TW201444980A - 一種大腸癌預後套組 - Google Patents

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Abstract

本發明公開了一種大腸癌預後套組，它包括檢測如下5個基因中的任意一個或者多個基因的表達水準的相關試劑：BST1，如SEQ ID NO:1所示；MGST1，如SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQ ID NO:11或者12所示；RCAN3，如SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQ ID NO:23或者24所示。本發明還公開了檢測上述5種基因中的任意一個或者多個基因的表達水準的試劑在製備大腸癌預後試劑中的用途。本發明套組可以對大腸癌患者進行準確預後，臨床應用前景良好。

Description

一種大腸癌預後套組
本發明有關一種套組，特別有關一種大腸癌預後套組。
大腸癌，是最常見的惡性腫瘤之一，其在美國人腫瘤發病率中排名第五，在中國人腫瘤發病率中排名第四，是歐洲人第三大致死腫瘤疾病。大腸癌的血液和淋巴結轉移嚴重影響了大腸癌的預後，是導致患者死亡的重要原因，全世界大腸癌的發生率每年以2%的速度上升，急需一種有效預測大腸癌發展過程及結果的手段。
為了解決上述問題，本發明提供了一種大腸癌預後套組。
本發明大腸癌預後套組，它包括檢測如下5個基因中的任意一個或者多個基因的表達水準的相關試劑：BST1，如SEQ ID NO：1所示；MGST1，如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQ ID NO：11或者12所示；RCAN3，如SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQ ID NO：23或者24所示。
其中，所述試劑為檢測所述基因轉錄的RNA，特 別是mRNA的量的試劑。
其中，所述試劑為檢測與所述mRNA互補的cDNA的量的試劑。
其中，所述試劑為檢測與所述cDNA互補的cRNA的量的試劑。
其中，所述試劑為探針。
其中，所述試劑為檢測所述基因編碼的多肽的量的試劑。
其中，所述試劑為抗體、抗體片段或者親和性蛋白。
檢測如下5個基因中任意一個或者任意多個基因的表達水準的相關試劑在製備大腸癌預後試劑中的用途：BST1，如SEQ ID NO：1所示；MGST1，如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQ ID NO：11或者12所示；RCAN3，如SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQ ID NO：23或者24所示。
其中，所述試劑為檢測所述基因轉錄的RNA，特別是mRNA的量的試劑。
其中，所述試劑為檢測與所述mRNA互補的cDNA的量的試劑。
其中，所述試劑為檢測與所述cDNA互補的cRNA的量的試劑。
其中，所述試劑為探針。
其中，所述試劑為檢測所述基因編碼的多肽的量 的試劑。
其中，所述試劑為抗體或者親和性蛋白。
本發明檢測人體樣本，特別是人血液樣本中基因表達的方法，包括：1)測定受試者血樣的基因組中任意一個或者任意多個基因轉錄的RNA的水準，所述基因組包括如下基因：BST1，如SEQ ID NO：1所示；MGST1，如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQ ID NO：11或者12所示；RCAN3，如SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQ ID NO：23或者24所示。
(2)檢測受試者血樣中的基因表達。
優選地，所述步驟(1)是測定基因組中5個基因轉錄的RNA的水準。
其中，所述樣本是大腸癌患者的血液樣本。
其中，所述步驟(1)使用至少一個寡核苷酸。
其中，一個寡核苷酸僅與一個基因轉錄的RNA雜交，和/或可以與所述基因轉錄的RNA互補的cDNA雜交。
其中，所述步驟(1)包括如下步驟：a、擴增所述基因轉錄的RNA，得擴增產物；b、使用至少一個引子檢測步驟a所得擴增產物的量。
其中，所述步驟(1)包括如下步驟：i、用至少一個探針與所述基因轉錄的RNA互補的cDNA雜交，得雜交產物；ii、檢測步驟i所得雜交產物的量。
其中，所述步驟(1)包括擴增所述基因轉錄的RNA 的方法。
其中，所述步驟(1)包括檢測所述基因轉錄的RNA互補的cDNA的量的方法。
其中，所述步驟(1)至少使用一個探針。
其中，所述步驟(1)至少使用一個引子。
本發明寡核苷酸，它僅與一個基因轉錄的RNA雜交，和/或可以與所述基因轉錄的RNA互補的cDNA雜交，所述屬於一個基因組的基因由如下基因組成：BST1，如SEQ ID NO：1所示；MGST1，如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQ ID NO：11或者12所示；RCAN3，如SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQ ID NO：23或者24所示。
所述的寡核苷酸選自SEQ ID NO：25~34所示的核苷酸序列。
本發明檢測人體樣本，特別是人血液樣本中基因表達的套組，包括5個基因的5種表達產物的特異配偶體(specific partner)，每個配偶體與每個基因特定配合，所述5個基因如下所示：BST1，如SEQ ID NO：1所示；MGST1，如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQ ID NO：11或者12所示；RCAN3，如SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQ ID NO：23或者24所示。
其中，所述特異配偶體是寡核苷酸，特別是探針和/或引子。
其中，所述特異配偶體選自SEQ ID NO：25~34所示的核苷酸序列的集合。
其中，所述特異配偶體包含抗體和/或親和性蛋白。
本發明通過血液樣本預測大腸癌患者的發展情況的方法，它包括如下步驟：a)取血液樣本，檢測如下5個基因中任意一個或者任意多個基因的表達產物的量：BST1，如SEQ ID NO：1所示；MGST1，如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQ ID NO：11或者12所示；RCAN3，如SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQ ID NO：23或者24所示；b)將步驟a)檢測到的基因的表達產物的量輸入支援向量機模型，計算預後指數；c)根據步驟b)計算得到的結果，判斷大腸癌患者的預後：若樣本的預後指數大於0，其被歸類為高風險病例；若樣本的預後指數小於0，其被歸類為低風險病例。優選地，所述步驟a)是檢測5個基因中每個基因的表達產物的量。
