TW201522644A - 利用生物轉換製備６－羥基芹菜素之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係有關於一種利用生物轉換製備6-羥基芹菜素(6-Hydroxyapigenin)之方法，其步驟包括：分別由米麴菌(Aspergillus oryzae)與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中擴增CYP57B3與sCPR基因，並將兩基因形成一融合基因；將融合基因接合至pGAPZA載體之中以形成環狀重組質體；再將環狀重組質體置於微生物表達系統(畢赤酵母，Pichiaa pastoris)中，並在含有芹菜素之培養基內培養此微生物表達系統一作用時間；藉此，可製備出6-羥基芹菜素，尤其係經過72小時培養後，可產生產量高達0.22mg/L之6-羥基芹菜素。
Description
本發明係有關於一種利用生物轉換製備6-羥基芹菜素之方法，尤其係指利用一具有CYP57B3與sCPR融合基因的重組質體，於含有芹菜素之培養基內培養一段時間後，可以大量產生6-羥基芹菜素之方法；本發明之方法首次揭示6-羥基芹菜素可藉由生物轉換方式製備而成。
按，黃酮類化合物(flavonoid)屬於植物中一種重要的次級代謝產物，近年來發現黃酮類化合物對於人體生理有許多功效，包含抗氧化性、預防骨質疏鬆、降低心血管疾病及減緩更年期症狀等。根據化學結構上的差異，黃酮類化合物主要可分成八種亞群(subtype)：查耳酮(chalcones)、黃酮(flavones)、黃烷酮(flavanones)、異黃酮(isoflavones)、黃酮醇(flavonols)、flavandiols、花青素(anthocyanins)，以及單寧(tannins)。近來雖然已經有很多研究證實黃酮類化合物具有多種不同的生物活性，然而，低生產率仍是阻礙黃酮類化合物運用於保健食品或醫藥產品的主因。
目前已知，某些黃酮類化合物可藉由化學轉換的方式合成，然而，合成的過程通常涉及有毒化學物質和極端的反應條件，使整個製備過程難以規模放大(scale up)。為了避免這些問題，相關領域發明人開始採用
生物合成的方式製備黃酮類化合物，例如可能對大量生產有幫助的微生物宿主，大腸桿菌和酵母菌等。
細胞色素P450單加氧酶(cytochrome P450 monooxygenases,CYP)為一大類含血紅素酵素(heme-containing enzymes)，能以區域選擇性和立體選擇性的方式(heme-containing enzymes)催化各種化學反應。一般而言，這類酵素作用方式和單加氧酶類似，可將一個氧分子中的氧原子引入受質分子(substrate molecule)之化學結構內，並且必需存在另一氧原子的氫提供者(例如NADPH或NADH等)，將另一氧原子還原為水分子。在化學合成方法中，非活化的碳原子的羥基化，僅可以藉由自由基反應達成，此反應大部分無足夠的選擇性使掌性(或光學活性)羥基(chiral hydroxyl group)加在希望的位置上。因此，CYP特別具有可將氧引入非活化碳氫鍵的非凡能力紛紛引起化學家和生物化學注意。在催化過程中，CYP必須伴隨有電子提供者：細胞色素P450還原酶(cytochrome P450 reductase,CPR)作用，以將電子由NADPH或NADH轉移至CYP的血紅素區域(heme domain)。
米麴菌(A.oryzae)是目前最知名、可將大豆異黃酮生物轉換成為其鄰位羥基衍生物(ortho-hydroxyl derivatives)的微生物(Biosci.Biotechnol.Biochem.2007,71,1330-1333.)。一般而言，大多數具有黃酮類化合物羥化酶活性的細菌CYP，通常只能催化黃酮類化合物的其中一種亞群；但最近有研究指出，米麴菌之CYP(CYP57B3)與釀酒酵母(S.cerevisiae)之CPR(sCPR)共同作用下，可生物轉換異黃酮類(isoflavone)中的木黃酮(genistein)與黃酮類(flavanone)中的柚皮素(naringenin)(Appl.Environ.Microbiol.2011,77,3147-3150.)，可見CYP57B3對受質專一性和習知CYP很不同。
