TW201510936A - 細胞影像分割方法以及核質比評估方法 - Google Patents

細胞影像分割方法以及核質比評估方法 Download PDF

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Abstract

一種細胞影像分割方法，包括執行一細胞核初始化步驟，決定一內部標記以及一外部標記，並藉以獲得一潛在細胞核以及一潛在細胞邊界；計算所接收之細胞影像的一梯度圖；對所計算之梯度圖執行一過濾步驟，以產生一已過濾之梯度圖；執行一細胞核偵測步驟以獲得一分割細胞核；以及執行一細胞核驗證步驟以獲得一有效細胞核。該細胞核初始化步驟包括執行一區塊偵測以獲得一候選細胞核；執行一離群值移除步驟以獲得該內部標記；執行一距離轉換步驟以獲得一距離圖；以及執行一細胞邊界初始化步驟，以獲得該外部標記。另提供一種核質比評估方法。

Description

細胞影像分割方法以及核質比評估方法
本發明所揭露之實施例係關於一細胞影像分割方法以及使用該細胞影像分割方法之一核質比評估的方法，特別係關於一種用於細胞分割以及核質比分析之細胞影像分割方法以及核質比評估方法。
在傳統的活檢(biopsy)方法以及病例檢測中，多數需要進行物理活檢(physical biopsy)，也就是必須移除活體的細胞組織，因此必須侵略性地花費長時間以及高成本收集足夠的細胞樣本以及進行微觀的評估，並且其必須依循復雜的流程，包括細胞定型(fixing)、包埋(embedding)，切割(sectioning)，以及染色(staining)，才有辦法判定疾病。另外，這些侵略性的程序，除了讓病患感到不舒適之外，也可能有感染以及癌細胞擴散的危險。
來自國立台灣大學的Ultrafast Optics Group(UFO)團隊，已成功地研發出一種可非侵略性地進行診斷以及可獲得不同皮膚深度中之體內切面影像(In vivo section images)的光學體內虛擬切片技術(Optical in vivo virtual biopsy technique)。光學體內虛擬活檢不需要進行細胞移除，因此不僅可避免傳統侵略式活檢程序中複雜的步驟，亦節省了傳統病理檢査的時間以及成本。
為了評估細胞的狀態，核質比(Nuclear-to-Cytoplasmic ratio；NC ratio)在診斷中是一種常用的測量方式，並且體內核質比分析(in vivo Nuclear-to-Cytoplasmic ratio analysis)在非侵入性以及即時性的皮膚疾病診斷中具有相當的意義。舉例而言，典型皮膚癌的表皮肌膚細胞的核質比通常會較正常細胞還高。
第1圖所示係為一種習知的細胞分割，其中包括用以進行分析之一原細胞影像(如第1a圖所示)以及已分割之複數細胞(如第1b圖所示)。在第1a圖中，紫紅色的部分表示細胞質，被細胞質所包圍之深色部分表示細胞核，並且黃色部分表示細胞邊界。在第1b圖中，青色部分表示已分割之細胞質，被已分割之細胞質所包圍的白色部分表示已分割之細胞核。
第1圖所示之習知的細胞分割需要手動選擇細胞核以及細胞質，以獲得已分割之細胞核以及已分割之細胞質來進行核質比評估。因此，習知的細胞分割需要花費較多時間並缺乏客觀性以及準確性，特別是需要分析大量的資料時更是如此。
另外，如下所示為習知的細胞影像處理方法：
影像臨界值(Image thresholding)方法是最簡單以及快速的影像分割方法，但其僅在物件以及背景具有高對比的情況下具有較好的分割結果。即使使用自適應臨界值方法(adaptive thresholding method)，亮度以及雜訊亦會影響影像分割，使其產生不適當的結果。然而，某些生物醫學影像(biomedical image)可能具有較低的對比性以及大量的雜訊，故不適合使用影像臨界值方法來進行細胞分割。
第2圖係為一種影像臨界值方法，包括一輸入影像(如第2a圖所示)以及藉由影像臨界值方法所產生之影像分割結果(如第2b圖所示)。第2a圖係為即將被分析之一輸入影像，並且第2b圖係根據其影像亮度臨界值所產生的 分割結果，其中第2b圖所示之分割結果中的待測物具有破損的區域以及不連續的邊界。當使用影像亮度臨界值進行細胞分割時，由於影像亮度臨界值方法並不考慮影像的關聯性信息(contextual information)並且容易受到亮度以及不規則雜訊的影響，因而導致其影像分割的準確性降低甚至產生預期外的結果。
分水嶺轉換(watershed transformation)是一種使用型態學影像處理(morphological image processing)概念的影像分割技術，用以獲得穩定的影像分割結果。分水嶺轉換的基本概念係用以考慮發生在地形圖上的現象。第3圖係一種地形圖的表示法，包括一二維灰階度影像(如第3a圖所示)，以及一三維地形表面(topographic surface)(如第3b圖所示)。第4圖係灰階度影像之一地形圖。如第3圖所示，一二維灰階度影像可被作為一三維地形表面，像素值可被詮釋為分水嶺轉換中之高度。其中，三種像素包括局部最低之像素(pixels at local minimum)、滴水點之像素(pixels at which a drop of water)以及水掉落可能會掉落到其他局部最低像素(pixels at which water would be equally likely to fall to more than one regional minimum)其分別對應到第4圖所示相應於區域最小值(regional minima)、盆地(catchment basin)以及分水嶺線(watershed line)。
考慮像素間影像關聯性信息之分水嶺轉換可想像為其具有存在在每一區域最小值中藉由水管與其他複數個洞相連的一個洞。當水龍頭開啟時，水會自水源流經水管，並以恆定的速率自每一區域最小值灌注到表面。而我們的目標是建造一個大壩(dam)來防止不斷上升的水位自一個集水盆地溢出到另一個，其中大壩相應於分割的物件。分水嶺轉換的主要目的係用以藉由兩個階段辨識區域最小值之區域。第一個階段係自區域最小值進行注水之程序(flooding process)。第二個階段係當兩個來自不同流域的水體相聚時，用以建造 屏障的水壩建構程序(dam construction)。
第5圖所示係分水嶺轉換中之注水程序，包括具有四個盆地(catchment basin)之原地形表面(如第5a圖所示)、水位(water level)為90的地形表面(如第5b圖所示)、水位為110的地形表面(如第5c圖所示)以及水位為130的地形表面(如第5d圖所示)。第5圖所示為分水嶺轉換中之注水程序的一實施例，其中第5a圖顯示具有四個盆地之原地形圖並且水龍頭已打開，故水位會開始上升。在第5b圖中可見，水位為90，並且某些區域已被水灌注。在第5c圖中可見，水位上升至110，並且一個水體(body of water)開始溢出至其他的地方，因此其需要建造一個水壩，以防止此類的事情發生。若水位仍持續上升，則需建造其他水壩，以防止兩個不同的水體相聚(如第5d圖所示)。
在上述的方式中，分水嶺轉換通常會參考梯度圖，接著藉由辨識影像中之區域最小值，分隔或者分割重疊的物件(touching object)。然而，由於影像中可能存在一些不需要的區域最小值或者不規則的雜訊，因此過度分割是分水嶺轉換中會遇到的主要問題，其有兩種主要用以解決過度分割問題的方式。
