TW201420108A - 包含靈芝萃取物的組成物及其用途 - Google Patents

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Lin-Yea Horng
Hui-Ching Sung
Li-Wen Chen
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Abstract

提供一種用於在患有細胞自噬(autophahy)缺陷之個體誘導細胞自噬之方法。本發明之方法包括投予該個體治療有效量之靈芝萃取物(Ganoderma lucidum extract)之步驟，其中，該細胞自噬增加該個體之蛋白質聚集體(protein aggregate)的清除。

Description

誘導細胞自噬的方法與組成物
本發明是有關誘導細胞自噬的方法，且特別是有關在個體誘導細胞自噬的方法，係藉由投予該個體靈芝萃取物。
細胞自噬(autophagy)或稱「自體消化過程(self digestion process)」，為維持細胞生理功能的重要過程之一，細胞質中某些需要被分解的成分，如蛋白質、沉積的蛋白質或胞器，經由細胞自噬於溶酶體中降解。細胞自噬過程對於維持神經恆定性也是必要的，且其功能失調(dysfunction)與多種疾病有直接關聯。
當細胞處在飢餓狀態時，細胞自噬提供細胞將細胞質物質分解後進行回收並促進其代謝轉換之過程，而當細胞處於壓力時，細胞自噬也能將損壞的胞器和蛋白質清除。
細胞自噬的缺陷主要與疾病有關，可為，但不限於：神經退化性疾病、肝臟相關疾病及癌症。許多人類神經退化性疾病與異常突變及/或泛素蛋白(polyubiquitinated protein)累積以及過度的神經細胞死亡有關。
神經生長因子(Nerve growth factor，NGF)於1951年的研究中被發現，是第一個被研究的神經滋養因子。在發育過程及成熟動物個體中，NGF是由星狀細胞(astrocytes)分泌，且對於神經突觸可塑性以及建立有功能的神經迴路亦扮演重要的角色。此內生性的NGF對於前腦負責學習記憶之膽鹼神經元的存活及功能也是不可或缺的角色，當此種神經滋養因子缺乏時，會導致學習與記憶喪失的情形發生。
在許多動物模式中，NGF已顯示具有潛在的神經保護效果。此外，在大鼠中，NGF能保護對抗粒線體毒素例如3-NP和MPTP所引起的神經元死亡。因此，在神經退化性疾病之治療的藥理應用中，NGF被認為是關鍵的角色。然而，NGF進出係受到血腦障壁(blood-brain barrier)的限制，且當經周邊投藥時又易被代謝掉；因此，它只能被直接注入至腦部而使用。當NGF經由腦室注射時，會引起許多副作用，因而使該傳遞途徑不能實行。因此，對於神經退化性疾病，調控內生性NGF表現在可能是一種嶄新的治療策略。
神經退化泛指神經元之功能或結構漸進式的缺失。許多神經退化性疾病，包括帕金森氏症(Parkinson’s disease,PD)、阿茲海默症(Alzheimer’s disease,AD)、亨丁頓氏舞蹈症(Huntington’s disease,HD)和肌萎縮性脊髓側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)都是因神經退化的過程所造成。最近，許多神經退化性疾病的類似疾病被發現，這些疾病彼此之間都有些關聯。舉例來說，有些神經退化性疾病與摺疊錯誤的蛋白質之不正常堆積有關，這類蛋白質亦被稱為非典型的蛋白質集結(atypical protein assemblies)。
亨丁頓氏舞蹈症(HD)是一種體染色體顯性遺傳之神經退化性疾病，其主要成因為亨丁頓(huntingtin，Htt)基因的表現子1(exon 1)上產生CAG三核苷酸重複序列的異常表現所導致。HD的主要特徵是HD實驗動物及病患腦中形成突變體亨丁頓蛋白Htt(mHtt)聚集體受斜紋狀體的神經元影響。此Htt基因之多麩醯胺(polyglutamine,polyQ)延伸的擴展大於37倍麩醯胺或編碼該polyQ延伸的短N-端片段足以造成聚集體形成於小鼠或該疾病之細胞模型。
靈芝(Ganoderma lucidum(GaLu))是亞洲地區使用廣泛且歷史悠久的藥用植物(真菌)之一。已有許多研究探討靈芝在疾病治療上的應用。靈芝的最重要藥理活性小分子成分是三萜類(triterpenoids)，研究指出該三萜類具有肝臟保護功能、降高血壓、降低膽固醇(hypocholesterolemic)、抗組織胺(anti-histaminic)、抗癌以及抗血管新生活性。然而，本草綱目提到靈芝具有增智慧的能力，這項功能至今尚未經由研究證實。
在本發明之態樣中，提供一種用於在患有細胞自噬缺陷之個體中誘導細胞自噬之方法。根據本發明，該方法包括投予該個體治療有效量之靈芝萃取物，其中，該細胞自噬增加該個體之蛋白質聚集體的清除。
在本發明的一個具體實施例中，細胞自噬缺陷是個體之細胞表現蛋白質聚集體，其中，該細胞為神經元或神經膠質細胞。在本發明的一個具體實施例中，蛋白質聚集體係選自下列所組成群組之聚集體：亨丁頓蛋白(hungtingtin)、澱粉樣蛋白β(Aβ)、α-突觸核蛋白(synuclein)、τ蛋白(tau)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)、其變異體和突變形式及其組合。
在本發明的一個具體實施例中，細胞自噬缺陷係選自神經退化性疾病、克隆氏症(Crohn’s disease)、老化、心臟疾病和肝臟疾病所組成群組之一種疾病。在本發明的一個具體實施例中，神經退化性疾病係選自下列所組成群組之一種疾病：亨丁頓氏舞蹈症、阿茲海默症、帕金森氏症、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)和致死性家族性失眠症。
根據本發明，靈芝萃取物是經口服投予至個體。
在本發明的另一態樣，提供一種用於在患有細胞自噬缺陷之個體活化神經生長因子(NGF)之方法，其中，該NGF活化該個體之細胞自噬，及其中，該細胞自噬增加該個體之蛋白質聚集體的清除。根據本發明，該方法包括投予個體治療有效量的靈芝萃取物。
在本發明的一個具體實施例中，細胞自噬缺陷是個體之細胞表現蛋白質聚集體。
在本發明的一個具體實施例中，蛋白質聚集體係選自下列所組成群組之聚集體：亨丁頓蛋白、澱粉樣蛋白β、α-突觸核蛋白、τ蛋白(tau)、超氧化物歧化酶1、其變異體和突變形式、及其組合。
在本發明的一個具體實施例中，蛋白質聚集體是一種或多種亨丁頓蛋白、澱粉樣蛋白β、α-突觸核蛋白、τ蛋白、超氧化物歧化酶1、其變異體和突變形式。
在本發明的另一態樣，提供一種用於個體預防記憶喪失之方法。根據本發明，該方法包括投予個體治療有效量的靈芝萃取物，其中，該靈芝萃取物活化該個體的細胞自噬。
在本發明的一個具體實施例中，靈芝萃取物誘導神經生長因子(NGF)以活化個體的細胞自噬。在本發明的一個具體實施例中，細胞自噬增加個體之蛋白質清除。
