TW201513878A - 石斛多醣於治療過敏性疾病之醫藥用途 - Google Patents

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Abstract

本案提出了使用取自石斛屬之多醣來治療過敏性疾病或減少發炎引起之氣管病變。

Description

石斛多醣於治療過敏性疾病之醫藥用途
本發明係關於治療過敏性疾病之方法，進一步地說，係關於對需要該治療之對象投以分離自石斛屬(Dendrobium)之多醣。
石斛屬(Dendrobium)是一種廣泛分布於亞洲、歐洲、與澳洲的熱帶蘭花屬別。其中部份種類在傳統中草藥療法中用於增進膚質與視力已有長久的歷史。石斛屬植物已被報導具有抗氧化(antioxidation)、抗發炎(anti-inflammation)與免疫調節(immune-regulation)的活性。參見Satoh et al.,Biochem.Pharmacol.51：339-343,1996；Yamaguchi et al.,Cordyceps sinensis.Phytoher.Res.14：647-649,2000；Zhao et al.,J.Biochem.Molecular Bio.40(5)：670-677,2007；以及US 20060251739。
本發明係基於不可預期地發現由石斛(Dendrobii Herba)(即石斛屬之莖)製備之多醣可有效治療過敏性疾病，諸如氣喘(asthma)、花粉過敏(pollen allergy)、過敏性結膜炎(allergic conjunctivitis)、以及異位性皮膚炎(atopic determitis)。
因此，本發明提供了治療過敏性疾病(如，氣喘、花粉過敏、過敏性結膜炎、或異位性皮膚炎)的方法，係藉由對於需要該治療之對象投以(如，口服)有效量之製備自石斛之多醣。
名辭「治療」在本文中係指對一對象施用或投以包含一或多種活性劑，該對象具有過敏性疾病、過敏性疾病之症狀、或是有引發過敏 性疾病之傾向，其目的在於治癒、治療、緩和、減輕、改變、矯正、改善、改進、或影響該疾病、該疾病之症狀、或是有引發該疾病之傾向。
名辭「有效量」在本文中係指各活性劑在與一或多種其他活性劑共同投藥至需要該治療之對象體內時，對該對象產生治療作用所需之量。如熟習技藝者所知，有效量會根據投藥途徑、賦形劑之使用、以及其他活性劑之共同使用而有所不同。
在本發明之一實例中，用以實施本發明方法之多醣係藉由包含至少下列五步驟之方法而製備：(1)浸泡第一種石斛生藥於第一種醇類，(2)移除第一種醇類以產生第二種石斛產物，(3)以水或含有水之溶劑萃取第二種石斛產物來獲得水溶液，(4)混合此水溶液與第二種醇類(如，50%體積比之乙醇)以進行多醣之沉澱，以及(5)收集沉澱之多醣。
本發明更提供了一種減低發炎導致的氣管病變之方法，其係藉由對於需要該治療之對象投以有效量之前述多醣。
本發明之範圍亦包含了使用本發明所述之多醣來治療過敏性疾病或減少發炎引起之氣管病變，或是用以製造進行這些治療之藥物。
本發明一或多個具體實例之細節示於下文之敘述。本發明之其他特徵、受體、或優點將可由下文中數個具體實例之詳細敘述以及附呈之申請專利範圍而得悉。
所附之圖式說明了本案的一個或是更多實例，並且在配合相關之說明內容後，兩者一併用來解釋本案的原理。其中，在圖式中盡可能使用相同的參考符號來代表相同或是類似的實例元件。
前述本案的示範性實施例說明僅是為了說明與描述本案，不是用來詳盡無遺地描述本案或是用來將本案限制在所提出的樣態中。在按照上述教示後可對前述實施例樣態進行調整與改變。
本案所提的實施例與範例是為了解釋本案的原理以及應用，以使在此領域具有通常知識者能利用本案、各種實施例與範例，並使在此領域具通常知識者仔細考量後對本案的實施例與範例進行改變以供特殊用途。對於在此領域具有通常知識者而言，其他不脫本案精神與範圍的實施將成為明顯而可行的。本案的主張範圍是由所附申請專利範圍定義而不侷限在前述的說明與示範性實施例內容。
在圖式中：圖1係圖示實例2中石斛對於小鼠之呼吸道過度反應試驗(AHR test)之效應，其係以Penh相對量之形式作記錄並以Buxco XA系統分析。陰性控制組(6隻，□)係正常小鼠。控制組(10隻，)係以卵白蛋白(OVA)致敏化但不以石斛處理。處理組係以卵白蛋白致敏化並餵食劑量為10mg/kg/day(8隻，)、30mg/kg/day(8隻，)、與90mg/kg/day(8隻，)之石斛多醣。記錄Penh並以Buxco XA系統分析。*表示p<0.05。
圖2係圖示實例2中小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中計數之總細胞數。陰性控制組(6隻，□)係正常小鼠。控制組(10隻，)係以卵白蛋白致敏化但不以石斛處理。處理組係以卵白蛋白致敏化並餵食劑量為10mg/kg/day(8隻，)、30mg/kg/day(8隻，)、與90mg/kg/day(8隻，)之石斛多醣。*表示p<0.05。
圖3係圖示實例2中小鼠支氣管肺泡灌洗液中白血球之百分比。圖3A至3C分別表示支氣管肺泡灌洗液中單核球、淋巴細胞、與嗜酸性白血球之百分比的結果。陰性控制組(6隻，□)係正常小鼠。控制組(10隻，)係以卵白蛋白致敏化但不以石斛處理。處理組係以卵白蛋白致敏化並餵食劑量為10mg/kg/day(8隻，)、30mg/kg/day(8隻，)、與90mg/kg/day(8隻，)之石斛多醣。*表示p<0.05。
圖4係圖示實例2中小鼠肺切片之蘇木紫與伊紅染色(H&E stain)結果。自小鼠取出肺組織，接著固定於10%福馬林。三天後，將肺包埋於石蠟中並切成5μm-厚度之切片。圖4A至4E分別表示實例2中的五種分組：正常組(正常小鼠作為陰性控制組)、控制組(小鼠以卵白蛋白致敏化但不以石斛處理)、處理組係以卵白蛋白致敏化並餵食劑量為10mg/kg/day(8隻)、30mg/kg/day(8隻)、90mg/kg/day(8隻)之石斛多醣。放大倍率為100倍。