為了解決過度分割的問題，第一個解決分水嶺基礎演算法(watershed-based algorithm)中過度分割問題的方式是片段合併策略(fragment merging strategy)，其中片段合併策略係利用微小的片段與其所依附父母物件(parent object)具有相似特徵為概念的合併標準，合併同一物件中微小以及零碎的片段。
另一個用以解決過度分割問題的方式係藉由標記圖(marker map)的協助下所進行的標記控制策略(marker-controlled strategy)。標記圖為可讓影像分割獲得高準確度之分割物件的重要資訊。內部標記就像是散落在地形圖中具 有許多波峰以及波谷之整個影像平面上的種子。這些種子會在分水嶺轉換的引導下逐漸成長，以逐漸符合將被分割之物件的大小以及形狀，並且由外部標記限制其成長的範圍，使其不與其他目標物件相交。
譜群聚法(Spectral clustering)是一種用在影像分割的的技術，其中譜群聚法將分割問題塑造為圖像模型，以作為一加權圖像分割問題(weighted graph partitioning problem)。圖像模型的建造係藉由一些物件間的關係，例如相似度、距離、相鄰關係、連接關係等等。舉例而言，圖像模型中之頂點(vertices)可被視為影像中之像素，並且在某些標準中，連接在兩個頂點間之加權後的邊緣，可被視為在兩個像素間的邊緣。另外，經由圖像模型找出一個部分(cut)的手段，可用以作為找出物件中解決影像分割問題之群組(groups)的手段，其中譜群聚法的概念同樣可用於細胞分割，以找出有意義的物件。即使譜群聚法係一個用以藉由圖像模型勘査大量資料以減少待分析資料複雜性的一種合適的方式，一個可將原資料表示為具有稀疏矩陣(sparse matrix)之特定空間所需的圖像模型，亦為一個應該在不同應用上考慮的重要課題。
形變模型(Deformable model)係隨著能量最小化(energy minimization)形變的曲線，其中形變模型係藉由內部以及外部力量指引之輪廓以及表面的逐漸發展，辨識目標物件之邊界。可用在細胞分割中形變模型有數種，例如蛇型以及氣球型。由於形變模型密切取決於數個參數設定，因此其可能會遇到一些為了一般應用所進行之開法演算法的困難。另外，形變模型的分割結果非常容易受到初始條件以及先前知識影響，因此其特別不可能用於自動細胞分割。舉例而言，蛇型演算法的主動輪廓(active contour)係經由電腦與使用者之互動(user interactivity)所決定的，其容易受到使用者的直覺以及初始的猜測影 響，因此在大部分應用中可能很難自動進行選擇或者決定。
收斂指標過濾器(Convergence index filter)係為了影像中低對比以及在前端採集程序中所造成具有不規則雜訊之邊緣或者邊界增強所設計之局部過濾器(local filter)，尤其是生物影像。收斂指標過濾器係參考梯度向量之方向的分佈而非梯度方向的大小以及空間域(spatial domain)中之亮度。在一支援區域中或者鄰近一目標像素之梯度向量的收斂程度(或者稱為收斂指標convergence index，CI)為投射到目標像素之梯度向量之貢獻程度的度量單位。另外，收斂指標過濾器可自適性地根據梯度向量的分佈，自我調整其遮罩(mask)之大小以及形狀，因此其可用以決定影像中模糊區域的邊界。接著討論的是過濾器的其中一種樣式。
收斂指標過濾器亦稱為COIN過濾器，其採用”具有可變半徑的圓作為其支援區域(support region)”的縮寫。第6圖為收斂指標過濾器(CF)的支援區域。第6圖所示為具有半徑r且圓心在目標像素P上的一個圓。鄰近目標像素P的區域是目標像素P之支援區域R，任意像素Q在支援區域R的直角坐標為(k,l)，並且在像素Q上之梯度向量G(Q)以及用以連接像素P以及Q之分割線的方向之間的夾角為θ。cosθ(k,l)係用以表示在直角座標為(k,l)之像素Q上之梯度向量G(Q)的收斂指標，其量化了投射在P上之梯度向量G(Q)的貢獻度(contribution)。
用在目標像素P上之收斂指標過濾器之輸出的定義為，落在目標像素P之支援區域R中之所有像素之收斂指數的平均值，其中目標像素P的直角座標為(x,y)，並且其在二維的離散空間(discrete space)可表示為： 其中M係支援區域R中之像素的數量，θ(k,l)係在直角坐標為(k,l)之像素Q上的梯度向量G(k,l)以及用以連接像素P以及Q之分割線之方向的夾角，cosθ(k,l)係在直角座標為(k,l)之像素Q上之梯度向量G(Q)的收斂指標。收斂過濾器之輸出落在-1以及+1之間，並且最大值+1發生在所有在支援區域R中之像素之梯度向量都指向目標像素P的時候，其表示在支援區域R中之相等強度線(equi-contours)具有同個中心(concentric)。第7圖所示為相等強度線為同心之一個圓形突起區域，包括如第7a圖所示之一圓形突起區域，以及如第7b圖所示之梯度向量的分佈。第7a圖係為圓形突起區域的一個範例，其亮度的等強線在二維空間中具有同心，而第7b圖係為其之梯度向量分佈，其中所有梯度向量都指向中心，因此這個圓型突起區域的中心具有一最大收斂指標+1。反之，最小值-1發生在支援區域R中之像素的所有梯度向量都反向指回目標像素P時。
本揭露之目的在於提供一種用於細胞分割之電腦輔助自動影像分割方法。
本揭露之另一個目的在於獲得一高效率、穩定準確度以及客觀的影像分割結果。
本揭露之又一個目的在於在各領域中提供一種自動細胞分割以及核質比評估方法，例如協助醫生使用非侵入式的方法，藉由核質比辨識疾病早期的症狀，或者提供化妝品企業或者醫療機構以細胞大小量化皮膚年齡或評估皮膚美白產品的影響。
本揭露之實施例提供一種細胞影像分割方法，包括接收一細胞影 像；執行一細胞核初始化步驟，以獲得一內部標記以及外部標記，並藉以獲得相應於上述潛在細胞核之一潛在細胞核以及一潛在細胞邊界；計算所接收之細胞影像的一梯度圖；根據潛在細胞核以及潛在細胞邊界，對所計算之梯度圖執行一過濾步驟，以產生一已過濾之梯度圖；藉由對已過濾之梯度圖進行一分水嶺演算法，執行一細胞核偵測步驟，以獲得一分割細胞核；以及藉由保留分割細胞中具有高緊湊度之部分並且去除分割細胞中具有低緊湊度之部分，執行一細胞核驗證步驟，以獲得一有效細胞核。細胞核初始化步驟包括執行一區塊偵測步驟，以獲得一候選細胞核；執行一離群值移除步驟，以去除候選細胞核之一離群值，並藉以獲得內部標記；對內部標記執行一距離轉換步驟，以獲得一距離圖；以及執行一細胞邊界初始化步驟，以自上述距離圖中獲得外部標記。
在一實施例中，區塊偵測步驟更包括將已接收之細胞影像映射至一尺度空間，以闡釋已接收之細胞影像在各種尺度的一多尺度表示。
在一實施例中，區塊偵測步驟更包括一疊印步驟，用以計算在各種尺度之平均尺度資訊，以獲得候選細胞核。
在一實施例中，距離轉換步驟更包括計算內部標記之一歐氏距離，以獲得距離圖。
在一實施例中，細胞邊界初始化步驟更包括對距離圖執行一分水嶺轉換，以獲得外部標記。
在一實施例中，過濾步驟更包括根據內部標記以及外部標記，對梯度圖執行一形態最小值之疊印。