根據本發明，該個體患有細胞自噬缺陷。在本發明的一個具體實施例中，細胞自噬缺陷係選自下列所組成群組之神經退化性疾病：亨丁頓氏舞蹈症、阿茲海默症、帕金森氏症、肌萎縮性脊髓側索硬化症和致死性家族性失眠症。
在本發明的另一個態樣，提供一種用於在患有細胞自噬缺陷之個體誘導細胞缺陷的組成物，其中，該方法包括靈芝酸(ganoderic acid)及醫藥上可接受的載劑。在本發明的一個具體實施例中，靈芝酸是一種或多種選自下列所組成之群組者：靈芝酸C2、靈芝酸A、靈芝酸H、靈芝烯酸D、靈芝烯酸D和12-乙醯氧基靈芝酸F(12-acetoxyganoderic acid F)。
此處提供各種具體的細節說明，以供更透徹瞭解本發明。
靈芝萃取物樣本的製備
將乾燥靈芝(Ganoderma lucidum)(Leyss.ex Fr.)Karst.浸泡於85%(v/v)酒精中以萃取分子量小於1000道耳吞(dalton)的分子。將萃取物進行減壓濃縮並冷凍乾燥儲存於-20℃備用。利用HPLC以得分離的靈芝小分子萃取物。利用管柱(Neulcosil C18 column)(250mm×4.6mm i.d.5μm)在室溫進行逆相層析(Reverse-phase HPLC)的分析。移動相包含溶液(A)0.1%之乙酸水溶液(v/v)以及溶液(B)乙腈，使用的線性梯度變化程序為：0至40分鐘為30至32%之B溶液、40至60分鐘為32至40%之B溶液、60至65分鐘為40%之B溶液、65至70分鐘為40至82%之B溶液、70至85分鐘為82至100%之B溶液。利用波長254 nm以及流速0.8 ml/min進行偵測。將質譜儀(Bruker Daltonics ion trap mass spectrometer)(Bruker,Billerica,USA)透過ESI介面(ESI interface)連接至HPLC儀器(Agilent 1100 HPLC instrument)。LC流出液導入ESI源在管柱後的分光比為2：1。使用超高純度氦(He)作為碰撞氣體及使用高純度氮(N2)作為霧化氣體。在負離子模式下的最佳化的參數設定如下：噴霧器,30 psi；乾氣,8 L/min；乾燥溫度,350℃。在全掃瞄質譜儀(MS)分析時，將光譜記錄範圍設定於m/z 50到1500。設定由數據決定的擷取，以使全掃瞄MS中的兩個最豐富離子能觸發串聯式質譜(tandem mass spectrometry)(MSn,n=2)。
細胞培養
星狀細胞培養是取自陽明大學動物中心(Animal Center at the National Yang Ming University,Taiwan.Briefly)初生一天C57BL/6J小鼠，以胰蛋白酶(trypsin)收取皮質組織。方法如下：將大腦皮質取出後分離細胞，並將細胞置於100-mm培養皿；培養於含有10% FBS之DMEM中，三天後更換新鮮的培養液並繼續培養三天；利用胰蛋白酶將細胞收下並培養於10-cm培養皿7至8天後進行實驗。依此方式培養，星狀細胞的組成約為90至95%，其分辨方式是利用星狀細胞特定標記(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的免疫組織染色所判斷。神經幹細胞的培養是從初生一天C57BL/6J小鼠取得。將小鼠的皮質組織經由胰蛋白酶化(trypsinization)後，懸浮於DMEM/F12培養液(2×105 cells/ml)中培養7天，其中含有1% N2、20 ng/ml EGF、20 ng/ml bFGF和100 g/ml BSA，使神經球(neurospheres)形成。神經球可經由神經幹細胞的特定標記(Nestin)來分辨。將神經幹細胞於含有1% N2和10% FCS的DMEM/F12培養7天直到成熟，得到神經細胞與膠細胞混合培養。PC12細胞株培養於DMEM培養液，內添加5% FBS和10%熱失活之馬血清(heat-inactivated horse serum)。所有細胞均培養於37℃培養箱，溼度與氣體供應為5% CO2/95%空氣。
表現mHtt74Q之PC12細胞株
可以表現於哺乳動物細胞的載體(其中包含EGFP(pEGFP-C1,Clontech)融合一段HD基因表現子1片段，其具有23(Htt-23Q)或74多麩醯胺重複(mHtt-74Q)於其C端(C terminus)，是由Dr.David C.Rubinsztein laboratory所贈送。篩選出可以穩定表現這段基因的PC12細胞株，並於37℃與5% CO2下，培養於含有100 μg/ml濕黴素(hygromycin)的DMEM標準培養液，所述DMEM標準培養液含有100 U/ml之盤尼西林(penicillin)/鏈黴素(streptomycin)之、2 mM之L-麩醯胺酸(L-glutamine)、10%之熱失活馬血清(heat-inactivated horse serum)、5%之FBS及200 μg/ml之G418，。在進行實驗時，於12孔盤中接種每孔有2x105細胞，並利用200 ng/ml之多西環素(doxycycline)處理24小時以誘導Htt-23Q或mHtt-74Q表現。細胞處理NGF(10,50,100 ng/ml)、GaLu-ACM(20,100,500 μg/ml)以及靈芝酸C2-ACM(4,20,100 μg ml-1)24小時以進行基因表現的分析，或48小時以進行粒線體活性及細胞自噬能力的分析。首先細胞經由生理食鹽水(PBS)清洗並離心，利用1%之三聚甲醛(paraformaldehyde)固定20分鐘接著進行流式細胞儀(FACS)(BD Biosciences)分析EGFP螢光表現，以軟體(Cellquest software)(BD Biosciences)每次分析10,000顆細胞的平均螢光值或進行即時PCR(real time PCR)分析基因表現。單磺醯戊二胺(Monodansylcadaverine,MDC)(Sigma)是一種螢光物質，用來偵測細胞自噬的活性。於37℃將細胞以0.05 mM之MDC染色30分鐘，之後用生理食鹽水清洗細胞，接著以螢光顯微鏡(Olympus IX-70 and POT2,USA)激發波為335 nm及發射波為525 nm觀察細胞染色結果。染色強度再藉由分析系統(Image-Pro Plus Analysis system)(Media Cybernetics,Bethesda,USA)分析以代表細胞自噬活性。在量化的部分，每個片子至少選4個視野進行定量。
RNA單離與即時PCR
以RNA-BeeTM RNA單離試劑(Tel-test,Friendswood,TX)抽取細胞的RNA。使用5 μg之RNA與AMV-RT(Promega)進行反轉錄反應產生cDNA，並進一步進行RT-PCR分析，利用序列偵測系統(ABI Prism 7700 Sequence Detection System)和套組(SYBR Green Master Mix kit)(Applied Biosystems,Foster City,CA)分析各基因表現情形。β-肌動蛋白或GAPDH為控制組。用2-△△CT的方程式分析基因表現倍數。各個引子的資訊如表1所示。