其中，所述步驟a)中，檢測至少一個基因的表達產物的量是將所述基因的表達產物與該表達產物的特異配偶體接觸。
其中，步驟a)中，檢測基因的表達產物的量，所述基因的核酸序列選自SEQ ID NO：1~24所示序列集合。
其中，步驟a)所述表達產物包括至少一個RNA轉錄物或者一個多肽。
其中，所述表達產物包括至少一個mRNA。
其中，所述RNA轉錄物通過雜交、擴增或者測序的方法來檢測和定量。
其中，所述RNA轉錄物在預設條件下與至少一個探針和/或至少一個引子接觸，在預設條件下，所述探針和/或引子可以與RNA轉錄物雜交。
其中，與所述RNA轉錄物的cDNA在預設條件下與至少一個探針和/或至少一個引子接觸，在預設條件下，所述探針和/或引子可以與cDNA雜交。
其中，所述多肽的檢測是通過將多肽與至少一個特異配體接觸來檢測的，特別是與抗體或者親和性蛋白接觸。
其中，所述多肽與至少兩個特異配體接觸，特別是與兩個抗體、兩個親和性蛋白或者一個抗體和一個親和性蛋白接觸。
本發明通過血液樣本體外篩查人大腸癌患病風險的套組，包括5個基因中任意一個或者任意多個基因的表達產物的特異配偶體，每個配偶體與每個基因特定配合，所述5個基因如下所示：BST1，如SEQ ID NO：1所示；MGST1，如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQ ID NO：11或者12所示；RCAN3，如SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQ ID NO：23或者24所示；所述特異配偶體與基因的表達產物特異結合；所述5個基因的核酸序列選自SEQ ID NO：1~24所示序列的 集合。
優選地，包括5個基因中每個基因的表達產物的特異配偶體。
其中，所述特異配偶體包括至少一個雜交探針。
其中，所述特異配偶體包括至少一個雜交探針和至少一個引子。
其中，所述特異配偶體包括至少一個雜交探針和兩個引子。
其中，所述特異配偶體包括至少一個特異配體，特別是抗體或者親和蛋白。
其中，所述特異配偶體包括至少兩個特異配體，特別是兩個抗體、兩個親和性蛋白或者一個抗體和一個親和性蛋白。
本發明核酸序列如SEQ ID NO：1~24所示的5個基因的表達產物的特異配偶體在製備體外篩查大腸癌患病風險的試劑中的用途，所述特異配偶體與5個基因的表達產物特異結合。
優選地，所述特異配偶體是5個基因中每個基因的表達產物的特異配偶體。
其中，所述特異配偶體包括至少一個雜交探針。
其中，所述特異配偶體包括至少一個雜交探針和至少一個引子。
其中，所述特異配偶體包括至少一個雜交探針和兩個引子。
其中，所述特異配偶體包括至少一個特異配體，特別是抗體或者親和蛋白。
其中，所述特異配偶體包括至少兩個特異配體，特別是兩個抗體、兩個親和性蛋白或者一個抗體和一個親和性蛋白。
本發明基因表達水準的檢測可以通過檢測RNA轉錄物來實現。
術語“RNA轉錄物”是指總RNA，即編碼或者非編碼RNA，包括直接來自于外周血樣本中，也包括間接來自於細胞裂解後的血液樣本中的RNA。細胞裂解的方法可以採用申請號：WO 99/05338的專利申請公開的磁性和機械裂解方法，或者採用申請號：WO 99/53340的專利申請公開的磁裂解方法，或者採用申請號：WO 99/15321的專利申請公開的機械裂解方法，當然，也可以採用本領域公知的方法，如，熱裂解、高滲透壓裂解或者使用胍鹽等裂解液的化學裂解方法。細胞裂解後，還需要將核酸從裂解步驟產生的其他細胞組成物中分離出來，通常來講，離心即可純化核酸。總RNA包含tRNA，mRNA和rRNA，其中，mRNA包括目標基因轉錄的mRNA，也包括來自於其他非目標基因的mRNA。
本發明中，RNA轉錄物可以通過雜交、擴增或者測序的方法來檢測和量化。比如，將RNA轉錄物與探針或者引子雜交。
術語“雜交是指在適當條件下，兩個核酸片段通過穩定且特異的氫鍵結合，形成雙螺旋複合物的過程。所述氫鍵 存在於互補的腺嘌呤A和胸腺嘧啶T(或者尿嘧啶U)之間，簡稱A-T鍵，或者存在於互補的鳥嘌呤G和胞嘧啶C之間，簡稱G-C鍵。
兩段核酸片段的雜交可能是完全的(即形成完全互補的核苷酸片段或者序列)，雜交過程中形成雙螺旋複合物僅包含A-T鍵和G-C鍵；也可能是局部的(即形成充分互補的核苷酸片段或者序列)，雜交過程中形成雙螺旋複合物包含A-T鍵和G-C鍵，使得其可以形成雙螺旋結構，也包含未綁定到雙螺旋複合物上的鹼基。
兩段核酸片段的雜交程度取決於雜交的反應條件，特別是嚴格程度。所述嚴格程度是指兩個核酸片段的鹼基組成函數，也指兩個核酸片段的錯配程度。嚴格程度取決於反應條件，比如，雜交溶液中，離子的濃度和種類，變性劑的性質和濃度，和/或雜交溫度。這些條件是常規條件，本領域技術人員能確定合適的條件。通常來講，根據待雜交核酸片段的長度，雜交溫度在20~70℃之間，優選在35~65℃之間，生理鹽水的濃度在0.5~1M之間。
術語“擴增引子”，是指包含5~100個核苷酸的核酸片段，優選地，包含能起始酶促反應(比如，酶促擴增反應)的15~30個核苷酸。
術語“酶促擴增反應”是指通過在至少一種酶的作用下產生核酸片段多拷貝的過程。所述擴增反應是本領域公知常識，且在如下技術中被提及：美國專利No.4,683,195、美國專利No.4,683,202和美國專利No.4,800,159中描述的PCR(多聚 酶鏈式反應)，申請號為：EP 0 201 184的專利申請中公開的LCR(連接酶鏈式反應)，申請號為：WO 90/01069的專利申請中公開的RCR(修復鏈式反應)，申請號為：WO 90/06995的專利申請中記載的3SR(自主序列複製)，申請號為：WO 91/02818的專利申請中記載的NASBA(依賴核酸序列的擴增技術)，美國專利No.5,399,491中記載的TMA(轉錄介導的擴增)。
當酶促擴增反應為PCR時，擴增一個目標基因至少需要2個目標基因特異性的引子，保證擴增產物與目標基因特異性一致。如，擴增產物可以為目標基因mRNA反轉錄製備的互補DNA(cDNA)，或者，與該cDNA互補RNA(cRNA)。當酶促擴增反應是反轉錄酶介導的PCR，即為RT-PCR。
術語“雜交探針”是指包括至少5個核苷酸的核酸序列，比如，包含5~100個核苷酸，其能在指定條件下與目標基因的表達產物或者該表達產物的擴增產物雜交形成複合物。在本發明中，所述目標基因的表達產物包含目標基因mRNA，所述目標表達產物的擴增產物包括與目標產物mRNA互補DNA cDNA或者與cDNA互補的cRNA。雜交探針上還包括用於檢測的標誌物。