圖5係圖示實例2中小鼠腸固有層淋巴細胞中調節性T細胞(Treg細胞)之百分比。CD4+CD25+細胞之比例係以流式細胞儀分析。陰性控制組(6隻，□)係正常小鼠。控制組(10隻，)係以卵白蛋白致敏化但不以石斛處理。處理組係以卵白蛋白致敏化並餵食劑量為10mg/kg/day(8隻，)、30mg/kg/day(8隻，)、與90mg/kg/day(8隻，□)之石斛多醣。*表示p<0.05。
圖6係圖示實例2中石斛對於小鼠卵白蛋白專一性免疫球蛋白E含量之效應。圖6A表示血清中含量之結果，而圖B表示支氣管肺泡灌洗液中含量之結果。陰性控制組(6隻，□)係正常小鼠。控制組(10隻，)係以卵白蛋白致敏化但不以石斛處理。處理組係以卵白蛋白致敏化並餵食劑量為10mg/kg/day(8隻，)、30mg/kg/day(8隻，)、與90mg/kg/day(8隻，)之石斛多醣。**表示p<0.01。
圖7係圖示實例2中小鼠肺組織之反轉錄-聚合酶連鎖反應(RT-PCR)結果。圖7A至7E分別表示介白素-13(IL-13)、嗜伊紅趨化原-1(eotaxin-1)、吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)、介白素-17(IL-17)、胸線基質淋巴生成素(TSLP)之基因表現量。所有信使核醣核酸(mRNA)表現量係與β-肌動蛋白(β-actin)之信使核醣核酸標準化。陰性控制組(6隻，□)係正常小鼠。控制組(10隻，)係以卵白蛋白致敏化但不 以石斛處理。處理組係以卵白蛋白致敏化並餵食劑量為10mg/kg/day(8隻，)、30mg/kg/day(8隻，)、與90mg/kg/day(8隻，)之石斛多醣。*表示p<0.05。
圖8A係照片圖示無致敏化之正常組小鼠於刺激24小時後的發炎眼睛。
圖8B係照片圖示經主動免疫但不以多醣處理之控制組小鼠於刺激24小時後的發炎眼睛。
圖8C係照片圖示小鼠經主動免疫並口服給予30mg/kg/day萃取自石斛之多醣的發炎眼睛。
圖8D係照片圖示小鼠經主動免疫並口服給予90mg/kg/day萃取自石斛之多醣的發炎眼睛。
圖9係圖示各組小鼠之淚液產生，其係藉由測量濾紙條上顏色改變之長度(mm)。**表示p<0.01。
圖10A係照片圖示正常組小鼠的嗜酸性白血球浸潤至結膜。
圖10B係照片圖示主動免疫但不以多醣處理之控制組小鼠的嗜酸性白血球浸潤至結膜。
圖10C係照片圖示小鼠經主動免疫並口服給予30mg/kg/day萃取自石斛之多醣的嗜酸性白血球浸潤至結膜。
圖10D係照片圖示小鼠經主動免疫並口服給予90mg/kg/day萃取自石斛之多醣的嗜酸性白血球浸潤至結膜。
圖10D係圖示嗜酸性白血球浸潤至結膜之計數結果。*表示p<0.05(相較於控制組)。
圖11係圖示於第0、24、與40天以酵素免疫分析法(ELISA)測量血清中豕草花粉專一性免疫球蛋白E含量。正常組(□)係健康小鼠。 控制組()係以豕草花粉致敏化但不以石斛多醣處理。處理組係以豕草花粉致敏化並餵食劑量為30mg/kg/day()與90mg/kg/day()之石斛多醣。**表示p<0.01。
圖12A係圖示以流式細胞儀分析脾臟細胞中CD4+CD25+T細胞之數量。*表示p<0.05。
圖12B係圖示以流式細胞儀分析血清中CD4+CD25+T細胞之數量。*表示p<0.05。
圖13係圖示耳之厚度。正常組(□)係健康小鼠。控制組()係以1%噁唑酮(oxazolone)致敏化但不以石斛多醣處理。處理組係以1%噁唑酮致敏化並餵食劑量為10mg/kg/day()、30mg/kg/day()、與90mg/kg/day(□)之石斛多醣。***表示p<0.001。
一般而言，本說明書中所使用的術語都有其在本發明背景領域中的通常意義，以及其在特定背景中使用時的意義。某些用以描述本發明的術語將於後討論，或是在說明書中的其他地方討論，以供做為從事者瞭解本發明說明的額外指導。為了方便起見，某些術語可能會被強調，例如使用斜體字及/或引號來表現。
使用強調的方式表現並不影響術語的範圍與意義，在相同背景下，不管術語是否有被強調，該術語的範圍與意義仍是相同的。值得注意的是同一件事可能會以超過一種方式來說明；因此，在本文中會使用可替換性地語言以及同義詞來表現任何一個或更多的術語，不論該術語是否有在文中進行精闢的闡述或是討論，使用可替換性地語言以及同義詞都沒有特定的意義。本案會提供某些術語的同義詞。一個或更多常用的同義詞並不排除其他同義詞的使用。本說明書中任何部分所提到的例 子(包含所討論的任何術語例子)都是用來說明而已，並沒有限制本發明的範圍、意義或是任何當作例子來說明的術語。同樣地，本發明也不受限於本說明書所提供的各種實施例中。
除非有特別地定義，否則在本說明書中所提及的技術性或是特定術語都有其對於在本發明所屬領域中具通常知識者一般所瞭解的相同意義。至於意見分歧的部分，本申請文件(包含定義的部分)將會進行控管。
本文中所提到的『約』、『大約』或是『大概』一般是指一指定數值或是範圍的20%以內，較佳地是指10%以內，而更佳地是指5%以內。所提到的數值量只是接近值，意指如果沒有明確表示，則『約』、『大約』或是『大概』這些術語可以經推想而知。
本文係敘述使用石斛(Dendrobii Herba)多醣治療過敏性疾病。「多醣」係聚合物，其組成包含藉由醣苷鍵(glycosidic bond)結合之若干單醣。一個多醣分子包含10個以上之各種單醣，如葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、半乳糖(galactose)、木醣(xylose)、或核醣(ribose)。多醣分子可具有線狀或分支狀結構。