西方墨點法
細胞先以生理食鹽水清洗三次後，加入溶解緩衝液(lysis buffer)(50 μl Tris,pH6.8/200 μl 10% SDS/100 μl 1 M DTT,1 ml)作用後，取約20 μg之蛋白質置入電泳膠體，並進行西方墨點法的分析。收集以靈芝萃取物處理24小時後之星狀細胞調整培養液(Astrocyte-conditioned medium,ACM)，於200×g離心20分鐘以去除細胞碎片。利用冷凍乾燥機，將上清液濃縮20倍後再進行西方墨點法分析。使用抗體如下：1：1,000稀釋之多株兔抗體抗小鼠NGF胜肽(polyclonal rabbit antibody against the mouse NGF peptide)(胺基酸40-63)(Cat no.ab6198,Abcam,Cambridge,UK)、1：1,000稀釋之多株兔抗體抗小鼠LC3(polyclonal rabbit antibody against the mouse LC3)(Cat no.PM-036,MBL,JAPAN)及1：10,000稀釋之抗體抗GAPDH(Cat no.ab9385,Abcam,Cambridge,UK)，用作為加載控制(loading control)。使用辣根過氧化物酶聯結抗IgG二級抗體系統，將結合抗體的蛋白質染色以增強化學螢光偵測(Amersham,Buckinghamshire,UK)。
利用PC12生物分析偵測星狀細胞調整培養液(ACM)中的NGF類似蛋白質
為了要研究神經突觸的生長，將PC12細胞株以較低密度種於24孔盤中(2×104細胞/平方公分(cm2),於含有10%馬血清及5% FBS之DMEM培養液中)。24小時培養之後，以PBS清洗附著的PC12細胞，用未經處理或以靈芝萃取液處理的星狀細胞之培養液處理PC12細胞，並觀察神經軸突生長(使用含有低量血清與1% FBS的DMEM)。每個處理組拍8至10張照片，以軸突長度大於兩倍細胞直徑者算為有軸突生長的細胞，每張照片分析100至200顆細胞。影像分析由不知情的第三者進行計算。ACM的製備是將以靈芝萃取物處理24小時後的星狀細胞，以生理食鹽水清洗，並加入血清含量低的培養液(不含靈芝萃取物)。24小時後，將培養液離心(200×g)20分鐘以去除細胞碎片，收集的上清液即為ACM，須立即使用。鼠NGF 100 ng/ml(Promega Biotech Co.,Ltd,USA)作為正控制組。
琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase,SDH)分析、粒線體追蹤染劑(Mitotracker)分析以及粒線體/核DNA比
將PC12或mHtt-74Q細胞(2×104細胞/孔)種於96孔盤。24小時後，細胞經由GaLu-ACM或NGF處理(100 μl/孔)48小時。琥珀酸脫氫酶活性與細胞蛋白量(以BioRed protein kit測量)做定量並利用MTT分析進行分析。吸光值變化利用微量盤偵測系統(microplate reader)(PerkinElmer Life Sciences Wallac Victor2)偵測。利用粒線體追蹤染劑Green FM染色(Invitrogen)來偵測粒線體，而利用粒線體追蹤染劑Red(四甲基若丹明甲酯(tetramethylrhodamine methyl ester,TMRM)染色(Invitrogen)來偵測粒線體膜通透性。以GaLu-ACM或NGF處理(100 μl/孔)細胞24或48小時，以不含血清之DMEM清洗細胞後，進行100 nM線體追蹤染劑Green FM或線體追蹤染劑Red(TMRM)染色30分鐘，以未加染劑，但加入等量的二甲基亞碸(DMSO)的細胞做為控制組。染色後，細胞經由生理食鹽水清洗三次，再利用螢光微量盤偵測系統(激發波485 nm,發射波520 nm)進行偵測，或用流式細胞儀(BD Biosciences)進行偵測與軟體(Cellquest software)(BD Biosciences)分析。以即時PCR進行定量分析粒線體/核DNA比。PC12細胞培養於12孔盤(2×105細胞/孔)中24小時，以GaLu-ACM或NGF處理48小時。從細胞萃取出基因組DNA(含有粒線體和核DNA兩者)進行分析。以定量即時PCR放大DNA(10 ng)。使用的引子如表1所示。
動物及3-NP中毒模式建立
從國家動物中心購置的60隻12週大C57Bl/6J公鼠飼養在符合規定的溫度及溼度下並給與飼料(PMI,Brentwood,MO,USA)及飲水，整個動物實驗過程符合陽明大學動物中心規範。粒線體毒素3-硝基丙酸(3-NP)(Sigma,法國)(儲存液10 mg/ml)溶於0.1 M之磷酸鹽緩衝液(PBS),pH=7.4並無菌過濾(Millipore,0.22 um)，保存於4℃。老鼠每天早晚間隔12小時(10：00 a.m.and 10：00 p.m.)以腹腔注射方式給予3-NP，使用3-NP的濃度到達600 mg/kg以延長神經退化的時間，給藥過程：以20 mg/kg進行四次注射、以40 mg/kg進行四次注射、以60 mg/kg進行六次注數(七天內總累積劑量為600 mg/kg)。將60隻老鼠分配於5個組別中：只給予鹽水的控制組以及4組給予3-NP，經過七天3-NP的傷害，從第8天開始不同濃度的靈芝(24,60或150 mg/kg/天)餵食老鼠14天。
行為給分
依照各項行為特徵分成0至5等五個給分等級：等級0：正常的行為；等級1：因輕微後肢受損所造成緩慢的運動；等級2：顯著的步態不協調的異常；等級3：將近完全的後肢癱瘓；等級4：因前肢受損而無法移動；等級5：斜臥或死亡。行為給分是由兩位對實驗條件不知情的評分者所給分。
滾輪測試
利用滾輪測試以偵測各組小鼠的感覺運動(sensorimotor)能力。測試之前先訓練小鼠可以在滾輪裝置上持續180秒的運動而不掉下來，共三次訓練並進行三天，排除無法達到此標準的動物。此裝置的桿子為直徑6公分，並以直徑50公分的圓盤分隔成四個隔間。桿子旋轉的速度可分為14和22 rpm。每次測試時，記錄小鼠站在裝置上的時間，最長不超過180秒，以至少三次不同測試的平均進行紀錄並分析。
腦組織的處理與GFAP組織免疫染色