術語“檢測”是指計數方式等直接檢測法和使用標誌物方式等間接檢測方法。目前，有很多用於核酸檢測的方法(比如，Kricka et al.,Clinical Chemistry,1999,no 45(4),p.453-458 or Keller G.H.et al.,DNA Probes,2nd Ed.,Stockton Press,1993,sections 5 and 6,p.173-249記載的方法)。
術語“標誌物”是指可以產生能被檢測的信號的示 蹤劑。示蹤劑列表：包括產生能被偵測到的信號的酶，比如，辣根過氧化物酶，鹼性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡萄糖-6-磷酸或者脫氫酶，通過比色法，螢光或發光法檢測；發色團，如螢光，發光，染料化合物；電子密度基團，通過電子顯微鏡或憑藉其導電性等電學性能、由安培法、伏安法或者阻抗測量的方法檢測；基團，通過光學方法，比如，衍射，表面等離子體共振，或接觸角變化，或原子力光譜隧道效應等物理方法檢測；放射性分子，比如32P,35S或者125I。
上述雜交探針是一種檢測探針。檢測探針被標誌物標記的探針，如，Tyagi & Kramer(Nature biotech,1996,14：303-308)所述，檢測探針具體是指“分子信標”檢測探針。“分子信標”具有莖-環形結構，包括一個螢光基團和一個淬滅基團，當“分子信標”特異的環序列與其互補的目標基因的結合將會導致莖展開，並在適當的波長的激發過程中發射螢光。檢測探針具體還包括“報告探針”，如NanoStringTM’s技術所示，其包括一個“顏色編碼的條碼”。
檢測探針包括螢光團和淬滅劑，如，6-羧基-螢光素或者6-羧基-X-羅丹明，3’末端有淬滅劑：4-二甲胺基苯基偶氮苯磺醯氯。
為了檢測雜交反應，需要對目標序列進行標記，可以是直接標記，具體是在目標序列內部加入標誌物，也可以是間接標記，即使用檢測探針。具體是在雜交之前，實施包括標記和/或剪切目標序列的步驟，比如，在酶促擴增反應中使用被標記了的去氧核糖核三磷酸。咪唑或者氯化錳可以達到剪 切的作用。目標序列也可以在擴增步驟之後再標記，比如，通過申請號：WO 91/19812的專利申請檔中記載的三明治雜交技術雜交一個檢測探針。另外一種優選的方法是申請號：FR 2780059的專利申請檔中記載的標記核酸序列的方法。
上述雜交探針也是一種“捕獲”探針。“捕獲”探針可以通過任何適合的方法，直接地或者間接地固定在固體基質上，比如，通過共價鍵結合或者吸附。所述固體基質，可以是合成材料，也可以是化學修飾或者非化學修飾的天然材料，具體可以是多糖，如，基於纖維素的材料、葡聚糖、共聚物和聚合物，基於纖維素的材料包含紙、纖維素衍生物，纖維素衍生物包括醋酸纖維素、硝酸纖維素；可以是苯乙烯型單、棉等天然纖維或者等合成纖維；可以是無機材料，如，二氧化矽、石英、玻璃或者陶瓷；還可以是乳膠、磁性粒子、金屬衍生工具、凝膠等。固體基質可以是微量滴定板，可以是申請號：WO-A-94/12670的專利申請檔中的固定膜，也可以是顆粒。針對每個目標基因，也可以在基質上固定不同捕獲探針，具體地，一個能夠固定大量探針的基因晶片作為基質即可以實現。“基因晶片”是指很微小但固定了許多捕獲探針的固體基質，捕獲探針固定在預定位置上。
基因晶片，或者說DNA晶片的概念可以追溯到20世紀90年代初。它基於多學科技術，結合了微電子技術，核酸化學，圖像分析和資訊技術。它的工作原理是分子生物的基礎：雜交現象，即，兩個DNA或者RNA序列的互補配對。基因晶片的方法基於固定在固體基質上的捕獲探針，直接或者間接 螢光素標記的目標核酸片段的樣本可以與該探針相互作用。捕獲探針特異的固定在基質或者晶片上，每個雜交均可以給出一條與目標基因相關的特定資訊。特定資訊的集合使得計量一個或者多個目標基因的表達水準成為可能。為了分析目標基因的表達水準，需要準備包含大量探針的基質，這些探針與所有或者部分轉錄為mRNA的目標基因相關。其中，“低密度基質”是指包含的探針低於50個的基質，“中等密度基質”是指包含的探針數量為50~10000的基質，“高密度基質”是指包含超過10000個探針的基質。
目標基因的cRNA或者cDNA與特定的捕獲探針雜交後，清洗晶片或者基質，被標記的cDNA或者cRNA與捕獲探針的複合物可以通過綁定了螢光標籤的高親和力配體顯示出來。並通過資訊技術作出分析螢光，得出結果。進行分子診斷時，不得不提Affymetrix公司製備的DNA晶片(("Accessing Genetic Information with High-Density DNA arrays",M.Chee et al.,Science,1996,274,610-614."Light-generated ligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis",A.Caviani Pease et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1994,91,5022-5026)，在該技術中，捕獲探針往往很小，含有25個左右的核苷酸。其他一些生物晶片分別在如下文獻中公開：G.Ramsay,Nature Biotechnology,1998,No.16,p.40-44；F.Ginot,Human Mutation,1997,No.10,p.1-10；J.Cheng et al,Molecular diagnosis,1996,No.1(3),p.183-200；T.Livache et al,Nucleic Acids Research,1994,No.22(15),p.2915-2921 J. Cheng et al,Nature Biotechnology,1998,No.16,p.541-546，或者在美國專利No.4,981,783、美國專利No.5,700,637、美國專利No.5,445,934、美國專利No.5,744,305和美國專利No.5,807,522中。固體基質的主要特徵是保守捕獲探針與目標核酸片段的雜交，但產生的背景雜音卻很小。
捕獲探針固定在基質上的方式主要有三種：
1、將預先合成的探針布放於玻片載體上。通過微量、縮微或噴墨裝置，這種探針可以被直接附著到晶片上。這個技術允許附著的探針具有一系列大小不等的鹼基，從幾個鹼基(5~10個)，到較大尺寸的60個鹼基(印刷)，再到幾百個鹼基(微印刷)。
所述印刷與印表機的方式相似，是基於小球體流體以4000轉/s的速度推進。所述微印刷包括將含有幾十到幾百個鹼基的長探針附著到玻璃載片表面上。這些探針通常來自於資料庫，是擴增和純化的產物。DNA可以處在小於4cm2大小的面積範圍內，製備得到微陣列晶片，微陣列可以攜帶大約1萬個識別區域的斑點。使用直徑為0.5~1mm的尼龍膜，攜帶擴增的產物(通常是PCR擴增的)，稱為巨陣列，其最大密度為25斑點/cm2。許多實驗室採用該技術。本發明中，微印刷技術是包含生物晶片的，如申請號：WO-A-00/71750或者FR 00/14896的專利申請檔所示，一定體積的樣品可以沉積在微量滴定板的底部，或者依照如申請號：FR 00/14691的專利申請檔，一定數目的其他液滴能夠沉積在微量滴定板或者裴氏培養皿底部。
