TW201533057A - 具有經修改藥理活性輪廓之改質血糖調控蛋白及其製備 - Google Patents

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Marcus Hermann Korn
Gerhard Seipke
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Paul Habermann
Ronald Schmidt
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Sanofi Sa
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本發明係關於具有經改良活性輪廓之改質胰島素類似物及血糖調控蛋白，製備此等分子之方法，其醫藥調配物，以及其等於治療上之用途。進一步，本發明係關於用於抑制血清中蛋白酶降解及/或增加蛋白質之血清穩定性之方法。

Description

具有經修改藥理活性輪廓之改質血糖調控蛋白及其製備
本發明係關於具有經改良活性輪廓之改質胰島素類似物及血糖調控蛋白，製備此等分子之方法，其醫藥調配物，以及其等於治療上之用途。進一步，本發明係關於用於抑制血清中蛋白酶降解及/或增加蛋白質之血清穩定性之方法。
胰島素缺乏症，如糖尿病為嚴重的疾病，罹患之病患很多遍及全球。糖尿病有兩種主要的類型，類分為I型及II型。
I型之特徴在於內分泌胰島素分泌不足。II型之特徴在於胰島素抗性，亦即，該細胞無法適當地使用胰島素。
該兩種類型係依靠血糖調控蛋白來治療。I型糖尿病之療法係取代胰島素，例如藉由胰島素或胰島素類似物。於II型糖尿病時，有幾種可能的療法可用，其等之中係用GLP-1激動劑來治療，例如利西拉肽(lixisenatide)，一種艾塞那肽(exendin)類似物。雖然II型基本上不是由身體無法產生胰島素所引起，於某些情況中，特別於更後期之情況中，胰島素療法亦適用於II型糖尿病。
有效的胰島素療法係使用具有貯存效應，所謂的基礎胰島素之胰島素調配物。此等調配物容許基本胰島素濃度長時間於體內伴隨著生理有利於病患。
該重組體胰島素類似物甘精胰島素為具有甘胺酸於胺基酸位置A21及精胺酸位置B31及B32(序列代號：11及12)之人類胰島素，其 特徴在於達到基本效應只需於24小時內給藥一次。「每日一次」給藥係以較低或不長期影響胰島素缺乏症來改善病患之生活品質與生理，且增加該病患的壽命。
然而，仍然存在的問題是，血糖調控蛋白，例如胰島素類似物有限的血清穩定性。所期望的是藉由提高其等之血清穩定性來改良此等化合物之藥效。
本發明係提供改質胰島素類似物及其他血糖調控蛋白，如GLP-1(受體)激動劑來解決這個問題。相較於未改質蛋白質，本發明之化合物係藉血清蛋白酶於血清中降低其等之代謝作用而展現提高血清穩定性且改善活性輪廓。進一步，本發明之分子顯示降低血糖過低症之風險，因為可避免降低血糖中之高峰動力。
改質血糖調控蛋白之較佳實例為胰島素、胰島素類似物，如甘精胰島素(序列代號：11及12)及A0(精胺酸)-甘精胰島素(序列代號：13及14)、GLP-1激動劑，特別艾塞那肽，例如，艾塞那肽-4(序列代號：4)，利拉魯肽(liraglutide)(序列代號：10)或利西拉肽(序列代號：3)；GLP-1受體激動劑，特別GLP-1(序列代號：7)，GLP-1(7-36)(序列代號：8)，GLP-2(序列代號：9)，歐新脫莫杜林(oxyntomodulin)(序列代號：5)，或葡萄朊(序列代號：6)。
於一個方面中，本發明係提供改質胰島素類似物或式I之鹽 其中，(a)A0為不存在或精胺酸，(b)(A1-A5)為於人類A鏈(序列代號：1)位置A1至A5中之胺基酸殘基， (e)(A8-A10)為於人類A鏈(序列代號：1)位置A8至A10中之胺基酸殘基，(d)(A12-A19)為於人類A鏈(序列代號：1)位置A12至A19中之胺基酸殘基，(e)A21為門冬醯胺或甘胺酸，(f)B1為苯丙胺酸(Phe)或組胺酸，(g)B3為門冬醯胺或組胺酸，(h)B2及(B4-B6)為於人類B鏈(序列代號：2)位置B2及B4至B6中之胺基酸殘基，(i)(B8-B18)為於人類B鏈(序列代號：2)位置B8至B18中之胺基酸殘基，(j)(B20-B27)為於人類B鏈(序列代號：2)位置B20至B27中之胺基酸殘基，(k)B28為脯胺酸或賴胺酸，(l)B29為賴胺酸或不存在，(m)B30為蘇胺酸或不存在，(n)B31為不存在，精胺酸或鹼性D-胺基酸，特別為D-精胺酸、D-組胺酸、D-賴胺酸、D-羥頼胺酸(Hyl)、D-鳥胺酸或D-瓜胺酸，(o)B32為鹼性D-胺基酸，特別為D-精胺酸，但附帶條件是若B31為精胺酸，則A21為甘胺酸，或若B31為不存在，則A0為精胺酸；且附帶條件為若B28為賴胺酸且B29、B30及B31為不存在，則A0為精胺酸。
「類似物」一詞，例如，如本文中所使用之胰島素類似物係指例如人類(序列代號：1及2)天然存在之胰島素的類似物，其係以另一個胺基酸於A及/或B鏈中取代至少一種天然存在之胺基酸，及/或分別於天然存在胰島素之A及/或B鏈中添加/刪除至少一種胺基酸，而不同於天然存在之胰島素。胰島素類似物之實例為甘精胰島素(A21(甘胺酸)、B31(精胺酸)及B32(精胺酸)-胰島素；序列代號：11及12)或A0(精胺酸)-甘精胰島素 (A0(精胺酸)、A21(甘胺酸)、B31(精胺酸)及B32(精胺酸)-胰島素；序列代號：13及14)。
本文中所用之字母A及B係指胰島素之A鏈(序列代號：1)或胰島素之B鏈(序列代號：2)。該字母之後的數字，例如A，係指A鏈中之胺基酸位置任意與位於該胺基酸位置之各個胺基酸一起於括號內。例如，A0(精胺酸)係定義，該胺基酸精胺酸位於胰島素A鏈之位置0上。該術語中顯示於該胺基酸位置前面之字母等同於上述命名慣例，例如0A-精胺酸等於A0(精胺酸)。
尤其本文中所用之「二」一詞係指受影響之二種胺基酸。例如，(31-32)B-二-D-精胺酸意指胺基酸位置B31及B32二者攜帶D-精胺酸。
尤其本文中所用之「des」一詞係指胺基酸位置被刪除。例如，(30-32)B-des-蘇胺酸-甘精胰島素意指該胺基酸位置B30、B31，及B32於給定之分子中被刪除，例如甘精胰島素。
於本文中以其等之一個字母編碼，三個字母編碼或全名來說明之胺基酸為L-胺基酸。
該(改質)胰島素類似物A鏈之胺基酸序列位置A0如該說明書中所定義者，係對應至序列表之對應胺基酸序列中之胺基酸位置1，例如，於序列代號：14、序列代號：20、序列代號：22、序列代號：24、序列代號：26中。此外，相較於原生胰島素B鏈序列(序列代號：1)，於某些胰島素類似物胺基酸序列中如說明書中所定義者，一種或多種胺基酸係於B鏈中被刪除。於該序列表中，那些B鏈胺基酸序列係以連續的序列呈現，亦即，無間隙。因此，該C-端胺基酸B29-B32之胺基酸位置可接受序列表中所列舉之胺基酸序列中之其他胺基酸位置。例如，於式I胰島素類似物之B鏈中具有B28為脯胺酸，B29為賴胺酸，B30為蘇胺酸，及B31為不存在，且B32為D-精胺酸，該B32之位置(例如D-精胺酸)相當於序列表中對應序列中之胺基酸位置B31(序列代號：23)。
如本文中所用之「改質」一詞係指蛋白質或類似物其係對應未改質蛋白質或類似物之非對映體。
根據本發明，所提供之改質胰島素類似物係於胰島素B鏈之C-端包含一種或二種鹼性D-胺基酸。「鹼性胺基酸」一詞係指具有鹼性 側鏈之胺基酸，例如側鏈包含胺基或胍基。胺基酸之鹼性D-類似物的實例為朊性胺基酸，如D-精胺酸、D-賴胺酸、D-組胺酸，或D-羥頼胺酸(羥基-頼胺酸)或非朊性胺基酸之D-類似物，如D-鳥胺酸或D-瓜胺酸。
本發明之較佳胰島素類似物為改質胰島素類似物或本文中所說明之式I鹽，其中，B30為蘇胺酸。
本發明之較佳胰島素類似物為改質胰島素類似物或本文中所說明之式I鹽，其中，A21為甘胺酸。
本發明之較佳胰島素類似物為改質胰島素類似物或本文中所說明之式I鹽，其中，A0為不存在。
本發明之較佳胰島素類似物為改質胰島素類似物或本文中所說明之式I鹽，其中，B31為D-精胺酸，B32為D-精胺酸或B31及B32為D-精胺酸。
本發明之較佳胰島素類似物為改質胰島素類似物或本文中所說明之式I鹽，其中，B29為賴胺酸。
本發明之較佳胰島素類似物為改質胰島素類似物或本文中所說明之式I鹽，其中，B28為脯胺酸。
本發明之較佳胰島素類似物為改質胰島素類似物或本文中所說明之式I鹽，其中，A0為精胺酸。
本發明之較佳胰島素類似物為改質胰島素類似物或本文中所說明之式I鹽，其中，B28為賴胺酸。
本發明之較佳胰島素類似物為改質胰島素類似物或本文中所說明之式I鹽，其中，B29為不存在。
本發明之較佳胰島素類似物為改質胰島素類似物或本文中所說明之式I鹽，其中，A21為門冬醯胺。
本發明之較佳胰島素類似物為改質胰島素類似物或本文中所說明之式I鹽，其中，B31為L-精胺酸。
本發明之較佳改質胰島素類似物為改質胰島素類似物或本文中所說明之式I鹽，其中，B31為不存在。
本發明之較佳改質胰島素類似物為改質胰島素類似物或本文中所說明之式I鹽，其中，B30為不存在。
特別佳之改質胰島素類似物為改質胰島素類似物或本文中 所說明之式I鹽，其中，A0為不存在，A21為甘胺酸，B28為脯胺酸，B29為賴胺酸，B30為蘇胺酸，B31為精胺酸，且B32為D-精胺酸(序列代號：15及16)，A0為不存在，A21為甘胺酸，B28為脯胺酸，B29為賴胺酸，B30為蘇胺酸，B31為D-精胺酸，及B32為D-精胺酸(序列代號：17及18)，A0為精胺酸，A21為甘胺酸，B28為脯胺酸，B29為賴胺酸，B30為蘇胺酸，B31為精胺酸，及B32為D-精胺酸(序列代號：19及20)，A0為精胺酸，A21為甘胺酸，B28為脯胺酸，B29為賴胺酸，B30為蘇胺酸，B31為D-精胺酸，及B32為D-精胺酸(序列代號：21及22)，A0為精胺酸，A21為門冬醯胺，B28為脯胺酸，B29為賴胺酸，B30為蘇胺酸，及B31為不存在，及B32為D-精胺酸(序列代號：23及24)，A0為精胺酸，A21為甘胺酸，B28為脯胺酸，B29為賴胺酸，B30為蘇胺酸，B31為不存在，及B32為D-精胺酸(序列代號：25及26)，A0為不存在，A21為門冬醯胺，B28為賴胺酸，B29為不存在，B30為蘇胺酸，B31為D-精胺酸，及B32為D-精胺酸(序列代號：29及30)，或A0為不存在，A21為甘胺酸，B28為賴胺酸，B29為不存在，B30為蘇胺酸，B31為D-精胺酸，及B32為D-精胺酸(序列代號：33及34)。