完成行為測試及給藥兩週後，以致死劑量的麻藥戊巴比妥鈉(sodium pentobarbital)經由腹腔注射方式進行麻醉小鼠，麻醉後先以10 ml之0.9% NaCl，再以30 ml之4%三聚甲醛(於0.1 MPBS,pH 7.4)進行心臟灌流，將大腦取出並於4%三聚甲醛靜置24小時，再將大腦移至30%蔗糖溶液(於0.1 M PBS)浸泡脫水乃至於下沉於瓶底。將大腦移出後冷凍保存於-70℃，之後進行冷凍切片，將大腦切成每片30 μm之冷凍切片冠狀面(cryostat coronal sections)以進行免疫染色。進行GFAP(膠細胞增生(gliosis)的型態標記)免疫染色，將冷凍切片以PBS沖洗三次，再經由4%胎牛血清白蛋白(bovine serum albumin)進行阻斷(blocking)。阻斷之後，切片與GFAP初級抗體(1：1000稀釋,NOVOUS,Littleton,USA)在4℃冰箱反應隔夜。隔天將切片取出，以PBS沖洗三次，再經由3% H2O2反應30分鐘去除過氧化酶(peroxidase)活性。接著將二級抗體兔抗小鼠聯結辣根過氧化物酶(rabbit anti-mouse conjugated with horseradish peroxidase)(1：200稀釋DAKO24Kit；Dakocytomation,Glostrup,Denmark)加入反應，最後以二胺基聯苯胺(diaminobenzidine)進行呈色並以光學顯微鏡觀察。實驗結果由對實驗條件不知情的評估者來對腦組織切片的膠細胞增生情形進行分析。
尼氏(Nissl)染色細胞的計數
為了偵測神經密度和分布情形，利用Nissl染色來進行偵測，流程如下：將斜紋狀體區切片進行甲苯酚紫(cresyl violet)染色並在顯微鏡下觀察細胞型態與缺失情形。利用甲苯酚紫染色，視野下可區分出細胞體較大且顏色較淺的為神經細胞，其典型的形態特徵為細胞質豐富、多邊型和至少一個放射出的突觸。而膠細胞則為細胞體小、較圓且細胞核顏色較深的型態。計數方式：在每隻老鼠斜紋狀體區每隔六片的腦部冠狀切片共取出十片，由對實驗條件不知情的評估者進行定量。每個切片的視野大小為200×200 μm，進行細胞數計數分析。細胞的堆積密度(packing density,PD)由每片切片分析的方型區域下所含的細胞數目決定，其套用公式如下：
其中，PD為堆積密度(mm-2)，Ni為切片中分析區域下數得的細胞數目(corrected by Abercrombie’s formula)，SAi為切片中分析方型區域的面積(mm2)。此部分的數據以每組三隻動物的平均值和標準差所表示。
測定SDH活性
3NP動物模式的建立如上述，各組動物(只處理3-NP或3-NP加靈芝萃取物的組別)的腦組織SDH活性測定方法如下：每隻老鼠約取20片切片在37℃下與0.1 M PBS反應15分鐘，以活化SDH酵素，接著以大量的PBS(0.1 M)沖洗，之後在37℃下於0.3 mM之硝基藍四氮唑(nitroblue tetrazolium)、0.05 M之琥珀酸鈉(sodium succinate)和0.05 M之磷酸鹽緩衝液(pH 7.6)反應30分鐘。為了測定不屬於SDH活性的非專一性呈色，相鄰的片子在染色時作為控制組並在反應時不加入琥珀酸鹽。反應後，先用冰的PBS沖洗片子5分鐘，以4%三聚甲醛固定，再以滅菌水沖洗，最後於室溫下自然乾燥。藍色的呈色強度代表了SDH酵素活性，利用分析系統(Image-Pro Plus Analysis system)(Media Cybernetics,Bethesda,USA)進行定量。定量方法如下：將圓形探頭置於切片上感興趣的區域，偵測部分染色組織的相對密度，該光密度值應在0至255灰度級的範圍內。每組有三到四隻老鼠，由對實驗條件不知情的評估者對切片進行分析。
電生理實驗
取4至6週大的C57BL/6J公鼠，乙醚麻醉後，剪下頭部，取出腦並立即浸泡於冰的人工脊髓液(Artificial cerebrospinal fluid,aCSF)，內含：122 mM NaCl、3.1 mM KCl、1.1 mM MgSO4．8H2O、1.3 mM CaCl2．2H2O、10 mM glucose、0.4 mM KH2PO4和25 mM NaHCO3，去除小腦及嗅葉，保留約三分之一的腦，以震動組織切片機(vibrating tissue slicer)(D.S.K Microslicer,Model DTK-1000)切成350微米的切片，將之置於充氣(95% O2，5% CO2)的aCSF中兩小時，使切片受損部分修復。之後將切片置於MED64探針(Panasonic；MED-P515AP)上，並調整適當的位置，以數位式顯微鏡(Olympus,MIC-D)拍攝其相對位置後，連接上多頻道記錄系統(multi-channel recording system)(Panasonic,MED64)做電生理反應記錄。
MED64系統(Panasonic)為一種較簡易操作的電生理儀器，其包含探針、連接件(connector)、整合擴音器(integrated amplifier)及軟體(Lerformer 1.5)，探針的中央由64個微電極排列而成，每個微電極為50×50 μm2，間距為150微米。第一次使用探針前須先以0.1%聚乙烯亞胺(PEI)於硼酸鹽緩衝液(0.15M,pH 8.4)浸泡八小時以上，作塗佈(coating)的動作，之後以去離子水沖洗探針，即可重複使用，探針內注入三次水，以石蠟膜封起，保存於4℃冰箱中。
記憶力測試
實驗選用與小鼠海馬迴有關之記憶行為的測試方法：迴避測試(Passive avoidance task)。將老鼠放在暗房與亮房中間，一般老鼠會傾向往暗房移動，待其進入暗房後，給予0.5 mA，持續兩秒之電擊，訓練其記憶暗房具有電擊，此訓練以老鼠待在亮房的時間作為是否記憶暗房內有電擊之依據，待在亮房時間超過300秒將不再記錄。觀察比較服用靈芝萃取物之老鼠對以睡眠剝奪影響其記憶之情形是否有改變。
小鼠之睡眠剝奪
10週大之C57BL/6J公鼠在完成迴避測試之訓練後，分成睡眠剝奪之實驗組與停留於原鼠籠之控制組，並置於同一房間內。睡眠剝奪組進行五小時之完全睡眠剝奪。以人為觀察方式，當老鼠呈現想睡覺之狀態，輕微搖晃鼠籠，迫使牠無法進入睡眠。在鼠籠鐵架上，提供充足的食物與飲水，老鼠在不睡覺的情況下，可自由在籠內移動。
統計分析
所有的結果都用平均值(mean)與標準差(SD)表示。比較兩組間差異時用學生T-test進行分析，當比較兩組以上的差異時運用單因子變異數分析(ANOVA)後接著進行Tukey的多重比較檢定(Tukey’s post-hoc test)。P值小於0.05時表示有顯著差異。
在HD細胞模型中，NGF的處理減少mHtt-74Q聚集
HD細胞模型由表現亨丁頓疾病(HD)蛋白質(mHtt-74Q)的PC12細胞株所建立，使用四環黴素(doxycycline,Dox)處理細胞株，偵測NGF的作用。以FACS分析在HD細胞模型中的mHtt-74Q含量。由實驗結果發現細胞處理過NGF後，其mHtt-74Q累積的情形較低(第1A及1B圖)。接著，進一步探討NGF是透過何種機制降低mHtt聚集體。為達此目的，以MDC染色來了解細胞自噬反應所扮演的角色(第1C及1D圖)；並用西方墨點法偵測LC3-II的表現情形(第1E圖)，LC3-II為細胞自噬反應進行中會表現的特殊標記。經NGF處理過後的細胞，其細胞自噬的活性會提升，相較之下，只處理Dox只能些微提升細胞自噬活性。此外，NGF處理的細胞中，增強型綠色螢光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的聚集體也降低(第1A及1C圖)。EGFP與細胞自噬的空泡在NGF處理的細胞中位於同樣的位置，此結果可以說明mHtt-74Q的清除是藉由細胞自噬。然而，只單獨處理Dox的細胞，MDC及EGFP則沒有共同存在相同位置的情形。因此，過多的蛋白質聚集體累積可能造成辨識運送物(cargo)的異常。整體看來，此結果支持NGF能更有效的引起細胞自噬活性，透過細胞自身的降解使mHtt的累積減少。