2、第二種在基質和晶片上附著晶片方法是原位雜 交。這種技術在晶片表面直接產生短探針。該技術基於原位寡核苷酸合成(詳見申請號：WO 89/10977和申請號：WO 90/03382的專利申請文件)和寡核苷酸合成程式。它包括一個移動的反應室，在該反應室中，寡核苷酸衍生反應可以沿著玻璃表面進行。
3、第三種技術叫做光刻，即Affymetrix公司開發的專門用於基因晶片的程式。它也是一種原位雜交技術，來自於微處理器技術。具體地，晶片表面被附著物活化，附著物是能夠被光活化的不穩定化學基團。這些基團一旦被活化就可以與寡核苷酸序列的3’末端反應。通過在晶片表面用預定形狀掩膜掩蓋的方式可以選擇性的活化和啟動晶片區域，在該掩蓋區域，可以結合四種核苷酸一個或者其他。不同掩膜的成功使用使得保護/反應可以交替迴圈，因而可以在大小約幾十平方微米的斑點產生寡核苷酸探針。該方式可以在幾平方釐米的表面區域產生成百上千的斑點。光刻的優點：可以通過4倍N迴圈產生N-mers的晶片。
雜交檢測目標基因表達還可以使用如下方法：(1)同上述方法步驟(1)，提取全血的總RNA，反轉錄得到該生物材料mRNAs的cDNAs。使用T7聚合酶，在啟動子的作用下，使cDNA的互補RNA發生聚合，得到以DNA為模版的互補RNA(cRNA)。得到包含目標基因特異性cRNAs與非目標基因特異性的cRNAs的混合物。(2)將cRNAs與固定了目標基因特異性的捕獲探針的基質混合，目標基因特異性的捕獲探針將與目標基因特異性的cRNAs發生雜交反應，而與非目標基因特異性 的cRNAs不發生雜交反應。通過在基質上同時固定不同的捕獲探針(一個探針與一個目標基因對應)，可以同時檢測不同目標基因的表達水準。在雜交反應之前也可以先對目標基因特異性的cRNAs按照前述方法進行標記和/或剪切。(3)檢測雜交反應的結果。檢測是通過將基質與帶有標籤的檢測探針混合後，檢測標籤發出的信號實現的，所述基質上帶有目標基因特異性的捕獲探針，該探針可以與目標基因特異性的cRNAs雜交。若之前已經對目標基因特異性的cRNAs進行標記，則直接檢測即可。當基質上有大量探針時，cRNA的優勢尤其明顯。
本發明基因表達水準的檢測可以通過檢測多肽來實現。具體是將多肽與至少一種特定配體相結合。前述試劑為檢測所述基因編碼的多肽的量的試劑。
優選地，所述試劑為抗體或者親和性蛋白。在本發明優選實施例中，是將表達的多肽與至少兩個特定配體結合。本發明特定配體可以是抗體或者名叫“NanofitinTM”的親和蛋白。
所述“抗體”包括多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體和重組抗體，它們的製備方法是本領域公知常識。
基因表達資料具有資料量大、維數高、樣本小、非線性的特點。對基因表達資料分析的重要任務之一是對樣品進行判別分類，即根據已知的基因表達資料建立判別模型，對未知樣本進行分類，這對疾病的診斷具有非常重要的意義。傳統的統計分類方法如線性判別、logistic判別等有很大的局限性，由於這些方法本質上是線性的，難以適合複雜的情況，同時基因 表達資料分析中變數(基因)的個數遠大於樣本的例數，無法進行有效的計算。
支持向量機(Support Vector Machine,SVM)是近年來在統計學習理論的基礎上發展起來的一種新型機器學習方法。它採用了結構風險最小化原則，能較好的解決小樣本學習的問題，尤其是針對維數高、樣本小、非線性的基因表達資料，支援向量機表現出了很好的性能。Guyon首次將其應用于白血病基因表達資料的研究，獲得成功(I.Guyon,Machine Learning,2002,No.46,p.389-422；J.)。近年來，國內學者的研究也證實了支援向量機演算法優越的性能(Z.Zhu,Journal of Clinical Oncology,2009,No.7,p.1091-1099；Y.Xu,Clincial Cancer Research,2013,No.19,p.3039-3045)。
本發明套組可以有效預測大腸癌患者的發展情況，並且操作簡單，僅需血液檢查，患者依從性高，為臨床大腸癌患者的治療提供了可靠的依據，具有良好的應用前景。
顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實例。凡基於本發明上述內容所實現的技術均屬於本發明的範圍。
圖1 組1中54例I-IV期患者Kaplan-Meier曲線。
圖2 組2中33例II期患者Kaplan-Meier曲線。
圖3 組2中54例III期患者Kaplan-Meier曲線。
實施例1 樣本採集
經過知情同意，外周血樣本來自於141例經過臨床病理診斷確診的大腸癌患者(CRC)，採集於2006.10~2009.5年間。
CRC招募於中國復旦大學上海癌症中心結直腸外科，均按照國際抗癌聯盟(UICC)建議的TNM分期系統進行分期。患者均未接受術前化療或者放療。患有遺傳性結直腸癌或炎症性腸道疾病(Corhn病或潰瘍性結腸炎)的患者被排除在本發明之外。檢測樣本的人口特徵和臨床特徵如表1所示：
血液樣本的收集：取每個參與者2.5ml外周血於PAXgeneTM血液RNA管(PreAnalytix GmbH,Hombrechtikon,CH)，並按照製造商的指導方法進行處理。中國復旦大學上海癌症中心，鏡檢一周後，手術前，收集CRCs的血液樣本。
分組：組1包括18例I期、8例II期、8例III期和20例IV期患者；組2包括33例II期和54例III期患者。
實施例2 BST1等5個基因的表達量檢測
1、實驗方法
(1)管家基因的選擇
以CSNK1G2,DECR1,FARP1表達水準的幾何平均數為“元管家基因”，作為即時定量PCR資料的校正因數。
(2)RNA提取和即時定量PCR檢測
全血抽取：取每個參與者2.5ml外周血於PAXgeneTM血液RNA管(PreAnalytix GmbH,Hombrechtikon,CH)，並按說明書進行處理；總RNA提取：按照說明書，用PAXgeneTM血液RNA系統(PreAnalytix)提取總RNA；用分光光度計在OD值為260nm下檢測總RNA的量，用安捷倫生物分析儀上的RNA6000 Nano LabChip®套組(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,U.S.A.)檢測總RNA的品質，完整值在7.0以上的RNA用於分析；反轉錄：以下面列出的目標基因的引子對為引子，使用QuantiTect®反轉錄套組(Qiagen GmbH,Hilden,Germany)，按照說明書的標準流程，用320毫微克的總RNA進 行反轉錄得到cDNA；cDNA擴增：以下面列出的目標基因的引子對為引子，使用SYBR Premix DimerEraser套組(Takara biotechnology,Dalian,China)，按照製造者提供的標準流程，擴增cDNA；cDNA檢測：擴增過程用Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR系統進行即時監測(Life Technologies,Carlsbad,CA,U.S.A.)，根據目標基因的表達量與管家基因表達量，計算目標基因的相對表達量：△Ct(基因相對表達量)=Ct(目標基因)-Ct(管家基因)，計算目標基因的相對表達量。表達量為負表明目標基因的Ct值低於管家基因的Ct值；相對表達量為正表明目標基因的Ct值高於管家基因的Ct值。
