TW201410866A - 製備免疫調節細胞之方法、依該方法所製備之細胞及其應用 - Google Patents

Abstract

本發明係提供一種簡單、直接且迅速的方法以由周邊單核細胞產生免疫調節細胞，該方法包括：以肝細胞生長因子(HGF)處理周邊單核細胞，以誘發該周邊單核細胞分化成免疫調節性白血球。本發明亦提供一種以前述方法所製備之免疫調節細胞。本發明另提供一種治療由異常免疫反應所致疾病之方法，包括：對患有該疾病之病患投予肝細胞生長因子；誘發該病患之周邊單核細胞分化成免疫調節性白血球；及調節該異常免疫反應。

Description

製備免疫調節細胞之方法、依該方法所製備之細胞及其應用

本發明關於一種製備具有特定功能之細胞之方法，特別係關於一種製備免疫調節細胞(immunomodulatory cells)之方法。

自體免疫疾病係由不正常的免疫反應所致，此種免疫反應會拮抗正常存在於人體中之物質或組織；換言之，免疫系統將身體某部分誤認為病原體並因而攻擊自身細胞。移植排斥則是不欲之免疫反應所造成的另一個問題，所謂移植，係將細胞、組織或器官由一處移往另一處之行為。雖然移植已成為一種例行的醫療手段，但免疫系統仍然是最難以克服的障礙。

免疫抑制藥物可降低免疫反應，通常可用於治療/預防自體免疫疾病及移植排斥。免疫抑制藥物會伴隨不同的副作用，包括抑制整體免疫系統、造成病患易受感染等。生物製劑亦可用於該治療，包括例如抗細胞激素療法(anti-cytokine therapy)、T細胞清除療法、B細胞清除療法、及耐受性誘發療法。近來，細胞療法(例如被動給予T細胞(adoptive T-cell)或幹細胞)成為治療或預防自體免疫疾病及移植排斥之新選擇，但此療法仍在發展中。

人類間葉幹細胞(mesenchymal stem cells，以下有時簡稱MSC或MSCs)為一種多元性前驅細胞(multilineage progenitor cells)之細胞群，具有分化成多種間葉細胞系之能力。間葉幹細胞可由骨髓(BM)及其他幾種器官，例如脂肪組織、胎盤、羊水、及胎兒組織，如胎兒的肺及血液，分離出。由於間葉幹細胞易於分離、且已報導可分化成中胚層之外(extra-mesodermal)的細胞類型，因此使得此種出生後前驅細胞(post-natal progenitors)成為多種疾病之細胞療法之熱門選擇。

除了多元性分化能力以外，骨髓及胎兒之間葉幹細胞已被報導具有免疫調節效果。此項功能牽涉到調控T細胞、B細胞、單核細胞衍生之樹突細胞(DCs)、及自然殺手細胞(NKs)之增殖能力及調控功能(effector functions)。人類間葉幹細胞對免疫細胞的效用，主要經由非細胞接觸過程而進行調控，但確切機制仍為未知。

日漸增多的研究顯示了免疫調節性免疫細胞的重要性。直到最近才知道有許多白血球次群可產生免疫抑制效果，包括調節性T淋巴球、第II型巨噬細胞、及未成熟樹突細胞。然而，幾乎沒有針對調節性單核細胞之資料。

肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，以下有時簡稱HGF)已知為有絲分裂促進劑，且為發展上重要的分子。亦已知為細胞脫離因子，HGF不僅提供強力生長訊號，亦可誘導細胞移動，因此，HGF在癌細胞生長及擴散的角色已被充分研究；但關於HGF在非有絲分裂之功效上則所知不多。HGF由中葉細胞分泌，並主要作用於上皮細胞及內皮細胞，但亦可作用於造血性前驅細胞。HGF已被顯示在胚胎器官發展、成人器官再生、及傷口癒合上扮演重要角色。HGF及TGF-β已被報導可於混合淋巴細胞反應中作為抑制T細胞增殖之調控者，此可藉由給予拮抗HGF及TGF-β之中和性抗體後，T細胞增殖作用會重新恢復而證明(Di Nicola et al.,Blood 2002；99：3838-3843)。然而，也有報告顯示了不同結論，該等因子係與間葉幹細胞對於T細胞受有絲分裂促進劑刺激之抑制作用無關，因而提出與前述不同的刺激物依賴性機制(Le Blanc et al.,Scand J Immunol 2004；60：307-315；Rasmusson I et al.,Exp Cell Res 2005；305：33-41)。

綜上述，HGF與免疫系統間的功能及交互作用仍為未知。

本發明係提供一種產生免疫調節細胞之方法，包括：以肝細胞生長因子(HGF)處理周邊單核細胞(peripheral mononuclear cells)，以誘發該周邊單核細胞分化成免疫調節性白血球(immunomodulatory leukocytes)。

本發明亦提供一種以前述方法所製備之免疫調節細胞。

本發明另提供一種治療由異常免疫反應所致疾病之方法，包括：對患有該疾病之病患投予肝細胞生長因子(HGF)；誘發該病患之周邊單核細胞分化成免疫調節性白血球；及調節該異常免疫反應。

本發明係提供一種產生免疫調節細胞之方法，包括：以肝細胞生長因子(HGF)處理周邊單核細胞，以誘發該周邊單核細胞分化成免疫調節性白血球。

該肝細胞生長因子(HGF)可為重組蛋白質，亦可為天然蛋白質，例如由間葉幹細胞或其他細胞系所產生。於一實施例中，HGF係來自間葉幹細胞，HGF為一種來自間葉幹細胞之分泌蛋白質。於一實施例中，間葉幹細胞係來自哺乳動物，舉例但非限制，例如：人、猴、大鼠、小鼠、豬、兔、狗、貓等。

於本發明之方法中，可藉由提供HGF或提供間葉幹細胞與周邊單核細胞接觸而達成HGF療法。於一實施例中，該周邊單核細胞可與間葉幹細胞共同培養，間葉幹細胞係產生HGF並將其分泌至環境。