靈芝刺激初級星狀細胞培養中NGF的表現
由於外生性NGF無法通過血腦障壁，因而影響了它在臨床上的應用性。因此對於靈芝誘導星狀細胞分泌NGF的效果進行測試。經由靈芝處理後，以RT-PCR及即時PCR分析後發現，星狀細胞的NGF mRNA表現情形有隨靈芝濃度上升而增多(第2A圖)。經由靈芝處理後，細胞內的NGF蛋白質表現量也有增加(第2B圖)。進一步了解除了NGF基因表現和蛋白質增加之外，NGF分泌量是否也隨之上升。依不同濃度的靈芝處理24小時後的星狀膠細胞培養液中，可以發現NGF含量上升，由此可知靈芝能夠促進星狀膠細胞表現並分泌NGF到培養液中，NGF的含量有隨靈芝濃度上升而增多(第2C圖)。因此，經靈芝處理的星狀細胞同時能增加NFG的合成與釋放。靈芝對於初級星狀細胞中NGF表現量專一性的影響如第3圖所示。利用靈芝處理後的星狀細胞培養液(ACM)處理PC12細胞後，可觀察到其神經突觸的增生(第4A及4B圖)；這個現象在給予NGF專一性抗體後就會消失，顯示NGF對於神經突觸增生具專一性(第4A及4C圖)。
在表現mHtt74Q的HD細胞模型中，靈芝的影響
用FACS分析亨丁頓氏舞蹈症(Hungtington Disease,HD)細胞模型(能表現mHtt-74Q的細胞)中的mHtt-74Q含量。靈芝處理後的ACM可以降低細胞中mHtt-74Q的累積(第2D及2E圖)。靈芝處理後的ACM也能增加MDC的強度(第2F圖)和LC3-II的表現(第2G圖)。
HPLC與LC-MS分析靈芝：鑑定不同靈芝酸及其對於NGF 刺激與神經突觸生長活性的影響
為了解靈芝粗萃物中的活性成分，利用HPLC與LC-MS分析靈芝乙醇萃取物中各個小分子的組成。靈芝小分子分析圖譜是進一步利用逆相(reversed-phase)HPLC分析而得。第5A圖顯示靈芝乙醇萃取物中各個小分子組成的圖譜。為了獲得最佳的提取效率和良好的分離，提取和色層分離條件進行了最優化。透過正(positive)/負(negative)離子ESI-MS可以偵測靈芝乙醇萃取物中各個三萜類的分子量，進而推測出其結構，共有六種主要的小分子從靈芝乙醇萃取物中被分離出來，其結構顯示於第5B圖。分析這六個小分子對於星狀膠細胞NGF mRNA表現以及對於神經突觸增生的效果(第5C及5E圖)，其效果被定義成能夠引起較未處理的組別有增加50%的能力為EC1.5，利用這樣的定義來作圖(第5D及5F圖)。由結果可知靈芝酸C2對於不管是NGF mRNA表現或者對於神經突觸增生的效果皆最強。
在表現mHtt74Q的HD細胞模型中，靈芝酸C 2 的影響
觀察靈芝酸C2處理後的培養液(靈芝酸C2-ACM)可以降低亨丁頓疾病(HD)細胞模型中mHtt-74Q的累積(第5G及5H圖)。此外，MDC染色(第5I圖)與LC3-II的西方墨點法分析(第5J圖)的結果顯示，經靈芝酸C2-ACM處理後的細胞，其細胞自噬的活性顯著增加。
靈芝對於3-NP誘導之小鼠斜紋狀體損傷的影響
由於先前研究已發現NGF對於3-NP損傷小鼠模型有保護效果，因此進一步利用此模型來研究靈芝在小鼠(in vivo)是否也具有跟NGF一樣的神經保護效果。將上述方法作些許修改，將3-NP的使用濃度提高到600 mg/kg以增加神經退化的過程。在3-NP誘導損傷後八天，給予小鼠不同濃度的靈芝萃取物飼料(24、60、150 mg/kg)餵食十四天。整個實驗的流程顯示於第6A圖。在3-NP傷害後第八天，小鼠具有明顯的行為異常，而餵食靈芝的組別則能較快回復牠們的行為分數(GaLu 60 mg/kg及150 mg/kg在第14天；GaLu 24 mg/kg在第21天)。利用滾輪測試在第14天及21天小鼠感覺運動(sensorimotor)能力回復的情形，在餵食靈芝濃度60及150 mg/kg的組別在第14天以及餵食24 mg/kg的組別在第21天，相較於沒有餵食靈芝的控制組均有較好的行動能力；而沒有餵食靈芝的控制組則還是有行為上的缺失(第6B及6C圖)。因此，靈芝的處理能夠改善對3-NP傷害所造成的行為缺失。進一步分析靈芝對於恢復神經受損的改善，利用切片染色包括用Nissl、GFAP以及SDH活性染色，可以觀察靈芝餵食的組別腦部的變化情形(第6D圖)。第6D圖為代表性的染色圖片，分別表示只處理3-NP以及處理3-NP並餵食三種不同濃度靈芝的組別。只處理3-NP而沒有餵食靈芝的控制組其斜紋狀體明顯缺失，但在餵食靈芝的組別中，其斜紋狀體神經缺失的情形較少。此外，餵食高低劑量的靈芝也顯示出不同的效果。第6E圖為Nissl染色定量的結果，可明顯看出餵食靈芝對神經保護的效果。靈芝餵食也具有降低3-NP導致GFAP不正常大量表現的情形。相較於有餵食靈芝的組別，只處理3-NP的組別在腦部斜紋狀體損傷周圍有許多大量表現GFAP的星狀膠細胞。3-NP是一種已知的SDH抑制劑，因此也分析腦中SDH活性，由第6D及6F圖可知，只處理3-NP的組別顯著的抑制SDH活性，而餵食靈芝的組別能回復由3-NP誘導的SDH活性低落的情形。由上述實驗可知，靈芝在3-NP誘導的斜紋狀體損傷中提供很好的神經保護效果。從只處理3-NP以及處理3-NP並餵食三種不同濃度靈芝的小鼠之斜紋狀體中分離mRNA，分析NGF的表現情形，發現餵食靈芝的小鼠其斜紋狀體中具有較高的NGF表現情形(第6G圖)。此表現情形隨靈芝濃度增加而增加，在靈芝濃度為60 mg/kg有最明顯促進NGF mRNA表現的能力，相較於正常控制組達到4.5倍，相較於3-NP控制組更達到7倍之多。
靈芝防止睡眠剝奪及降低長期增益表現(long term potentiation)
在老鼠實驗上已證實無論長期或短期睡眠剝奪皆會影響老鼠記憶的鞏固。使用五小時的完全睡眠剝奪，已知這樣的睡眠剝奪方式會造成海馬迴的長期增益現象(long term potentiation,LTP)表現受到影響，長期增益現象無法在三十分鐘後維持良好表現，且隨時間拉長，其長期增益表現會衰退，即表現在生理上的長期記憶可能受到不良的影響。
事先餵食小鼠食用靈芝三天後，在第四天早晨對老鼠進行睡眠剝奪，在睡眠剝奪後，老鼠可自由睡眠24小時後，分別進行電生理實驗。