管家基因的引子對：
1、CSNK1G2
F：5’-GCCGCAGTGATGTTCTAGC-3’
R：3’-TCTGCTGCCGTGCAAATC-5’
2、DECR1：
F：5’-CGATGCTACCACCTAATAGT-3’
R：3’-TAGGCTGGACAGAAGAGT-5’
3、FARP1：
F：5’-ACCTGTCGTTATTCCTATATCC-3’
R：3’-GAAACCGTGTTCCCTGTG-5’
目標基因的引子對：
1、BST1：
F：5’-ATAGCCACCTCCTTGTTA-3’
R：3’-TAATCGAGTCCAGAGTCAT-5’
2、MGST1：
F：5’-TAGAACGTGTACGCAGAG-3’
R：3’-CAATGGTGTGGTAGATCC-5'；
3、HP：
F：5’-GGTTCAGAAGACCATAGC-3’
R：3’-ATCTTATCGCATCCACTC-5’
4、RCAN3：
F：5’-ACCAGGAAGGAACAGAAC-3’
R：3’-AGAACGAAACCACAATGAC-5’
5、SRA1：
F：5’-GCAGCCAATGAAGAGAAA-3’
R：3’-GGGAACCGAGGATTATGA-5’
實施例3 基因表達量與大腸癌的相關性
1、單個基因表達量與大腸癌預後的相關性
按照實施例2的方法分別檢測實施例1中組1的54名患者的血液樣本中5個基因的表達水準一相對表達量，採用COX比例風險模型分析結合前向特徵選擇演算法，篩選表達模式與患者 預後具有顯著相關性的目標基因。根據統計分析結果，5個基因的表達模式對患者預後具有各自獨立的、顯著的預測意義。
(1)BST1(bone marrow stromal cell antigen 1)：
BST1基因的表達量與大腸癌患者的預後顯著相關(P=0.02)。該基因高表達將增加大腸癌患者死亡的風險。風險比為3.3，表明該基因表達量每增加一個單位，患者死亡的風險將增加3.3倍。
(2)MGST1(microsomal glutathione S-transferase 1)：
MGST1基因的表達量與大腸癌患者的預後顯著相關(P=0.01)。該基因高表達將增加大腸癌患者死亡的風險。風險比為4.5，表明該基因表達量每增加一個單位，患者死亡的風險將增加4.5倍。
(3)HP(haptoglobin)：
HP基因的表達量與大腸癌患者的預後顯著相關(P=0.005)。該基因高表達將增加大腸癌患者死亡的風險。風險比為2.3，表明該基因表達量每增加一個單位，患者死亡的風險將增加2.3倍。
(4)RCAN3(RCAN family member 3)：
RCAN3基因的表達量與大腸癌患者的預後顯著相關(P=0.001)。該基因低表達將增加大腸癌患者死亡的風險。風險比為0.6，表明該基因表達量每降低一個單位，患者死亡的風險將增加1.7倍。
(5)SRA1(Steroid receptor RNA activator 1)：
SRA1基因的表達量與大腸癌患者的預後顯著相關(P=0.001)。該基因低表達將增加大腸癌患者死亡的風險。風險比為0.1，表明該基因表達量每降低一個單位，患者死亡的風險將增加10倍。
2、5個基因的表達量與大腸癌預後的相關性
發明人採用通行的R統計語言、“e1071”軟體工作包，調用支援向量機演算法，結合上述54例樣本中5個基因的表達資料，建立分類模型。根據該分類模型可以計算每個待檢大腸癌患者的預後指數。
若樣本的預後指數大於0，其被歸類為高風險病例；若樣本的預後指數小於0，其被歸類為低風險病例。實施例1組1中25例患者被歸入高風險組，29例患者歸入低風險組。高風險組的25例患者中有20例死亡，低風險組的29名患者中僅3例死亡，提示低風險組的預後要顯著地優於高風險組。Log-rank檢驗P值小於0.001，具有統計學意義。採用 Kaplan-Meier曲線和Log-rank檢驗比較兩組患者的生存率。Kaplan-Meier曲線如圖1所示。採用多因素COX回歸分析比較病理TNM分期與5個基因預測模型評估患者預後的性能，結果如表1所示，TNM分期和5個基因預測結果均與患者預後具有顯著的相關性(P值小於0.01)，並且5個基因預測模型能夠提供獨立于現有臨床病理分期的、可用于評估患者死亡風險的資訊。
按照實施例3的方法檢測實施例1組2中33例II期患者的血液樣本中5個基因的表達水準。根據5個基因的表達水準，用前述分類模型分類，計算預後指數。其中，15例患者被歸入高風險組，18例患者歸入低風險組。採用Kaplan-Meier曲線和Log-rank檢驗比較兩組患者的生存率。Kaplan-Meier曲線如圖2所示。
按照實施例3的方法檢測實施例1組2中54例III期患者的血液樣本中5個基因的表達水準。根據5個基因的表達水準，用前述分類模型分類，計算預後指數。其中，26例患者被歸入高風險組，28例患者歸入低風險組。採用Kaplan-Meier曲線和log-rank檢驗比較兩組患者的總生存時間，結果如圖3所示。
同時，觀察上述樣本的病情發展情況，II期高風險組的15例患者中有3例死亡，低風險組的18名患者全部存活，提示低風險組的預後要優於高風險組。Log-rank檢驗P值等於 0.05，具有統計學意義；III期高風險組的26例患者中有7例死亡，低風險組的28例患者中有1例死亡，提示低風險組的預後要優於高風險組。Log-rank檢驗P值等於0.016，具有統計學意義。
綜合上述結果，統計如表2：
由上述結果可以看出，因大腸癌死亡的患者全部屬於本發明套組預測屬於高風險的人群，本發明預測屬於低風險的人群全部存活，說明本發明套組可以準確預後。
實施例4 本發明套組的組成及待檢樣本的檢測
1、套組的組成
(1)總RNA提取試劑
PAXgeneTM血液RNA系統。
(2)反轉錄試劑
反轉錄酶(50ul)；反轉錄緩衝液(200ul)；基因組DNA去除緩衝液(100ul)；引子(50ul)；無酶水(1.9ml)；PCR反應板：含正向引子溶液和反向引子溶液的384孔板。
管家基因的引子對：
1、CSNK1G2
F：5’-GCCGCAGTGATGTTCTAGC-3’
R：3’-TCTGCTGCCGTGCAAATC-5’
2、DECR1：
F：5’-CGATGCTACCACCTAATAGT-3’
R：3’-TAGGCTGGACAGAAGAGT-5’
3、FARP1：