用以施行本發明方法之多醣可經由各種常見方法自石斛中製備。舉例如下。將石斛屬(Dendribium)植物(如，環草石斛(Dendrobium loddigesii)、馬鞭石斛(Dendrobium fimbriatum var.oculatum)、黃草石斛(Dendrobium chrysanthum)、鐵皮石斛(Dendrobium candidum ex Lindl)、或金釵石斛(Dendrobium nobil))的莖收集、乾燥、以及於醇類(如，甲醇(methanol)、乙醇(ethanol)、或其混合物)中浸泡一段適當的期間(如，至少一小時，例如隔夜)。經由例如蒸發移除醇類後，將此石斛屬莖產物浸泡於水中一適當期間(如，12-16小時)。不溶的物質係經由離心或過濾移除，以產生可溶的部份。該可溶部份係與一醇類(如， 30-70%(v/v)乙醇)混合以沉澱多醣。視需要，在與醇類混合之前，該水溶部分以溫水稀釋並維持在50-70℃中20-60分鐘。沉澱物係藉由例如離心來收集，且較佳者乾燥之，以獲得本發明方法所使用之多醣。
前述石斛多醣可與醫藥可接受之載劑混合，視需要，與另一治療活性劑混合，以形成醫藥組合物。適用於醫藥組合物之載劑必須為「可接受」，意謂其可與該組合物之活性成分相容(且較佳者，可安定該活性成分)，以及不會對欲治療之對象有害。一或多種助溶劑可被使用作為醫藥賦形劑，以傳遞含有多醣之醫藥組合物。其它載劑之實例包括糊精(dextrine)、二氧化矽(silicon oxide)、硬脂酸鎂(magnesium stearate)、纖維素(cellulose)、十二烷基硫酸鈉(sodium lauryl sulfate)、藥品與化妝品用黃色10號(D&C Yellow # 10)、微晶纖維素(microcrystalline cellulose)、甘露醣醇(mannitol)、葡萄糖、脫脂奶粉(defatted milk powder)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、以及澱粉(starch)，或其組合。該醫藥組合物可為各種形式，諸如，錠劑、膠囊、粉末、膠體、或液體。
所述醫療組合物係經由適當的途徑投予對象，如口服投予，每日一或多次，或是每數日投予一次。口服投予之固體調配物可包含適當之載劑或賦形劑，諸如，玉米澱粉(corn starch)、明膠(gelatin)、乳糖(lactose)、阿拉伯膠(acacia)、蔗糖(sucrose)、微晶纖維素、高嶺土(kaolin)、甘露醣醇、磷酸二鈣(dicalcium phosphate)、碳酸鈣(calcium carbonate)、氯化鈉(sodium chloride)、或藻酸(alginic acid)。可使用的崩散劑包括，但不限於，微甘醇酸鹽(microglycolate)、以及藻酸。可使用的錠劑黏合劑包括阿拉伯膠、甲基纖維素(methylcellulose)、羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethylcellulose)、聚乙烯吡咯烷酮 (Povidone3)、羥丙基甲基纖維素(hydroxypropyl methylcellulose)、蔗糖、澱粉、以及乙基纖維素(ethylcellulose)。可使用的潤滑劑包括硬脂酸鎂、硬脂酸(stearic acid)、液態矽(silicone fluid)、滑石(talc)、蠟(wax)、油(oil)、以及膠態二氧化矽(colloidal silica)。
所述固體調配物可經設計以在腸內釋放其組合物。舉例而言，該組合物係限制於固體次單元或膠囊隔間中，其分別具有包含腸溶性聚合物之基質或壁或封壁，其在小腸或大腸之pH下會溶解或分散，以在腸內釋放該藥物物質。
在另一實例中，上述多醣係與一或多種可食用之載劑混合，以形成食品產物(如，優格、奶、或豆奶)、或食品添加物(如，營養補給或草藥產物)。可食用載劑之實例包括澱粉、環糊精(cyclodextrin)、麥芽糊精(maltodextrin)、甲基纖維素、甲氧羰基纖維素(carbonmethoxy cellulose)、三仙膠(xanthan gum)、以及其水溶液。此等食品產物可以食品產業中已知之方法製備。在本文中，名辭「食品」係泛指各種液態與固態/半固態材料，其用以滋養人類以及動物、維持正常或加速生長、或是保持精力或敏捷。
本文所述之多醣可用以治療過敏性疾病，例如與嗜酸性白血球(eosinophil)、免疫球蛋白E(Immunoglobulin E，簡稱IgE)、化學激素(chemokine)、或是第二型輔助性T細胞細胞激素(Th2 cytokine)之增加相關的過敏性疾病。已知過敏原可引發一系列免疫反應，包括T細胞分化成第二型輔助性T作用細胞(Th2 effector cell)；釋放第二型輔助性T細胞細胞激素(如，介白素-4(Interleukin-4，簡稱IL-4)、介白素-5(Interleukin-5，IL-5)、介白素-6(Interleukin-6，IL-6)、與介白素-13(Interleukin-13，IL-13))；產生免疫球蛋白E；以及活化 嗜中性白血球(neutrophil)、嗜酸性白血球或肥胖細胞(mast cell)。過敏原所引發的免疫反應可導致各種過敏性疾病，諸如，氣喘、花粉過敏、過敏性結膜炎、以及異位性皮膚炎。
氣喘係一種呼吸系統的慢性疾病。在人類中，其主要的特徵有呼吸道發炎、高度黏稠黏液的過度分泌、以及支氣管收縮。此呼吸道窄化導致的症狀諸如喘鳴、呼吸短促、胸部緊悶感、以及咳嗽。所述特徵可能藉由諸如暴露於環境的刺激(或過敏原)、冷空氣、暖空氣、潮濕空氣、或情緒壓力所引發。此外，過敏性致敏化作用(allergic sensitization)亦可藉由產生對抗環境抗原之免疫球蛋白E、吸引淋巴細胞(lymphocyte)與嗜酸性白血球至肺或血清中、以及引起第二型輔助性T細胞細胞激素或化學激素的產生來定義。在已開發世界中，因為氣喘的盛行率快速增加，且影響將近四分之一的都市兒童，近來已受到大眾的注意。參見Craig M.Lilly,Journal of Allergy and Clinical Immunology,Vol.115,Issue 4,Supplement 1,April 2005,Pages S526-S531。
