B及HepG2細胞株係分別施予DMSO與1μM拉帕替尼120小時，質體轉殖至細胞的方法及結晶紫染色方法係同上述。
請參照第6c圖所示，係為Hep3B及HepG2細胞株分別轉殖空質體、野生型及突變型的B型肝炎病毒全基因體質體後，施予拉帕替尼之結晶紫染色的結果。在該Hep3B細胞株的實驗中，轉殖該空質體及突變型該B型肝炎病毒全基因體質體後，施予拉帕替尼皆未發生明顯的細胞毒殺作用；但在轉殖野生型該B型肝炎病毒全基因體質體後，施予拉帕替尼會對該Hep3B細胞株產生明顯的細胞毒殺作用。在該HepG2細胞株的實驗中，轉殖該空質體及突變型該B型肝炎病毒全基因體質體後，施予拉帕替尼已發生輕微細胞毒殺作用，推測是因為該HepG2細胞株對拉帕替尼較為敏感；而在轉殖野生型該B型肝炎病毒全基因體質體後，即使僅表現微量的該HBx蛋白質(請對照第6b圖)，相較於轉殖該空質體及突變型該B 型肝炎病毒全基因體質體後之該HepG2細胞株，拉帕替尼對該HepG2細胞株產生更明顯的細胞毒殺作用。
綜合上述實驗，驗證HBx蛋白質的表現是預測肝癌細胞對拉帕替尼的敏感性的一指標分子，並且，即使肝癌細胞中之該HBx蛋白質僅微量表現，亦較未表現該HBx蛋白質的肝癌細胞對拉帕替尼更具敏感性。
在乳癌細胞中，拉帕替尼已知為一種抑制表皮生長因子受體酪胺酸酶家族蛋白質活性的小分子抑制劑，但在肝癌中的作用機轉尚未明朗；接著，進一步探討HBx蛋白質造成肝癌細胞對拉帕替尼具敏感性的機制。
(G)HBx蛋白質對表皮生長因子受體酪胺酸酶家族蛋白質之表現程度與磷酸化實驗
本實驗使用Hep3B及HepG2細胞株作為對照組，並將能穩定表現HBx蛋白質的該Hep3B及該HepG2細胞株(即為Hep3Bx及HepG2x細胞株)作為實驗組，分別以西方墨點法偵測細胞中表皮生長因子受體酪胺酸酶家族蛋白質(包含表皮生長因子受體、ErbB2、ErbB3及ErbB4蛋白質)之表現程度與磷酸化程度；其中，磷酸化程度越高，表示蛋白質的作用活性越高；其中，本實驗使用之一級抗體包含抗表皮生長因子受體(EGFR)抗體(1：1000，購自Santa Cruz)、抗磷酸化表皮生長因子受體(pEGFR)抗體(1：1000，購自Cell signaling)、抗ErbB2抗體(1：1000，購自Santa Cruz)、抗磷酸化ErbB2抗體(1：1000，購自Cell signaling)、抗ErbB3抗體(1：1000，購自Santa Cruz)、抗磷酸化ErbB3抗體(1：1000，購自Cell signaling)、抗ErbB4抗體(1：1000，購自Santa Cruz)及抗磷酸化ErbB4抗體(1：1000，購自Cell signaling)，另以抗actin抗體(1：10000，購自Sigma)作為內部控制組。
請參照第7圖所示，在西方墨點法的結果中，Hep3Bx及 HepG2x細胞株中之ErbB2蛋白質及ErbB3蛋白質表現程度及其磷酸化程度(pErbB2及pErbB3蛋白質)皆高於未表現HBx蛋白質的Hep3B及HepG2細胞株；其中，又以該ErbB3蛋白質之表現程度及其磷酸化程度增加最為明顯。此結果表示，當該Hep3B及該HepG2細胞株表現該HBx蛋白質時(即該Hep3Bx及該HepG2x細胞株)，亦伴隨著該ErbB2蛋白質及該ErbB3蛋白質之表現。
(H)HBx蛋白質對ErbB3 mRNA表現程度之影響
ErbB3為表皮生長因子受體酪胺酸酶家族蛋白質之一員，其基因序列係如SEQ ID NO：3所示，且其胺基酸序列係如SEQ ID NO：4所示。
本實驗係取1μg之核醣核酸及1μL之oligo(dT)18引子(50μM)混合於總體積為12μL之無核酸酶高純度水，於65℃反應5分鐘後，置於冰上，再加入4μL之5倍反應緩衝液、20單位之核醣核酸酶抑制劑(Rnase inhibitor)、2μL之核苷酸混合液(10mM)及200單位之反轉錄酶(RevertAidTM H Minus M-MuLV)至最後反應總體積為20μL，於45℃反應60分鐘後，於70℃反應5分鐘來終止反轉錄反應，接著取0.2μL之反轉錄產物及1μL之引子混合物(10μM)混合於即時聚合酶連鎖反應緩衝液並於測定儀(Illumina EcoTM)中，以95℃反應10分鐘後，再於95℃反應15秒、60℃反應1分鐘作為一循環，共進行45~60次循環，即完成反應。