在一實施例中，細胞影像分割方法更包括一細胞質初始化步驟，以獲得有效細胞核之一潛在細胞質區域。潛在細胞質區域具有一最小邊界以及 一最大邊界。最小邊界係為有效細胞核之一邊界。最大邊界係由上述有效細胞核之上述距離圖中所獲得的。潛在細胞質區域是最小邊界外以及最大邊界內之區域。細胞影像分割方法更包括對有效細胞核之距離圖執行一分水嶺轉換，以獲得最大邊界。
在一實施例中，潛在細胞質區域具有複數梯度向量以及一細胞邊界。細胞影像分割方法更包括一細胞質偵測步驟，藉由複數梯度向量，獲得細胞邊界。
在一實施例中，分割細胞核的緊湊度係由在分割細胞核中之每一複數像素的面積以及周長所決定的。詳細而言，分割細胞核之緊湊度係由一A/P2函式所決定的，其中A代表在分割細胞核中之每一像素之面積，並且P代表在分割細胞核中之每一像素的周長。
本揭露之實施例另提供一種核質比評估方法包括執行上述之細胞影像分割方法，以及藉由計算一細胞核面積以及一細胞質面積，獲得一核質比。
熟知本領域之技術者可藉由本發明以下所揭露之實施方式無疑慮地完全了解本發明，並且以下所提供之附圖僅為本發明的一種圖示，不應用以限制本發明，其中：
第1a圖所示為習知的細胞分割機制。
第1b圖所示為第1a圖之分割細胞。
第2a圖所示為一輸入影像。
第2b圖所示為影像之亮度臨界值的分割結果。
第3a圖所示為一二維灰階度影像。
第3b圖所示為一三維地形表面。
第4圖所示為灰階度影像之一地形圖。
第5a圖所示為具有四個盆地的一原地形表面。
第5b圖所示係水位為90之一地形表面。
第5c圖所示係水位為110之一地形表面。
第5d圖所示係水位為130之一地形表面。
第6圖所示為收斂指標過濾器之一支援區域。
第7a圖所示為一圓型突起區域。
第7b圖所示為梯度向量的分佈。
第8a圖所示為本揭露之細胞影像分割方法之一種實施例的流程圖。
第8b圖所示為細胞影像分割方法中之一細胞核初始化步驟的詳細流程。
第8c圖所示為一核質比評估方法的流程圖。
第9圖所示為細胞分割以及核質比分析的方塊圖。
第10a圖所示為第2a圖之梯度圖。
第10b圖所示為梯度圖之分水嶺轉換的分割結果。
第11圖所示為一細胞核初始化步驟的方塊圖。
第12a圖所示為一輸入影像。
第12b圖所示為尺度σ=5之尺度空間表示。
第12c圖所示為尺度σ=7之尺度空間表示。
第12d圖所示為尺度σ=9之尺度空間表示。
第13a圖所示為尺度σ=5之一已偵測區塊圖(blob map)。
第13b圖所示為尺度σ=7之一已偵測區塊圖。
第13c圖所示為尺度σ=9之一已偵測區塊圖。
第13d圖所示為尺度σ=5、7以及9之已偵測區塊圖的一疊印。
第13e圖所示為最終以適當尺度表示並由白色圓圈標記已偵測區塊以作為候選細胞核的結果。
第14a圖所示為具有離群值之候選細胞核。
第14b圖所示為不具有離群值之潛在細胞核。
第15a圖所示為一4x4之二進制影像。
第15b圖所示為二進制影像之一距離圖。
第15c圖所示為二進制影像之像素值。
第15d圖所示為已轉換之第15b圖影像的像素值。
第16a圖所示為複數個內部標記。
第16b圖所示為一歐幾里德距離圖。
第16c圖所示為複數個外部標記。
第16d圖所示為疊印在原影像上之一標記圖。
第17a圖所示為一一維標記訊號f以及遮罩訊號g。
第17b圖所示為一標記訊號f之大小為1的一侵蝕.
第17c圖所示為相對於一遮罩訊號g之一標記訊號f之大小為1的一測量學的侵蝕。
第18a圖所示為輸入訊號f以及標記訊號fm。
第18b圖所示為(f+1)以及fm之間的一逐點最小值(point-wise minimum)。
第18c-18f圖所示為相對於遮罩函數g之標記訊號fm之大小為1-4的測量學轉換。
第18g圖所示為標記函數fm中之(f+1)^fm的一重建。
第19a圖所示為第2a圖之一梯度圖。
第19b圖所示為一標記圖。
第19c圖所示為第2a圖經由形態最小值疊印後之已過濾之梯度圖。
第19d圖所示為一梯度圖.
第19e圖所示為像素標記。
第19f圖所示為一已過濾之梯度圖。
第20a圖所示為不考慮形狀緊湊度之第2圖的分割細胞核。
第20b圖所示為考慮形狀緊湊度之第2圖的分割細胞核。
第20c圖所示為疊印在原影像上之分割細胞核。
第20d圖所示為導致高緊湊度之具有一較大面積以及一較小周長的橢圓。
第20e圖所示為導致低緊湊度之具有較小面積以及較大周長的一海星型形狀。
第21圖所示為在兩相鄰細胞周圍之梯度向量的分布。
第22a圖所示為具有黃色區塊的原影像。
第22b圖所示為位於第22a圖所示之黃色區塊中之所有像素的梯度向量。
第22c圖所示為位於第22b圖所示之綠色區塊中之所有像素的梯度向量。
第23圖所示為一推薦局部過濾器(proposed local filter)之一支援區域。
第24a圖所示為第2a圖之分割細胞核。
第24b圖所示為分割細胞核之一歐幾里德距離圖。
第24c圖所示為每一細胞之一潛在細胞質區域的最大邊界Rmax。
第24d圖所示為有效細胞核Rmin以及最大邊界Rmax在第2a圖上之疊映。
第25圖所示為梯度向量g(Q j ')以及ν(Q j ')間之角度的幾何意義。
第26a圖所示為已分割細胞。
第26b圖所示為在原影像上之已分割細胞的輪廓圖(delineation)。
第27a圖所示為一原影像。
第27b圖所示為在原影像上之已分割細胞的一已標記輪廓圖。
第28a圖所示為一原影像。
第28b圖所示為在原影像上之已分割細胞的已標記輪廓圖。
第29a圖所示為一原影像。
第29b圖所示為在原影像上之已分割細胞的已標記輪廓圖。
第30a圖所示為一原影像。
第30b圖所示為在原影像上之已分割細胞的已標記輪廓圖。
第31a圖所示為一原影像。
第31b圖所示為在原影像上之已分割細胞的已標記輪廓圖。
在各圖中的附圖中，相同的標號表示相同或相似的部件。另外，下文所使用諸如”第一”、”第二”、”第三”、”第四”、”內部”、”外部”、”頂部”、”底部”、”前面”、”後面”以及類似的術語僅供觀看圖示參考並僅用以便於理解本發明。
為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：
細胞分割以及核質比分析
本發明所揭露之實施例係關於生物醫學成像，並著重於複數影像以及影像序列之處理以及分析的程序，其中包含四個基本的描述符，該四個基本描述符包括由人眼所感知的形狀、大小、顏色以及紋理(texture)。為了使電腦或者計算裝置可理解並分析所述之描述符，部分數學運算模型及其相應之物理意義會被理解運用，以將上述可觀察到之描述符轉換為資料化的特徵。對於生物醫學成像的核質比(Nuclear-to-Cytoplasmic ratio；NC ratio)分析而言，活檢技術(biopsy technique)係用於取得細胞或者組織以進行進一步分析，而細胞分割可區隔並選擇出獨立的細胞核以及細胞質，並進一步地應用於核質比分析中。隨後所評估出來的核質比或者細胞的資訊可提供醫師進行討論以及詮釋，以了解疾病的狀態或者病症。