用於誘導之HGF之濃度可為，舉例但非限制，例如每毫升培養基(per ml of medium)中為3-40納克(ng)。於一實施例中，HGF之濃度可為5 ng/ml、10 ng/ml、15 ng/ml、20 ng/ml、 25 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml或介於上述任兩數值之間。於一實施例中，以5-30 ng/ml為佳，以10-30 ng/ml為較佳。

於本發明中，該周邊單核細胞意指具有圓形細胞核之任何血液細胞。該周邊單核細胞係包括淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜鹼性球、及樹突細胞。該淋巴細胞係由T細胞、B細胞及自然殺手細胞所組成。於一實施例中，該周邊單核細胞係來自一哺乳動物。

HGF可誘導該周邊單核細胞分化成免疫調節性白血球，例如骨髓衍生抑制細胞(myeloid-derived suppressor cell，以下有時簡稱MDSC或MDSCs)、單核細胞等。於一實施例中，該免疫調節性白血球可抑制經活化之同種異體淋巴細胞(allogeneic lymphocyte)之增殖。

該骨髓衍生抑制細胞具有多種免疫調節功能，包含例如產生精胺酸酶、產生一氧化氮合成酶、誘導調節型T細胞等。於一實施例中，MDSC可表現細胞標記CD11b及CD33，且不表現CD14；亦即，該骨髓衍生抑制細胞所表現之細胞標記為CD14^-CD11b⁺CD33⁺。於一實施例中，藉由應用本發明之方法，MDSC之量可增加約1.5至5倍。於一實施例中，在未經處理之周邊單核細胞中存在微量MDSC，例如約1%，而經HGF處理後可擴增至約3%以上。於一實施例中，MDSC可擴增成該周邊單核細胞之約3-10%，以約3-5%為較佳。

該單核細胞具有多種免疫調節功能，包含例如產生IL-10、產生抗發炎性細胞激素、調節免疫反應，使其傾向Th2型顯性反應(Th2-dominant response)等。尤其是，藉由應用本發明之方法，可誘導該單核細胞能夠產生IL-10(亦即，IL10⁺)。於一實施例中，經誘導之單核細胞亦可表現CD14，而不表現CD16；亦即，該經誘導之單核細胞所表現之細胞標記為CD14⁺CD16^-IL10⁺。於一實施例中，藉由本發明之方法所 產生的CD14⁺CD16^-IL10⁺單核細胞可佔周邊單核細胞之約3%以上，而在未經處理之周邊單核細胞中則不存在CD14⁺CD16^-IL10⁺，僅有CD14⁺CD16^-IL10^-單核細胞存在。於一較佳實施例中，以該周邊單核細胞總量為基礎計算，該CD14⁺CD16^-IL10⁺單核細胞為約5%。

本發明亦提供一種免疫調節細胞，係依據前述方法所製備。該免疫調節細胞係衍生自周邊單核細胞，藉由將該周邊單核細胞與間葉幹細胞共同培養、及/或以間葉幹細胞分泌之HGF處理，藉此可誘導細胞分化作用。於一實施例中，該免疫調節細胞為CD14^-CD11b⁺CD33⁺骨髓衍生抑制細胞。於另一實施例中，該免疫調節細胞為CD14⁺CD16^-IL10⁺單核細胞。

本發明係提供一種可簡單、直接且迅速地由周邊單核細胞產生免疫調節細胞之方法。該方法可進一步應用於產生可臨床應用於自體免疫疾病及器官移植之移植排斥的免疫調節細胞。

本發明進一步提供一種治療由異常免疫反應所致疾病之方法。該由異常免疫反應所致疾病，例如：器官移植之移植排斥、或自體免疫疾病，包括：系統性紅斑狼瘡(system lupus erythematosus)、多發性硬化症(multiple sclerosis)、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)、第1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus)、乳糜瀉(coeliac disease)、修格連氏症候群(Sjögren's syndrome)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、葛瑞夫茲氏症(Graves' disease)、免疫性血小板缺乏紫斑症(idiopathic thrombocytopenic purpura)等。

於此治療方法中，對患有該疾病之病患投予HGF。該病患可為哺乳動物。於一實施例中，所投予之HGF為蛋白質型式，以間葉幹細胞分泌之HGF為佳，以人類來源之間葉幹細胞分泌之HGF為更佳。於另一實施例中，亦可提供一間葉幹細 胞，其可產生HGF以供給該病患。在投予HGF後，可誘發該病患之周邊單核細胞分化成免疫調節性白血球(例如MDSC、單核細胞等)。由此細胞分化作用所衍生出的免疫調節性白血球具有不同的免疫功能，可調節病患的免疫系統，並可據此調節該異常的免疫反應。

實施例 實施例1：免疫調節性骨髓衍生抑制細胞(MDSCs)之製備 材料與方法 細胞培養

如參考文獻(Yen BL et al.,Stem Cells.2005；23(1)：3-9；Chang CJ et al.,Stem Cells.2006；24(11)：2466-77；Liu KJ et al.,Cell Transplant.2011；20：1721-30)所述之方法，分離並擴增人類胎盤衍生之間葉幹細胞(MSCs)(來自足月胎盤之間葉幹細胞細胞群)。在本機構之審議委員會之同意下，取得來自健康提供者母體之足月胎盤(38-40週孕期)。簡言之，間葉幹細胞係培養於含有10%胎牛血清(FBS，購自HyClone)之低葡萄糖-DMEM培養基(購自Gibco-Invitrogen)。將間葉幹細胞培養至70%緻密度之條件培養基，收集並貯存於-80℃直到測試。在本機構之審議委員會之同意下，取得採自健康自願者之任選之白血球層之人類周邊血液淋巴細胞。如先前所述之方法，利用Ficoll-Paque(1.077 g/ml；Gibco-Invitrogen)密度梯度離心分離周邊血液白血球。利用MACS(磁珠細胞分離)CD14及CD4單離套組(購自Miltenyi Biotec)並依照製造商之說明書，自周邊血液白血球分別純化出CD14⁺及CD4⁺之T細胞。簡言之，將周邊血液白血球與適當的磁珠置於4℃下20分鐘，接著以包含1%之FBS之磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)洗滌周邊血液白血球與磁珠之複合物，並藉由AutoMACS(Miltenyi Biotec) 分成正型餾份及負型餾份。收集正型餾份，其中CD14⁺及CD4⁺之T細胞純化物經FACS分析證實純度高於98%，並培養於RPMI-1640培養基中。