特別佳之改質血糖調控蛋白為胰島素類似物，如甘精胰島素 或A0(精胺酸)-甘精胰島素，其包括二個或多個L-胺基酸於其之C-末端被其等之對應D-胺基酸(類)，特別D-精胺酸及/或D-賴胺酸所替代。
本發明之另一個方面為改質血液調控蛋白質，於其之C-端包含至少一種，例如一、二、三、四或五個鹼性D-胺基酸(如上所說明者)。較佳者為，一種或多種鹼性L-胺基酸被其等之鹼性D-胺基酸(類)，特別D-精胺酸及/或D-賴胺酸所替代。
本文中所用之「血糖調控蛋白」一詞可為直接或間接涉及調控人類或動物中血糖濃度之任何蛋白質。例如，改質血液調控蛋白為GLP-1激動劑，如艾塞那肽，例如艾塞那肽-4(序列代號：4)、利拉魯肽(序列代號：10)或利西拉肽(AVE0010，序列代號：3)或GLP-1受體激動劑像GLP-1(序列代號：7)、GLP-1(7-36)(序列代號：8)或-2(序列代號：9)、歐新脫莫杜林(序列代號：5)、葡萄朊(序列代號：6)或結合且活化葡萄朊及GLP-1受體之肽 類(賀約特等，生物化學期刊，269，30121-30124，1994；戴氏JW等，自然化學生物學(Nature Chem.Biol.)5：749-757，2009)及抑制體重增加且減少食物攝取，其係說明於專利申請案WO 2008/071972、WO 2008/101017、WO 2009/155258、WO 2010/096052、WO 2010/096142、WO 2011/075393、WO 2008/152403、WO 2010/070251、WO 2010/070252、WO 2010/070253、WO 2010/070255、WO 2011/160630、WO 2011/006497、WO 2011/152181、WO 2011/152182、WO 2011/117415、WO 2011/117416中，其之內容併入本文中參考，或結合且活化GIP及GLP-1受體二者之GIP及肽類及任意之葡萄朊受體，及改善血糖控制，抑制體重增加且減少食物攝取，如於專利申請案WO 2011/119657、WO 2012/138941、WO 2010/011439、WO 2010/148089、WO 2011/094337，及WO 2012/088116中所說明者，其之內容併入本文中參考。血糖調控蛋白之其他實例為胰島素及胰島素類似物或DPP-4抑制劑。
改質血糖調控蛋白之較佳實例為GLP-1激動劑，特別是艾 塞那肽，例如，艾塞那肽-4(序列代號：4)、利拉魯肽(序列代號：10)或利西拉肽(序列代號：3)；GLP-1受體激動劑，特別是GLP-1(序列代號：7)、GLP-1(7-36)(序列代號：8)、GLP-2(序列代號：9)、歐新脫莫杜林(序列代號：5)，或葡萄朊(序列代號：6)。
另一個特別佳之改質血糖調控蛋白為利西拉肽。利西拉肽 (序列代號：3)為一種艾塞那肽-4類似物，其包含艾塞那肽-4(序列代號：4)之胺基酸1至39且於胺基酸位置36(des Pro36)刪除脯胺酸。利西拉肽包含6個C-端之頼胺酸殘基。
另一個特別佳之改質GLP-1激動劑為GLP-1激動劑或式II鹽：(C1-C38)-C39-C40-C41-C42-C43-C44
其中，(a)C1-C38為於des Pro36艾塞那肽-4(1-39)(序列代號：3)位置C1至C38中之胺基酸殘基，(b)C39-C43為賴胺酸或鹼性D-胺基酸，較佳為D-賴胺酸，(c)C44為鹼性D-胺基酸，較佳為D-賴胺酸。
特別佳之改質GLP-1激動劑或式II鹽為一種其中C39-C42為賴胺酸，C43及C44為D-賴胺酸(序列代號：35)者。
特別佳之改質GLP-1激動劑或式II鹽為一種其中C39-C43為賴胺酸且C44為D-賴胺酸(序列代號：36)者。
特別佳之改質GLP-1激動劑或式II鹽為一種其中C39為賴胺酸且C40-C44為D-賴胺酸(序列代號：37)者。
特別佳之改質GLP-1激動劑或式II鹽為激動劑其中C39及C40為賴胺酸且C41-C44為D-賴胺酸(序列代號：38)者。
本發明化合物之較佳的鹽為製藥可接受的鹽。較佳之製藥可接受的鹽為醋酸鹽。
本發明之另一個具體例係關於改質胰島素類似物或改質血液調控蛋白質二者之軛合物如本文中所說明者，及免疫球蛋白Fc區，其係經由選自於下列之群組，包括：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧化乙烯化之多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、可生物分解之聚合物、脂質聚合物、甲殼素、玻尿酸，及其組合物之非肽基連接子連結。
本文中所用之「非肽基連接子」一詞較佳係指生物可相容之聚合物，其包括二種或多種重複的單位，經由共價鍵不包括肽鍵而彼此連接。
較佳為，該軛合物係包括改質胰島素類似物如本文中所說明者，且該非肽基連接子係附著至該胰島素類似物B鏈之胺基端。
較佳為，該免疫球蛋白Fc區係由一至四個結構區選自於下列之群組，包括：CH1、CH2、CH3，及CH4，特別由IgG、IgA、IgD、IgE，或IgM所衍生之結構區所組成。
本發明之另一個具體例係指醫藥調配物，其包含改質胰島素類似物如本文中所說明者，及/或本文中所說明之改質血糖調控蛋白，較佳為改質利西拉肽(lixisentatide)及製藥可接受載劑。
於較佳之具體例中，該醫藥調配物為長效作用之調配物。如此之調配物，與包含未改質分子之調配物相較時，其特徴在於保持本發明 改質分子於體內改良之持續時間，滴定率(titer)及穩定性，較佳為血清穩定性。
該醫藥調配物可適用於非經腸胃給藥，如腹膜內、靜脈內、肌肉內、皮下，或皮內，較佳係用於皮下給藥，較佳為注射。該醫藥調配物可製備成單劑量或多劑量調配物。
適當之注射裝置係已知於此方面技藝中，例如，所謂的「筆」，包括具有活性劑的匣如本文中所說明者，及注射針。
該醫藥調配物可為液態調配物。胰島素類似物或血糖蛋白質之液態醫藥調配物係已知於此方面之技藝中，較佳為利西拉肽。
例如，此等液態調配物可包含製藥可接受載劑，如緩衝劑，例如，磷酸鹽、檸檬酸鹽及/或醋酸鹽；適當之防腐劑如苯酚、間甲酚，及苄醇；張力劑如甘油、乳糖、山梨糖醇、甘露糖醇、葡萄糖、蔗糖、NaCl、含鈣或鎂化合物如CaCl2；止痛藥；增溶劑及/或穩定劑。
該調配物可進一步包含抗氧化劑，如蛋胺酸或抗壞血酸鹽。
本發明進一步提供改質胰島素類似物或改質血糖調控蛋白二者如本文中所說明者使用於治療法中。
特別，該改質胰島素類似物或改質血糖調控蛋白如本文中所說明者，可用於預防、減輕，或治療胰島素缺乏症、胰島素抗藥性、肥胖症、血糖過低症，及/或神經變性失調。
該神經變性失調可涉及氧化應力、神經元軸突完整性喪失、細胞凋亡、神經元喪失及/或發炎反應。
該神經變性失調亦可能伴隨著認知障礙。
較佳之胰島素缺乏症為糖尿病，特別I型或II型糖尿病。
較佳之神經變性失調係選自於下列之群組，包括：阿茲海默氏病、帕金森氏病、進行性上核麻痺症(PSP)、多發性系統萎縮症(MSA)、路易體失智症(Lewy body dementia)、帕金森氏病、癡呆、癲癇、中風、亨丁頓氏舞蹈病、腦組織缺氧、多發性硬化，及末梢神經病變。
特別佳之神經變性失調係選自於下列之群組，包括：阿茲海默氏病、帕金森氏病，及中風，特別是早期阿茲海默氏病或早期帕金森氏病。
本發明進一步提供用於抑制血清中蛋白酶降解之方法，較佳 係藉由羧基蛋白酶或胰蛋白酶，及/或藉由一種或多種D-胺基酸附著於該蛋白質來提高蛋白質之血清穩定性。
抑制蛋白酶降解之百分比係於相同條件下測量 抑制=1-[(改質蛋白質裂解%/未改質蛋白質裂解%)]x 100%而決定。較佳為，該抑制為50%、55%、60%、65%、70%、72%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%，或99%。血清穩定性增加係於相同條件下測量比較血液中生物活性改質蛋白對生物未改質蛋白之存在期間而決定。
該D-胺基酸(類)可附著至該蛋白質之N-端或C-端。較佳 為，該D-胺基酸(類)係附著至該蛋白質之C-末端。
藉由上述方法改質之蛋白質，原則上可為任何對血清中蛋白 酶降解敏感之蛋白質。於一個具體例中，該蛋白質為血糖調控蛋白如本文中所定義者，較佳為胰島素(序列代號：1及2)、或胰島素類似物如甘精胰島素(序列代號：11及12)或A0(精胺酸)-甘精胰島素(序列代號：13及14)、GLP-1激動劑、特別是艾塞那肽，例如，艾塞那肽-4(序列代號：4)、利拉魯肽(序列代號：10)或利西拉肽(序列代號：3)或GLP-1受體激動劑，特別是GLP-1(序列代號：7)、GLP-1(7-36)(序列代號：8)、GLP-2(序列代號：9)、歐新脫莫杜林(序列代號：5)，或葡萄朊(序列代號：6)。
該D-胺基酸(類)可藉由本文中所說明之方法，特別藉由實例中所使用之方法引入。於一個具體例中，該D-胺基酸(類)係藉由：(a)提供蛋白質，例如，已任意地被肽鏈內切酶，較佳為頼胺醯肽鏈內切酶或胰蛋白酶裂解之重組產生的蛋白質，且(b)附著肽至該蛋白質，其中該肽包含一種或多種C-末端之D-胺基酸及任意一種或多種L-胺基酸，其中該D-胺基酸於該蛋白質中取代對應之L-胺基酸，或其中該D-胺基酸被添加到C-末端而引入。
該肽宜具有長度2-10，更佳為2、3、4，或5個胺基酸。
重組產生蛋白質之方法係已知於此方面之技藝中。同樣的，附著肽的方法係已知於此方面之技藝中。較佳者為，所要附著之肽係經預 先合成，例如藉由化學合成法。較佳為，該肽係經由胰蛋白酶催化之轉肽作用而添加。
於一個具體例中，本文中所說明之方法係包括提供如重組產 生該蛋白質為胰島素斷片或該胰島素類似物，如甘精胰島素或A0(精胺酸)-甘精胰島素，其包括於步驟(b)之前該胰島素或胰島素類似物之A鏈及B鏈終止於胺基酸位置B29(賴胺酸)。
本文中所用之「斷片」一詞係指蛋白質，例如胰島素類似物 或葡萄糖調控蛋白質如本文中所說明者，其之C-末端缺乏1、2、3、4或5個胺基酸。
例如，該蛋白質為位置B30缺乏胺基酸蘇胺酸之甘精胰島 素。
於一個具體例中，該蛋白質可為胰島素或胰島素類似物，如 甘精胰島素或A0(精胺酸)-甘精胰島素，且該方法包括於步驟(b)之前用肽鏈內切酶，較佳為頼胺醯肽鏈內切酶或胰蛋白酶裂解該蛋白質。
於本文中所說明方法之另一個具體例中，該添加之D-胺基 酸可替代已被肽鏈內切酶，較佳為頼胺醯肽鏈內切酶或胰蛋白酶裂解之蛋白質的L-胺基酸。