第8a圖所示為本揭露之細胞影像分割方法之一種實施例的流程圖。細胞影像分割方法包括接收一細胞影像(步驟S0)，執行一細胞核初始化步驟以獲得一內部標記以及一外部標記，並藉以獲得一潛在細胞核以及相應於上述潛在細胞核之一潛在細胞邊界(步驟S1)，計算所接收之細胞影像的一梯度圖(步驟S2)，根據所獲得之潛在細胞核以及潛在細胞邊界，對所計算之梯度圖執行一過濾步驟，以產生一已過濾之梯度圖(步驟S3)，藉由對上述已過濾之梯度圖進行一分水嶺演算法(watersheds)，執行一細胞核偵測步驟，以獲得一分割細胞核(步驟S4)，藉由保留上述分割細胞中具有高緊湊度之部分並且去除上述分割細胞中具有低緊湊度之部分，執行一細胞核驗證步驟，以獲得一有效細胞核(步驟S5)，執行一細胞質初始化步驟(cytoplasm initialization step)，以獲得有效細胞核之一潛在細胞質區域(步驟S6)，其中潛在細胞質區域具有一最小邊界以及一 最大邊界，潛在細胞質區域是最小邊界外以及最大邊界內之區域，最小邊界係為有效細胞核之一邊界，並且最大邊界係由有效細胞核之距離圖所獲得的。細胞分割方法更包括執行一細胞質偵測步驟，以藉由潛在細胞質區域之複數梯度向量，獲得潛在細胞質區域之細胞邊界(步驟S7)，其中潛在細胞質區域係同心(concentric)，並且細胞的形狀及其相應之細胞核係為凸多邊形區域。
參考第8b圖，在步驟S1中之細胞核初始化步驟可更包括執行一區塊偵測步驟(blob detection step)，以獲得一候選細胞核(步驟S1a)，執行一離群值移除步驟(outlier removal step)，以去除候選細胞核之一離群值，並藉以獲得內部標記(步驟S1b)，對內部標記執行一距離轉換步驟(distance transform step)，以獲得一距離圖(distance map)(步驟S1c)以及執行一細胞邊界初始化步驟，以自距離圖中獲得外部標記(步驟S1d)。在步驟S1a中，區塊偵測步驟可包括藉由先前關於將被分割之細胞核的資訊，偵測區塊(斑點)(blobs)，並且將所接收之細胞影像映射(spanning)至一尺度空間之中，以闡釋已接收之細胞影像在各種尺度的一多尺度表示。區塊偵測步驟可更包括一疊印步驟(super-impose)，用以計算在各種尺度之平均尺度資訊(average scale information)，以獲得上述候選細胞核。另外，在步驟S1b中，離群值移除步驟可更包括移除不完全被細胞質所包圍之候選細胞核。再者，在步驟S1c中，距離轉換步驟可更包括計算內部標記之一歐氏距離(Euclidean distance)，以獲得距離圖。另外，在步驟S1d中，細胞邊界初始化步驟可更包括對歐氏距離圖執行一分水嶺轉換，以獲得外部標記。在步驟S3中，過濾步驟更包括根據內部標記以及外部標記，對梯度圖執行一形態最小值疊印(morphological minima imposition)。
在另一方面，本文亦提出一核質比評估方法。請參考第8c圖， 核質比評估方法包括執行上述細胞影像分割方法，並經由計算一細胞核面積以及一細胞質面積獲得一核質比。
第9圖係細胞分割以及核質比分析的方塊圖。第9圖顯示細胞分割以及核質比分析的方塊圖，其中第9圖可分為兩個部分，包括分別顯示於左邊以及右邊方塊中的細胞核分割部分以及細胞質分割部分。本發明使用若干手段進行細胞核分割，包括根據影像中之像素以及標記控制策略(marker-controlled strategy)的關聯性信息(contextual information)所進行之梯度分水嶺轉換、區塊偵測步驟(blob detection)以及考慮形狀描述符(shape descriptors)。分水嶺轉換主要的目地在於辨識原影像中之區域最小值，以作為被分割之細胞核。首先，計算梯度圖係用以突顯在輸入影像中相應於區域最小值的梯度圖中之細胞核邊界以及複數同質區域(homogeneous region)。但若細胞核偵測係直接執行於梯度圖上，其可能由於梯度圖中不需要的區域最小值或者雜訊而遇到過度分割問題。為了解決上述問題，使用標記控制策略以及區塊偵測步驟之細胞核初始化步驟可安排在細胞核偵測之前進行。
對於細胞初始化而言，獲得潛在細胞核及其相應之細胞邊界，可用以幫助設計用以移除梯度圖中不需要之區域最小值的濾波器，以保留需要的區域最小值。接著，在已過濾之梯度圖上，執行使用分水嶺轉換的細胞核偵測，以獲得一分割細胞核。細胞核驗證亦可考慮使用形狀符，以移除離群值並保留有效細胞核。當然，若使用者互動或者一些已知的訊息可在分析過程中使用，其亦可改善結果並使醫生的診斷更具說服力。
對於細胞質分析而言，基於有效細胞核之資訊所執行之細胞質初始化步驟，可獲得潛在細胞質區域以及所相應之更精確之細胞邊界。再來，在 細胞質偵測階段中所設計之局部過濾器係用以獲得分割細胞質。最後，一已評估之核質比可在核質比評估階段中獲得。
細胞核分割
細胞核分割使用具有標記控制策略之梯度分水嶺轉換、區塊偵測步驟以及形狀描述符(shape descriptors)，以獲得準確之分割細胞核。由於下述之細胞質分割需要參考有效細胞核，以引導演算法找到最適合並具有高表現的解答，因此細胞核分割是在本發明所提供之細胞分割演算法中相當關鍵的階段，其中有效細胞核可以被作為全部細胞分割之優化問題的初始條件。
使用分水嶺轉換之標記控制策略
分水嶺轉換已在先前技術中描述，其關於影像的關聯性信息以及辨識出區域最小值皆係為了細胞核分割。在影像觀察中，位於影像之區域最小值中具有較低亮度的細胞核，與梯度圖中之同質區域高度相關。因此，具有已知資訊的梯度圖可用以定義細胞核之邊界，以在背景中互相接觸(重疊)的細胞中，萃取分析出均勻圓形之細胞核。
第10圖所示之影像分割包括第2a圖之一梯度圖(如第10a圖所示)以及梯度圖之分水嶺轉換的分割結果(如第10b圖所示)。為了獲得第10圖所示之梯度圖，我們利用索貝爾運算子(Sobel operator)以及羅伯特跨梯度運算子(Roberts cross-gradient operator)計算在四個方向中之梯度圖，其中四個方向包括水平方向、垂直方向以及對角線方向。
若細胞核偵測直接使用梯度圖之分水嶺轉換，其可能因為梯度圖存在不需要的區域最小值以及不相關的雜訊，而遇到如第10b圖所示之過度分割的問題。因此，其需要設計一個可設置於細胞核偵測之前面階段的過濾器， 以排除不需要的區域最小值並且保留需要的區域最小值。
細胞核初始化中之過度分割的問題，需要藉由依照形態最小值疊印技術的標記控制策略來解決，其需要並且定義兩種標記，其分別包括大略標記潛在細胞核之位置以及其相應之細胞核邊界：(1)內部標記：內部標記係為各區域內相連畫素的群組，也就是將被分割之潛在細胞核；；(2)外部標記：外部標記為相應於理想上各細胞之邊界的相連畫素的群組。
我們可以想像內部標記係為最初用以引導分水嶺轉換的點，並藉由外部標記的限制，抵抗分水嶺轉換中之過度溢出，以獲得符合需要的細胞大小以及形狀的結果。
細胞核初始化
第11圖所示為一細胞核初始化步驟的方塊圖。對於細胞初始化而言，其目的在於藉由距離轉換、區塊偵測、離群質移除以及距離轉換，獲得潛在細胞核以及其所相應之細胞邊界。細胞核初始化之主要方塊圖如第11圖所示。內部標記系用以標記潛在細胞核，並且外部標記系用以標記其相應之細胞邊界。以下所示為了本應用所定義之內部標記的兩個條件：(1)內部標記的區域係被具有較高亮度之像素所圍繞的區域；(2)各內部標記之區域中具有均勻亮度之所有像素形成一連接之物件。
為了決定內部標記，區塊偵測步驟係根據分割細胞核的已知資訊所執行，用以獲得候選細胞核。候選細胞核之離群值會被離群值移除步驟所移除，以獲得潛在細胞核(等同於為內部標記)。接著，內部標記之距離轉換系用以獲得距離圖。再者，細胞核邊界初始化系用以決定潛在細胞核邊界(等同於外部 標記)，當醫生或者護理人員希望選擇某既定之細胞時，使用者互動亦可作為在細胞初始化中之標記的決定。