然而，目前仍不清楚是否CYP57B3也能生物轉換黃酮類(flavone)中的芹菜素(apigenin)，因此，此課題便成為相關領域發明人所思及之方向。
今，發明人即是鑑於上述現有之製備黃酮類化合物之方法於實際實施使用時仍具有多處缺失，於是乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，而加以改善，並據此研創出本發明。
本發明主要目的為提供一種利用生物轉換製備6-羥基芹菜素之方法，其主要係將合成之芹菜素(apigenin)藉由CYP57B3以及sCPR兩種酵素生物轉換製得6-羥基芹菜素(6-Hydroxyapigenin)。
為了達到上述實施目的，本發明一種利用生物轉換製備6-羥基芹菜素之方法，其包含下列步驟：步驟一：利用聚合酶鏈鎖反應由米麴菌之cDNA擴增CYP57B3基因，並由釀酒酵母之gDNA擴增一細胞色素還原酶基因，其中細胞色素還原酶基因係sCPR(cytochrome P450 reductase)基因；步驟二：將CYP57B3基因及細胞色素還原酶基因分別以第一、二組限制酶切割，再接合以形成一融合基因；步驟三：將一pGAPZA載體以第三組限制酶切割後，並將融合基因接合至pGAPZA載體之相對應限制酶切位上以形成一環狀重組質體；以及步驟四：將環狀重組質體置於一適合的微生物表達系統中，並利用含有芹菜素之培養基培養微生物表達系統一作用時間，以產生6-羥基芹菜素；其中，微生物表達系統係畢赤酵母。
於本發明之一實施例中，第一組限制酶係EcoR I/Bgl Ⅱ，第
二組限制酶係Bgl Ⅱ/XhoI，而第三組限制酶係EcoR I/XhoI。
於本發明之一實施例中，培養基係YPD(yeast extract peptone dextrose)培養基。
於本發明之一實施例中，作用時間超過72小時後，6-羥基芹菜素之產量可達0.22mg/L。
本發明亦提供一種如上述之方法製得之6-羥基芹菜素(6-Hydroxyapigenin)，係由芹菜素(apigenin)生物轉換製得。
(S1)‧‧‧步驟一
(S2)‧‧‧步驟二
(S3)‧‧‧步驟三
(S4)‧‧‧步驟四
第一圖：本發明較佳實施例之製備方法步驟流程圖
第二圖：(A)本發明具體實施例之流程示意圖(B)本發明具體實施例之環狀重組質體示意圖
第三圖：(A)標準品芹菜素、6-羥基芹菜素、3-羥基芹菜素之HPLC分析圖譜(B)發酵液培養72小時測得產物之HPLC分析圖譜
第四圖：本發明芹菜素生物轉換之示意圖
第五圖：本發明較佳實施例之6-羥基芹菜素產量分析圖
本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。
首先，請參閱第一圖，為本發明較佳實施例之製備方法步驟流程圖，本發明一種利用生物轉換製備6-羥基芹菜素之方法，其包含下列步驟：
步驟一(S1)：利用聚合酶鏈鎖反應由米麴菌(Aspergillus oryzae)之cDNA擴增CYP57B3基因，並由釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)之gDNA擴增一細胞色素還原酶基因，其中，細胞色素還原酶基因係sCPR(cytochrome P450 reductase)基因；步驟二(S2)：將CYP57B3基因及細胞色素還原酶基因分別以第一、二組限制酶切割，再接合以形成一融合基因；其中，第一組限制酶為EcoR I/Bgl Ⅱ，第二組限制酶為Bgl Ⅱ/XhoI，而第三組限制酶為EcoR I/XhoI；步驟三(S3)：將一pGAPZA載體以第三組限制酶切割後，並將融合基因接合至pGAPZA載體之相對應限制酶切位上以形成一環狀重組質體；以及步驟四(S4)：將環狀重組質體置於一適合的微生物表達系統中，可例如置於畢赤酵母(Pichia pastoris)中，並利用含有芹菜素之培養基(可例如為YPD培養基)培養此微生物表達系統一作用時間，以產生6-羥基芹菜素(6-Hydroxyapigenin，scutellarein)，於作用時間越長可製得越多6-羥基芹菜素，例如，當作用時間為72小時，6-羥基芹菜素之產量達0.22mg/L。