請參照第8圖所示，為Hep3B及Hep3Bx細胞株中，表皮生長因子受體酪胺酸酶家族蛋白質之相對核糖核酸(mRNA)表現程度量化結果，其中，係以actin的表現程度作為各數值之分母。實驗結果證實，在該Hep3Bx細胞株中ErbB3蛋白質表現程度增加主要是因為ErbB3之mRNA的表現程度增加。接著，以表皮生長因子受體酪胺酸酶家族中的 ErbB3蛋白質為研究主題，探討該ErbB3蛋白質與HBx蛋白質之間的關係。
(I)HBx蛋白質對ErbB3蛋白質表現程度之影響
首先，將myc-HBx表現質體以不同劑量(0、1、3及5μg)轉殖至Hep3B細胞株中，以西方墨點法偵測HBx蛋白質表現程度與ErbB3蛋白質表現程度之間的關係。其中，表現質體與轉殖方式係同上述。請參照第9a圖所示，當該Hep3B細胞株中該HBx蛋白質的表現程度越高，該ErbB3蛋白質表現程度也隨之增加。
接著，另使用pDEST-V5-HBx病毒載體以不同MOI(Multiplicity of infection，即為病毒感染劑量，分別為MOI 0、50及100)分別感染Hep3B及HepG2細胞株，並以反轉錄-即時聚合酶連鎖反應法觀察ErbB3之mRNA表現程度；其中，病毒載體、感染方式與反轉錄-聚合酶連鎖反應法係同上述。請參照第9b圖所示，當該Hep3B及該HepG2細胞株被越多該pDEST-V5-HBx病毒載體感染，細胞中ErbB3之mRNA表現程度也隨之增加。
請參照第9c圖所示，以西方墨點法偵測Hep3B細胞株被不同MOI(0、50及100)之pDEST-V5-HBx病毒載體感染後，HBx蛋白質與ErbB3蛋白質之表現程度。實驗結果發現當該Hep3B細胞株被越多該pDEST-V5-HBx病毒載體感染，會造成細胞中該HBx蛋白質表現程度增加，該ErbB3蛋白質表現程度也隨之增加。
請參照第9d圖所示，以西方墨點法偵測Hep3B細胞株轉殖空質體、野生型及突變型的B型肝炎病毒全基因體質體後，HBx蛋白質與ErbB3蛋白質之表現。實驗結果顯示，在表現該HBx蛋白質之轉殖野生型該B型肝炎病毒全基因體質體的該Hep3B細胞株中，同時亦表現該ErbB3蛋白質；不表現該HBx蛋白質之轉殖該空質體或突變型該B型肝炎病毒全基因體質體的該Hep3B細胞株中，同時亦不表現該ErbB3蛋白質。
續以能默化HBx基因表現之HBx小片段干擾核糖核酸(siRNA)作為實驗組(其序列係如SEQ ID NO：9所示)，並以序列如SEQ ID NO：10所示之siRNA作為對照組(購自Sigma)，使其作用於能持續表現該HBx蛋白質之Hep3Bx細胞株，觀察ErbB3與該HBx蛋白質之間的關係。
首先將5μL之siRNA(20μM)及1μL之轉染試劑混合於100μL之無血清培養液中反應30分鐘備用；將6~8成滿之Hep3Bx細胞株(培養於3.5cm培養皿)之培養液吸取後丟棄，並以1倍磷酸緩衝液(1×PBS)潤洗一次，將前述包含siRNA及轉染試劑之混合物以無血清培養液補充至最後細胞反應體積為1mL，並加入前述Hep3Bx細胞株中，置於培養箱反應5小時，續補充血清至最後總體積為2mL之10%含血清培養液，於4天後進行後續實驗。
請參照第9e圖所示，當Hep3Bx細胞株中使用HBx siRNA以抑制該HBx之mRNA，會導致該Hep3Bx細胞株中原本穩定表現的該HBx蛋白質表現減少甚至消失，並且伴隨ErbB3蛋白質的表現一併減少或消失。
綜合上述實驗，證明HBx蛋白質與ErbB3蛋白質的表現程度在肝癌細胞中為正相關，並且，單就該HBx蛋白質之表現即能夠增加該ErbB3蛋白質的表現。
(J)肝癌檢體中ErbB3核醣核酸表現實驗
本實驗收集肝癌患者的檢體，並將之區分為非B型肝癌病毒相關之肝癌檢體(對照組)及B型肝癌病毒相關之肝癌檢體(實驗組)，抽取上述肝癌檢體之總RNA後，將總RNA分別反轉錄成為cDNA，再以即時聚合酶連鎖反應法分別偵測檢體中ErbB3 mRNA之表現程度。
請參照第10圖所示，相對於對照組，ErbB3 mRNA的表現 程度在實驗組中相對較高，並且於統計上與對照組具有顯著差異。由於B型肝癌病毒會表現HBx蛋白質，並於本實驗中證實B型肝癌病毒相關之肝癌檢體中同時亦有顯著較高之該ErbB3 mRNA，顯示於肝癌之臨床檢體上，該HBx蛋白質之表現確實會改變肝癌細胞的代謝途徑，使該ErbB3 mRNA表現程度相對增加。