區塊偵測步驟
在區塊偵測步驟中，要被分割之原影像被映射至尺度空間(scale-space)中，以闡釋影像在各種尺度的一多尺度表示，以藉由尺度以及空間訊息(spatial information)擷取所需要的架構或者特徵點。藉由高斯核心(Gaussian kernel g)，輸入影像可使用尺度空間來表示，接著，尺度空間導數(scale-space derivatives)可被用以提取影像中之區塊尺度以及空間訊息。二維影像f之尺度空間表示L，可表示為：L(．,．；σ)=f(．,．)*g(．,．；σ),其中g為高斯運算子，其可表示為，σ系尺度參數，並且*表示捲積運算子(convolution operator)。
尺度空間表示可想像成在影像上各種規則的空間解析度測試，用以藉由各種尺度擷取架構以達到自動尺度選擇。第12圖為各種尺度之一尺度空間表示，包括輸入影像(如第12a所示)、尺度σ=5之尺度空間表示(如第12b所示)、尺度σ=7之尺度空間表示(如第12c所示)、尺度σ=9之尺度空間表示(如第12d所示)。第12a圖所示之輸入影像及其在尺度σ=5、7以及9之尺度空間表示分別顯示於第12b、12c以及12d圖。由圖示可知，不同大小的區塊在不同的尺度空間表示中被辨識。
為了擷取適當的尺度以及局部資訊(locality information)，用以局部極值檢測(local extrema detection)之尺度空間導數以及高斯矩陣被採用，以獲 得區塊資訊。在尺度σ的尺度空間導數可表示為： 其中，L(．,．；σ)為在σ的尺度空間表示，為關於x及/或y(α+β=2)的二階偏微分運算子。由於偏微分運算子以及高斯運算子係為滿足交換性(commutative property)之線性非時變(Linearly Time-Invariant，LTI)系統，故尺度空間導數可藉由執行輸入影像f和高斯微分運算子之間的捲積來獲得。海森矩陣(Hessian matrix)H(f)係為在某些方向上所測量之局部主曲率的函數f之兩階偏導數的方陣，其可表示為：
對於二維影像而言，如下所示之2x2的海森矩陣H2x2(L(x,y；σ))可用以量測在水平以及垂直方向上各畫素的主曲率，並且其特徵值與主曲率L(x,y；σ)成比例：
為了避免計算海森矩陣的分解特徵值(eigenvalues decomposition)，本揭露使用線性代數中的一個屬性(property)以簡化其計算。首先定義λ1以及λ2為H2x2(L(x,y；σ))的特徵值，接著決定海森矩陣，如下所示：det H2x2(L(x,y；σ))=Lxx(x,y；σ)Lyy(x,y；σ) -Lxy(x,y；σ)Lyx(x,y；σ)=λ 1 λ 2
上述的特性可用以決定一像素是否為被隔除的角落像素。若海森矩陣H2x2(L(x,y；σ))的行列式係為負數，在水平以及垂直方向上的主曲率則為正數，換言之落在(x,y)的像素不係角落像素，而是一邊緣或者脊像素。在另一方面，若海森矩陣H2x2(L(x,y；σ))的行列式係為正數，落在(x,y)的像素則為被隔離之角落點的一極值。由於所需要的細胞核係位於影像之區域最小值中，因此其亦需要檢査在尺度σ Lxx(x,y；σ)以及Lyy(x,y；σ)是否也大於0，以移除區域最大值並獲得區域最小值。另外，各像素之主曲率不僅需要在水平以及垂直方向上測量，其亦需要在另外兩個對角線方向上測量(45以及135度)，以獲得更精確的區域最小值。
由於下述之離群值移除需要每一所偵測之區塊之適當的尺度資訊以及局部資訊，以進行離群值移除。因此，用以計算平均尺度資訊之疊印步驟可在各種尺度中之已偵測的區塊圖上執行，以進行自動尺度選擇，並獲得最終偵測之具有適當尺度資訊的區塊。第13圖係為自動尺度選擇，包括尺度σ=5之一已偵測區塊圖(如13a圖所示)、尺度σ=7之一已偵測區塊圖(如第13b圖所示)、尺度σ=9之一已偵測區塊圖(如第13c圖所示)、尺度σ=5、7以及9之已偵測區塊圖的一疊印(如第13d圖所示)，以及最終以適當尺度表示並由白色圓圈標記已偵測區塊以作為候選細胞核的結果(如第13e圖所示)。第13a、13b以及13c顯示在尺度σ=5、7以及9中分別以紅色、綠色以及藍色圓圈顯示之已偵測區塊圖。第13d圖顯示在尺度σ=5、7以及9之已偵測區塊圖的疊印，以估計各個已偵測區塊之適當尺度的資訊。第13e圖顯示最終以適當尺度表示並由白色圓圈標記已偵測區塊以作為候選細胞核的結果。
離群值移除
候選細胞核中可能有一些離群值，並且局部限制必須用以移除離群值。另外，可假設有效細胞核必須被亮度較高以及面積較大的細胞質所圍繞。第14圖係為一內部標記判斷步驟，包括具有離群值之候選細胞核(如第14a圖所示)，以及不具有離群值之潛在細胞核(第14b圖所示)。第14a圖顯示在原影像中被白色圓圈標記之具有離群值的候選細胞核，某些後選細胞核並未完全被細胞質所包圍。適應區塊大小的局部限制可作為移除離群值的基準，以保留完全被亮度較高以及面積較大的細胞質所圍繞的有效細胞核。第14b圖顯示不具有離群值之後選細胞核，即為潛在細胞核或者內部標記。
距離轉換
第14b圖所示之不具有離群值的已偵測區塊可被作為內部標記，以指出潛在細胞核大致的位置，接著其亦需要劃分細胞邊界之外部標記，以粗略形成藉由標記控制策略執行之分水嶺轉換的一完整的標記圖。由於其不需要外部標記太靠近分割細胞核之區域的邊界，因此需要計算內部標記圖之幾何距離圖，其為各像素與其最接近之內部標記之像素之間的幾何距離。幾何距離圖係為另一種原始的二進制影像，其標記了各像素以及在幾何距離量測的二進制圖中位置最接近該像素的非零像素之間的距離。
第15圖係為使用幾何距離量測之一距離轉換，包括4x4之二進制影像(如第15a圖所示)、二進制影像之一距離圖(如第15b圖所示)、二進制影像之像素值(如第15c圖所示)以及已轉換之第15b圖影像的像素值(如第15d圖所示)。第15圖顯示使用幾何距離量測之一距離轉換的一種實施例。第15a圖顯示一4x4之二進制影像，其像素值如第15c圖所示。第15b圖係為第15a圖使用幾何距離量測之一距離圖。若定義像素值在二進制影像中為1的像素組為物件， 細胞核以及其他像素值為0的像素組則為第15a圖中之背景。接著，第15b圖所示之此二進制影像的距離圖，可粗略地藉由具有高於細胞核亮度的一組像素，勾勒出細胞核的潛在邊界。因此，距離轉換可在細胞分割之區域中產生一有用的表示方式。
第16圖係為一外部標記判斷方式，包括複數個外部標記(如第16a圖所示)、一歐幾里德距離圖(如第16b圖所示)、複數個外部標記(如第16c圖所示)以及疊印在原影像上之一標記圖(如第16d圖所示)。對於第12a圖所示之原影像的細胞核初始化而言，所偵測之不具有離群值的區塊系用以作為第16a圖中黃色部分之內部標記，並計算其之幾何距離圖(如第16b圖所示)。再來，所執行之幾何距離圖的分水嶺轉換系用以獲得如第16c圖所示黃色部分之外部標記。將內部以及外部標記圖與原影像疊印(如第16d圖所示)，以可視化影像中之分割細胞邊界(細胞邊界初始化步驟)。由圖中可觀察到，內部標記圖確實大略地標記了潛在細胞核，並且外部標記圖大略地勾勒出細胞邊界。另外，外部標記將影像劃分為多個區域，並且每一區域僅包括一個內部標記。換言之，細胞分割的問題被簡化為將每一區域劃分為兩個部分，其為一個可為單一像素的單一的物件或者一在細胞核以及其背景中連接之物件。因此，其可獲得在標記以及分割結果間之一對一的對應關係，並可增進細胞核分割的準確性。