觀察餵食靈芝的組別，其長期增益現象(LTP)受睡眠剝奪干擾之情形相較於沒有食用靈芝的組別不嚴重，餵食靈芝的組別其長期增益現象為133.6±7.0%，而沒有食用靈芝的組別則為113.5±5.9%。隨著時間增加，其長期增益被誘發的程度可趨近於沒有被睡眠剝奪的控制組(148.5±16.7%)(第8A、9A及10A圖)，而比較可代表長期記憶的後期長期增益現象(late-phase long term potential,L-LTP)，餵食125 mg/kg/day靈芝的組別已於睡眠剝奪組具有統計上的差異(p=0.001至0.4)，且趨近於控制組(表2)。如表2所示，餵食靈芝20 mg/kg/day及50 mg/kg/day的組別分別為126.9±22.3%和127.6±18.6%，且此兩組別都較睡眠剝奪組高。而在自由睡眠24小時後，各組的長期增益現象差異不大(第8B、B和10B圖)，顯示靈芝在正常情況下可能不會異常促進長期增益，但在外界因素干擾時，如睡眠剝奪導致記憶鞏固情形不佳的情況下，可預防或回復記憶受干擾的情況。
表2 餵食不同劑量GaluM之小鼠在5小時睡眠剝奪後的後期LTP
靈芝增加小鼠海馬迴中細胞自噬的活化，且預防或回復由睡眠剝奪所造成的記憶力缺失
採用與之前相同的睡眠剝奪模型，在第四天早晨進行被動迴避試驗的訓練(第11圖)。小鼠在訓練前已事先餵食靈芝三天，而事先的餵食並不會導致小鼠在學習所需的時間或訓練次數上產生差異(第12C圖)。而小鼠在體重的增加(第12A圖)及進食情形(第12B圖)亦未受到靈芝混入飼料的影響而有所差異。
在訓練完畢後，剝奪五小時之完整睡眠再立即測試小鼠對被動迴避試驗的記憶情形，可發現小鼠對「進入暗室會被電擊」的記憶情形不佳(滯留(latency)：96.3±72.7)(第14圖)。然而，事先食用三天靈芝的小鼠組別，其滯留期(latency period)為160.8±20.6至242.9±89.8，在經過睡眠剝奪後其記憶情形雖較控制組差，但較睡眠剝奪組為佳。顯示靈芝可具有預防或是回復睡眠剝奪對記憶力造成的傷害。
做完動物實驗後，犧牲這些老鼠，取其海馬迴及大腦皮質，觀察腦中是否確有細胞自噬被活化之情形。以西方墨點法偵測睡眠剝奪後(第14圖)及共餵食五天靈芝(第15圖)的小鼠其海馬迴及皮質，發現海馬迴中細胞自噬的表現隨餵食濃度增加有增加的情形(0.90±0.38至1.63±0.49倍)，而皮質的採樣中，各組表現LC3-II的差異不大。顯示靈芝的餵食可活化細胞自噬在海馬迴中的表現且參與了記憶鞏固的過程。
上述說明書僅用以說明本發明之特徵及功效，而非用於限制本發明之範圍。咸瞭解熟習此技藝之人士可在不悖離本說明書所揭示之精神及原理下賦予不同之修飾與變更，且本發明之權利保護範圍應如後述之申請專利範圍所列。
靈芝(Ganoderma lucidum)於本說明書及圖式中縮寫為GaLu。
第1A至1E圖顯示神經生長因子(NGF)對表現mHtt-74Q的PC12細胞模型之影響。(A)經NGF處裡後之細胞的螢光平均強度(FMI)比。直方圖表示在兩次獨立實驗中測得之FMI的量化(n=6)。(B)在表現mHtt-74Q並經50 ng/ml之NGF處理之細胞中，螢光分布向左移，代表聚集體減少。X軸代表測得的綠色螢光幅度，而呈螢光程度繪製的Y軸代表細胞數。數值以平均標準差(mean±SD)方式表示(** P<0.01為與未經Dox處理(No Dox)相比；而# P<0.05、## P<0.01為與經Dox處理(Dox)相比)。(C)NGF促進自噬小體(autophagosome)的形成，並可促進mHtt的降解。利用MDC染色以檢視細胞內表現自體吞噬泡。在經NGF處理的細胞中可見MDC染色後的螢光強度增加。白色箭頭代表在經NGF處理之細胞中的MDC與EGFP的影像重疊(co-localization)，而黃色箭頭代表在經Dox處理之細胞中的EGFP聚集體和經MDC染色的點狀螢光影像。在Dox細胞中有稀少的EGFP與MDC的影像重疊。(比例尺為10微米(μm))。(D)MDC染色之量化結果。與控制組(no Dox)相比，結果為每細胞中所含的點狀螢光影像。(E)以西方墨點法檢視在不同條件下LC3-I與LC3-II之蛋白質濃度(以200 nM之雷帕黴素(Rapamycin)誘導細胞自噬作為正控制組)(n=3).* P<0.05,** P<0.01為與無Dox相比，而# P<0.05,## P<0.01為與Dox相比，以學生T檢定。
第2A至2G圖顯示靈芝(GaLu)(為星狀細胞NGF誘導物)在PC12細胞中調節粒腺體的生體合成(biogenesis)與在HD細胞模型中減緩mHtt所誘導的損害。分析初級星狀細胞經GaLu處理六小時之mRNA表現量(A)或二十四小時之蛋白質表現量(B)。(C)顯示NGF於星狀細胞經GaLu(GaLu-ACM)處理二十四小時所收集之二十倍濃縮細胞培養液的西方墨點圖示。(D)利用流式細胞儀分析以GaLu-ACM抑制mHtt-74Q聚集體。直方圖表示在兩次獨立實驗中測得之FMI的量化(n=6)。(E)在表現mHtt-74Q並經100μg/ml之GaLu處理之細胞中，螢光分布向左移，代表聚集體數目減少。(F)GaLu增加MDC強度。白色箭頭所指為經GaLu處理的細胞有MDC和EGFP的影像重疊。(比例尺為10微米)。與未經處理的控制組(no Dox)相比，將每細胞的點狀螢光影像區進行MDC之量化。(G)顯示利用西方墨點法觀察LC3-I和LC3-II在每個條件下的蛋白質表現濃度。(使用200 nM之雷帕黴素處理作為誘導細胞自噬的正控制組)(n=3)。* P<0.05,** P<0.01為與無Dox相比，而# P<0.05,## P<0.01為與Dox相比，以學生T檢定。
第3圖顯示靈芝萃取物在初級星狀細胞中專一性的增加NGF mRNA的表現量。星狀細胞經靈芝萃取物處理6小時後進行RT-PCR，分析神經滋養因子(NGF、IGF-1、bFGF和BDNF)的表現。
第4A至4C圖顯示星狀細胞NGF誘導物(靈芝萃取物)在PC12細胞中誘導神經突觸的生長。所使用的培養液為經靈芝(GaLu-ACM)處理或未經靈芝處理24小時後的初級星狀細胞培養液。將PC12細胞以GaLu-ACM或NGF處理後收集。
第5A至5J圖顯示區分來自靈芝粗萃物的不同成分以及靈芝酸C2對PC12細胞和HD細胞模型的影響。(A)GaLu乙醇萃取物之HPLC分析。逆相HPLC的條件為：管柱：Nucleosil C18(4.6 mm x 250 mm；5 μm)。移動相組成為：0.1%乙酸水溶液及乙腈，使用線性梯度程序為0至40分鐘為30至32%之乙腈、40至60分鐘為32至40%之乙腈、60至65分鐘為40%之乙腈、65至70分鐘為40至82%之乙腈；流速為：0.8 ml/分鐘；偵測波長：254 nm。總共六種三萜類被分離出來。(B)從GaLu萃取物分離出的六種三萜類之化學結構(A至F)。(C)將星狀細胞以各個成分處理6小時後，利用即時聚合酶鏈鎖反應(Real time PCR)分析該星狀細胞中NGF mRNA的表現量。β-肌動蛋白(β-actin)的表現量作為校正值。(D)偵測各個化合物提升50%活性時所需的濃度，列出最大的活化潛力。(E)將PC12細胞以GaLu-ACM或NGF(正控制組)處理24小時後，觀察神經突觸生長的情形，其生長活性以百分比表示。(F)偵測提升50%活性時所需的各個化合物濃度，列出最大的活化潛力。