免疫表型

以BD FACSCalibur流式細胞儀系統(購自BD Biosciences,Mississauga,Canada)進行細胞表面標記分析。除了抗CD14、CD33及CD11b之抗體係購自BioLegend,San Diego,CA,USA、抗ARG1抗體購自R&D Systems,Minneapolis,MN,USA、抗iNOS抗體購自Abcam,Cambridge,UK、及抗c-met抗體購自eBiosciences,San Diego,CA,USA以外，其餘抗體均購自BD Biosciences。

骨髓衍生抑制細胞之擴增

周邊血液白血球(PBL)與間葉幹細胞或癌症細胞株(比例為10：1)共培養3天，接著進行CD14^-CD11b⁺CD33^-評估，其亦為用於骨髓衍生抑制細胞之FACS細胞分離法之細胞表面標記(利用BD Aria Cell Sorter(購自BD Biosciences)進行)。依照製造商之說明書(購自Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)，部分實驗以磁珠負型餾份篩出之CD14^-細胞取代PBL而進行。將預定劑量之重組人類HGF(rhHGF，購自R&D Systems)加入周邊血液白血球，進行下述PBL細胞分裂之MDSC抑制作用之分析評估。簡言之，以2.5μmol/L螢光染劑CFSE(carboxyfluorescein succinimidyl ester；購自Molecular Probes/Gibco-Invitrogen,Grand Island,NY,USA)標記異體PBL達10分鐘，接著，以抗-CD3/CD28珠粒(購自Gibco-Invitrogen)刺激。以FACS細胞分離法分離出同質性MSC-擴張之骨髓衍生抑制細胞，再與經刺激之異體PBL以不同的作用細胞-標的細胞(E：T)比例共培養3天。以流式細胞分析法，藉由CFSE染劑強度評估PBL細胞分裂作用。

HGF分泌作用之定量

以細胞培養盤所收集之上清液，利用商業購得之ELISA套組(購自R&D Systems)，依製造商之說明書操作，以測定HGF。

RNA干擾測試

利用針對IL-6及HGF之siRNA(specific small interfering RNA，購自Gibco-Invitrogen)並依製造商之說明書進行抑制(knockdown)測試。以ELISA驗證siRNA對於間葉幹細胞-分泌因子之抑制效果。

體內(in vivo)試驗

所有動物實驗均依循本機構之動物照護及使用委員會所核准之規範進行。C57BL/6小鼠(4至8週大)均來自台灣國家實驗動物中心(台灣，台北)。由尾靜脈注射重組小鼠HGF(100 ng，購自R&D Systems)，於注射3天後將小鼠犧牲。收集周邊血液、骨髓及脾臟，進行Gr1⁺CD11b⁺細胞之流式細胞分析。

統計分析

在上述測試中，以SPSS 18.0軟體(購自SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)進行統計分析，並將統計顯著性定義為p<0.05。Student’s t-test用於兩群組之間的比對，ANOVA則用於複數群組之間的比對。

實施例1-(1) 間葉幹細胞可使來自周邊血液白血球之功能性CD14 ^- CD11b ⁺ CD33 ^- 骨髓衍生抑制細胞大量增加

先前技術均未報導過關於不同來源之間葉幹細胞(MSC)之強烈免疫抑制特性會與骨髓衍生抑制細胞(MDSC)擴增相關。骨髓及胎盤之間葉幹細胞均具有CD73、CD105及CD90正 型之表面標記表現，且為造血性標記(包括共刺激分子CD80及86)負型之表現(參照第1A圖)。兩種間葉幹細胞群均可分化為成骨系(osteogenic lineage)、成軟骨系(chondrogenic lineage)、成脂系(adipogenic lineage)，符合多元性間葉幹細胞之原則(參照第1B圖)。

將間葉幹細胞與人類同種異體周邊血液白血球共培養，並進行骨髓衍生抑制細胞分析，在人類系統之特徵係表現CD33及CD11b，但不表現CD14。如第2A、2B圖所示，骨髓及胎盤間葉幹細胞均可增加周邊血液白血球中的CD14^-CD11b⁺CD33^-細胞數量。檢測間葉幹細胞-擴增之CD14^-CD11b⁺CD33^-細胞(以下有時簡稱「MSC-誘導之骨髓衍生抑制細胞」)之特性及生物學功能，其結果顯示於第2C至2F圖。藉由共培養，MSC-誘導之骨髓衍生抑制細胞具有抑制淋巴細胞增殖之功能，且呈現劑量依賴性(參照第2C圖)。MSC-誘導之骨髓衍生抑制細胞可表現ARG1及iNOS(參照第2D&2E圖)，並可於經刺激之周邊血液白血球中誘發大量的CD4⁺CD25^high T_regs(參照第2F圖)。據此，MSC-誘導之骨髓衍生抑制細胞確實具有多種免疫調節功能。

實施例1-(2) MSC-誘導之骨髓衍生抑制細胞之擴增係由分泌性HGF所調控

如第3A圖所示，由間葉幹細胞所誘導之骨髓衍生抑制細胞之擴增，並不受細胞分隔培養之影響，此暗示了無須細胞-細胞接觸，且在此過程中可能關係到分泌性因子。如第3B圖所示之間葉幹細胞之上清液分析，間葉幹細胞分泌多種基質相關因子，如：RANTES/CCL5、HGF、及IL-6。IL-6已知與骨髓衍生抑制細胞增殖有關，然而，拮抗抗體及siRNA抑制實驗 兩者均顯示，IL-6對於間葉幹細胞誘發之骨髓衍生抑制細胞增殖並無關連(實驗數據未顯示於說明書中)。