形態影像處理
在現階段，用以產生潛在細胞核以及其相應細胞邊界的內部以及外部標記圖已經由上述流程所獲得，其中上述流程需要標記控制策略以及分水嶺轉換。接著，我們還需要使用形態最小值疊印之一過濾器，以移除梯度圖中不需要的區域最小值並保留需要的區域最小值，以解決分水嶺轉換中過度分割 的問題。
形態轉換的目的在於藉由根據已知知識所選擇的結構元件探測影像，以獲得相關的數據結構。結構元件為一已知的形狀，用以偵測影像，以在影像中擷取需要的物件。
以下將介紹用以進行最小值疊印技術之基於侵蝕操作(erosion operation)的測地轉換(geodesic transformation)以及形態重建。在測地轉換中，需要考慮兩個輸入影像，其中包括對第一影像進行形態轉換，以及保留第二影像中高於或者低於逐點像素值(point-wise pixel values)之像素。相應於一遮罩影像g之標記影像f中大小為n的測地侵蝕(Geodesic erosion)可表示為： 其中，”ˇ”係為逐點最大值運算子，並且(f)係為侵蝕運算子。測地侵蝕的目地在於藉由遮罩影像g，限制標記影像f的收縮。上述方程式的步驟為藉由結構元件腐蝕標記影像f，接著保留已腐蝕之影像在遮罩影像g上的部份。
第17圖係為測地侵蝕之一實施例，包括一維標記訊號f以及遮罩訊號g(如第17a圖所示)、一標記訊號f之大小為1的一侵蝕(如第17b圖所示)以及相對於一遮罩訊號g之一標記訊號f之大小為1的一測量學的侵蝕(如第17c圖所示)。第17圖顯示一維訊號之一測地侵蝕的實施例，其中標記訊號f的收縮被遮罩訊號g所限制。
形態重建為重複測地轉換一有限數量，直到達到穩定為止，其實際上通常比測地轉換更常被使用。使用遮罩影像g在標記影像f上藉由侵蝕之重建可表示為： 其中，i為。最小值疊印係藉由侵蝕之重建的一種應用，其限制了遮罩影像g中之區域最小值僅發生在屬於標記影像f之像素的位置，並可表示為： 其中，若像素屬於標記影像時，則fm(p)=0；否則，fm(p)=tmax。另外，tmax係在遮罩影像g的範圍中之最大像素值，例如若在遮罩影像g中之像素的位元寬度為8，則tmax=255，並且”^”為逐點最小值運算子。
第18圖係最小值疊印之一種實施例，包括輸入訊號f以及標記訊號fm(如第18a圖所示)、(f+1)以及fm之間的一逐點最小值(point-wise minimum)(如第18b圖所示)、相對於遮罩函數g之標記訊號fm之大小為1-4的測量學轉換(如第18c-18f圖所示)以及標記函數fm中之(f+1)^fm的一重建(如第18g圖所示)。第18圖顯示一維訊號之最小值疊印，並且輸入訊號f之局部最小值被限制於只發生在標記訊號fm標記的位置。
第19圖係為形態最小值疊印，包括第2a圖之一梯度映射(如第19a圖所示)、包括在黃色部分之內部以及外部標記的一標記圖(如第19b圖所示)、第2a圖經由形態最小值疊印後之已過濾之梯度映射(如第19c圖所示)、特定在綠色區塊中之梯度映射(如第19d圖所示)、在紅色部分並疊印在第19d圖所示之梯度圖上的像素標記(如第19e圖所示)以及特定在綠色區塊中之已過濾之梯度映射(如第19f圖所示)。內部以及外部標記係用以在梯度圖上執行最小值疊印，以獲得已過濾之梯度圖，且其區域最小值僅發生在內部標記以及外部標記像素之位置。第19a圖顯示第2a圖之梯度圖，其已大略增進相應於輸入影像中區域最小值的梯度圖中之細胞核邊界以及同質區域。第19b圖所示包括內部標 記以及外部標記之標記圖係用以使用最小值疊印對梯度圖進行調整，以及獲得如第19c圖所示之已過濾梯度圖。詳細而言，我們所關注的是綠色區塊，並且分別顯示於第19d、19e以及19f圖中之在綠色區塊中的梯度圖、標記圖以及已過濾梯度圖。第19e圖顯示位於梯度圖中之標記像素，以表示標記之位置。
舉例而言，如第19d圖所示，在白色圓圈中為一局部最小值，並且其不是如第19e圖所示被紅色標記像素所標記的區域。因此，在白色圓圈中不被紅色像素所標誌的區域最小值會在第19f圖中之形態最小值疊印後被移除。另一方面，在第19d圖中在粉紅色圓圈中具有一區域最小值，並且其為如第19e圖所示被紅色標記像素所標記的區域。因此，在粉紅色圓圈中被紅色像素所標誌的區域最小值會在第19f圖中之形態最小值疊印後被保留。另外，形態最小值疊印僅允許梯度圖中之區域最小值發生在第19b之標記圖中黃色標記像素共同所處的位置。
細胞核偵測以及驗證
第20圖係第2a圖之分割細胞核，包括不考慮形狀緊湊度之第2圖的分割細胞核(如第20a圖所示)、考慮形狀緊湊度之第2圖的分割細胞核(如第20b圖所示)、疊印在原影像上之分割細胞核(如第20c圖所示)。再次使用分水嶺轉換以計算已過濾之梯度圖的分水嶺(如第19c圖所示)，並自原肌膚細胞影像中獲得如第20a圖所示之分割細胞核。為了增加分割細胞和的可靠度，在一實施例中更包括考慮細胞核的形狀。形狀描述符為電腦、圖訊識別領域(patter recognition area)以及特別是顯微成像分析(microscopy imaging analysis)之應用的關鍵，其中形狀描述符具有的排除不需要的物件的功能，以用以增進分析的準確度。緊湊度(Compactness)為偵測不規則癌細胞之指標，其可在細胞核驗證的 階段使用，並且可表示為：緊湊度=A/P2，其中A表示物件的面積，P表示物件的周長。舉例而言，第20d以及20e圖中有兩種形狀，其中第20d圖的為橢圓形，並且第20e圖的為海星形。橢圓形具有較大的面積以及較小的周長，因此橢圓形具有較高的緊湊度。海星形具有較小的面積以及較大的周長，因此海星形具有較低的緊湊度。而細胞的形狀非常接近於具有高緊湊度的圓形或者橢圓形，因此該特性可用以移除不需要的具有低緊湊度的物件，以增進細胞核分割的準確度。
第20a圖顯示不考慮形狀緊湊度的分割細胞核，其中具有低緊湊度之離群值，並且該等低緊湊度的離群值不屬於細胞核。第20b圖所示為考慮形狀緊湊度之有效細胞核，其中保留了更加確認並具有高緊湊度的細胞核，並且移除了具有低緊湊度的離群值，以增進分割結果的準確度。在第20c圖中，白色的有效細胞核疊印在原影像上，以觀察並確認分割細胞核是否為所需要的。
細胞質分割
對於細胞質分割而言，收斂指標過濾器的操作係基於直覺的參數設定，並且由於收斂指標過濾器考慮的是影像的梯度向量而不是影像的亮度，因此收斂指標過濾器適合需要進行細胞分割之低對比以及高雜訊的顯微影像，其中收斂指標過濾器不需要前置處理(pre-processing)，因此在診斷中不會失去重要的用以增加對比並且移除雜訊的信息。另外，對於使用者或者醫護人員而言，收斂指標過濾器的參數設定可在演算處理的技術細節外，主觀地根據輸入之生醫影像的基本資訊調整，例如細胞的大小或者形狀。舉例而言，生醫影像的細胞大小與在前端採集程序之採樣率以及細胞或者組織的種類有關，因此使用者可主觀地根據在輸入影像中所觀察到的特徵設定參數。值得注意的是，收斂指 標過濾器係根據影像的關聯性信息以及位置訊息，以獲得確定的分割結果，並減少影像中低對比以及高雜訊所造成分割結果的不確定性。