該方法可包括引入D-胺基酸，特別鹼性D-胺基酸，其為朊 性胺基酸如D-精胺酸、D-組胺酸、D-羥頼胺酸，或D-賴胺酸之類似物。其可進一步包括引入D-胺基酸，特別鹼性D-胺基酸，其為非-朊性胺基酸如D-鳥胺酸或D-瓜胺酸之類似物。
該蛋白質可為胰島素類似物如甘精胰島素或A0(精胺酸)-甘 精胰島素，且該引入之D-胺基酸係於位置B31或B32，較佳於位置B31及B32之D-精胺酸。該蛋白質可藉著用蛋白酶，如頼胺醯肽鏈內切酶或胰蛋白酶裂解而產生。
例如，該肽為L-蘇胺酸-L-精胺酸-D-精胺酸或L-蘇胺酸-D- 精胺酸-D-精胺酸或賴胺酸-精胺酸-D-精胺酸或賴胺酸-D-精胺酸-D-精胺酸。
本發明之一個具體例係指用於抑制蛋白質之蛋白酶降解的 方法，其係藉由附著一種或多種D-胺基酸至該蛋白質，其中該蛋白質為胰 島素類似物如甘精胰島素或A0(精胺酸)-甘精胰島素，且該引入之胺基酸為D-精胺酸於胺基酸位置B31及B32且該蛋白酶為胰蛋白酶。
本發明之另一個方面係指製備改質胰島素類似物或改質血糖調控蛋白之方法，其包括：(a)提供蛋白質，例如，已任意地被肽鏈內切酶，較佳為頼胺醯肽鏈內切酶或胰蛋白酶裂解之重組產生的蛋白質，及(b)附著肽至該蛋白質，其中該肽包含一種或多種C-末端之D-胺基酸及任意一種或多種L-胺基酸，其中該D-胺基酸替代於該蛋白質中對應之L-胺基酸，或其中該D-胺基酸被添加到C-末端。
於本文中所說明之方法中，所添加之D-胺基酸可為鹼性D-胺基酸如D-精胺酸、D-組胺酸、D-羥頼胺酸(D-Hly)、D-賴胺酸、D-鳥胺酸，及/或D-瓜胺酸，較佳為D-精胺酸及/或D-賴胺酸。
於較佳之具體例中，該方法係指製備改質胰島素類似物或改質血糖調控蛋白二者，如本文中所說明者，較佳為那些式I或式II者。
該方法係適合於步驟(a)中提供胰島素或胰島素類似物之胰島素斷片或胰島素類似物如甘精胰島素或A0(精胺酸)-甘精胰島素，例如藉由重組產生，其包括於步驟(b)之前該胰島素或胰島素類似物之A鏈及B鏈終止於胺基酸位置B29(賴胺酸)，其可被肽鏈內切酶，較佳為頼胺醯肽鏈內切酶或胰蛋白酶於步驟(b)之前裂解。
於本文中所說明方法之另一個具體例中，該添加之D-胺基酸可替代已被肽鏈內切酶，較佳為頼胺醯肽鏈內切酶或胰蛋白酶裂解之胰島素、胰島素類似物或蛋白質之L-胺基酸。
例如，該胰島素類似物為甘精胰島素或A0(精胺酸)-甘精胰島素，且該肽為L-蘇胺酸-L-精胺酸-D-精胺酸或L-蘇胺酸-D-精胺酸-D-精胺酸。
本發明之進一步具體例為醫藥調配物，較佳為長效作用調配物，其包含如上所說明之改質胰島素類似物或如上所說明之軛合物及製藥可接受載劑作為活性劑。
本發明之進一步具體例為如上所說明之改質胰島素類似物或如上所說明之軛合物使用於治療法中。
本發明之進一步具體例為如上所說明之改質胰島素類似物 或如上所說明之軛合物用於預防、減輕，或治療胰島素缺乏症、胰島素抗藥性、肥胖症、血糖過低症，及/或神經變性失調，特別涉及或伴隨著氧化應力、神經元軸突完整性喪失、細胞凋亡、神經元喪失、認知障礙及/或發炎反應之神經變性失調。
本發明之進一步具體例為改質胰島素類似物或軛合物使用 於如上所說明者，其中，該胰島素缺乏症為糖尿病，特別I型或II型糖尿病。
本發明之進一步具體例為改質胰島素類似物或軛合物使用 於如上所說明者，其中，該神經變性失調係選自於下列之群組，包括：阿茲海默氏病、帕金森氏病、進行性上核麻痺症(PSP)、多發性系統萎縮症(MSA)、路易體失智症、帕金森氏病、癡呆、癲癇、中風、亨丁頓氏舞蹈病、腦組織缺氧、多發性硬化，及末梢神經病變。
本發明之進一步具體例為用於抑制血清中蛋白酶降解及/或 增加胰島素類似物之血清穩定性之方法，其係藉由附著一種或多種D-胺基酸至該胰島素類似物導致如上所說明之改質胰島素類似物，較佳為，其中該D-胺基酸(類)係被附著至該胰島素類似物之C-末端且此外較佳者，其中該蛋白酶為羧基蛋白酶。
本發明之進一步具體例為如上所說明之方法，其中該胰島素 類似物較佳為胰島素(序列代號：1及2)，或甘精胰島素(序列代號：11及12)或A0(精胺酸)-甘精胰島素(序列代號：13及14)。
本發明之進一步具體例為如上所說明之方法，其中該D-胺基酸(類)係藉由：(a)提供胰島素類似物，例如，已任意地被肽鏈內切酶，較佳為頼胺醯肽鏈內切酶或胰蛋白酶裂解之重組產生的胰島素類似物，且(b)附著肽至該胰島素類似物，其中該肽包含一種或多種C-末端之D-胺基酸及任意一種或多種L-胺基酸，其中該D-胺基酸係替代該胰島素類似物中所對應之L-胺基酸，或其中該D-胺基酸被添加到C-末端，而引入。
本發明之進一步具體例為如上所說明之方法，其中該胰島素 類似物為重組產生之胰島素斷片或胰島素類似物如甘精胰島素或A0(精胺酸)-甘精胰島素，其包括於步驟(b)之前該胰島素或胰島素類似物之A鏈及B鏈終止於胺基酸位置B29(賴胺酸)。
本發明之進一步具體例為如上所說明之方法，其中該胰島素 類似物為甘精胰島素或A0(精胺酸)-甘精胰島素，且該方法包括用肽鏈內切酶，較佳為頼胺醯肽鏈內切酶或胰蛋白酶裂解該蛋白質。
本發明之進一步具體例為如上所說明之方法，其中該添加之 D-胺基酸係替代已經被肽鏈內切酶裂解之胰島素類似物的L-胺基酸，較佳為其中該D-胺基酸為鹼性D-胺基酸，更佳為D-精胺酸或D-賴胺酸。
本發明之進一步具體例為如上所說明之方法，其中該胰島素 類似物為甘精胰島素或A0(精胺酸)-甘精胰島素，且該肽為L-蘇胺酸-L-精胺酸-D-精胺酸或L-蘇胺酸-D-精胺酸-D-精胺酸。
本發明之進一步具體例為如上所說明之方法，其中該肽係經 由胰蛋白酶催化之轉肽作用而添加。
本發明之進一步具體例為製備改質胰島素類似物之方法，其包括：(a)提供胰島素類似物，例如，已任意地被肽鏈內切酶，較佳為頼胺醯肽鏈內切酶或胰蛋白酶裂解之重組產生的胰島素類似物，且(b)附著肽至該胰島素類似物，其中該肽包含一種或多種C-末端之D-胺基酸及任意一種或多種L-胺基酸，其中該D-胺基酸係替代該胰島素類似物中所對應之L-胺基酸，或其中該D-胺基酸被添加到C-末端。
本發明之進一步具體例為如上所說明之方法，其中該D-胺基酸為鹼性D-胺基酸，較佳為D-精胺酸及/或D-賴胺酸。
本發明之進一步具體例為如上所說明的方法，其係用於製造如上所說明之改質胰島素類似物或如上所說明之軛合物。本發明之進一步具體例為如上所說明包括該胰島素或胰島素類似物於步驟(a)中重組產生胰島素斷片或胰島素類似物如甘精胰島素或 A0(精胺酸)-甘精胰島素之方法，其包括於步驟(b)之前該胰島素或胰島素類似物之A鏈及B鏈終止於胺基酸位置B29(賴胺酸)。
本發明之進一步具體例為如上所說明之方法，其中該胰島素類似物為甘精胰島素或A0(精胺酸)-甘精胰島素，且該肽為L-蘇胺酸-L-精胺酸-D-精胺酸或L-蘇胺酸-D-精胺酸-D-精胺酸。
圖1：皮下注射(s.c.)12納莫耳/公斤32B-D-精胺酸-甘精胰島素(序列代號：15及16)，(31-32)B-二-D-精胺酸-甘精胰島素(序列代號：17及18)，0A-精胺酸-32B-D-精胺酸-甘精胰島素(序列代號：19及20)，及0A-精胺酸-(31-32)B-二-D-精胺酸-甘精胰島素(序列代號：21及22)於大鼠中之血糖降低效應。
圖2：皮下注射1國際單位/公斤(31-32)B-二-D-精胺酸-甘精胰島素(序列代號：17及18)及甘精胰島素於大鼠中之血糖降低效應
圖3：於皮下注射1國際單位/公斤(31-32)B-二-D-精胺酸-甘精胰島素(序列代號：17及18)及甘精胰島素一小時後於大鼠中之藥品動力及代謝輪廓
圖4：甘精胰島素之結構
圖5：(30-32)B-des-蘇胺酸-甘精胰島素
圖6：32B-D-精胺酸-甘精胰島素(序列代號：15及16)，D-精胺酸係以藍色描繪
圖7：(31-32)B-二-D-精胺酸-甘精胰島素(序列代號：17及18)
圖8：0A(精胺酸)-30B-des-蘇胺酸-甘精胰島素
圖9：0A-精胺酸-32B-D-精胺酸-甘精胰島素(序列代號：19及20)，D-精胺酸以藍色描繪
圖10：0A(精胺酸)-(31-32)B-二-D-精胺酸-甘精胰島素(序列代號：21及22)
圖11：用於製備胰島素非對映體之流程圖
實例
下列之實例係說明用來闡述本發明。
甘精胰島素(序列代號：11及12)C-末端D-精胺酸變異體之製備與特性
表格目錄：
表1：甘精胰島素之D-精胺酸變異體的名稱命名
表2：MALDI-MS數據用於證明離析物與產物之分子結構
表3：胺基酸之掌性分析結果
表4：CpB藉引入D-精胺酸之裂解抑制作用
1. 用於製備改質胰島素類似物之概念
1.1 甘精胰島素之C-末端D-精胺酸變異體
甘精胰島素係包括單一溶素於29B中，其提供以半合成法製備D-精胺酸變異體之可能性。
根據該重組體甘精胰島素，由賴胺酸-C裂解所產生之(30-32)B-des-蘇胺酸-甘精胰島素係用作為離析物，用於胰蛋白酶-催化之轉肽作用/與二種不同之三肽類偶合：與L-蘇胺酸-L-精胺酸-D-精胺酸偶合係導致32B-D-精胺酸-甘精胰島素(序列代號：15及16)，然而與L-蘇胺酸-D-精胺酸-D-精胺酸偶合係導致(31-32)B-二-D-精胺酸-甘精胰島素(序列代號：17及18)。
1.2 0 A (精胺酸)-甘精胰島素之C-末端D-精胺酸變異體
該概念可轉移至其他胰島素，只要其等可製備成B30-des-蘇胺酸-胰島素。於本案之情況中，業已使用裂解副產物，其亦可被說明為0A(精胺酸)-30B-des-蘇胺酸-甘精胰島素。與L-蘇胺酸-L-精胺酸-D-精胺酸之胰蛋白酶-催化的偶合則導致0A(精胺酸)-32B-D-精胺酸-甘精胰島素(序列代號：19及20)，與L-蘇胺酸-D-精胺酸-D-精胺酸偶合係導致0A(精胺酸)-(31-32)B-二-D-精胺酸-甘精胰島素(序列代號：21及22)。
2. 胰島素非對映體之製備流程圖
參見圖11
3. 甘精胰島素D-精胺酸變異體之命名慣例
4. 改質胰島素類似物之特性
4.1 質譜法分析
4.1.1 藉由MALDI-MS測定法之A-及B-鏈的總質量與質量
30B-des-蘇胺酸-胰島素與該產物之A-及B-鏈的總質量與質量二者，於偶合後業已藉由MALDI-MS於該二硫化物鍵復原(reduction)後測定。於每一種物質發現已預期之質量，如顯示於表2中者。
注意：(30-32)B-des-三肽-...等於30B-des-蘇胺酸-
4.2 胺基酸之掌性分析