本發明亦揭示一種以上述之方法製得之6-羥基芹菜素(6-Hydroxyapigenin)，係由芹菜素(apigenin)生物轉換製得。
此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。
簡言之，本發明利用生物轉換的方式將芹菜素轉換成6-羥基芹菜素，並且，建立一個可於發酵槽中大量生產6-羥基芹菜素之條件。
實驗一：建構含有CYP57B3與sCPR融合基因之環狀重組質體
〈微生物及材料〉
由台灣生物資源保存及研究中心(Bioresources Collection and Research Center,BCRC)取得A.oryzae(BCRC32288)與S.cerevisiae(ATCC57896)菌株，並依據BCRC流程培養菌株。包含畢赤酵母(P.pastoris X-33)、載體(plasmid vector pGAPZATM)、以及抗生素(zeocin)之畢赤酵母表達套組(Eazy SelectTM Pichia expression kit)均購自Invitrogen公司(Carlsbad,CA)。芹菜素、6-羥基芹菜素，及3’-羥基芹菜素係購自Indofine化學公司(Hillsborough,NJ)。所有其他的化學物質則購自東京化成工業(Tokyo Chemical Industry,Tokyo)，並且皆為分析試劑等級。
〈建構重組畢赤酵母〉
本發明欲將米麴菌CYP57B3基因與釀酒酵母之sCPR基因融合(in-frame fusion)，形成一融合基因(fusion gene)以探討芹菜素的生物轉換情形。首先，請參閱第二圖-(A)，為本發明具體實施例之流程示意圖，使用聚合酶鏈鎖反應進行基因擴增(gene amplification by PCR)：分別由米麴菌之cDNA與釀酒酵母之gDNA擴增(amplify)CYP57B3基因與sCPR(cytochrome P450 reductase)基因，使用的引子對序列如表一所示。
接著，將擴增出的CYP57B3與sCPR基因定序並分別選殖(clone)於pETDuet-1TM載體之EcoR I/Bgl Ⅱ切位與Bgl Ⅱ/XhoI切位上以形成一融合基因pET-CYPsCPR。再利用限制酶EcoR I與XhoI切割此融合基因，並將其選殖至pGAPZA載體之相對應限制酶切位上以形成一環狀重組質體pGAP-CYPsCPR(如第二圖-(B)所示)。再利用限制酶SpaI切割pGAP-CYPsCPR，並根據表達套組(expression kit)之說明書，使用電穿孔法(electroporation)將pGAP-CYPsCPR轉形(transform)至一微生物表達系統中(P.pastoris X-33)形成畢赤酵母重組體(recombinant P.pastoris)。利用抗生素zeocin篩選重組體，並使用上述PCR方法確認融合基因插入到重組體的基因體DNA內。
實驗二：發酵作用及HPLC分析
將畢赤酵母重組體培養於20mL YPD(1% yeast extract,2% peptone,2% dextrose)培養基內，條件為28℃，200rpm，此培養基尚含有100μg/ml的抗生素Zeocin、250μM的δ-aminolevulinic acid(血紅素前驅物)和25mg/L的芹菜素(apigenin)。在預定的時間間隔內，使用高效液相層析法(high performance liquid chromatography,HPLC)進行分析。
對於大規模的反應，係將30mL的種菌培養物(seed culture)接種(inoculate)到7L的發酵槽中，此發酵槽係含有3L的YPD培養基，並添加有100μg/ml的抗生素Zeocin、250μM的δ-aminolevulinic acid、25mg/L的芹
菜素，以及1%(v/v)的消泡劑(Sigma)，然後伴隨通氣(0.5,v/v/m)和攪拌(280rpm)，於28℃進行反應。在不同時間點各收集10mL的培養物，並利用HPLC分析測定6-羥基芹菜素的含量。