以下為使用收斂指標過濾器分割細胞質的一些假設：(1)細胞的形狀以及其所相應的細胞核皆為凸多邊形區域；(2)各細胞質以及其所相應之細胞核幾乎同心，並且每一屬於細胞質及其相應之細胞核之像素的梯度向量皆指向同一細胞中心。
第21圖為在兩個相鄰之細胞周圍之梯度向量的分佈。第22圖為兩個相鄰之細胞的梯度圖，包括具有黃色區塊的原影像(如第22a圖所示)、位於第22a圖所示之黃色區塊中之所有像素的梯度向量(如第22b圖所示)以及位於第22b圖所示之綠色區塊中之所有像素的梯度向量(如第22c圖所示)。上述收斂指標過濾器分割細胞質的假設使其可利用有效細胞之資訊，偵測各細胞之細胞質的大小以及形狀。第21圖顯示為上述想法之一實施例，並且第21圖為具有包含細胞質邊界以及細胞核邊界之突起區域的兩個相鄰細胞，其中細胞質邊界為黑色部分，細胞核邊界為紅色部分。另外，綠色箭頭表示在細胞質邊界周圍之梯度向量的分佈，其中綠色箭頭指向所相應的細胞中心。為了在實際的生醫影像上觀察此現象，我們專注於在第22a圖所示之黃色區塊內之兩個相鄰之細胞的梯度圖。第22b圖顯示在黃色區塊中之所有像素之藍色的梯度向量疊印在原影像上。若我們進一步專注於在第22b圖所示在綠色區塊中之這兩個相鄰細胞，可觀察到在每一細胞質上之梯度向量的分佈都指向相應之細胞的中心，如第22c圖所示。另外，梯度向量分佈的特性可利用在細胞質分割中。
局部過濾器系由先前在收斂指標中所描述之滑動帶濾波器(sliding band filter)的概念所設計的，其具有決定內部以及外部邊界間各種距離之 支援區域的能力以及決定在每一方向上之中心的能力，以在各細胞之支援區域之內部以及外部邊界至中心的每一方向上，適應最小距離Rmin以及最大距離Rmax的限制。
第23圖係局部過濾器之一支援區域。如第23圖所示，局部過濾器之支援區域R包含在不同方向上具有不同長度之內部以及外部邊界的一淺藍區域，並且內部以及外部邊界亦與中心P在不同方向上存在各種不同之長度。另外，細胞質分割亦需要有效細胞核的資訊，其有效細胞核的資訊包括形狀以及位置。
為了細胞質分割，P點可作為一白色有效細胞核之中心，並且P點周圍的淺藍色支援區域R可作為所偵測之細胞質的區域。
細胞質初始化
首先，細胞質初始化必須決定兩種極值，其中該兩種極值為內部以及外部邊界至支援區域之中心P在每一方向上的最小距離Rmin以及最大距離Rmax，以獲得更精準之細胞質分割。該兩種極值用以決定每一有效細胞核的形狀以及位置。細胞質的最小邊界Rmin可做為每一有效細胞核的邊界，以確認細胞質區域部會落在細胞核區域內。另外，最大距離Rmax系根據距離轉換的概念，產生有效細胞核的距離圖，以勾勒出每一細胞之潛在細胞質區域的最大邊界。因此，我們可以藉由最小距離Rmin以及最大距離Rmax準確地獲得潛在細胞質區域之邊界的限制，並可避免過度分割的問題以及各種生醫影像中堆疊細胞的邊界問題。
第24圖所示為決定最小距離Rmin以及最大距離Rmax的流程，其中包括第2a圖之分割細胞核(如第24a圖所示)、分割細胞核之一歐幾里德距離 圖(如第24b圖所示)、每一細胞之一潛在細胞質區域的最大邊界Rmax(如第24c圖所示)以及有效細胞核Rmin以及最大邊界Rmax在第2a圖上之疊映(如第24d圖所示)。第24圖為決定最小距離Rmin以及最大距離Rmax的流程。第24a圖顯示之第2a圖之分割細胞核，其細胞質之邊界為最小距離Rmin。第24b圖所示為其分割細胞核之歐幾里德距離圖。接著，使用分水嶺轉換以大略勾勒出第24c圖所示之各細胞之潛在細胞質區域的最大邊界Rmax。再來，第24d圖顯示疊印於第2a圖上之有效細胞核的最小距離Rmin以及最大距離Rmax清楚地劃分出各細胞的潛在細胞質區域。
細胞質偵測
在決定最小距離Rmin以及最大距離Rmax後，分別以橘色以及粉紅色在第23圖上標示每一細胞的最小距離Rmin以及最大距離Rmax。另外，局部過濾器之支援區域可作為N個線段的集合，並且其可用以表示在第23圖中細胞質在每一方向上自中心P向外的寬度。另外，梯度向量之收斂指標的定義與滑動帶濾波器大致相同，但在細胞中心P與支援區域的外部邊界之間，某些不同方向上的距離rj則是不同的。
局部過濾器的輸出在座標為(x,y)之點P上可被定義為N線段上之收斂指數的平均，並可在2維離散空間上表示為： 其中，N為自中心點P之半線輻射(half-lines radiating)的數量。Filterj(x,y)為線段在線jth上之收斂指數的平均。以及為中心點P至內部以及外部邊界在線jth以及半線Lj上的最小距離以及最大距離。為梯度向量G(Qj)=G(i,θj)的收斂指標，在像素的極座標為(i,θj)，並且其具有i至線jth以及半線Lj上之點p的距離，θj為相應於在笛卡爾座標系統中x軸之jth半線的方向。(i,θ j )為在極座標為(i,θj)之像素之梯度向量G(Qj)=G(i,Qj)的方向，Gx(i,θj)以及Gy(i,θj)分別為水平方向以及垂直方向在極座標為(i,θj)之像素上的一階導數。
第25圖為梯度向量以及的幾何表示。根據先前的假設，各細胞質以及其相應之細胞核幾乎是同心的，細胞的形狀以及相應之細胞核的形狀皆為突起區域，並且反應出細胞質特徵的支援區域會根據梯度向量的分佈自適變形，使得之中的梯度向量之收斂平均值成為最大值。為了計算，我們使用內積的概念： 其中，為自點指向點P的一向量。符號”∥.∥”表示向量的模方(norm)。
另外，在評估在每一方向上收斂指數Filterj(x,y)的平均時，由於具有較小值之可能為需要忽略之不規則的雜訊，我們僅考慮梯度向量大於一既定值之收斂指標，以增進實驗結果之細胞質分割的準確度。
局部過濾器之優化問題的解決方式為考慮分別在構成分割細胞 質內部以及外部邊界之每一半線Lj上的Qj以及的集合。在第26圖中所示的淺藍色區域為已分割的細胞質。本揭露所提供使用梯度向量分佈而非亮度之局部過濾器、考慮位置結構以及每一細胞的自適限制的方法，使其在各種生醫影像中成為細胞質分割之有效的工具。
第26圖為細胞質分割的結果，包括已分割細胞(如第26a圖所示)以及在原影像上之已分割細胞的輪廓圖(delineation)(如第26b圖所示)。第26a圖所示之第2A圖的分割細胞包括白色的已分割細胞核以及相應的青色細胞質。第26b圖所示為在原影像上已分割細胞的輪廓。為了使其更方便地獲得每一已分割細胞的資料，每一標記的分割細胞在電子表格中具有其單獨的資料紀錄，如下所述。
實驗結果
31名健康的志願者手的前臂皮膚的內側，利用上文提出的演算法，在600張的三次諧波(THG)虛擬活檢影像中，進行自動細胞分割以及核質比的評估。每一獨立的細胞都可利用本發明所提出的演算法來隔離以及切割，並且被評估過的核質比以及細胞大小也可提供各領域的醫生(例如，皮膚科以及放射科醫生)進行討論和讀解，使得這系統在臨床診斷中更有利用價值。
第27圖為細胞切割的結果，包括一原影像(如第27a圖所示)，以及在原影像上之已分割細胞的一已標記輪廓圖(如第27b圖所示)。表格1為第27圖中各分割細胞的詳細資料。
第28圖為細胞分割的結果，包括：原影像(如第28a圖所示)，以及在原影像上之已分割細胞的已標記輪廓圖(如第28b圖所示)。表格2是第28圖中各分割細胞的詳細資料。
第29圖為細胞分割後的結果，包括一原影像(如第29a圖所示)以及在原影像上之已分割細胞的已標記輪廓圖(如第29b圖所示)。表格3是第29 圖中各分割細胞的詳細資料。