結果與控制組相比後取相對值，以標準差表示，其結果包含至少三次的獨立實驗。(* P<0.05,** P<0.01,單因子變異數分析(one-way ANOVA)後接著進行Tukey的多重比較檢定(Tukey’s multiple comparison test))。(G)利用流式細胞儀分析靈芝酸C2-ACM抑制mHtt-74Q聚集體的情形。經靈芝酸C2-ACM處理之細胞係以螢光平均強度(FMI)值表示。直方圖表示在兩次獨立實驗中測得之FMI的量化(n=6)。(H)在表現mHtt-74Q並經20 μg/ml之靈芝酸C2-ACM處理之細胞中，螢光分布向左移，代表聚集體減少。(I)靈芝酸C2-ACM增強MDC強度。白色箭頭所指為經靈芝酸C2-ACM處理的細胞有MDC和EGFP存在同一位置的現象。(比例尺為10微米)。與未經處理的控制組(no Dox)相比，將每細胞的點狀螢光影像區進行MDC之量化。(J)顯示利用西方墨點法觀察LC3-I和LC3-II在各個條件下的蛋白質表現濃度。(使用200 nM之雷帕黴素處理作為誘導細胞自噬的正控制組)(n=3)。* P<0.05,** P<0.01為與無Dox相比，而# P<0.05,## P<0.01為與Dox相比，以學生T檢定。
第6A至6G圖顯示靈芝萃取物處理改善在3-NP模型中的行為表現。
第7A和7B圖顯示C57BL/6J小鼠經過短暫的睡眠剝奪後，其長期增益現象(LTP)有受損情形。(A)首先，小鼠先餵以GaLu(20,50,125 mg/kg/day)三天。第四天時，對小鼠施以五小時的人工睡眠剝奪。睡眠剝奪之後，將半數小鼠犧牲，進行電生理實驗，另外半數小鼠則被放回鼠籠內。24小時回復睡眠之後，將該批小鼠進行犧牲與電生理實驗。(B)維持TBS以誘導LTP的情形顯著的因睡眠剝奪而被破壞(0=0.002)。
第8A和8B圖顯示以靈芝萃取物餵食小鼠後，進行腦切片，使用MED64系統偵測海馬迴CA1的場興奮性突觸後膜電位(field excitatory post-synaptic potentials,fEPSP)。四到六週大的C57BL/6J小鼠餵食前述的靈芝萃取物。(A)經過五小時的睡眠剝奪後，各組別的LTP都有被誘導的情形(控制組、睡眠剝奪組(SD)、餵食GaLu 20 mg/kg/day組)。(B)24小時回復睡眠之後，將小鼠犧牲進行fEPSP記錄。各組別的LTP都有被誘導的情形。(控制組，n=6；睡眠剝奪組，n=7：餵食GaLu 20 mg/kg/day組，n=5)。
第9A和9B圖顯示以靈芝萃取物餵食小鼠後，以MED64系統偵測對於海馬迴CA1的fEPSP影響。四到六週大的C57BL/6J小鼠餵食前述的靈芝萃取物。(A)經過五小時的睡眠剝奪後，各組別的LTP都有被誘導的情形(控制組、睡眠剝奪組(SD)、餵食GaLu 50 mg/kg/day組)。(B)24小時回復睡眠之後，將小鼠犧牲進行fEPSP記錄。各組別的LTP都有被誘導的情形。(控制組，n=6；睡眠剝奪組，n=7：餵食GaLu 50 mg/kg/day組，n=5)。
第10A和10B圖顯示以靈芝萃取物餵食小鼠後，以MED64系統偵測對於海馬迴CA1的fEPSP影響。四到六周大的C57BL/6J小鼠餵食如前文所述的靈芝萃取物。(A)經過五小時的睡眠剝奪後，各組別的LTP都有被誘導的情形(控制組、睡眠剝奪組(SD)、餵食GaLu 125 mg/kg/day組)。(B)24小時回復睡眠之後，將小鼠犧牲進行fEPSP記錄。各組別的LTP都有被誘導的情形。(控制組，n=6；睡眠剝奪組(SD)，n=7：餵食GaLu 125 mg/kg/day組，n=5至7)。
第11圖顯示將C57BL/6J小鼠進行睡眠剝奪後，進行迴避測試。首先，C57BL/6J小鼠先進行迴避測試的訓練。經過行為給分後，將控制組的小鼠放回原本的鼠籠，而其他小鼠則進行五小時的睡眠剝奪。完成睡眠剝奪後，立即開始第一輪的迴避測試。完成一輪測試後，所有動物須放回原本的鼠籠直至第二輪測試。
第12A至12D圖顯示睡眠剝奪小鼠餵食GaLu三種劑量後的體重變化與進食量。八週大的C57BL/6J小鼠第一次開始餵食三種劑量(20,50 and 125 mg/kg/day)的GaLu，控制組的小鼠餵食一般飼料。(A)小鼠在餵食GaLu(第1天)前先測一次體重，之後開始餵食GaLu的期間(第1到5天)和睡眠剝奪時皆稱重。(B)餵食GaLu的期間測量進食量。結果顯示為五組之間每隻小鼠體重與進食量的平均值。(C)餵食GaLu三天後，各組進行迴避測試訓練的結果。(D)不同組別遭受電擊的平均時間。睡眠剝奪組，n=11；控制組與餵食GaLu組，n=9。
第13圖顯示C57BL/6J小鼠在五小時睡眠剝奪後進行迴避測試之結果。小鼠先給予訓練後接著進行五小時睡眠剝奪或是維持小鼠在原鼠籠中(控制組)，以小鼠在迴避測試中，滯留不進入暗箱(latency)的時間(秒)以平均標準差方式表示。在24小時睡眠恢復的的數值亦表示於圖中。#p<0.001為與控制組相比較(學生T檢定)，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001為與睡眠剝奪組相比較。控制組，n=12；睡眠剝奪組，n=15；靈芝餵食組，n=12。
第14A至14C圖顯示在五小時睡眠剝奪後，可見GaLu餵食的小鼠的細胞自噬增加。於八週大的C57BL/6J小鼠分別餵食不同劑量(20、50、125 mg/kg)的GaLu四天。接著進行五小時睡眠剝奪後，立即將小鼠犧牲。收集海馬迴與皮質進行細胞溶解。分析細胞自噬標誌LC3的表現與切除。(A)海馬迴細胞溶解物。(B)皮質細胞溶解物。(C)圖示為西方墨點法利用軟體(Image Quant software)做蛋白質表現強度相對定量。蛋白質表現強度為LC3除以GAPDH之結果。數值以平均標準差方式表示(n=6至8)。** P<0.01為與控制組相比後具顯著差異；而#P<0.05、##P<0.01為與睡眠剝奪組相比具顯著差異。
第15A至15C圖顯示在二十四小時睡眠恢復後，可見GaLu餵食的小鼠的細胞自噬增加。將八週大的C57BL/6J小鼠分別餵食不同劑量(20、50、125 mg/kg)的GaLu五天。接著在24小時睡眠恢復後立即將小鼠犧牲。收集海馬迴與皮質進行細胞溶解。分析細胞自噬標誌LC3的表現與切除。(A)海馬迴細胞溶解物。(B)皮質細胞溶解物。(C)圖示為西方墨點法利用Image Quant software軟體做蛋白質表現強度相對定量。蛋白質表現強度為LC3除以GAPDH之結果。數值以平均標準差方式表示(n=6至8)。** P<0.01為與控制組相比後具顯著差異；而#P<0.05、##P<0.01為與睡眠剝奪組相比具顯著差異。