藉由分析型C18逆向管柱(C18 reversed-phase column)(Spherisorb,5μm,4.6 i.d.×250mm,ODS 2,Phase Separation,Deeside Industrial Park,Clwyd,UK)進行HPLC分析的操作條件係包括：利用含有1.5%(v/v)醋酸(acetic acid)的水溶液A與乙腈(acetonitrile)溶液B梯度沖提(gradient elution)，以及利用15%溶液B初始等度沖提(isocratic elution)4分鐘；再以線性梯度(linear gradient)15%至35%的溶液B沖提20分鐘，以及用35%的溶液B進行最後10分鐘的等度沖提(isocratic elution)，流速為1毫升/分鐘；所有樣品以吸光值269nm偵測。由HPLC分析標準品得到的標準曲線，計算生成的6-羥基芹菜素含量。
實驗結果
結果一
畢赤酵母(P.pastoris)廣泛地被運用於產業利用與基礎研究上，並且已知畢赤酵母本身不能消化芹菜素(數據未顯示)。因此，本具體實施例中係以畢赤酵母表達套組(Eazy SelectTM Pichia expression kit)建構一重組微生物體。CPR將電子轉移到相對應細胞色素P450的能力對於CYP催化效率扮演至關重要的角色，有些人工合成的自足細胞色素P450(artificial self-sufficient P450)融合非自足細胞色素P450(non-self-sufficient P450)與CPR後，具有很高的催化活性。藉此，本發明人係將CYP57B3和sCPR融合(in-frame fusion)以研究芹菜素的生物轉換反應。
建構此融合基因具有兩個重要特徵：(1)移除CYP57B3的終止密碼，並將一段包含BglII限制酶切位之Arg-Ser連接序列(linker sequence)置入CYP57B3；(2)移除sCPR膜-結合區域(membrane-binding domain)的前41個胺基酸，並將一段Arg-Ser-Pro(R-S-P)連接序列置入sCPR的N端區域(如第二圖-(B)所示)。
結果顯示，由具有環狀重組質體(pGAP-CYPsCPR)的畢赤酵母重組體(recombinant P.pastoris)可生物轉換芹菜素，產生其他衍生物(羥基化產物)。
結果二
於畢赤酵母重組體發酵過程中，利用HPLC以標準品作為參考，並鑑定生物轉換出來的羥基化產物。請參閱第三圖-(A)，為標準品芹菜素、6-羥基芹菜素、3-羥基芹菜素之HPLC分析圖譜，縱軸為吸光值269nm測得的強度(intensity)，橫軸為滯留時間(retention time)；三種標準品的滯留時間分別為：6-羥基芹菜素(6-hydroxyapigenin)-17.7分鐘、3’-羥基芹菜素(3'-hydroxyapigenin)-22.1分鐘、芹菜素(apigenin)-27.1分鐘。
請參閱第三圖-(B)，為發酵液培養72小時測得產物之HPLC分析圖譜。結果顯示，相較於未加入芹菜素測得的HPLC結果，加入芹菜素發酵後產生了兩個新峰，其中，與第三圖-(A)的標準品相比較，滯留時間為17.7分鐘的新峰為6-羥基芹菜素，另一新峰則為未知產物(unknown product)，於此不多加論述。此結果證實CYP57B3也可以將芹菜素生物轉換成它的鄰位羥基衍生物(ortho-hydroxyl derivatives)一6-羥基芹菜素(如第四圖所示)。
為了進一步擴大使用重組畢赤酵母的生物轉換反應，本發明
人在含有3L YPD培養基的7L發酵槽中進行發酵。收集不同時間點的發酵樣品，並由HPLC分析標準品得到的標準曲線計算6-羥基芹菜素的產量。請參閱第五圖，為本發明較佳實施例之6-羥基芹菜素產量分析圖，縱軸分別代表6-羥基芹菜素(6-hydroxyapigenin，■)及生質(biomass，□)產量，橫軸代表發酵(培養)時間(time)；結果顯示，加入初始濃度25mg/L的芹菜素進行發酵之後，6-羥基芹菜素的產量隨著發酵時間(24小時~72小時)增加而增加，在72小時的時間點，可得到最高產量的6-羥基芹菜素達0.22毫克/升。
綜上所述，本發明之方法首次揭示6-羥基芹菜素可藉由生物轉換方式製備而成：藉由米麴菌之CYP57B3協同sCPR作用可生物轉換芹菜素成為6-羥基芹菜素；再者，於7L的發酵槽中可得到6-羥基芹菜素之產出率高達0.22毫克/升。