由於間葉幹細胞會大量分泌HGF，因此測試並評估此分子是否與間葉幹細胞誘發之骨髓衍生抑制細胞增殖有關連，如第3C圖所示，添加重組HGF可使骨髓衍生抑制細胞擴增，且呈現劑量依賴效果，最高至HGF濃度為約30ng/ml，近似於間葉幹細胞之條件培養基中測得之上限(第3B圖)。HGF-擴增之骨髓衍生抑制細胞亦會表現iNOS及ARG1，且具有抑制性效應物功能(分別參照第3D&3E圖)。為確認HGF在間葉幹細胞誘發之骨髓衍生抑制細胞擴增作用之關連性，利用siRNA對間葉幹細胞進行RNA干擾，以抑制HGF分泌。當有效抑制間葉幹細胞之HGF分泌時，間葉幹細胞誘發之骨髓衍生抑制細胞擴增現象也消失(第3F圖)。因此，本實驗數據證實間葉幹細胞所分泌之HGF係與骨髓衍生抑制細胞增殖有關。

亦測試來自其他細胞株之HGF，如第4A、4B圖所示，由不同細胞株分泌之HGF之量，係與骨髓衍生抑制細胞增加之量相關。

為了於體內(in vivo)驗證上述發現，將重組HGF以靜脈注射方式注入野生型C57BL/6小鼠。3天後，可觀察到該等小鼠骨髓中之CD11b⁺Gr1⁺骨髓衍生抑制細胞增加(第4C圖)，顯示HGF可於體內環境擴增骨髓衍生抑制細胞。

實施例1-(3) HGF誘發之骨髓衍生抑制細胞擴增，係經由c-met、其受器、及增加STAT3磷酸化所調控

進一步研究HGF-調控之骨髓衍生抑制細胞擴增之機制。檢測骨髓衍生抑制細胞上之c-met(HGF之同源受器)之表現，並發現CD14^-白血球持續表現低量c-met(第5A圖)，且若以中和性抗體阻斷CD14^-細胞之c-met，則HGF誘發之骨髓衍生抑制 細胞擴增現象會消失(第5B圖)。再檢測骨髓衍生抑制細胞之HGF-誘發之STAT3磷酸化作用，以確認HGF/c-met之主要效用係經由STAT3調控。如第5C圖所示，添加外源性HGF會誘發高於基準線之磷酸化STAT3(pSTAT3)，暗示該途徑被活化。於外源性HGF存在下添加STAT3抑制劑(cpd188)，該骨髓衍生抑制細胞中pSTAT3增加的現象會消失，且展現劑量依賴性(第5D圖)。因此，HGF藉由與其受器c-met結合，其導致STAT3磷酸化增加，進而調控骨髓衍生抑制細胞之增生。

HGF-調控之骨髓衍生抑制細胞擴增之機制係如第6圖所示，HGF(尤其是由間葉幹細胞所分泌者)可使骨髓衍生抑制細胞增加。從機制上而言，間葉幹細胞所誘導的骨髓衍生抑制細胞增生係經由HGF/c-met途徑，其下游與STAT3相關。藉由與間葉幹細胞或HGF共培養所擴增之骨髓衍生抑制細胞具有功能性，其表現iNOS及ARG1，且具有抑制功能，可誘導T_regs。因此，HGF-誘發之骨髓衍生抑制細胞會達成免疫調節功能。此種免疫調節功能可用以治療自體免疫疾病及其他免疫相關疾病，如移植物-宿主疾病。

實施例2：製備免疫調節性單核細胞

於本發明中，發現間葉幹細胞可經由分泌肝細胞生長因子(HGF)而誘發免疫調節性產生IL-10之CD14⁺單核細胞群。該等免疫調節性單核細胞之存在會抑制T細胞增殖，及改變T細胞之效應物功能，由Th1走向Th2。亦測試HGF與CD14⁺單核細胞間的交互作用，且該信號途徑係與該免疫調節性單核細胞生成IL-10相關。

材料與方法 細胞培養

如實施例1所述方式，分離及培養人類胎盤衍生之間葉幹細胞。

將得自美國菌種中心(ATCC)之人類組織細胞淋巴瘤細胞株U937及人類T細胞急性白血病細胞株Jurkat，依其所公開之流程培養。在部分實驗中，於重組人類HGF(rhHGF，購自Peprotech)處理前，以ERK1/2抑制劑U0126(細胞訊息傳導)、p38 MAPK抑制劑SB203580(購自Merck)、及STAT3抑制劑cpd188(購自Merck)處理U937達30分鐘。

細胞增殖測試

以2.5 μM之CFSE(carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester，購自Gibco-Invitrogen)將細胞於25℃及0.1%之小牛血清蛋白(BSA)下染色10分鐘。以0.1% BSA洗滌兩次後，以RPMI-1640培養基重新溶散該細胞，並於25℃下培養10分鐘。將周邊血液白血球、或移除CD14之周邊血液白血球，以人類T細胞活化劑，即，抗-CD3/CD28 Dynabeads(購自Gibco-Invitrogen)，或有絲分裂劑PHA(phytohemagglutinin，100 μg/ml，購自Sigma-Aldrich)，在間葉幹細胞培養基與rhHGF存在或不存在下進行刺激。另外，將經抗-CD3/CD28珠粒刺激之CD4⁺T細胞與rhHGF-處理之HLA-錯配之CD4⁺細胞以不同比例進行共培養。在72小時後，將以CFSE標記之細胞(5 x 10⁵細胞/孔)收集並以0.1%BSA洗滌兩次。如前述，以FACS進行細胞分裂次數之分析。