相同於氣喘，過敏性結膜炎與異位性皮膚炎皆起因於對過敏原，諸如花粉，的過度敏感；然而，發炎部位與症狀不同。相似地，這些過敏性疾病亦與第二型輔助性T細胞細胞激素或化學激素過多、以及發炎部位之免疫球蛋白E和嗜酸性白血球之數量比例相關。
結膜係覆蓋於眼睛的薄膜。當過敏原刺激結膜，會發生於眼睛的一般症狀包括：眼癢、眼瞼腫脹、流淚、畏光、水狀分泌物、以及異物感。過敏原會引發前述典型的過敏性進程。研究顯示患者在一些活動上會受到限制，諸如戶外活動、閱讀、睡眠、以及駕駛。因此，治療過敏性結膜炎之患者可增進其日常生活之品質。
特異體質過敏症(atopy)，或異位性症候群(atopic syndrome)，係一種過敏性過敏症(allergic hypersensitivity)，其影響身體非與過敏原直接接觸的部位。特異體質過敏症包含濕疹(eczema)(異位性皮膚炎)、過敏性結膜炎、過敏性鼻炎(allergic rhinitis)、以及氣喘。其中似乎有極大的遺傳因素。異位性症候群可因嚴重的過敏性反應而致命，諸如重度過敏反應(anaphylaxis)，其起因於對食物或環境的反應。雖然特異體質過敏症有許多種定義，其最普遍被定義為患者血清中出現總量以及過敏原專一性免疫球蛋白E之增加，致使對於一般過敏原之皮膚穿刺試驗(skin-prick test)呈現陽性反應。自20世紀以來，許多黏膜發炎疾病已顯著地變得更為普遍，而特異體質過敏症即為此等疾病之典型例子。在工業化國家中，特異體質過敏症目前發生於10-20%之兒童以及1-3%之成人，而其盛行率在過去三十年中已增加超過一倍。
本文所述之石斛多醣亦可用以增加調節性T細胞(T regulatory cell)在腸固有層(intestinal lamina propria)部位的族群量，其係經由如口服投予。名辭「調節性T細胞」在本文中係指T細胞之特定亞族群，其作用在於壓制免疫系統之活化以及因此維持免疫系統之恆定與對自我抗原之耐受性。有時，其亦被稱為抑制性T細胞(suppressor T cell)。調節性T細胞有多種類型，包括表現有CD8穿膜醣蛋白(CD8+ T細胞)、表現有CD4、CD25、與Foxp3(CD4+CD25+調節性T細胞或「Treg細胞」)、以及其它有抑制性功能之T細胞種類。在本發明之一具體實例中，該調節性T細胞係指表現有CD4與CD25之族群。
名辭「腸固有層」在本發明中係指疏鬆結締組織(loose connective tissue)之一薄層，其位於上皮(epithelium)之下並與上皮構成黏膜(mucosa)。該區域中，有許多免疫細胞留在此處，例如，樹狀細胞 (dendritic cell)、巨噬細胞(macrophage)、T細胞、B細胞、或肥胖細胞等。
在另一實例中，該多醣亦可降低投予對象之血清與支氣管肺泡灌洗液(brochoalveolar lavage fluid，簡稱BALF)中之免疫球蛋白E。免疫球蛋白E於過敏之致病機轉中具有重要的角色。如同其他免疫球蛋白，免疫球蛋白E係B淋巴細胞在暴露於來自環境之外來抗原後所製造。當二或多個細胞表面結合之免疫球蛋白E同時連結至其專一性過敏原，細胞會立即釋放既成之發炎細胞激素，包括組織胺(histamine)，其會引起立即型效應或過敏之初期反應。該細胞激素吸引嗜酸性白血球、巨噬細胞、以及更多的嗜鹼性白血球(basophil)至該區域。這些新合成之物質與受其吸引而至的細胞係參與晚期過敏反應之重要成員。免疫球蛋白E、過敏、以及氣喘之間的緊密關聯早已被確認(Platts-Mills TAE,Am J Respir Crit Care Med,164：S1-S5,2001；Milgrom H,et al.,N Eng J Med.,341：1966-73,1999)。在本發明之一實例中，餵食萃取自石斛之多醣的小鼠，其血清與支氣管肺泡灌洗液中有較低之免疫球蛋白E。所述小鼠亦具有較少之嗜酸性白血球與細胞激素或化學激素，其吸引免疫細胞以及刺激呼吸道上皮。因此，該萃取自石斛之多醣可治療氣喘。
在另一實例中，該多醣係用以減低發炎引起之氣管病變，其係藉由口服投予該對象萃取自石斛之多醣。
名辭「氣管病變(airway-remodeling)」在本文中係指結構之改變，其發生係與慢性呼吸道發炎相關或起因於此。氣管病變造成在呼吸道上皮、固有層、以及黏膜下層(submucosa)之改變，而導致氣道壁(airway wall)增厚。氣喘之氣管病變的後果包括不完全可逆之呼吸道 窄化、支氣管過度反應(bronchial hyper-responsiveness,)、呼吸道水腫(airway edema)、以及黏液過度分泌。
在不須進一步詳盡闡述之情形下，咸信熟習技藝者可根據上文之敘述而將本發明使用至其最完全之程度。因此，下述之特定具體實例僅被視為說明，且不以任何方式限制本揭示內容之其他部分。所有本文所引述之刊物以其全文併入本文作為參考。
實例1：石斛中多醣之製備
2Kg之新鮮石斛係乾燥以形成乾燥之材料，接著以20L之甲醇浸泡處理以獲得經處理之植物。此經處理之植物經過去甲醇之流程，接著浸泡於水中隔夜以獲得隔夜之水溶液。此隔夜之水溶液係以24L之溫水於60℃萃取30分鐘，接著於10℃離心5000rpm(ER-RC13 C-124,HITACH)。離心後，上層液以孔徑6μm之濾紙過濾。此濾液以50%(v/v)乙醇沉澱以獲得多醣。
實例2：萃取自石斛之多醣對於氣喘之效應
氣喘動物模式之建立