F：5’-ACCTGTCGTTATTCCTATATCC-3’
R：3’-GAAACCGTGTTCCCTGTG-5’
目標基因的引子對：
1、BST1：
F：5’-ATAGCCACCTCCTTGTTA-3’
R：3’-TAATCGAGTCCAGAGTCAT-5’
2、MGST1：
F：5’-TAGAACGTGTACGCAGAG-3’
R：3’-CAATGGTGTGGTAGATCC-5'；
3、HP：
F：5’-GGTTCAGAAGACCATAGC-3’
R：3’-ATCTTATCGCATCCACTC-5’
4、RCAN3：
F：5’-ACCAGGAAGGAACAGAAC-3’
R：3’-AGAACGAAACCACAATGAC-5’
5、SRA1：
F：5’-GCAGCCAATGAAGAGAAA-3’
R：3’-GGGAACCGAGGATTATGA-5’
(3)cDNA擴增試劑
含有反應酶和螢光染料的混合緩衝液(20ml)；ROX參考染料(800ul)PCR反應板：PCR反應板：同反轉錄試劑中PCR反應板。
2、套組的使用方法
(1)待檢參與者2.5ml外周血採集於PAXgeneTM血液RNA管(PreAnalytix GmbH,Hombrechtikon,CH)，並按照製造商的指導方法進行處理；按照製造者提供的說明書，用PAXgeneTM血液RNA系統(PreAnalytix)提取待檢樣本。
(2)反轉錄以步驟(1)的總RNA為範本，用上述反轉錄試劑，得到5個目標基因和管家基因的cDNA。
(3)cDNA擴增取步驟(2)得到的cDNA為範本，用上述cDNA擴增試劑擴增，使用Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR系統檢測cDNA的量。
(4)將檢測到的5個基因的表達水準輸入支援向量機模型，計算預後指數。若樣本的預後指數大於0，其被歸類為高風險病例；若樣本的預後指數小於0，其被歸類為低風險病例。
備註：本發明套組中，目標基因引子對的數目可以根據需要任意選擇一對或者多對。
綜上所述，本發明5個基因與大腸癌發展密切相關，這些基因的高/低表達會顯著提高大腸癌的危險性，可通 過單獨或者同時檢測這5個基因的表達水準測定大腸癌患者病情的發展情況，準確度高。
<110> 生物梅里埃股份公司
<120> 一種大腸癌預後套組
<130> GY224-14P1128
<160> 40
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1497
<212> DNA
<213> BST1基因序列
<400> 1
<210> 2
<211> 919
<212> DNA
<213> MGST基因序列1
<400> 2
<210> 3
<211> 944
<212> DNA
<213> MGST1基因序列2
<400> 3
<210> 4
<211> 997
<212> DNA
<213> MGST1基因序列3
<400> 4
<210> 5
<211> 927
<212> DNA
<213> MGST1基因序列4
<400> 5
<210> 6
<211> 937
<212> DNA
<213> MGST1基因序列5
<400> 6
<210> 7
<211> 1088
<212> DNA
<213> MGST1基因序列6
<400> 7
<210> 8
<211> 849
<212> DNA
<213> MGST1基因序列7
<400> 8
<210> 9
<211> 1509
<212> DNA
<213> MGST1基因序列8
<400> 9
<210> 10
<211> 902
<212> DNA
<213> MGST1基因序列9
<400> 10
<210> 11
<211> 1461
<212> DNA
<213> HP基因序列1
<400> 11
<210> 12
<211> 1284
<212> DNA
<213> HP基因序列2
<400> 12
<210> 13
<211> 2787
<212> DNA
<213> RCAN3基因序列1
<400> 13
<210> 14
<211> 2754
<212> DNA
<213> RCAN3基因序列2
<400> 14
<210> 15
<211> 2668
<212> DNA
<213> RCAN3基因序列3
<400> 15
<210> 16
<211> 2646
<212> DNA
<213> RCAN3基因序列4
<400> 16
<210> 17
<211> 2503
<212> DNA
<213> RCAN3基因序列5
<400> 17
<210> 18
<211> 2580
<212> DNA
<213> RCAN3基因序列6
<400> 18
<210> 19
<211> 2361
<212> DNA
<213> RCAN3基因序列7
<400> 19
<210> 20
<211> 2533
<212> DNA
<213> RCAN3基因序列8
<400> 20
<210> 21
<211> 2392
<212> DNA
<213> RCAN3基因序列9
<400> 21
<210> 22
<211> 2187
<212> DNA
<213> RCAN3基因序列10
<400> 22
<210> 23
<211> 1955
<212> DNA
<213> SRA1基因序列1
<400> 23
<210> 24
<211> 1270
<212> DNA
<213> SRA1基因序列2
<400> 24
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> BST1基因轉錄mRNA的反轉錄正向擴增引子
<400> 25
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> BST1基因轉錄mRNA的反轉錄反向擴增引子
<400> 26
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> MGST1基因轉錄mRNA的反轉錄正向擴增引子
<400> 27
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> MGST1基因轉錄mRNA的反轉錄反向擴增引子
<400> 28
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> HP基因轉錄mRNA的反轉錄正向擴增引子
<400> 29
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> HP基因轉錄mRNA的反轉錄反向擴增引子
<400> 30
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> RCAN3基因轉錄mRNA的反轉錄正向擴增引子