細胞激素陣列

以間葉幹細胞培養盤(包括與CD14⁺細胞共培養或否)所收集之條件培養基進行分析，藉由人類定量抗體陣列(購自RayBiotech)並依製造商所建議流程測定細胞激素圖譜。簡言之，將試膜與阻斷緩衝液共置於室溫下30分鐘，再加入樣本共置於室溫下90分鐘，接著，在室溫下以洗滌緩衝液I洗滌該試膜三次、洗滌緩衝液II洗滌該試膜兩次，每次洗滌為5分鐘；與經生物素接合之抗體共置於室溫下90分鐘。最後，洗滌該試 膜，並與經辣根過氧化氫酶接合之卵白素在室溫下共置2小時，再與檢測緩衝液共置2分鐘。以螢光檢測儀(GenePix 4000B Microarray Scanner，購自Axon Instruments,Inc.)進行檢測，並將數據數位化並進行影像分析(GenePix Pro software，購自Axon Instruments,Inc.)。藉由消去背景染色、及以相同試膜之陽性對照組正規化後，可獲得相對蛋白質濃度。

RNA靜默(silencing)測試

間葉幹細胞之HGF分泌之RNA靜默測試係利用兩種不同HGF-干擾RNA(簡稱HGF siRNA)(Stealth Select RNAi^TM siRNA，購自Gibco-Invitrogen)，並依製造商所建議流程測定，並使用製造商所建議之陰性對照組(StealthTM negative control)。使用Lipofectamine^TM RNAiMAX(購自Gibco-Invitrogen)，並依製造商所建議流程，將siRNA轉染間葉幹細胞。簡言之，將細胞於無血清培養基中培養24小時，添加轉染混合物達4-6小時，並轉移至完全培養基，培養3天後，以ELISA檢測其培養液以確認於間葉幹細胞中之HGF抑制效果。如前人文獻所述方法及依製造商說明書(購自R&D systems)，使用HGF及IL-10之酵素接合免疫吸附測定(ELISA)檢測條件培養基中由間葉幹細胞所產生之HGF、及單核細胞/細胞株所產生之IL-10。

免疫表型測試

如前人文獻所述方法，將細胞(周邊血液白血球、CD14⁺細胞、血癌細胞株)進行不同表面標記表現之染色，並以BDFACSCalibur(購自BD Biosciences)進行分析。除了抗c-Met之抗體購自eBiosciences以外，其餘流式細胞儀分析所用抗體均購自BD Biosciences。各分析均使用適當的FITC-接合及PE-接合之同型免疫球蛋白對照組。

胞內細胞介素染色

經抗-CD3/CD28所刺激之CD4⁺ T細胞(包括與經HGF處理之CD14⁺細胞共培養與否)所產生的IFN-γ、IL-4及IL13，係於培養72小時後測量。將細胞於50μg/ml之PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate，購自Sigma-Aldrich)、0.745μg/ml之離子黴素(購自Sigma-Aldrich)、及4 μM之孟寧素(購自BioLegend)之存在下重新溶散達4-6小時。接著，將細胞與抗-人類IFN-γ FITC(購自BioLegend)、抗-人類IL-4 PE(購自BioLegend)、或抗-人類IL13 PE(購自BD Biosciences)於4℃下共置45分鐘。並平行使用FITC-接合及PE-接合之同型免疫球蛋白作為對照組。將細胞洗滌兩次、並懸浮於PBS-BSA以進行FACS分析。

重組小鼠HGF之體內測試

將小鼠(C57BL/6)以靜脈注射注入以150 μl之PBS稀釋之200ng之重組小鼠HGF(rmHGF，購自Peprotech)。8天後，藉由以PBS灌洗方式，由小鼠股骨取出骨髓細胞；及將脾臟於4℃下以3-ml注射器頭磨碎，再以尼龍篩過濾。將所得細胞懸浮液離心，將紅血球溶裂，並洗滌所得單細胞懸浮液。以磁珠分離法(auto-MACS)，分別使用CD45R/B220 PE(購自Biolegend,clone：RA3-6B2)、CD90.2 PE(購自eBioscience,clone：53-2.1)及抗-PE磁珠，以去除脾細胞中的B-淋巴細胞及T-淋巴細胞。將細胞懸浮液與抗-小鼠CD11b PE(購自BioLegend)及抗-小鼠IL10 PerCPCy5.5(購自BD Biosciences)共置，並以FACS檢測。

RNA分離及反轉錄-聚合酶連鎖反應(RT-PCR)

以Trizol試劑(購自Gibco-Invitrogen)萃取全RNA，並如前人文獻所述方法進行RT-PCR，使用下列PCR引子：IL-10之順向引子為5'-CTGTGAAAACAAGAGCAAGGC-3'、且反向引子為5'-GAAGCTTCTGTTGGCTCCC-3'；而β-肌動蛋白(陽性 對照組)之順向引子為5'-TGGCACCACCTTCTACAATGAGC-3'、且反向引子為5'-GCACAGCTTCTCCTTAATGTCACGC-3'。每實驗為三重覆。使用ImageJ軟體(NIH)以光密度分析方式，並以β-肌動蛋白標準化可獲得mRNA相對定量。

西方墨點分析

如前人文獻所述方法自細胞萃取蛋白質。拮抗ERK1/2、STAT3及α-管蛋白之主要抗體係購自Santa Cruz Biotechnology，而拮抗phospho-ERK1/2、phospho-STAT3、p38 MAPK、phospho-p38 MAPK、Akt、及phospho-Akt之主要抗體係購自Cell Signaling Technologies。

統計分析

以SPSS軟體(購自SPSS Inc.,version 19.0)進行統計分析，以Student’s t-test用於兩群組之間的比對，ANOVA則用於複數群組之間的比對。所有資料均以平均數±SEM表示，並將統計顯著性定義為p<0.05。所有實驗均為至少三重覆。