接著，更進一步探討當ErbB3 mRNA表現程度增加，是否增加拉帕替尼對表現HBx蛋白質之肝癌細胞的毒殺作用。
(K)以短暫性轉殖ErbB3之Hep3B細胞株進行細胞觀察實驗
本實驗中，首先將Hep3B細胞株分別轉殖pDsRed空質體與pDsRed-ErbB3表現質體(係以具有如SEQ ID NOs：11及12所示序列之引子對進行構築)，並以西方墨點法偵測ErbB3蛋白質之表現。其中，轉殖方法係同上述。請參照第11a圖所示，轉殖該pDsRed空質體之該Hep3B細胞株並不表現該ErbB3蛋白質表現，而轉殖該pDsRed-ErbB3表現質體之該Hep3B細胞株則有表現該ErbB3蛋白質。
接著，請參照第11b圖所示，為投予拉帕替尼後，表現ErbB3蛋白質與否的肝癌細胞之顯微鏡觀察結果。在施予DMSO 120小時後，轉殖pDsRed空質體與pDsRed-ErbB3表現質體的Hep3B細胞株皆無發現毒殺作用，然而，在施予1μM的拉帕替尼120小時後，相較於轉殖pDsRed空質體的細胞，轉殖該pDsRed-ErbB3表現質體的該Hep3B細胞株明顯減少，表示發生顯著的細胞毒殺作用。
續參照第11c圖所示，由於pDsRed質體係可以發出紅色訊號，係以螢光顯微鏡於波長535nm激發光下，觀察短暫性轉殖pDsRed空質體及pDsRed-ErbB3表現質體之Hep3B細胞株，於處理DMSO或1μM的拉帕替尼120小時後的細胞狀況，其結果顯示，在施予DMSO 120小時 後，轉殖該pDsRed空質體與該pDsRed-ErbB3表現質體的Hep3B細胞株皆無發現毒殺作用，然而，在施予1μM的拉帕替尼120小時後，相較於轉殖該pDsRed空質體的細胞，轉殖該pDsRed-ErbB3表現質體的該Hep3B細胞株明顯減少，表示發生顯著的細胞毒殺作用。
續以第11c圖的細胞觀察結果予以量化，計算出投予拉帕替尼後，轉殖pDsRed-ErbB3表現質體與pDsRed空質體的肝癌細胞存活度結果；其中，各以施予DMSO之轉殖pDsRed-ErbB3表現質體及pDsRed空質體的肝癌細胞存活度數值作為分母，計算出細胞存活度的百分比。請參照第11d圖所示，在施予DMSO 120小時後，轉殖該pDsRed空質體與該pDsRed-ErbB3表現質體的Hep3B細胞株之細胞存活度皆為100%，然而，在施予1μM的拉帕替尼120小時後，轉殖該pDsRed-ErbB3表現質體的該Hep3B細胞株存活度僅剩下不到20%，表示表現ErbB3蛋白質的該Hep3B細胞株，對拉帕替尼的敏感性會顯著增加，而造成明顯的細胞毒殺作用。
(L)施予ErbB3 siRNA之Hep3Bx細胞株進行細胞觀察實驗
本實驗能默化ErbB3基因表現之ErbB3 siRNA作為實驗組(其係具有如SEQ ID NO：13所示之序列)，並以具有如SEQ ID NO：10所示序列之siRNA作為對照組(購自Sigma)，使其作用於能持續表現HBx蛋白質之Hep3Bx細胞株，觀察ErbB3蛋白質與該HBx蛋白質之間的關係。siRNA之實驗方法係同上述。
請參照第12a圖所示，Hep3Bx細胞株中ErbB3 siRNA會抑制ErbB3之mRNA，而導致該Hep3Bx細胞株中原本會表現的ErbB3蛋白質減少甚至消失。
請參照第12b圖所示，係為以siRNA默化ErbB3 mRNA及蛋白質之表現後，Hep3Bx細胞株經結晶紫染色的結果。在施予1μM的拉 帕替尼120小時後，相較於對照組，加入ErbB3 siRNA的Hep3B細胞株幾乎完全死亡，表示抑制該Hep3Bx細胞株中該ErbB3蛋白質的表現，會使拉帕替尼對該Hep3Bx細胞株產生明顯的毒殺效果。
綜合上述，本發明之評估拉帕替尼於肝癌療效之方法，係於體外檢測肝癌檢體中之HBx基因表現程度及/或ErbB3基因表現程度，藉由其與正常檢體之差異，以評估拉帕替尼於肝癌患者之療效，醫者可以針對合適族群之肝癌患者投以拉帕替尼，以提升拉帕替尼於肝癌之治療效果，為本發明之功效。
再者，本發明之以HBx基因表現程度及/或ErbB3基因表現程度作為分子指標之用途，係藉由偵測肝癌檢體中之HBx基因表現程度及/或ErbB3基因表現程度，以評估選擇適用拉帕替尼治療的肝癌族群，進而達到提升拉帕替尼治療肝癌療效之功效。
雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
<110> 義守大學
<120> 評估拉帕替尼於肝癌療效的方法與HBx及/或ErbB3基因表現程度作為分子指標之用途
<130> PK13346
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 462
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 154
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 4026
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
<210> 4
<211> 1342
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用以構築myc-HBx之正向引子
<400> 5
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用以構築myc-HBx之反向引子
<400> 6
<210> 7
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用以構築pDEST-V5-HBx之正向引子
<400> 7
<210> 8
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用以構築pDEST-V5-HBx之反向引子
<400> 8
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用以默化HBx基因表現之HBx小片段干擾核糖核酸
<400> 9
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 控制組小片段干擾核糖核酸
<400> 10
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用以構築pDSRed-ErbB3之正向引子
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 用以構築pDSRed-ErbB3之反向引子
<400> 12
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用以默化ErbB3基因表現之ErbB3小片段干擾核糖核酸
<400> 13

Claims (6)

  1. 一種評估拉帕替尼於肝癌療效之方法，係包含：由肝癌患者取得一肝癌檢體；於體外測定一分子指標於該肝癌檢體之表現程度；對照正常檢體中該分子指標之表現程度；依據該分子指標於該肝癌檢體之表現程度，作為預測拉帕替尼於肝癌療效之判斷依據；其中，該分子指標係為HBx基因或ErbB3基因。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之評估拉帕替尼於肝癌療效之方法，其中，係以即時聚合酶連鎖反應法偵測該肝癌檢體之分子指標表現程度。
  3. 一種以HBx基因表現程度作為分子指標之用途，其中，HBx基因表現程度係用以預測拉帕替尼於肝癌之療效。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之以HBx基因表現程度作為分子指標之用途，其中，HBx基因表現程度係指該HBx基因之mRNA表現程度或蛋白質表現程度。
  5. 一種以ErbB3基因表現程度作為分子指標之用途，其中，ErbB3基因表現程度係用以預測拉帕替尼於肝癌之療效。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之以ErbB3基因表現程度作為分子指標之用途，其中，ErbB3基因表現程度係指該ErbB3基因之mRNA表現程度或蛋白質表現程度。
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