BALB/c雄性小鼠隨機分組為正常組(6隻，健康小鼠作為陰性控制組)、控制組(10隻，小鼠以卵白蛋白(ovalbumin，簡稱OVA)致敏化，但不給予萃取自石斛之多醣)、以及以卵白蛋白致敏化並給予劑量為10mg/kg/day(8隻)、30mg/kg/day(8隻)、90mg/kg/day(8隻)萃取自石斛之多醣的處理組。除了正常組，所有小鼠分別於第1與第14天以腹腔注射(intraperitoneal injection)方式給予含有20與50μg/mL卵白蛋白(Sigma，USA)以及2mg與5mg氫氧化鋁(Al(OH)3)作為佐劑之磷酸鹽緩衝液(phosphate-buffered saline，簡稱PBS)以致敏化。陰性控制組小鼠係以腹腔注射方式於每次致敏化時間點給予一倍 濃度之磷酸鹽緩衝液。所有小鼠於第28、29、與30天皆暴露於含有1%卵白蛋白之磷酸鹽緩衝液中20分鐘，其係以超音波噴霧器(ultrasonic nebulizer，Buxco)進行。於第31天，所有小鼠以不同濃度之乙醯-β-甲基膽鹼(methacholine)進行呼吸道過度反應(Airway hyperresponsiveness，簡稱AHR)試驗，並於隔天犧牲(該試驗係參考Charles Perkins et al.,J.Allergy Clin.Immunol.,118(2)：410-419)。分別於第0、21、以及呼吸道過度反應試驗後自小鼠眼窩(眼後靜脈叢(retro-orbital venous plexus))採集血液。此血液樣本係用以測試卵白蛋白專一性抗體。
對於乙醯-β-甲基膽鹼之呼吸道過度反應之測量
小鼠係無拘束地置於圓柱狀塑膠玻璃製體機描記容器(plethysmograph chamber)，其係連接至一霧化控制氣霧傳遞系統(Buxco nebulized control aerosol delivery system)與一整體體積描記分析裝置(Buxco Max II apparatus for analyzing barometric plethysmography,Buxco Electronics,Sharon,Conn)。呼吸道阻力(enhanced pause，簡稱Penh)之基線測量係以超過5分鐘之期間來進行。Penh係指氣流阻塞之無單位量值，其反映與吸氣和呼氣間及時之量化差異與程度相關之肺功能變化。具體地說，Penh被認為係反映測量容器內壓力訊號之波型變化之參數以及呼吸道阻塞之指數，該波型變化係支氣管收縮(bronchoconstriction)之結果。氣喘之嚴重度可以Penh評估(Zhang et al.,J.Allergy Clin.Immunol.,Feb；113(2)：320-6,2007)。
小鼠藉由噴霧器(Buxco Electronics,Sharon,Conn)吸入霧化之含有乙醯-β-甲基膽鹼之磷酸鹽緩衝液以刺激3分鐘，該乙醯-β-甲基膽鹼之起始濃度為6.25mg/mL。Penh之測量開始於暴露在霧化之乙醯-β- 甲基膽鹼完成之後，並計算此3分鐘期間之平均Penh。其後，連續地重複上述流程，並改變乙醯-β-甲基膽鹼之濃度為12.5mg/mL與25mg/mL。所有記錄結果係以基線測量值作標準化，各組結果係表示於圖1。
呼吸道過度反應係呼吸道阻塞以及氣喘之重要症狀，諸如呼吸急促、胸部緊悶感、咳嗽、與說話困難，之重要因素。因此，抑制呼吸道過度反應可減輕氣喘之嚴重度。如圖1所示，相較於對照組，三組處理組對於25mg/mL氣霧化乙醯-β-甲基膽鹼之Penh反應皆有顯著地降低。此結果指出萃取自石斛之多醣可抑制呼吸道過度反應，因此，其可治療氣喘。
支氣管肺泡灌洗液之分析
支氣管肺泡灌洗液係藉由肺內肺泡之洗出而獲得之液體。其係用以測定肺間質組織(interstitial lung tissue)中生物化學與發炎之變化，藉此評估本發明方法之功效。
小鼠頸椎脫臼後，使氣管暴露並插入聚乙烯導管。小鼠支氣管肺泡灌洗液係藉由通過之氣管灌入1mL之磷酸鹽緩衝液而收集。此灌洗液經離心後，取上清液進行抗體測定，而總細胞計數係得自離心之沉澱物。該沉澱物係製備成細胞離心玻片(cytospin slide)並以劉氏染色法(Liu’s stain)染色，其係改良自Giemsa氏染色法(Sevens,M.L.Fundamentals of clinical hematology.,W.B.Saunders company,1997)。
小鼠支氣管肺泡灌洗液之細胞係先以0.5mL劉氏染液A(Liu’s A solution)染色30秒(劉氏染液A係經由溶解0.18g伊紅Y(Eosin Y)與0.05g甲基藍(Methylene blue)於100mL甲醇，接著以3號濾紙(No.3 filter paper)過濾而製備)。之後，立即加入1mL劉氏染液B(Liu’s B solution)與玻片上之劉氏染液A混合(劉氏染液B係經由溶解0.12g甲基藍、0.14g天青B(Azure B)、2.52g磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、與1.26g磷酸二氫鉀(KH2PO4)於100mL水，接著以3號濾紙過濾而製備)。反應60秒後，玻片經水洗以洗去染液。玻片風乾後，於光相位顯微鏡(optical phase microscope)下進行檢驗，計數總數300顆細胞後分析其中差異。結果表示於圖2與圖3。
如圖2所示，相較於控制組，90mg/kg/day處理組之總細胞數有顯著地降低。再者，各種細胞(嗜酸性白血球(eosinophil)、嗜中性白血球(neutrophil)、單核球(monocyte)、與淋巴細胞(lymphocyte))之百分比表示於圖3。相較於控制組，口服處理90mg/kg/day石斛多醣之組，其嗜酸性白血球與淋巴細胞之百分比顯著地減少。
我們出乎意料地發現，自石斛取得之多醣可有效治療氣喘，其係透過下述機制。嗜酸性白血球已被報導在氣喘發展中有重要角色。參見Walsh G.M.,Curr Opin Hematol.,8(1)：28-33,2001；與Menzies-Gow A et al.,J Asthma.,38(8)：605-13,2001。如上所示，石斛多醣減少支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性白血球之數量，因而緩和氣喘之症狀。
萃取自石斛之多醣對於肺中嗜酸性白血球增多與氣管病變之效應
取得支氣管肺泡灌洗液後，肺組織於10%中性緩衝福馬林(neutral buffered formalin)中固定24小時。肺組織以石蠟(paraffin)包埋並切片為5μm厚度。切片以蘇木紫與伊紅染液(Haematoxylin & Eosin solution，簡稱H&E solution；hematoxylin，Sigma MHS-16；eosin，Sigma HT110-1-32)進行染色。實驗結果照相並示於圖4。