第30圖為細胞分割後的結果，包括一原影像(如第30a圖所示)以及在原影像上之已分割細胞的已標記輪廓圖(如第30b圖所示)。表格4是第30圖中各分割細胞的詳細資料。
第31圖為細胞分割後的結果，包括一原影像(如第31a圖所示)以及在原影像上之已分割細胞的已標記輪廓圖(如第31b圖所示)。表格5是第31圖中各分割細胞的詳細資料。
第27-31圖顯示數種實驗的結果，並且表格1到5也標示出各分割細胞的詳細資料，包括核質比、細胞大小以及其相應之位置。由實驗結果可知，大多數的分割細胞都分割的非常準確，只有少數的分割是有誤的。醫生以及其他護理工作人員可採用使用者互動來減少有誤的細胞，並且利用細胞資訊來記錄每個分割細胞或目標細胞來加強細胞分割以及核質比的在臨床診斷中的評估。
表6是核質比分析比較圖。
表6顯示了本揭露以及習知核質比的比較。習知論文(S.-Y.Chen,S.-U.Chen,H.-Y.Wu,W.-J.Lee,Y.-H.Liao,and C.-K.Sun,In vivo virtual biopsy of human skin by using noninvasive higher harmonic generation microscopy,IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics,vol.16,no.3,pp.478-492,2010.)以及本揭露使用同樣的THG影像資料庫來做分析。本揭露以及習知論文最大不同點在於本揭露會自動分析以及處理生物醫學影像，而習知論文是人工手動操作以及篩選分割細胞和核質比分析。
從表6中所示之核質比的評估統計分佈可以看出核質比的評估演算法跟習知論文非常接近。本揭露所提供之分割細胞的演算法是由電腦計算平臺而算出來的，而由電腦之處理時間可以大概算出演算法的複雜性。由實驗結果可知，一張12位元並且解析度為512x512的影像，自動細胞分割以及資料評估需要5到15秒完成。然而，同樣12位元並且解析度為512x512的影像，在習知論文中需用到好幾分鐘來完成同樣的影像分析。
本揭露中細胞分割係利用電腦系統輔助設計不只加快醫療影像的分析並且提供客觀分割結果以及一致的準確度。在比較之下，傳統細胞分割技術利用人工細胞篩選來做分割以及需要好幾分鐘的時間來處理一張影像，另外，其也會受到眼睛疲勞以及主觀判別的影響，導致粗糙和不可靠的分割以及分析結果。舉例而言，本揭露所提供的方法可以利用核質比來協助醫生用非侵略性的方式提早辨別出疾病的症狀以及量化肌膚老化和評估肌膚活化商品(skin brightening products)。不僅如此，上文所提到的資料庫都可以利用電腦處理器，來執行細胞分割的方法。
以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，即大凡依本發明申請專利範圍及發明說明內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。另外本發明的任一實施例或申請專利範圍不須達成本發明所揭露之全部目的或優點或特點。此外，摘要部分和標題僅是用來輔助專利文件搜尋之用，並非用來限制本發明之權利範圍。

Claims (11)

  1. 一種細胞影像分割方法，適用於一電腦系統之一處理器，包括：接收一細胞影像；執行一細胞核初始化步驟，以獲得一內部標記以及外部標記，並藉以獲得一潛在細胞核以及相應於上述潛在細胞核之一潛在細胞邊界；計算所接收之上述細胞影像的一梯度圖；根據上述潛在細胞核以及上述潛在細胞邊界，對所計算之上述梯度圖執行一過濾步驟，以產生一已過濾之梯度圖；藉由對上述已過濾之梯度圖進行一分水嶺演算法，執行一細胞核偵測步驟，以獲得一分割細胞核；藉由保留上述分割細胞中具有高緊湊度之部分並且去除上述分割細胞中具有低緊湊度之部分，執行一細胞核驗證步驟，以獲得一有效細胞核，其中上述細胞核初始化步驟更包括：執行一區塊偵測步驟，以獲得一候選細胞核；執行一離群值移除步驟，以去除上述候選細胞核之一離群值，並藉以獲得上述內部標記；對上述內部標記執行一距離轉換步驟，以獲得一距離圖；以及執行一細胞邊界初始化步驟，以自上述距離圖中獲得上述外部標記。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之細胞影像分割方法，其中上述區塊偵測步驟更包括將已接收之上述細胞影像映射至一尺度空間，以闡釋已接收之上述細胞影像在各種尺度的一多尺度表示。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之細胞影像分割方法，其中上述區塊偵測步驟更包括一疊印步驟，用以計算在各種尺度之平均尺度資訊，以獲得上述候選細胞核。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之細胞影像分割方法，其中上述距離轉換步驟更包括計算上述內部標記之一歐氏距離(Euclidean distance)，以獲得上述距離圖。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之細胞影像分割方法，其中上述細胞邊界初始化步驟更包括對上述距離圖執行一分水嶺轉換，以獲得上述外部標記。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之細胞影像分割方法，其中上述過濾步驟更包括根據上述內部標記以及上述外部標記，對上述梯度圖執行一形態最小值疊印步驟。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之細胞影像分割方法，更包括一細胞質初始化步驟，以獲得上述有效細胞核之一潛在細胞質區域，其中上述潛在細胞質區域具有一最小邊界以及一最大邊界，其中上述最小邊界係為上述有效細胞核之一邊界，其中上述最大邊界係由上述有效細胞核之上述距離圖中所獲得的，其中上述潛在細胞質區域是上述最小邊界外以及上述最大邊界內之區域，其中上述方法更包括對上述有效細胞核之上述距離圖執行一分水嶺轉換，以獲得上述最大邊界。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之細胞影像分割方法，其中上述潛在細胞質區域具有複數梯度向量以及一細胞邊界，其中上述細胞影像分割方法更包括一細胞質偵測步驟，以藉由上述複數梯度向量，獲得上述細胞邊界。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之細胞影像分割方法，其中上述分割細胞核更包括複數像素，並且其中上述分割細胞核之緊湊度係由在上述分割細胞核中之每一上述像素之面積以及周長所決定的。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之細胞影像分割方法，其中上述分割細 胞核之緊湊度係由一A/P2函式所決定的，其中A代表在上述分割細胞核中之每一像素的面積，並且P代表在上述分割細胞核中之每一像素的周長。
  11. 一核質比評估方法，包括：執行如申請專利範圍第7項所述之細胞影像分割方法；以及藉由計算一細胞核面積以及一細胞質面積，獲得一核質比。
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