<400> 31
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> RCAN3基因轉錄mRNA的反轉錄反向擴增引子
<400> 32
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> SRA1基因轉錄mRNA的反轉錄正向擴增引子
<400> 33
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> SRA1基因轉錄mRNA的反轉錄反向擴增引子
<400> 34
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 管家基因CSNK1G2轉錄mRNA的反轉錄正向擴增引子
<400> 35
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> 管家基因CSNK1G2轉錄mRNA的反轉錄反向擴增引子
<400> 36
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 管家基因DECR1轉錄mRNA的反轉錄正向擴增引子
<400> 37
<210> 38
<211> 18
<212> DNA
<213> 管家基因DECR1轉錄mRNA的反轉錄反向擴增引子
<400> 38
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 管家基因FARP1轉錄mRNA的反轉錄正向擴增引子
<400> 39
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 管家基因FARP1轉錄mRNA的反轉錄反向擴增引子
<400> 40

Claims (56)

  1. 一種大腸癌預後套組，其特徵在於：它包括檢測如下5個基因中的任意一個或者多個基因的表達水準的相關試劑：BST1，如SEQ ID NO：1所示；MGST1，如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQ ID NO：11或者12所示；RCAN3，如SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQ ID NO：23或者24所示。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的套組，其特徵在於：所述試劑為檢測所述基因轉錄的RNA、特別是mRNA的量的試劑。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的套組，其特徵在於：所述試劑為檢測與所述mRNA互補的cDNA的量的試劑。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的套組，其特徵在於：所述試劑為檢測與所述cDNA互補的cRNA的量的試劑。
  5. 如申請專利範圍第2至4項任一項所述的套組，其特徵在於：所述試劑為探針。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的套組，其特徵在於：所述試劑為檢測所述基因編碼的多肽的量的試劑。
  7. 根據權利要求6所述的套組，其特徵在於：所述試劑為抗體、抗體片段或者親和性蛋白。
  8. 一種檢測如下5個基因中任意一個或者任意多個基因的表達水準的相關試劑在製備大腸癌預後套組中的用途： BST1，如SEQ ID NO：1所示；MGST1，如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQ ID NO：11或者12所示；RCAN3，如SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQ ID NO：23或者24所示。
  9. 如申請專利範圍第8項所述的用途，其特徵在於：所述試劑為檢測所述基因轉錄的RNA、特別是mRNA的量的試劑。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的用途，其特徵在於：所述試劑為檢測與所述mRNA互補的cDNA的量的試劑。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的用途，其特徵在於：所述試劑為檢測與所述cDNA互補的cRNA的量的試劑。
  12. 如申請專利範圍第9至11項任一項所述用途，其特徵在於：所述試劑為探針。
  13. 如申請專利範圍第8項所述的用途，其特徵在於：所述試劑為檢測所述基因編碼的多肽的量的試劑。
  14. 如申請專利範圍第13項所述的用途，其特徵在於：所述試劑為抗體或者親和性蛋白。
  15. 一種檢測人體樣本、特別是人血液樣本中基因表達的方法，包括：(1)測定受試者血樣的基因組中任意一個或者任意多個基因轉錄的RNA的水準，所述基因組包括如下基因：BST1，如SEQ ID NO：1所示；MGST1，如SEQ ID NO：2、3、 4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQ ID NO：11或者12所示；RCAN3，如SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQ ID NO：23或者24所示；(2)檢測受試者血樣中的基因表達。
  16. 如申請專利範圍第15項所述的方法，其特徵在於：所述步驟(1)是測定基因組中5個基因轉錄的RNA的水準。
  17. 如申請專利範圍第15項所述的方法，其特徵在於：所述樣本是大腸癌患者的血液樣本。
  18. 如申請專利範圍第15項所述的方法，其特徵在於：所述步驟(1)使用至少一個寡核苷酸。
  19. 如申請專利範圍第18項所述的方法，其特徵在於：其中，一個寡核苷酸僅與一個基因轉錄的RNA雜交，和/或可以與所述基因轉錄的RNA互補的cDNA雜交。
  20. 如申請專利範圍第19項所述的方法，其特徵在於：所述步驟(1)包括如下步驟：a、擴增所述基因轉錄的RNA，得擴增產物；b、使用至少一個引子檢測步驟a所得擴增產物的量。
  21. 如申請專利範圍第20項所述的方法，其特徵在於：所述步驟(1)包括如下步驟：i、用至少一個探針與所述基因轉錄的RNA互補的cDNA雜交，得雜交產物；ii、檢測步驟i所得雜交產物的量。
  22. 如申請專利範圍第15項所述的方法，其特徵在於：所述步 驟(1)包括擴增所述基因轉錄的RNA的方法。
  23. 如申請專利範圍第15項所述的方法，其特徵在於：所述步驟(1)包括檢測所述基因轉錄的RNA互補的cDNA的量的方法。
  24. 如申請專利範圍第15項所述的方法，其特徵在於：所述步驟(1)至少使用一個探針。