氣喘係以呼吸道粘膜之特殊發炎模式為特徵，並包含嗜酸性白 血球之浸潤、增加第二型輔助性T細胞(TH2)之數量，其係相對於第一型輔助性T細胞(TH1)。此外，呼吸道有特有之結構改變，稱為重建(remodeling)，其部份改變可能甚至在此疾病之發展前。這些見於氣喘患者之結構改變可包括呼吸道壁網狀基底膜(reticular basement membrane)之增厚、異常彈性纖維網絡(elastic fiber network)之形成、呼吸道軟骨(cartilage)結構之改變、血管新生(angiogenesis)、以及呼吸道平滑肌(smooth muscle)量之增加。
本發明中，控制組顯著地呈現呼吸道上皮基底層(epithelium basement)之增厚與支氣管狹窄。當處理石斛多醣之劑量增加，氣管病變之特徵隨之減低且支氣管之直徑回至正常。合併圖2之結果，本發明之一特點為減少嗜酸性白血球與淋巴細胞之方法，亦減輕呼吸道重組之症狀。
口服給予萃取自石斛之多醣可增加Treg細胞在腸固有層之百分比
小鼠係以頸椎脫臼法犧牲。立即取出小腸，並於Hanks氏平衡鹽溶液(Hank's buffered saline solution，簡稱HBSS，其含有HEPES、不含鈣與鎂離子)中清洗。小心地剪下集合淋巴結(Peyer’s patch)，並將小腸剪成片段。為移除上皮細胞，此小腸片段係於1mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol，簡稱DTT，Amresco，USA)溶液與1mM乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，簡稱EDTA，Sigma，USA)中於37℃反應1小時。反應後，將此小腸片段切碎成1-mm碎片並於含有30unit/mL第一型膠原蛋白酶(Collagenase Type I，Sigma，USA)、10unit/mL第二型膠原蛋白酶(Collagenase Type II，Sigma，USA)、與10%胎牛血清(fetal calf serum，簡稱FCS)之RPMI 1640(Gaithersburg， USA)中於37℃分解1小時。將酵素分解後之組織通過尼龍篩網(nylon mesh，Small Parts，USA)以獲得細胞。經過清洗，單核細胞(mononuclear cell)係藉由於細胞分離液(Percoll，GE Healthcare，USA)中離心而取得。
調整此單核細胞至1×106 cells/mL，並加至管中與螢光異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate，簡稱FITC)結合之CD4抗體(BD Biosciences，USA)以及與藻紅素(phycoerythrin，簡稱PE)結合之CD25抗體(BD Biosciences，USA)於4℃避光反應30分鐘。細胞接著以冷的磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗二次，並經由雙色螢光標記流式細胞術(two-color cytometry)分析，其係以FACScan流式細胞儀(FACScan flow cytometry，BD Biosciences，USA)執行。CD4+CD25+細胞之細胞數除以CD4+細胞之細胞數係Treg細胞之比例。結果示於圖5。餵食90mg/kg/day石斛多醣之小鼠有較多之Treg細胞於腸固有層。
萃取自石斛之多醣對於卵白蛋白(ovalbumine，簡稱OVA)致敏化之小鼠之血清與支氣管肺泡灌洗液中卵白蛋白專一性免疫球蛋白E之效應
於第1、14天與犧牲前一天收集之血清以及支氣管肺泡灌洗液係以酵素免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，簡稱ELISA)測定卵白蛋白專一性免疫球蛋白E。此項試驗係參照廠商操作需知而施行。血清樣本重複測定係稀釋至1：50，支氣管肺泡灌洗液則不稀釋。此試驗所用之抗體係與鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase，簡稱AP)結合之山羊抗小鼠免疫球蛋白E(goat-anti-mouse IgE)，其係購自Southern BioTech(USA)。如圖6所示，血清免疫球蛋白E顯著地降低於90mg/kg/day石斛多醣組。然而，支氣管肺泡灌洗液之免疫球蛋白E亦於 相同組別有下降的趨勢。
現今，許多研究已指出免疫球蛋白E係立即過敏性反應之主要因子，因其可於過敏原與嗜中性白血球間形成一橋梁，並引起細胞之去顆粒反應(degranulation)而釋出無數既成之媒介物(mediator)與細胞激素(cytokine)(Holgate S et al.,J Allergy Clin.Immunol.,115：459-465,2005；Cooper PJ,Parasite Immunol.26：455-467,2004；Milgrom H,et al.,ut supra)。因此，免疫球蛋白E合成之中和或抑制可作為治療過敏性疾病之合理選擇(Sarinho E and Cruz AA,J Pediatr(Rio J),82(5 Suppl)：S127-32,2006；Wagelie-Steffen AL et al.,Clin Chest Med.,27：133-147,2006；Clark J et al.,J Asthma,43：87-93,2006)。本發明中，90mg/kg/day石斛多醣可降低氣喘小鼠其血清與肺中免疫球蛋白E含量。有鑑於這些資料結果，石斛多醣有巨大之潛力來治療過敏性疾病或氣喘。
萃取自石斛之多醣對於以卵白蛋白致敏化之小鼠之肺組織中基因表現之效應