實施例2-(1) HGF可抑制經抗-CD3/28-活化之周邊血液白血球之增殖

如實施例1所示，間葉幹細胞展現對T淋巴細胞之強力免疫調節性，其效果係經由分泌因子所調控。如第7A圖所示，該間葉幹細胞之條件培養基(MSC-CM)可抑制周邊血液白血球增殖，其會被PHA(會優先刺激單核細胞)活化，或被抗-CD3/28(會專一刺激T細胞)活化。與經PHA-刺激之周邊血液白血球相較，MSC-CM可對經抗-CD3/28-刺激之周邊血液白血球展現略強的抑制效果。又，經抗-CD3/28-刺激之周邊血液白血球與間葉幹細胞共培養時，其細胞激素圖譜會改變，由Th1發炎前驅環境(pro-inflammatory Th1 milieu)-以IFN-γ及 TNF-α為代表，轉向強化的免疫調節環境(more immunomodulatory milieu)-以IL-10為代表(第7B圖)。

在不同細胞激素、趨化激素、及基質相關分子分析(第7C圖)中，HGF為MSC-CM中分泌最大量者。接著，添加rhHGF至經活化之周邊血液白血球。令人驚訝的是，rhHGF可抑制經抗-CD3/28-活化之周邊血液白血球之增殖，但對經PHA-刺激之周邊血液白血球則否(第7D圖)，表示HGF之免疫抑制作用係針對T細胞。且HGF對周邊血液白血球之抑制作用並無劑量依賴性。又，以siRNA對間葉幹細胞之HGF抑制(knockdown)試驗，其ELISA檢測結果如第7E圖所示。當經抗-CD3/28-活化之周邊血液白血球與siHGF-間葉幹細胞共培養時，該免疫抑制效果則降低至明顯程度(第7F圖)。另外，HGF-siRNA間葉幹細胞之培養基可使對周邊血液白血球之增殖抑制作用部分回復(數據未顯示)。該等結果顯示，間葉幹細胞所分泌之HGF可抑制經抗-CD3/28-活化之周邊血液白血球之增殖。

實施例2-(2) 對經活化CD4 ⁺ 細胞之HGF-所調控之免疫調節作用，CD14 ⁺ 單核細胞為必要

HGF為c-Met之配體，c-Met為一種酪胺酸激酶。根據前述HGF對經抗-CD3/28-活化之周邊血液白血球具有抑制作用，但對經PHA-活化之周邊血液白血球則否，顯示HGF之免疫調節作用係針對T細胞。然而，初級T細胞上並不表現c-Met(數據未顯示於說明書中)，Jurkat細胞，即T細胞血癌細胞株亦無(第8A圖)。曾有報導T細胞不表現c-Met，但單核細胞係表現少量c-Met；單核細胞為CD14⁺細胞，包括約10%之人類周邊血液白血球，且已知人類單核細胞性血癌細胞株U937與提供者之周邊血液白血球而來之主要CD14⁺單核細胞均表現c-Met(第8A及8B圖)。

上述結果顯示，HGF對T細胞之效用可能需要單核細胞作為中間物。為了測試此假設，將CD14⁺細胞由周邊血液白血球移除，接著添加rhHGF至經抗-CD3/28-活化之周邊血液白血球。如第8C圖所示，在CD14+細胞被移除的情況下，HGF對於經抗-CD3/28刺激之周邊血液白血球增殖之抑制作用係完全消失。

將CD14⁺-珠粒篩選之單核細胞以rhHGF處理，並與經抗-CD3/28-刺激之CD4+細胞共培養。如第8D圖所示，T細胞之增殖作用可被經HGF-處理之CD14⁺細胞所抑制，且該抑制作用會隨作用細胞：標的細胞(CD14⁺比CD4⁺細胞)之比例增加而增加。然而，HGF之劑量對於該單核細胞調控之抑制作用並無影響，與第7D圖相同。經抗-CD3/28-活化之周邊血液白血球與經HGF-處理之CD14⁺單核細胞共培養係改變細胞激素圖譜，從較高的Th1朝向Th2環境(第8E圖)。CD4⁺ T細胞之胞內Th1(IFN-γ)及胞內Th2(IL-4 and IL-13)產物之FACS分析顯示，CD4⁺ T細胞與經HGF-處理之CD14⁺細胞共培養會增加IL-4與IL-13之生成；反之，IFN-γ則減少。該等數據顯示HGF直接與CD14⁺單核細胞產生交互作用，進而改變了T細胞的免疫功能。

實施例2-(3) HGF可顯著誘發IL-10生成

單核細胞為導向發炎環境之細胞浸潤(cellular influx)之主要成分，可依據環境刺激而分化成樹突細胞或巨噬細胞，以提供發炎前驅特性或抗發炎特性。為了研究HGF是否可調控CD14⁺單核細胞之分化，分析其傾向分化為樹突細胞系或巨噬細胞系而有表面標記表現之改變。HGF處理後，無論是與樹突細胞相關之標記CD11b、CD11c及HLA-DR、或與巨噬細胞相關之標記CD206之表現量均未改變(第9A圖)。另外，並未測 得DC-SIGN、CD68及CD73之表現。然而，CD16-細胞之餾份輕微增加(第9B圖)，且該CD14⁺單核細胞之次群已報導過具有免疫調節性。

於第10A圖中，與間葉幹細胞共培養之CD14⁺細胞之細胞激素定量陣列分析顯示，發炎前驅細胞介素(包括IFN-γ及TNF-α)生成量顯著降低，而抗發炎細胞介素(IL-10)則顯著增加。此數據顯示，間葉幹細胞之免疫抑制效果可來自於降低IFN-γ及增加IL-10之生成。為了進一步確認HGF與單核細胞之IL-10生成增加之間的交互關係，將初級CD14⁺細胞與rhHGF共培養，並測量培養基所含IL-10之濃度。如第10B圖所示，經HGF-處理之CD14⁺細胞、以及經MSC-CM-處理之CD14⁺細胞之選擇培養基均具有高於基準線之高量IL-10生成。

將mHGF注射至野生型B6小鼠以進行上述效果之體內測試。如第10C圖所示，HGF誘發脾細胞中生成IL-10之單核細胞群之輕微增加，但在骨髓細胞或周邊血液中則否(數據未顯示)。據此，HGF係與CD14⁺單核細胞生成IL-10相關。