  25. 如申請專利範圍第15項所述的方法，其特徵在於：所述步驟(1)至少使用一個引子。
  26. 一種寡核苷酸，它僅與一個基因轉錄的RNA雜交，和/或可以與所述基因轉錄的RNA互補的cDNA雜交，所述屬於一個基因組的基因由如下基因組成：BST1，如SEQ ID NO：1所示；MGST1，如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQ ID NO：11或者12所示；RCAN3，如SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQ ID NO：23或者24所示。
  27. 如申請專利範圍第26項所述的寡核苷酸，其特徵在於：其選自SEQ ID NO：25~34所示的核苷酸序列。
  28. 一種檢測人體樣本、特別是人血液樣本中基因表達的套組，其特徵在於：包括5個基因的5種表達產物的特異配偶體，每個配偶體與每個基因特定配合，所述5個基因如下所示：BST1，如SEQ ID NO：1所示；MGST1，如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQ ID NO：11或者 12所示；RCAN3，如SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQ ID NO：23或者24所示。
  29. 如申請專利範圍第28項所述的套組，其特徵在於：所述特異配偶體是寡核苷酸，特別是探針和/或引子。
  30. 如申請專利範圍第29項所述的套組，其特徵在於：所述特異配偶體選自SEQ ID NO：25~34所示的核苷酸序列的集合。
  31. 如申請專利範圍第30項所述的套組，其特徵在於：所述特異配偶體包含抗體和/或親和性蛋白。
  32. 一種通過血液樣本預測大腸癌患者的發展情況的方法，其特徵在於：它包括如下步驟：a)取血液樣本，檢測如下5個基因中任意一個或者任意多個基因的表達產物的量：BST1，如SEQ ID NO：1所示；MGST1，如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQ ID NO：11或者12所示；RCAN3，如SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQ ID NO：23或者24所示；b)將步驟a)檢測到的基因的表達產物的量輸入支援向量機模型，計算預後指數；c)根據步驟b)計算得到的結果，判斷大腸癌患者的預後。
  33. 如申請專利範圍第32項所述的方法，其特徵在於：所述步驟a)是檢測5個基因中每個基因的表達產物的量。
  34. 如申請專利範圍第32項所述的方法，其特徵在於：所述步 驟a)中，檢測至少一個基因的表達產物的量是將所述基因的表達產物與該表達產物的特異配偶體接觸。
  35. 如申請專利範圍第32項所述的方法，其特徵在於：步驟a)中，檢測基因的表達產物的量，所述基因的核酸序列選自SEQ ID NO：1~24所示序列集合。
  36. 如申請專利範圍第32項所述的方法，其特徵在於：步驟a)所述表達產物包括至少一個RNA轉錄物或者一個多肽。
  37. 如申請專利範圍第32項所述的方法，其特徵在於：所述表達產物包括至少一個mRNA。
  38. 如申請專利範圍第36項所述的方法，其特徵在於：所述RNA轉錄物通過雜交、擴增或者測序的方法來檢測和定量。
  39. 如申請專利範圍第36項所述的方法，其特徵在於：所述RNA轉錄物在預設條件下與至少一個探針和/或至少一個引子接觸，在預設條件下，所述探針和/或引子可以與RNA轉錄物雜交。
  40. 如申請專利範圍第39項所述的與所述RNA轉錄物的cDNA在預設條件下與至少一個探針和/或至少一個引子接觸，在預設條件下，所述探針和/或引子可以與cDNA雜交。
  41. 如申請專利範圍第36項所述的方法，其特徵在於：所述多肽的檢測是通過將多肽與至少一個特異配體接觸來檢測的，特別是與抗體或者親和性蛋白接觸。
  42. 如申請專利範圍第41項所述的方法，其特徵在於：所述多肽與至少兩個特異配體接觸，特別是與兩個抗體、兩個親和性蛋白或者一個抗體和一個親和性蛋白接觸。
  43. 一種通過血液樣本預測大腸癌患者的發展情況的套組，其特徵在於：包括5個基因中任意一個或者任意多個基因的表達產物的特異配偶體，每個配偶體與每個基因特定配合，所述5個基因如下所示：BST1，如SEQ ID NO：1所示；MGST1，如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQ ID NO：11或者12所示；RCAN3，如SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQ ID NO：23或者24所示；所述特異配偶體與基因的表達產物特異結合；所述5個基因的核酸序列選自SEQ ID NO：1~24所示序列的集合。
  44. 如申請專利範圍第43項所述的套組，其特徵在於：包括5個基因中每個基因的表達產物的特異配偶體。
  45. 如申請專利範圍第43項所述的套組，其特徵在於：所述特異配偶體包括至少一個雜交探針。
  46. 如申請專利範圍第45項所述的套組，其特徵在於：所述特異配偶體包括至少一個雜交探針和至少一個引子。
  47. 如申請專利範圍第46項所述的套組，其特徵在於：所述特異配偶體包括至少一個雜交探針和兩個引子。
  48. 如申請專利範圍第43項所述的套組，其特徵在於：所述特異配偶體包括至少一個特異配體，特別是抗體或者親和蛋白。
  49. 如申請專利範圍第48項所述的套組，其特徵在於：所述特 異配偶體包括至少兩個特異配體，特別是兩個抗體、兩個親和性蛋白或者一個抗體和一個親和性蛋白。
  50. 一種核酸序列如SEQ ID NO：1~24所示的5個基因中任意一個或者任意多個基因的表達產物的特異配偶體在製備大腸癌預後試劑中的用途。
  51. 如申請專利範圍第50項所述的用途，其特徵在於：所述特異配偶體是5個基因中每個基因的表達產物的特異配偶體。
  52. 如申請專利範圍第50項所述的用途，其特徵在於：所述特異配偶體包括至少一個雜交探針。
  53. 如申請專利範圍第52項所述的用途，其特徵在於：所述特異配偶體包括至少一個雜交探針和至少一個引子。
  54. 如申請專利範圍第53項所述的用途，其特徵在於：所述特異配偶體包括至少一個雜交探針和兩個引子。
  55. 如申請專利範圍第50項所述的用途，其特徵在於：所述特異配偶體包括至少一個特異配體，特別是抗體或者親和蛋白。
  56. 如申請專利範圍第55項所述的用途，其特徵在於：所述特異配偶體包括至少兩個特異配體，特別是兩個抗體、兩個親和性蛋白或者一個抗體或者一個親和性蛋白。
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