取下組織並切成碎片。總核醣核酸(ribonucleic acid，簡稱RNA)係使用rare RNA總量RNA抽取試劑(Gsharp Corporation，Taiwan)來分離，其係參照廠商之操作需知。反轉錄(reverse transcription)係使用5μg核醣核酸與MMLV反轉錄酶(MMLV reverse transcrptase，Promega，USA)於總體積40μL下進行互補去氧核醣核酸(complementary DNA，簡稱cDNA)合成。取部分反轉錄產物(1μL)進行聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，簡稱PCR)擴增。所使用介白素-13(IL-13)、嗜伊紅趨化原-1(eotaxin-1)、吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，簡稱IDO)、介白素-17(IL-17)、 以及胸線基質淋巴生成素(Thymic stromal lymphopoietin，簡稱TSLP)之引子的序列列表如下：
用以擴增這些基因之PCR條件係95℃反應5分鐘為初始之變性(degeneration)反應，接著94℃反應30秒、58℃反應30秒、與72℃反應1分鐘。所有之基因表現量係以β-肌動蛋白信使核醣核酸 (messenger RNA，簡稱mRNA)作標準化。如圖7所示，肺中細胞激素或化學激素之信使核醣核酸表現量於餵食30mg/kg/day與90mg/kg/day萃取自石斛之多醣之組別係較低的。
在過敏性發炎反應中，藉由一些化學激素，諸如介白素-13、嗜伊紅趨化原-1、介白素-17、與胸線基質淋巴生成素，選擇性地吸引嗜酸性白血球至呼吸道，顯示嗜酸性白血球專一性化學趨化物質持續地在肺部發炎反應之進程中被製造與釋放(Rothenberg ME.,N.Engl.J.Med.,338：1592-1600,1998；Lacy P et al.,Chem.Immunol.,76：134-155,1998)。再者，由嗜酸性白血球所誘發之吲哚胺2,3-雙加氧酶之增加已知會導致第一型輔助性T細胞之細胞凋亡(apoptosis)以及引起第二型輔助性T細胞之極化(polarization)。因此，嗜酸性白血球可能透過在淋巴組織中表現具有功能活性之吲哚胺2,3-雙加氧酶來維持過敏性氣喘可見之第一型輔助性T細胞-第二型輔助性T細胞不平衡(Odemuyiwa SO et al,J Immunol.,2004 Nov 15；173(10)：5909-13)。所以，抑制這些蛋白質之產生有助於阻止氣喘之進程。本發明中，口服處理來自石斛之多醣之小鼠具有較低上述基因之表現，所述基因係與吸引嗜酸性白血球或淋巴細胞相關。由於這兩種細胞在過敏性疾病之發展具有重要的角色，特別是氣喘，而減低化學激素可避免肺部浸潤。因此，與嗜酸性白血球相關之過敏性疾病之症狀，諸如氣喘，可被治療。
實例3：萃取自石斛之多醣對於花粉過敏之效應
豕草花粉(Ragweed pollen)中活性蛋白之萃取
豕草花粉係購自Polyscience,Inc.(Polyscience,Inc.,Warrington,Pa.,U.S.A)。豕草花粉(1g)與500μL乙醚(ether)和20mL 0.125M碳酸氫銨(ammonium bicarbonate)於室溫處理48小時，接著以10000 ×g離心30分鐘後獲得第一種上清液。經處理之花粉再與12mL 0.125M碳酸氫銨於室溫處理24小時，接著以10000×g離心30分鐘後獲得第二種上清液。收集第一與第二種上清液至透析袋，其有3500Da之孔徑，以5mM碳酸氫銨透析4小時，接著換新的5mM碳酸氫銨並持續透析24小時。最後的產物係凍乾並儲存於-20℃備用。自花粉中萃取之萃取率係21.1%，而萃取物含有11.9%之蛋白質。
以主動免疫(active immunization)誘發眼結膜炎並處理萃取自石斛之多醣
誘發眼結膜炎之模式係修改自先前之研究(Schopt,L.,et al.,Invest Ophthalmol Vis Sci,2005.46(8)：p.2772-80)。所有8週齡之Balb/c母鼠皆於致敏化前11天接受卵巢切除(ovariectomy)之手術。小鼠在第0、7、14、與29天以腹腔注射給予含有200μg花粉萃取物(包含50μg蛋白質)與4mg氫氧化鋁(Al(OH)3)之200μL磷酸鹽緩衝液以致敏化。於第8與第15天，小鼠以點眼方式給予含有500μg花粉萃取物與25μg氫氧化鋁(Al(OH)3)之5μL磷酸鹽緩衝液於左眼以致敏化。於第22、23、24、與36、37、38、39、40天，小鼠以溶於磷酸鹽緩衝液之花粉萃取物(每眼給予1mg溶於3μL磷酸鹽緩衝液)刺激(challenge)左眼。刺激15分鐘後，小鼠進行淚液之測量，並觀察眼瞼腫脹與結膜發紅(conjunctiva redness)。正常組小鼠不接受前述致敏化，但是進行相同地刺激。控制組小鼠接受致敏化與刺激，但是不以多醣處理。處理組小鼠於第8天起至第52天犧牲止口服給予30mg/kg/day或90mg/kg/day之萃取自石斛之多醣。
外觀觀察與淚液之測量
過敏性結膜炎係對於過敏原，例如花粉，之過度敏感。其包含 於眼之症狀有癢、眼瞼腫脹、產生過多淚液、與結膜或眼白發紅。為評估以多醣處理之功效，於每次刺激15分鐘後，小鼠之左眼照相並進行測量淚液產生之測試。關於淚液產生之測量，其係使用濾紙條。此處所用濾紙條係浸泡於含有0.1%(w/v)酚紅(phenol red，Sigma，USA)之70%乙醇，並於室溫乾燥隔夜。濾紙條之大小係寬度1mm且長度20mm。在小心地去除下眼瞼過多的分泌物後，將濾紙條置於與內外眼角交界之下眼瞼。用以測量小鼠淚液製造之標準時間為1分鐘。發炎眼睛之照片示於圖8A-8D，濾紙條顏色改變之長度示於圖9。
如圖8A所示之結果，正常組小鼠之眼睛只有輕微紅腫，但控制組小鼠有嚴重的腫脹與發炎(圖8B)。小鼠口服給予30mg/kg/day(圖8C)或90mg/kg/day(圖8D)萃取自石斛之多醣雖然亦有眼睛發炎，但其紅腫症狀有減輕。