實施例2-(4) HGF係經由ERK1/2磷酸化而誘發IL-10分泌

進一步研究HGF誘發單核細胞生成IL-10之機制。將單核細胞株U937以HGF處理，並檢測其於IL-10基因表現之改變。如第11A圖所示，IL-10轉錄子之增加在rhHGF處理6小時達到高峰，表示HGF與IL-10生成有直接關係。HGF啟動許多胞內訊息傳導途徑及其下游途徑，PI3K/AKT、Ras/ERK1/2、p38/MAPKs、及STAT3亦與調控IL-10基因表現相關。如第11B圖所示，於U937細胞株以HGF處理後，ERK1/2、STAT3、及p38/MAPK之磷酸化增加，但AKT則否。為了進一步研究此三種途徑，以HGF及特定抑制劑同時處理U937細胞株，抑制劑包括：U0126(p-ERK1/2抑制劑)、SB203580(p38/MAPK抑 制劑)、及cpd188(pSTAT3抑制劑)。結果如第11C及11D圖所示，於U0126及SB203580組中，IL-10基因表現以劑量依賴性之方式減少，但僅有ERK1/2抑制劑在HGF處理後造成IL-10蛋白質生成顯著降低。此結果顯示HGF-調控之單核細胞之IL-10生成係經由ERK1/2所調控。

如第12圖所示，HGF(尤其是間葉幹細胞分泌者)作用於CD14⁺單核細胞以調控同種異體T細胞之功能，並經由ERK1/2增加IL-10。間葉幹細胞所分泌之HGF直接作用於CD14⁺單核細胞(其表現HGF之受器c-Met)，以抑制經活化之CD4⁺細胞增殖作用。此種CD14⁺單核細胞為間葉幹細胞所分泌之HGF對經活化之CD4⁺細胞之抑制效果所必須，該抑制效果包含增加免疫調控性CD14⁺CD16^-單核細胞、誘發IL-10生成、調控T細胞之細胞激素圖譜，由Th1導向Th2。就機制上而言，HGF係經由ERK1/2途徑而誘發CD14⁺單核細胞之IL-10生成。上述實施例顯示了先前技術未知的間葉幹細胞之強免疫調節特性之機制，以及，強調了免疫調節性單核細胞在改變T細胞免疫功能上所扮演的重要角色。

值得注意的是，HGF對T細胞增殖的抑制效果並非劑量依賴性，可能是因為單核細胞上c-Met(HGF之受器)表現量低，因此受器飽和之閥值也相對較低。

HGF誘發單核細胞中ERK1/2及p38MAPK之磷酸化，且HGF所誘發IL-10生成僅受ERK1/2抑制劑所阻斷，表示Ras/Raf訊息傳導途徑與HGF所誘發之單核細胞分泌IL-10有關。ERK1/2負責在免疫細胞中控制IL-10表現之數種轉錄因子之磷酸化及活化，包括MAF、JUN、GATA3、及SMAD4，並非p38之受質。因此，該等轉錄因子可能在HGF所誘發之單核細胞生成IL-10中具有關鍵作用。

上述實施例證實HGF可直接且非常迅速地在CD14⁺單核細胞(3天內)誘發免疫調節表型，且細胞仍然為未貼附狀態，表示分化尚未開始。循環周邊血液單核細胞之次群(為CD14⁺⁺CD16^-)可產生高量抗發炎細胞激素，包括IL-10。循環CD14⁺單核細胞為周邊血液白血球之大部分成分，且若免疫調節性單核細胞可迅速地被誘發，該等白血球可以對循環免疫調節性細胞整體之量做出更顯著的貢獻。

上述特定實施例之內容係為了詳細說明本發明，然而，該等實施例係僅用於說明，並非意欲限制本發明。熟習本領域之技藝者可理解，在不悖離後附申請專利範圍所界定之範疇下針對本發明所進行之各種變化或修改係落入本發明之一部分。

第1圖顯示骨髓間葉幹細胞(BM-MSCs)及胎盤衍生間葉幹細胞(P-MSCs)之特徵，第1A圖：表面標記；第1B圖：BM-MSCs及P-MSCs之三譜系分化表型，Osteo：成骨系、Chondro：成軟骨系、Adipo：成脂系；比例尺：200 mm。

第2圖係顯示在異體周邊血液白血球(PBLs)中，間葉幹細胞擴增了功能性CD14^-CD11b⁺CD33⁺骨髓衍生抑制細胞(MDSCs)數量。第2A圖：藉由間葉幹細胞，CD14^-CD11b⁺CD33⁺細胞自周邊血液白血球中增加，同種異體之周邊血液白血球(30位提供者)單獨培養或與間葉幹細胞共培養(BM-間葉幹細胞及P-間葉幹細胞各有三位提供者)。 第2B圖：周邊血液白血球之CD11b⁺或CD14^-CD11b⁺CD33⁺細胞與間葉幹細胞共培養後之定量百分比，與周邊血液白血球單獨培養相比較之p<0.05。第2C圖：間葉幹細胞誘發之骨髓衍生抑制細胞之抑制功能，同種異體周邊血液白血球(T，標的細胞)以CFSE(carboxyfluorescein suceinimidyl ester)染色 以評估細胞分裂，並在添加或不添加間葉幹細胞擴張之骨髓衍生抑制細胞(E，作用細胞)下，以抗-CD3/28(a-CD3/28)刺激，其中該添加係以不同E：T比例。以流式細胞分析評估PBL細胞分裂，右圖為量化結果，p<0.05。第2D圖：誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)之表現，第2E圖：MSC-擴張之骨髓衍生抑制細胞之精胺酸酶-1(ARG1)之表現，由PBL負面選擇CD14^-細胞，單獨培養或與間葉幹細胞共培養，進一步以CD11b、CD33、及iNOS(第2D圖)或ARG1(第2E圖)染色。第2F圖：藉由MSC-擴張之骨髓衍生抑制細胞而增加CD4⁺CD25^High調控性T細胞(T_regs)，將表現CD14^-CD11b⁺CD33⁺之MSC-擴張之骨髓衍生抑制細胞分出(FACS)，並與經抗-CD3/28刺激之異體PBL以不同比例共培養，並評估高表現CD4⁺CD25之T細胞之誘導作用，右圖為量化結果，與PBL/a-CD3/28相較之p<0.05。