為了證明D-精胺酸於胰島素中之數量，業已將樣品送至圖賓根(Tübingen)之CAT GmbH & Co KG公司，在那裡進行胺基酸之掌性分性。L-精胺酸與D-精胺酸於各自樣品中之實驗數量係與所期望之理論值數量對應得很好(表3)。因此，每一個胰島素非對映體之結構已明確地測定。
4. 羧肽酶活性之體外抑制作用
於HPLC-MS試驗中發現該羧肽酶B(CpB)於體外裂解甘精胰島素至何種程度。表4係顯示32B-D-精胺酸強烈地抑制該裂解動力。然而，(31-32)B-二-D-精胺酸於體外完全抑制該裂解。
質量偏差±0.01%
* 該0小時值係於添加該酵素後分析
該主要及次要結構係藉由質譜法來測定，且該D-胺基酸於該改質胰島素類似物中之數量係藉由胺基酸之掌性分析來測定。於二-D-精胺酸變異體(31-32)B-二-D-精胺酸-甘精胰島素及0A-精胺酸-(31-32)B-二-D-精胺酸-甘精胰島素中於體外觀察到對羧肽酶B(CpB)裂解100%之抗性(沒有生成代謝物M1((31-32)B-des-二-精胺酸-甘精胰島素=21-甘胺酸-胰島素))，然而，並未於32B-D-精胺酸變異體32B-D-精胺酸-甘精胰島素中看到，且相較於甘精胰島素，0A-精胺酸-32B-D-精胺酸-甘精胰島素顯示至少顯著地降低CpB-裂解速率。於體外試驗中觀察到30B-des-蘇胺酸係用此等改質胰島素類似物形成(代謝物M2(21A-甘胺酸-30B-des-蘇胺酸-胰島素)，其表明胰蛋白酶活性。用(31-32)B-二-D-精胺酸-甘精胰島素與0A-精胺酸-(31-32)B-二 -D-精胺酸-甘精胰島素並未觀察到此等降解。該數據可能表明31B-D-精胺酸抑制該胰蛋白酶誘導之M2形成。
6. 藥理學
改質胰島素類似物之藥理試驗進行如下。該試驗物質之血糖降低效應已於雄性，血糖量正常之維斯塔(Wistar)大鼠中進行研究。該等動物可於夜間自由獲取食物與水。於早晨中，測試物質係於大鼠禁食達二小時後經由皮下注射投遞。於該實驗期間，該等動物保持未進食，但可自由獲取水。
該試驗物質於動物血糖上之效應係由尾尖連續血液採集後測定。該血糖之時間/功效-輪廓已經建立。於所有4種試驗物質發現血糖降低之效應(參照圖1)。其係用引入改質之(31-32)B-二-D-精胺酸-甘精胰島素導致作用之期間延長，且導致血糖降低曲線變平來示範性地顯示，與直接用甘精胰島素相較。後者還指出引入改良之結果血糖過低症之風險降低(參照圖2)。
7. 來自於大鼠血漿樣品之甘精胰島素C-末端D-精胺酸變異體之
LC-MS/MS分析
縮寫字表
<LLOQ 低於定量下限
>ULOQ 高於定量上限
°C 攝氏度
μg 微克
μL 微升
μm 微米
BA 生物分析
Conc. 濃度
Cs 校準樣品
g 重力(於離心速度時亦用作克，其中「g」意指重力)
h 小時
HPLC 高效液體色層分離法(HPLC)
ID 內徑
ISTD 內部標準
L 升
LC-MS/MS 液體色層分離法偶合至串聯質譜法
LLOQ 定量下限
M 莫耳
mg 毫克
min 分鐘
mL 毫升
mM 毫莫耳
MS/MS 串聯質譜法
n 個別值之數目
ng 毫微克
nm 毫微米
PBS 磷酸鹽緩衝之食鹽水(於25C，pH 7.4，一錠劑溶解於200毫升去離子水中產生0.01M磷酸鹽緩衝液，0.0027M氯化鉀及0.137M氯化鈉)
pH 質子濃度之負性常用對數
QC 品質控制
RT 停滯時間
sec 秒鐘
ULOQ 定量上限
[U-15N]- 於標記之內部標準與該化合物名稱組合時用作為前
置代號之縮寫(例如：[U15N]-甘精胰島素)
VAL 驗證樣品
v/v 體積/體積
7.1 測試系統(矩陣)
所使用之試驗系統為大鼠血漿。鉀EDTA(K2-EDTA)係用作為阻凝劑。
7.2 物質
7.2.1 設備
反應管，1.5毫升(聚丙烯)
多吸移管
旋渦混合器(海道非夫公司(Heidolph))
離心機：Rotanta 46 RSC/RP(海帝斯公司(Hettich))
離心機：Mikro 22 R/RP(海帝斯公司)
Vivacon 500過濾器VN01 H02
自動進樣瓶(聚丙烯)
免疫親和柱(用100微升含有10毫克/毫升Zentech©抗-胰島素小鼠抗體偶合至經CNBr-活化之瓊脂糖凝膠4快速流動(Sepharose4 Fast Flow)填充)
7.2.2 試劑與溶劑
使用於該研究中之所有的化學品皆為試劑等級或更高者
大鼠血漿：來自於不同的動物(K2-EDTA作為阻凝劑)
乙腈：Merck Lichrosolv，# 1.00030(或相等物)
用於LC-MS/MS的水：Roth Rotisolv，# AE72.1(或相等物)
水：經微孔純化(或相等物)
甲酸：默克公司(Merck)，#1.00253.1000(或相等物)
Brij35：席格馬歐德里奇公司(Sigma-Aldrich)，# P1254(或相等物)
PBS(磷酸鹽緩衝之食鹽水)：席格馬歐德里奇公司，# P4417-100Tab(或相等物)
ProClin 300：色譜科公司(Supelco)，# 48912-U(或相等物)
氫氧化鈉：Riedel-de-Haën，# 30620(或相等物)
甘精胰島素：核准之批量1
甘精胰島素-M1：核准之批量
甘精胰島素-M2：核准之批量
[U-15N]-甘精胰島素：可取得具有純度資訊之證明書2
[U-15N]-甘精胰島素-M1：可取得具有純度資訊之證明書
[U-15N]-甘精胰島素-M2：可取得具有純度資訊之證明書
7.3 所需溶液及混合物之製備
7.3.1 乙腈/水/甲酸之混合物(20：80：0.1，v/v/v)
將20毫升乙腈置於100毫升容器中且用80毫升水混合。添加100微升甲酸。
7.3.2 乙腈/Brij35之混合物(100：0.1，v/w)
將100毫升乙腈置於100毫升容器中且用0.1克Brij35混合。
7.3.3 乙腈/水/甲酸/Brij35之混合物(20：80：0.1：0.001，v/v/v/w)
將20毫升乙腈置於100毫升容器中且用80毫升水及100微升乙腈/Brij35(100：0.1，v/w)混合。添加100微升甲酸。
7.3.4 乙腈/甲酸之混合物(100：0.5，v/v)
將1000毫升乙腈置於1升容器中且用5毫升甲酸混合。
7.3.5 水/甲酸之混合物(100：0.5，v/v)
將1000毫升水置於1升容器中且用5毫升甲酸混合。
7.3.6 稀釋與清洗緩衝液-0.01M PBS/Brij35(100：0.001 v/w)之混合物pH 7.8
將1000毫升水置於1升容器中且用5錠劑之PBS混合。將該溶液用0.1M氫氧化鈉及1毫升乙腈/Brij35(100：0.1，v/w)調整至pH 7.8。
7.3.7 洗提緩衝液-水/甲酸/乙腈/Brij35之混合物(90：1：10：0.001，v/v/v/w)
將1000毫升水置於1升容器中且用10毫升甲酸及1毫升乙腈/Brij35(100：0.1，v/w)混合。
7.3.8 貯存緩衝液-0.01M PBS/Brij35/ProClin 300(100：0.001：0.04，v/w/v)之混合物，pH 7.8
將200毫升水置於200毫升容器中且用1錠劑PBS、200微升乙腈/Brij35(100：0.1，v/w)及80微升ProClin 300混合。將該溶液用0.1M氫氧化鈉調整至pH 7.8。
7.3.9 0.1M氫氧化鈉
將0.4克氫氧化鈉置於100毫升容器中且用100毫升水混合。
7.3.10 甘精胰島素儲備溶液
將約1毫克甘精胰島素用乙腈/水/甲酸(20：80：0.1，v/v/v)填充至1毫升。該溶液需要製備二次(用於校準標準及用於品質控制)。可使用其他計重與體積只要所產生之儲備溶液濃度為約1毫克/毫升。
7.3.11 [U-15N]-甘精胰島素儲備溶液
將22.3微升[U-15N]-甘精胰島素儲備溶液[448000毫微克/毫升於乙腈/水/甲酸(20：80：0.1，v/v/v)中]填充至10毫升於乙腈/水/甲酸中(20：80：0.1，v/v/v)。依可用之[U-15N]-甘精胰島素儲備溶液之濃度而定，可使用其他計重與體積只要所產生之儲備溶液濃度為1000毫微克/毫升。將所有的稀釋液貯存於約-80℃冰箱中。
7.3.12 甘精胰島素-M1之儲備溶液
將約1毫克甘精胰島素-M1用乙腈/水/甲酸(20：80：0.1，v/v/v)填充至1毫升。該溶液需要製備二次(用於校準標準及用於品質控制)。可使用其他計重與體積只要所產生之儲備溶液濃度為約1毫克/毫升。
7.3.13 [U-15N]-甘精胰島素-M1之儲備溶液
將20.9微升[U-15N]-甘精胰島素-M1儲備溶液[478000毫微克/毫升於乙腈/水/甲酸(20：80：0.1，v/v/v)中]填充至10毫升於乙腈/水/甲 酸中(20：80：0.1，v/v/v)。依可用之[U-15N]-甘精胰島素-M1儲備溶液之濃度而定，可使用其他計重與體積只要所產生之儲備溶液濃度為1000毫微克/毫升。將所有的稀釋液貯存於約-80℃冰箱中。
7.3.14 甘精胰島素-M2之儲備溶液
將約1毫克甘精胰島素-M2用乙腈/水/甲酸(20：80：0.1，v/v/v)填充至1毫升。該溶液需要製備二次(用於校準標準及用於品質控制)。可使用其他計重與體積只要所產生之儲備溶液濃度為約1毫克/毫升。
7.3.15 [U-15N]-甘精胰島素-M2之儲備溶液
將22.9微升[U-15N]-甘精胰島素-M2儲備溶液[437000毫微克/毫升於乙腈/水/甲酸(20：80：0.1，v/v/v)中]用乙腈/水/甲酸(20：80：0.1，v/v/v)填充至1毫升。依可用之[U-15N]-甘精胰島素-M2儲備溶液之濃度而定，可使用其他計重與體積只要所產生之儲備溶液濃度為1000毫微克/毫升。將所有的稀釋液貯存於約-80℃冰箱中。
7.4 標準，品質控制及內部標準製備
7.4.1 校準標準之製備
將該甘精胰島素、甘精胰島素-M1及甘精胰島素-M2之儲備溶液貯存於-80℃。儲備溶液可於經證實之穩定期內使用。
校準標準係製備如下：將甘精胰島素、甘精胰島素-M1及甘精胰島素-M2之第一儲備溶液用乙腈/水/甲酸/Brij35(20：80：0.1：0.001，v/v/v/w)稀釋至100 000毫微克/毫升之標稱濃度且隨即用乙腈/水/甲酸/Brij35(20：80：0.1：0.001，v/v/v/w)稀釋至1000毫微克/毫升之標稱濃度。將此溶液(1000毫微克/毫升)用於製備校準標準6、校準標準5及校準標準4。將校準標準6用於製備校準標準3，校準標準5用於製備校準標準2且校準標準3係用於製備校準標準1。該校準樣品係每日製備，且保存於約4℃冰箱中。此外，該校準樣品可於任何經證明之穩定期內使用。下列之混合物將用於製備校準標準，然 而該體積可改變使該混合物之體積適應各自之驗證試驗，只要所生成之目標濃度等於那些於下列表中者：