如圖9所示之結果，與過敏性結膜炎之症狀一致，控制組小鼠在接觸花粉後產生較多淚液。相較於控制組小鼠，小鼠口服給予30mg/kg/day或90mg/kg/day萃取自石斛之多醣顯著地有較少淚液。
組織學分析
小鼠犧牲後取下頭部，接著固定於Bouin氏緩衝液。72小時後，將Bouin氏緩衝液置換為含有14%乙二胺四乙酸之磷酸鹽緩衝液以移除鈣至少72小時。當鈣完全移除後，以剪刀剪去眼球與結膜以外的組織。修剪後之組織接著包埋於石蠟中，並切成5μm厚度之切片。切片係以Giemsa氏染色法(GIEMSA STAIN STOCK SOLUTION，Sigma，USA)進行染色。計數每片切片中結膜之固有粘膜層(lamina propria mucosae)中浸潤之嗜酸性白血球。所有實驗小鼠之玻片計數結果係以平均值±標準誤(average±S.E.M.)表示。
嗜酸性白血球浸潤至結膜可作為過敏性結膜炎嚴重度之標記，因已有報導指出當過敏之嚴重度增加，測得之嗜酸性白血球數量較高(Sumi et al.,Int Arch Allergy Immunol.143(4)：276-81,2007)。如圖10A-10D所示，控制組有最多浸潤細胞。相較於控制組，浸潤細胞之數量顯著地降低於30mg/kg/day與90mg/kg/day處理組(圖10E)。結果指出處理萃取自石斛之多醣可減輕過敏之嚴重度。
血清中免疫球蛋白E之測量
於刺激後第0、24、與40天，收集主動免疫小鼠之血液並製備血清。血清中豕草花粉專一性免疫球蛋白E係以酵素免疫分析法測量，詳細實驗內容如前所述。
如圖11所示，於第40天，相較於控制組，口服給予30mg/kg/day或90mg/kg/day萃取自石斛之多醣之小鼠有顯著地較低之免疫球蛋白E。
流式細胞術分析
新鮮取得並去除紅血球之脾臟細胞(splenocyte)以2%甲醛(formaldehyde)固定，並以螢光激發細胞分選(fluorescence activated cell sorting，簡稱FACS)緩衝液(含有1%胎牛血清之磷酸鹽緩衝液)清洗之。清洗後，細胞與螢光異硫氰酸鹽結合之山羊抗小鼠CD4+抗體在最理想濃度下於4℃反應30分鐘，再以相同緩衝液清洗兩次。清洗後，細胞接著與藻紅素結合之山羊抗小鼠CD25+抗體在最理想濃度下於4℃反應30分鐘，再以相同緩衝液清洗兩次。最後，細胞以100μL螢光激發細胞分選緩衝液回懸浮，並於FACScan流式細胞儀(Becton Dickinson Bioscience，San Diego，CA，USA)進行分析。資料分析與蒐集係使用CellQuest軟體執行。
如圖12A與圖12B所示之結果，主動免疫小鼠之脾臟細胞與血清中CD4+CD25+ T細胞之百分比較低。相較於控制組，口服給予30mg/kg/day或90mg/kg/day萃取自石斛之多醣之小鼠有較高CD4+CD25+ T細胞之百分比。
實例4：萃取自石斛之多醣對於異位性皮膚炎之效應
異位性皮膚炎動物模式之建立
於第0天，9週齡之小鼠以100μL之1%噁唑酮(oxazolone)塗於腹部皮膚以致敏化，而塗以磷酸鹽緩衝液之組別作為正常組。於第7與第8天，以40μL之0.5%噁唑酮局部地塗於雙耳以進行刺激。控制組係接受致敏化與刺激但不以多醣處理之組別。處理組於第0天致敏化前4天起直至犧牲止分別口服給予10mg/kg/day、30mg/kg/day、或90mg/kg/day萃取自石斛之多醣。於第9與第10天測量耳之厚度，即第8天刺激後24小時。所有試驗小鼠第9天之結果係以平均值±標準誤表示。
結果
如圖13所示之結果，所有主動免疫小鼠之耳厚度皆增加。相較於控制組，10mg/kg/day與30mg/kg/day處理組沒有明顯的效果；然而，90mg/kg/day處理組之耳厚度顯著地減小。
熟習技藝者可理解，在不偏離本發明主要概念之情形下，前述具體實例可施行變化。因此，本發明不限於所揭露的特定具體實例是可被理解的，可藉由附加申請專利範圍的方式涵括本發明精神及範圍內之修改。
其他具體實例
所有揭示於此說明書中之特徵可以任何方式組合。各個揭示於 此說明書中之特徵可以另一提供相同、相當、或類似目的之替代手段取代。因此，除非另有明示，各例示之特徵僅係一總括系列之相當或類似特徵中之一例。
由上文之敘述，熟習技藝者可輕易確認本發明之必要特徵，且在不偏離本發明精神及範圍之情形下，熟習技藝者可實施本發明之各種不同變化及修飾，以使其適用於各種用途及條件。因此，其他具體實例亦涵括於申請專利範圍中。
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Claims (10)

  1. 一種石斛(Dendrobii Herba)之多醣之用途，其係用於製備治療過敏性疾病的藥物。
  2. 根據請求項1之用途，其中該過敏性疾病係與嗜酸性白血球(eosinophil)、免疫球蛋白E(IgE)、化學激素(chemokine)或第二型輔助性T細胞細胞激素(Th2 cytokine)之增加相關。
  3. 根據請求項1之用途，其中該過敏性疾病係氣喘(asthma)。
  4. 根據請求項1之用途，其中該藥物係能夠減低發炎引起之氣管病變(airway-remodeling)。
  5. 根據請求項1之用途，其中該藥物係經由口服投予。
  6. 根據請求項1之用途，其中該多醣係藉由包含下列步驟之方法製備：浸泡第一種石斛生藥於第一種醇類；移除該第一種醇類以產生第二種石斛產物；以水萃取該第二種石斛產物以獲得一水溶液；混合該水溶液與第二種醇類以進行多醣的沉澱；及收集沉澱之多醣。
  7. 根據請求項6之用途，其中該第一種醇類係甲醇、乙醇或其與水之混合物。
  8. 根據請求項6之用途，其中該第二種醇類係乙醇。
  9. 根據請求項8之用途，其中該乙醇之濃度為30%(v/v)至70%(v/v)。
  10. 根據請求項8之用途，其中該乙醇之濃度為50%(v/v)。
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