由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點：
1.本發明係第一個以生物轉換方式合成6-羥基芹菜素之方法，並且其產量可高達0.22mg/L。
2.先前技術指出米麴菌之CYP57B3基因可生物轉換出異黃酮類(isoflavone)中的染料木黃酮(genistein)與大豆黃酮(daidzein)、黃烷酮類(flavanone)的柚皮素(naringenin)，本發明進一步證實CYP57B3基因亦可生物轉換黃酮類(flavone)的芹菜素(apigenin)。
綜上所述，本發明之利用生物轉換製備6-羥基芹菜素之方法，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發
明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。
惟，上述所揭之圖示及說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。
(S1)‧‧‧步驟一
(S2)‧‧‧步驟二
(S3)‧‧‧步驟三
(S4)‧‧‧步驟四
Claims (6)
- 一種利用生物轉換製備6-羥基芹菜素之方法，其包含下列步驟：步驟一：利用聚合酶鏈鎖反應由米麴菌(Aspergillus oryzae)之cDNA擴增CYP57B3基因，並由釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)之gDNA擴增一細胞色素還原酶基因，其中該細胞色素還原酶基因係sCPR(cytochrome P450 reductase)基因；步驟二：將該CYP57B3基因及該細胞色素還原酶基因分別以第一、二組限制酶切割，再接合以形成一融合基因；步驟三：將一pGAPZA載體以第三組限制酶切割後，並將該融合基因接合至該pGAPZA載體之相對應限制酶切位上以形成一環狀重組質體；以及步驟四：將該環狀重組質體置於一適合的微生物表達系統中，並利用含有芹菜素之培養基培養該微生物表達系統一作用時間，以產生6-羥基芹菜素(6-Hydroxyapigenin)。
- 如申請專利範圍第1項所述之利用生物轉換製備6-羥基芹菜素之方法，其中該第一組限制酶係EcoR I/Bgl Ⅱ，該第二組限制酶係Bgl Ⅱ/XhoI，而該第三組限制酶係EcoR I/XhoI。
- 如申請專利範圍第1項所述之利用生物轉換製備6-羥基芹菜素之方法，其中該微生物表達系統係畢赤酵母(Pichia pastoris)。
- 如申請專利範圍第1項所述之利用生物轉換製備6-羥基芹菜素之方法，其中該培養基係YPD(yeast extract peptone dextrose)培養基。
- 如申請專利範圍第1項所述之利用生物轉換製備6-羥基芹菜素之方法，其中該作用時間超過72小時後，該6-羥基芹菜素之產量達0.22mg/L。
- 一種如申請專利範圍第1項所述之方法製得之6-羥基芹菜素(6-Hydroxyapigenin)，係由芹菜素(apigenin)生物轉換製得。
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| CN110885846A (zh) * | 2018-09-07 | 2020-03-17 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 合成黄芩素和野黄芩素的微生物、其制备方法及其应用 |
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| CN110885846B (zh) * | 2018-09-07 | 2023-08-25 | 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 | 合成黄芩素和野黄芩素的微生物、其制备方法及其应用 |
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