7.4.2 品質控制/驗證樣品之製備
將甘精胰島素、甘精胰島素-M1及甘精胰島素-M2之儲備溶液貯存於-80℃。儲備溶液可於經證實之穩定期內使用。
品質控制樣品/驗證樣品係製備如下：將甘精胰島素、甘精胰島素-M1及甘精胰島素-M2之第一儲備溶液用乙腈/水/甲酸/Brij35(20：80：0.1：0.001，v/v/v/w)稀釋至100 000毫微克/毫升之標稱濃度且隨即用乙腈/水/甲酸/Brij35(20：80：0.1：0.001，v/v/v/w)稀釋至1000毫微克/毫升之標稱濃度。將該溶液(1000毫微克/毫升)用於製備品質控制3及品質控制2。將品質控制3之溶液用於製備品質控制1且品質控制2之溶液係用於製備LLOQ含量。該稀釋液係每日製備且保存於約4℃冰箱中。此外，該稀釋液可於任何經證明之穩定期內使用。下列之混合物將用於製備品質控制樣品/驗證樣品，然而該體積可改變使該混合物之體積適應各自之驗證試驗，只要所生成之目標濃度等於那些於下列表中者：
7.4.3 驗證樣品之製備(用參考化合物加標)
將用於穩定試驗之驗證樣品製備成摻標之K2-EDTA血漿樣品。為了此目的，將K2-EDTA血漿加入標準之甘精胰島素、甘精胰島素M1及甘精胰島素-M2之溶液以得到高的QC-含量(8毫微克/毫升)且進一步用K2-EDTA血漿予以稀釋至得到低的QC-含量(0.6毫微克/毫升)。該加標之血漿樣品可於任何經證明之穩定期內使用。
下列之混合物將用作為品質控制樣品/驗證樣品，其係於K2-EDTA血漿中直接製備，然而該體積可改變使該混合物之體積適應各自之驗證試驗，只要所生成之目標濃度等於那些於下列表中者：
7.4.4 內部標準製備
將[U-15N]-甘精胰島素(1000毫微克/毫升)之儲備溶液用乙腈/水/甲酸/Brij35(20：80：0.1：0.001，v/v/v/w)稀釋至50毫微克/毫升之標稱濃度。該稀釋液係每日製備且保存於約4℃冰箱中。將[U-15N]-甘精胰島 素-M1(1000毫微克/毫升)之儲備溶液用乙腈/水/甲酸/Brij35(20：80：0.1：0.001，v/v/v/w)稀釋至25毫微克/毫升之標稱濃度。該稀釋液係每日製備且保存於約4℃冰箱中。將該[U-15N]-甘精胰島素-M2(1000毫微克/毫升)之儲備溶液用乙腈/水/甲酸/Brij35(20：80：0.1：0.001，v/v/v/w)稀釋至25毫微克/毫升之標稱濃度。該稀釋液係每日製備且保存於約4℃冰箱中。
7.5 檢測方法
若分析樣品必須於解凍，則於LC-MS/MS分析之前將其等貯存於冰上或於4℃冰箱中以避免甘精胰島素、甘精胰島素-M1及甘精胰島素-M2於K2-EDTA血漿中降解。可使用免疫親和柱(IAC)。若多項樣品將在特定日子於各自之管柱中運行，則遵循步驟C以便再使用該IAC管柱，或若該IAC管柱不在特定日再次使用，則遵循步驟D。
步驟A-樣品製備：
˙將300微升K2-EDTA血漿置於1.5毫升反應管中。
˙添加50微升內部標準操作溶液[50毫微克/毫升[U-15N]-甘精胰島素、25毫微克/毫升[U-15N]-甘精胰島素-M1、25毫微克/毫升[U-15N]-甘精胰島素-M2於乙腈/水/甲酸/Brij35(20：80：0.1：0.001，v/v/v/w)中]。於雙空白樣品之情況中，添加純的乙腈/水/甲酸/Brij35(20：80：0.1：0.001，v/v/v/w)。
˙添加30微升甘精胰島素、甘精胰島素-M1及甘精胰島素-M2之操作溶液。於校準標準或QC-樣品之情況中，此為於乙腈/水/甲酸/Brij35中(20：80：0.1：0.001，v/v/v/w)之各自的操作溶液。
˙添加300微升0.01M PBS/Brij35(100：0.001，v/w)pH 7.8
˙密封各管且混合。
步驟B-免疫親和純化作用：
˙用2毫升(2 x 1毫升)清洗緩衝液-0.01M PBS/Brij35(100：0.001，v/w)pH 7.8平衡該IAC管柱
˙將離心之樣品由步驟A施用至該IAC管柱上
˙用2毫升(2 x 1毫升)清洗緩衝液-0.01M PBS/Brij35(100：0.001，v/w)pH 7.8清洗該IAC管柱
˙吸量80微升洗提緩衝液-水/甲酸/(100：1，v/v/)
˙將該IAC管柱置於Vivacon 500過濾器VN01 H02之上
˙吸量300微升洗提緩衝液-水/甲酸/乙腈/Brij35(90：1：10：0.001，v/v/v/w)
˙密封各管且將該樣品以~21500重力(克)離心達15分鐘
˙於Matrix ScreenMates管中吸量該洗提液
˙封閉該Matrix ScreenMates管且將該洗提液用於LC-MS/MS樣品分析(注射體積典型地為60微升)
步驟C-清洗IAC管柱用於以下之免疫親和純化作用：
˙用4毫升(4 x 1毫升)清洗緩衝液-水/甲酸/(100：1：，v/v)清洗該IAC管柱
˙用2毫升(2 x 1毫升)清洗緩衝液-0.01M PBS/Brij35(100：0.001，v/w)pH 7.8清洗該IAC管柱。現在該IAC管柱可使用於下一個萃取中。
步驟D-用於貯存IAC管柱之方法：
˙用4毫升(4 x 1毫升)洗提緩衝液-水/甲酸/(100：1：，v/v)清洗該IAC管柱
˙用0.5毫升貯存緩衝液-PBS(0.01M於水中)/Brij35/ProClin 300(100：0.001：0.04，v/w/v)pH 7.8清洗該IAC管柱
(三)塞住該IAC管柱且吸量0.5毫升貯存緩衝液-PBS(0.01M於水中)/Brij35/Proclin 300(100：0.001：0.04，v/w/v)pH 7.8
˙用封口膜密封該柱且將該柱以直立位置貯存於4℃。
7.6 樣品分析
7.6.1 色層分離法與質譜構型
7.6.1.1 分析設備
7.6.1.1.1 液體色層分離系統
戴安尼克斯(Dionex)極品(Ultimate)3000系列液體色層分離系統或等效 HPLC系統：脫氣機，極品3000型
LC-泵，極品3000型
自動進樣器，極品3000型
柱溫箱，極品3000型
7.6.1.1.2 串聯質譜儀
API 5000來自於應用生物系統(Applied Biosystems)之MDS Sciex或等效質譜儀
7.6.1.1.3 維吉瓦爾科(VIGI Valco)閥或等效閥
瓦爾科儀器公司
二位置促動器控制模組
7.6.2 色層分離條件
梯度輪廓：
瓦非科閥(Valco Valve)：
7.6.3 質譜之條件
實際之先質-與產品離子質量，由於不同的PPG質量校準設置，可能由一質譜儀至另一或於相同之儀器上變化多至±0.5質量單位。碰撞能量可由一質譜儀到另一個或於相同之儀器上變化。
用於二質量轉變之停留時間可由5毫秒變化至500毫秒。
參考資料
1(31-32)B-二-D-精胺酸-甘精胰島素，相較於甘精胰島素，其具有相同的胺基酸序列，但於位置31及32上具有二個D-精胺酸而不是L-精胺酸。因為該質譜檢測不能區分D-及L-胺基酸，甘精胰島素可用於製備校準標準及品質控制樣品。
2(31-32)B-二-D-精胺酸-甘精胰島素，相較於甘精胰島素，其具有相同的胺基酸序列，但於位置31及32上具有二個D-精胺酸而不是L-精胺酸。因為該質譜檢測不能區分D-及L-胺基酸，[U15-N]-甘精胰島素可用作為內部標準用於(31-32)B-二-D-精胺酸-甘精胰島素。
3於乙腈/水/甲酸/Brij35(20：80：0.1：0.001，v/v/v/w)(2至100毫微克/毫升)中所生成的操作溶液係用於製備於血漿中之校準樣品：將30微升此等操作溶液加至300微升血漿且對應至稀釋10倍。於血漿中所生成之最終濃度可於該表之最後管柱中發現。
4於乙腈/水/甲酸/Brij35(20：80：0.1：0.001，v/v/v/w)(2至100毫微克/毫升)中所生成之操作溶液係用於製備於血漿中之品質控制樣品：將30微升此等操作溶液加至300微升血漿且對應至稀釋10倍。於血漿中所生成之最終濃度可於該表之最後管柱中發現。
<110> 賽諾菲公司(Sanofi)
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> DISULFID
<222> (6)..(11)
<220>
<221> DISULFID
<223> 於序列代號：1位置7之半胱胺酸與序列代號：2位置7之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<222> (7)..(7)
<220>
<221> DISULFID
<223> 於序列代號：1位置20之半胱胺酸與序列代號：2位置19之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<222> (20)..(20)
<400> 1
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(7)
<223> 於序列代號：2位置7之半胱胺酸與序列代號：1位置7之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> DISULFID
<222> (19)..(19)
<223> 於序列代號：2位置19之半胱胺酸與序列代號：1位置20之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<400> 2
<210> 3
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AVE0010
<220>
<221> BINDING
<222> (44)..(44)
<223> -NH2
<400> 3
<210> 4
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 艾塞那肽-4(Exendin-4)
<220>
<221> BINDING
<222> (39)..(39)
<223> -NH2
<400> 4
<210> 5
<211> 37
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