<110> 國立陽明大學 <120> 包含靈芝萃取物的組成物及其用途 <130> 112752 <160> 10 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <221> misc_difference <222> (1)..(20) <223> β-肌動蛋白前置引子 <400> 1 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <221> misc_difference <222> (1)..(20) <223> β-肌動蛋白反置引子 <400> 2 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <221> misc_difference <222> (1)..(25) <223> NGF前置引子 <400> 3 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <221> misc_difference <222> (1)..(24) <223> NGF反置引子 <400> 4 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <221> misc_difference <222> (1)..(22) <223> PGC-1前置引子 <400> 5 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <221> misc_difference <222> (1)..(23) <223> PGC-1反置引子 <400> 6 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <221> misc_difference <222> (1)..(24) <223> nucDNA前置引子 <400> 7 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <221> misc_difference <222> (1)..(26) <223> nucDNA反置引子 <400> 8 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <221> misc_difference <222> (1)..(22) <223> mtDNA(16S rRNA)前置引子 <400> 9 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <221> misc_difference <222> (1)..(20) <223> mtDNA(16S rRNA)反置引子 <400> 10
由於本案的圖為實驗數據，並非本案的代表圖。故本案無指定代表圖。

Claims (18)

  1. 一種用於在患有細胞自噬缺陷之個體中誘導細胞自噬的方法，包括投與該個體治療有效量的靈芝萃取物，其中，該細胞自噬增加該個體之蛋白質聚集體的清除。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該細胞自噬缺陷係該個體之細胞表現蛋白質聚集體。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中，該個體之細胞為神經細胞或神經膠質細胞。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該蛋白質聚集體係選自下列所組成群組之聚集體：亨丁頓蛋白(hungtingtin)、澱粉樣蛋白β(Aβ)、α-突觸核蛋白(α-synuclein)、τ蛋白(tau)、超氧化物歧化酶1(SOD1)、其變異體和突變形式及其組合。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該細胞自噬缺陷係選自下列所組成群組之一種疾病：神經退化性疾病、克隆氏症(Crohn’s disease)、老化、心臟疾病和肝臟疾病。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中，該神經退化性疾病係選自下列所組成群組之一種：亨丁頓氏舞蹈症、阿茲海默症、帕金森氏症、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)和失眠。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該靈芝萃取物係經口服投予至該個體。
  8. 一種用於在患有細胞自噬缺陷的個體活化神經生長因子(NGF)的方法，包括該神經生長因子活化該個體之細胞自噬，其中，該細胞自噬增加該個體之蛋白質聚集體的清除。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之方法，包括投予該個體治療有效量的靈芝萃取物。
  10. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中，該細胞自噬缺陷係該個體之細胞表現蛋白質聚集體。
  11. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中，該蛋白質聚集體係選自下列所組成群組之聚集體：亨丁頓蛋白、澱粉樣蛋白β、α-突觸核蛋白、τ蛋白、超氧化物歧化酶1、其變異體和突變形式及其組合。
  12. 一種用於個體預防記憶喪失的方法，包括投予該個體治療有效量的靈芝萃取物，其中，該靈芝萃取物活化該個體之細胞自噬。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中，該靈芝萃取物誘導神經生長因子(NGF)以活化該個體的細胞自噬。
  14. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中，該細胞自噬增加該個體之蛋白質清除。
  15. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中，該個體患有細胞自噬缺陷。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中，該細胞自噬缺陷係選自下列所組成群組之神經退化性疾病：亨丁頓氏舞蹈症、阿茲海默症、帕金森氏症、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)和失眠。
  17. 一種用於在患有細胞自噬缺陷之個體中誘導細胞自噬的組成物，包含一種或多種的靈芝酸(ganoderic acid)及醫藥上可接受的載劑。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之組成物，其中，該靈芝酸係一種或多種選自下列所組成之群組者：靈芝酸C2、靈芝酸A、靈芝酸H、靈芝烯酸D、靈芝烯酸D和12-乙醯氧基靈芝酸F(12-acetoxyganoderic acid F)。
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