<210> 6
<211> 29
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
<210> 7
<211> 37
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
<210> 8
<211> 36
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
<210> 9
<211> 33
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
<210> 10
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 利拉魯肽(Liraglutide)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> N-[epsilon]-([gamma]-Glu(N-[alpha]-hexadecanoyl)))
<400> 10
<210> 11
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘精胰島素B鏈
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(7)
<223> 於序列代號：11位置7之半胱胺酸與序列代號：12位置7之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> DISULFID
<222> (19)..(19)
<223> 於序列代號：11位置19之半胱胺酸與序列代號：12位置20之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<400> 11
<210> 12
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘精胰島素A鏈
<220>
<221> DISULFID
<222> (6)..(11)
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(7)
<223> 於序列代號：12位置7之半胱胺酸與序列代號：11位置7之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> DISULFID
<222> (20)..(20)
<223> 於序列代號：12位置20之半胱胺酸與序列代號：11位置19之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<400> 12
<210> 13
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A0-Arg-甘精胰島素B鏈
<220>
<221> DISULFID
<223> 於序列代號：13位置7之半胱胺酸與序列代號：14位置8之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<222> (7)..(7)
<220>
<221> DISULFID
<222> (19)..(19)
<223> 於序列代號：13位置19之半胱胺酸與序列代號：14位置21之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<400> 13
<210> 14
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A0-Arg-甘精胰島素A鏈
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(12)
<220>
<221> DISULFID
<222> (8)..(8)
<223> 於序列代號：13位置7之半胱胺酸與序列代號：14位置8之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> DISULFID
<222> (21)..(21)
<223> 於序列代號：13位置19之半胱胺酸與序列代號：14位置21之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<400> 14
<210> 15
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰島素類似物B鏈
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(7)
<223> 於序列代號：15位置7之半胱胺酸與序列代號：16位置7之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> DISULFID
<222> (19)..(19)
<223> 於序列代號：15位置19之半胱胺酸與序列代號：16位置20之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> X=D-Arg
<400> 15
<210> 16
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰島素類似物A鏈
<220>
<221> DISULFID
<222> (6)..(11)
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(7)
<223> 於序列代號：16位置7之半胱胺酸與序列代號：15位置7之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> DISULFID
<222> (20)..(20)
<223> 於序列代號：16位置20之半胱胺酸與序列代號：15位置19之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<400> 16
<210> 17
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰島素類似物B鏈
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(7)
<223> 於序列代號：17位置7之半胱胺酸與序列代號：18位置7之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> DISULFID
<222> (19)..(19)
<223> 於序列代號：17位置19之半胱胺酸與序列代號：18位置20之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> X=D-Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> X=D-Arg
<400> 17
<210> 18
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰島素類似物A鏈
<220>
<221> DISULFID
<222> (6)..(11)
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(7)
<223> 於序列代號：18位置7之半胱胺酸與序列代號：17位置7之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> DISULFID
<222> (20)..(20)
<223> 於序列代號：18位置20之半胱胺酸與序列代號：17位置19之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<400> 18
<210> 19
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A0-Arg-胰島素類似物B鏈
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(7)
<223> 於序列代號：19位置7之半胱胺酸與序列代號：20位置8之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> DISULFID
<222> (19)..(19)
<223> 於序列代號：19位置19之半胱胺酸與序列代號：20位置21之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> X=D-Arg
<400> 19
<210> 20
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A0-Arg-胰島素類似物A鏈
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(12)
<220>
<221> DISULFID
<222> (8)..(8)
<223> 於序列代號：29位置7之半胱胺酸與序列代號：20位置8之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> DISULFID
<222> (21)..(21)
<223> 於序列代號：19位置19之半胱胺酸與序列代號：20位置21之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<400> 20
<210> 21
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A0-Arg-胰島素類似物B鏈
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(7)
<223> 於序列代號：21位置7之半胱胺酸與序列代號：22位置8之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> DISULFID
<222> (19)..(19)
<223> 於序列代號：21位置19之半胱胺酸與序列代號：22位置21之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> X=D-Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> X=D-Arg
<400> 21
<210> 22
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A0-Arg-胰島素類似物A鏈
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(12)
<220>
<221> DISULFID
<222> (8)..(8)
<223> 於序列代號：21位置7之半胱胺酸與序列代號：22位置8之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> DISULFID
<222> (21)..(21)
<223> 於序列代號：21位置19之半胱胺酸與序列代號：22位置21之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<400> 22
<210> 23
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A0-Arg-胰島素類似物B鏈
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(7)
<223> 於序列代號：23位置7之半胱胺酸與序列代號：24位置8之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> DISULFID
<222> (19)..(19)
<223> 於序列代號：23位置19之半胱胺酸與序列代號：24位置21之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> X=D-Arg
<400> 23
<210> 24
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A0-Arg-胰島素類似物A鏈
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(12)
<220>
<221> DISULFID
<222> (8)..(8)
<223> 於序列代號：23位置7之半胱胺酸與序列代號：24位置8之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> DISULFID
<222> (21)..(21)
<223> 於序列代號：23位置19之半胱胺酸與序列代號：24位置21之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<400> 24
<210> 25
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A0-Arg-胰島素類似物B鏈
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(7)
<223> 於序列代號：25位置7之半胱胺酸與序列代號：26位置8之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> DISULFID
<222> (19)..(19)
<223> 於序列代號：25位置19之半胱胺酸與序列代號：26位置21之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> X=D-Arg
<400> 25
<210> 26
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A0-Arg-胰島素類似物A鏈
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(12)
<220>
<221> DISULFID
<222> (8)..(8)
<223> 於序列代號：25位置7之半胱胺酸與序列代號：26位置8之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> DISULFID
<222> (21)..(21)
<223> 於序列代號：25位置19之半胱胺酸與序列代號：26位置21之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<400> 26
<210> 27
<400> 27
000
<210> 28
<400> 28
000
<210> 29
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰島素類似物B鏈
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(7)
<223> 於序列代號：29位置7之半胱胺酸與序列代號：30位置7之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> DISULFID
<222> (19)..(19)
<223> 於序列代號：29位置19之半胱胺酸與序列代號：30位置20之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> X=D-Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> X=D-Arg
<400> 29
<210> 30
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰島素類似物A鏈
<220>
<221> DISULFID
<222> (6)..(11)
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(7)
<223> 於序列代號：29位置7之半胱胺酸與序列代號：30位置7之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> DISULFID
<222> (20)..(20)
<223> 於序列代號：29位置19之半胱胺酸與序列代號：30位置20之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<400> 30
<210> 31
<400> 31
000
<210> 32
<400> 32
000
<210> 33
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰島素類似物B鏈
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(7)
<223> 於序列代號：33位置7之半胱胺酸與序列代號：34位置7之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> DISULFID
<222> (19)..(19)
<223> 於序列代號：33位置19之半胱胺酸與序列代號：34位置20之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> X=D-Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> X=D-Arg
<400> 33
<210> 34
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰島素類似物A鏈
<220>
<221> DISULFID
<222> (6)..(11)
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(7)
<223> 於序列代號：33位置7之半胱胺酸與序列代號：34位置7之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<220>
<221> DISULFID
<222> (20)..(20)
<223> 於序列代號：33位置19之半胱胺酸與序列代號：34位置20之半胱胺酸間之二硫鍵橋
<400> 34
<210> 35
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 改質AVE0010
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> X=D-Lys
<220>
<221> BINDING
<222> (44)..(44)
<223> -NH2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> X=D-Lys
<400> 35
<210> 36
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 改質AVE0010
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> X=D-Lys
<220>
<221> BINDING
<222> (44)..(44)
<223> -NH2
<400> 36
<210> 37
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 改質AVE0010
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> X=D-Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> X=D-Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (42)..(42)
<223> X=D-Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> X=D-Lys
<220>
<221> BINDING
<222> (44)..(44)
<223> -NH2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> X=D-Lys
<400> 37
<210> 38
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 改質AVE0010
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> X=D-Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (42)..(42)
<223> X=D-Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> X=D-Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> X=D-Lys
<400> 38

Claims (38)

  1. 一種式I之改質胰島素類似物或其鹽， 其中，(a)A0為不存在或精胺酸，(b)(A1-A5)為於人類(序列代號：1)或動物胰島素A鏈位置A1至A5中之胺基酸殘基，(c)(A8-A10)為於人類(序列代號：1)或動物胰島素A鏈位置A8至A10中之胺基酸殘基，(d)(A12-A19)為於人類(序列代號：1)或動物胰島素A鏈位置A12至A19中之胺基酸殘基，(e)A21為門冬醯胺或甘胺酸，(f)B1為苯丙胺酸(Phe)或組胺酸，(g)B3為門冬醯胺或組胺酸，(h)B2及(B4-B6)為於人類(序列代號：2)或動物胰島素B鏈位置B2及B4至B6中之胺基酸殘基，(i)(B8-B18)為於人類(序列代號：2)或動物胰島素B鏈位置B8至B18中之胺基酸殘基，(j)(B20-B27)為於人類(序列代號：2)或動物胰島素B鏈位置B20至B27中之胺基酸殘基，(k)B28為脯胺酸或賴胺酸，(l)B29為賴胺酸或不存在，(m)B30為蘇胺酸或不存在， (n)B31為不存在，精胺酸或鹼性D-胺基酸，特別為D-精胺酸，D-組胺酸，D-賴胺酸，D-羥頼胺酸(Hyl)，D-鳥胺酸，或D-瓜胺酸。(o)B32為鹼性D-胺基酸，特別為D-精胺酸，但附帶條件為，若B31為精胺酸，則A21為甘胺酸，或若B31為不存在，則A0為精胺酸，且附帶條件為，若B28為賴胺酸且B29，B30與B31為不存在，則A0為精胺酸。
  2. 如請求項1之改質胰島素類似物，其中B30為蘇胺酸。
  3. 如請求項1或2之改質胰島素類似物，其中A21為甘胺酸。
  4. 如請求項1至3中任一項之改質胰島素類似物，其中A0為不存在。
  5. 如請求項1至4中任一項之改質胰島素類似物，其中至少一種B31及B32為D-精胺酸。
  6. 如請求項1至5中任一項之改質胰島素類似物，其中B29為賴胺酸。
  7. 如請求項1至6中任一項之改質胰島素類似物，其中B28為脯胺酸。
  8. 如請求項1至3或5至7中任一項之改質胰島素類似物，其中A0為精胺酸。
  9. 如請求項1至6或8中任一項之改質胰島素類似物，其中B28為賴胺酸。
  10. 如請求項1至5或7至9中任一項之改質胰島素類似物，其中B29為不存在。
  11. 如請求項1至2或4至10中任一項之改質胰島素類似物，其中A21為門冬醯胺。
  12. 如請求項1至4或6至11中任一項之改質胰島素類似物，其中B31為L-精胺酸。
  13. 如請求項1至4或6至11中任一項之改質胰島素類似物，其中B31為不存在。
  14. 如請求項1或3至13中任一項之改質胰島素類似物，其中B30為不存在。
  15. 如請求項1至14中任一項之改質胰島素類似物，其中， (a)A0為不存在，A21為甘胺酸，B28為脯胺酸，B29為賴胺酸，B30為蘇胺酸，B31為精胺酸，及B32為D-精胺酸(序列代號：15及16)，(b)A0為不存在，A21為甘胺酸，B28為脯胺酸，B29為賴胺酸，B30為蘇胺酸，B31為D-精胺酸，及B32為D-精胺酸(序列代號：17及18)，(c)A0為精胺酸，A21為甘胺酸，B28為脯胺酸，B29為賴胺酸，B30為蘇胺酸，B31為精胺酸，及B32為D-精胺酸(序列代號：19及20)，(d)A0為精胺酸，A21為甘胺酸，B28為脯胺酸，B29為賴胺酸，B30為蘇胺酸，B31為D-精胺酸，及B32為D-精胺酸(序列代號：21及22)，(e)A0為精胺酸，A21為門冬醯胺，B28為脯胺酸，B29為賴胺酸，B30為蘇胺酸，B31為不存在，及B32為D-精胺酸(序列代號：23及24)，(f)A0為精胺酸，A21為甘胺酸，B28為脯胺酸，B29為賴胺酸，B30為蘇胺酸，B31為不存在，及B32為D-精胺酸(序列代號：25及26)，(g)A0為不存在，A21為門冬醯胺，B28為賴胺酸，B29為不存在，B30為蘇胺酸，B31為D-精胺酸，及B32為D-精胺酸(序列代號：29及30)，或(h)A0為不存在，A21為甘胺酸，B28為賴胺酸，B29為不存在，B30為蘇胺酸，B31為D-精胺酸，及B32為D-精胺酸(序列代號：33及34)。
  16. 一種以非肽基聚合物連接如請求項1至15中任一項之改質胰島素類似物的軛合物，該非肽基聚合物係選自下列所組成之群組：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧化乙烯化之多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、可生物分解之聚合物、脂質聚合物、甲殼素、玻尿酸、及其組合物。
  17. 如請求項16之軛合物，其中，該胰島素類似物係根據請求項1至15中任一項之定義，且該非肽基聚合物係連接至該胰島素類似物B鏈之胺基端。
  18. 一種醫藥調配物，宜為長效作用調配物，其包含如請求項1-15中任一項之改質胰島素類似物或如請求項16或17之軛合物作為活性劑及製藥可接受載劑。
  19. 一種用於治療之如請求項1-15中任一項之改質胰島素類似物或如請求項16至17之軛合物。
  20. 一種如請求項1-15中任一項之改質胰島素類似物或如請求項16或17之軛合物之用途，其係用於預防、減輕或治療胰島素缺乏症、胰島素抗藥性、肥胖症、血糖過低症，及/或神經變性失調，特別是涉及或伴隨著氧化應力、神經元軸突完整性喪失、細胞凋亡、神經元喪失、認知障礙及/或發炎反應之神經變性失調。
  21. 如請求項20之改質胰島素類似物或軛合物之用途，其中，該胰島素缺乏症為糖尿病，特別是I型或II型糖尿病。
  22. 如請求項20之改質胰島素類似物或軛合物之用途，其中，該神經變性失調係選自於下列之群組，包括：阿茲海默氏病、帕金森氏病、進行性上核麻痺症(PSP)、多發性系統萎縮症(MSA)、路易體失智症(Lewy body dementia)、帕金森氏病、癡呆、癲癇、中風、亨丁頓氏舞蹈病(Huntington's Chorea)、腦組織缺氧、多發性硬化，及末梢神經病變。
  23. 一種用於抑制血清中蛋白酶降解及/或增加胰島素類似物之血清穩定性的方法，其係藉由連接一種或多種D-胺基酸至該胰島素類似物，而產生如請求項1-15中任一項之改質胰島素類似物。
  24. 如請求項23之方法，其中該D-胺基酸(類)係連接至該胰島素類似物之C-末端。
  25. 如請求項23或24之方法，其中，該蛋白酶為羧基蛋白酶。
  26. 如請求項23至25中任一項之方法，其中該胰島素類似物較佳為胰島素(序列代號：1及2)，或甘精胰島素(序列代號：11及12)或A0(精胺酸)-甘精胰島素(序列代號：13及14)。
  27. 如請求項23至25中任一項之方法，其中該D-胺基酸(類)係藉由下列方法而引入：(a)提供胰島素類似物，例如，已任意地被肽鏈內切酶，較佳為頼胺醯肽鏈內切酶或胰蛋白酶裂解之重組產生的胰島素類似物，且(b)連接肽至該胰島素類似物，其中該肽包含一種或多種C-末端之D-胺基酸及任意一種或多種L-胺基酸，其中該D-胺基酸係替代該胰島素類似物中所對應之L-胺基酸或其中該D-胺基酸被添加到C-末端。
  28. 如請求項27項之方法，其中該胰島素類似物為胰島素重組產生之斷片或例如甘精胰島素或A0(精胺酸)-甘精胰島素之胰島素類似物，其包含於步驟(b)之前，該胰島素或胰島素類似物之A鏈及該B鏈終止於胺基酸位置B29(賴胺酸)。
  29. 如請求項27之方法，其中該胰島素類似物為甘精胰島素或A0(精胺酸)-甘精胰島素，且該方法包括用肽鏈內切酶，較佳為頼胺醯肽鏈內切酶或胰蛋白酶裂解該蛋白質。
  30. 如請求項27之方法，其中該所添加之D-胺基酸係替代已經被肽鏈內切酶裂解之胰島素類似物的L-胺基酸。
  31. 如請求項27至30中任一項之方法，其中該D-胺基酸為鹼性D-胺基酸，較佳為D-精胺酸或D-賴胺酸。
  32. 如請求項23至31中任一項之方法，其中該胰島素類似物為甘精胰島素或A0(精胺酸)-甘精胰島素，且該肽為L-蘇胺酸-L-精胺酸-D-精胺酸或L-蘇胺酸-D-精胺酸-D-精胺酸。
  33. 如請求項27至32中任一項之方法，其中該肽係經由胰蛋白酶催化之轉肽作用而添加。
  34. 一種製備改質胰島素類似物之方法，其包括：(a)提供胰島素類似物，例如，已任意地被肽鏈內切酶，較佳為頼胺醯肽鏈內切酶或胰蛋白酶裂解之重組產生的胰島素類似物，且(b)連接肽至該胰島素類似物，其中該肽包含一種或多種C-末端之D-胺基酸及任意一種或多種L-胺基酸，其中該D-胺基酸係替代 該胰島素類似物中所對應之L-胺基酸，或其中該D-胺基酸被添加到C-末端。
  35. 如請求項34之方法，其中該D-胺基酸為鹼性D-胺基酸，較佳為D-精胺酸及/或D-賴胺酸。
  36. 如請求項34或35之方法，其係用於製造如請求項1-15中任一項之改質胰島素類似物或如請求項16或17項之軛合物。
  37. 如請求項34至36中任一項之方法，其包括於步驟(a)中重組產生該胰島素或甘精胰島素之胰島素斷片或胰島素類似物，如甘精胰島素或A0(精胺酸)-甘精胰島素，包括於步驟(b)之前，該胰島素或胰島素類似物之A鏈及B鏈終止於胺基酸位置B29(賴胺酸)。
  38. 如請求項34至36中任一項之方法，其中，該胰島素類似物為甘精胰島素或A0(精胺酸)-甘精胰島素且該肽為L-蘇胺酸-L-精胺酸-D-精胺酸或L-蘇胺酸-D-精胺酸-D-精胺酸。
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