第3圖顯示骨髓衍生抑制細胞之間葉幹細胞擴增作用係經由分泌之肝細胞生長因子(HGF)所調控。第3A圖：骨髓衍生抑制細胞受間葉幹細胞誘發之擴增作用係經分泌因子所調控。異體PBL與間葉幹細胞共培養，無論是直接接觸(MSC)或由培養盤分隔(TW)者，均產生CD14^-CD11b⁺CD33⁺骨髓衍生抑制細胞之擴增作用；^＊,p<0.05與PBL單獨培養者比較；n.s.：不顯著。第3B圖：以細胞介素定量陣列分析間葉幹細胞之高量分泌因子；IL：間白素、LAP：潛伏型胜肽、SDF：基質衍生因子。第3C圖：添加外源性重組HGF至PBL可增加骨髓衍生抑制細胞數量(^＊,p<0.05線性趨勢)。第3D圖：經HGF-擴增之骨髓衍生抑制細胞中iNOS(上行)及ARG1(下行)表現之測試。第3E圖：經HGF-擴增之骨髓衍生抑制細胞對於經抗-CD3/28刺激之PBL增殖之抑制作用，以CFSE對細胞分裂進行染色，並以流式細胞儀分析。第3F圖：以HGF專一性小片段干擾RNA(siRNA)抑制間葉幹細胞之HGF分泌，會使骨髓衍生抑制細胞擴增作用消失。異體周邊 血液白血球與間葉幹細胞(來自3位提供者)共培養，並經無標的小片段干擾RNA(siRNA Ctrl)或HGF專一性siRNA(siHGF)轉染，並進行CD14^-CD11b⁺CD33⁺細胞之評估；^＊,p<0.05與間葉幹細胞(左圖)或PBL單獨培養(右圖)相較。

第4圖顯示癌細胞分泌之HGF及小鼠體內投予HGF可增加骨髓衍生抑制細胞之數量。第4A圖：間葉幹細胞所分泌之HGF之量，MG63(骨肉瘤細胞系)、胚胎幹細胞衍生之間葉前驅細胞(EMP)、及JEG-3(絨毛膜癌細胞系)；第4B圖：四種細胞類型及PBL共培養後之骨髓衍生抑制細胞之倍數增生；^＊,p<0.05線性趨勢。第4C圖：將重組HGF(100 ng)以尾靜脈注射至C57BL/6小鼠，並於注射後一天及三天評估其周邊血液、脾臟及骨髓中之CD11b⁺Gr1⁺細胞；^＊,p<0.05與PBS相較。

第5圖顯示由HGF擴增之骨髓衍生抑制細胞係經其受器c-met及增加STAT3磷酸化所調控。第5A圖：以流式細胞儀分析骨髓衍生抑制細胞上之c-met表現(12位提供者)，並提供量化之平均螢光強度(MFI)之圖表；^＊,p<0.05與同型免疫球蛋白對照組相較(Ctrl)。第5B圖：c-met與HGF調控之骨髓衍生抑制細胞擴增之關連。以同型免疫球蛋白(IsoAb)或c-met阻斷抗體(anti-c-Met)阻斷周邊血液白血球，以重組HGF(20ng/ml)處理，並評估CD14^-CD11b⁺CD33⁺細胞之增加。 第5C圖：STAT3與HGF調控之骨髓衍生抑制細胞擴增之關連。將重組HGF(20ng/ml)添加至CD14^-白血球中，並對CD11b、CD33、及經磷酸化之STAT3(pSTAT3)進行染色，以流式細胞儀評估(右上角數值為MFI)，一併提供量化之MFI之圖表；^＊,p<0.05線性趨勢。第5D圖：將重組HGF(20ng/ml)及不同劑量之cpd188(STAT3抑制劑)添加至PBL中，並對CD11b、CD33、及經磷酸化之STAT3(pSTAT3)進行染色，以流式細胞儀評估，一併提供量化之 CD14^-CD11b⁺CD33⁺pSTAT3⁺細胞所佔比例；a,p<0.05與PBL單獨培養相較；b,p<0.05線性趨勢。

第6圖顯示HGF所調控之骨髓衍生抑制細胞擴增之機制。

第7圖顯示胎盤衍生之間葉幹細胞所分泌之HGF對於經抗-CD3/28-活化之同種異體周邊血液白血球增殖之抑制作用。第7A圖：周邊血液白血球，單獨培養(未受刺激；黑色柱)、以PHA刺激(白色柱)、或以抗-CD3/28活化珠粒處理(灰色柱)，且以MSC-CM處理或否；或第7D圖：重組人類HGF(rhHGF)；n=15。將經刺激之周邊血液白血球之增殖作用設定為100%，其定義為以流式細胞儀分析經CFSE染色之周邊血液白血球有>90%產生細胞分裂；於第7A圖：a,p<0.01及b,p<0.05與對照組相較；c,p<0.05與經PHA活化之周邊血液白血球並以MSC-CM處理。於第7D圖：a,p<0.05；b,p<0.05與經PHA活化之周邊血液白血球並以HGF處理。第7B圖：細胞激素之細胞激素定量陣列檢測，產自間葉幹細胞(黑色柱)、周邊血液白血球(白色柱)、周邊血液白血球與間葉幹細胞共培養(灰色柱)、經抗-CD3/28活化之周邊血液白血球(斜線柱)、及經抗-CD3/28活化之周邊血液白血球與間葉幹細胞共培養(斑點柱)，培養3天，n=1。第7C圖：間葉幹細胞之細胞激素及基質相關因子分泌之細胞激素定量陣列檢測。第7E圖：於間葉幹細胞、以HGF-siRNA處理之間葉幹細胞、以無標的siRNA處理之間葉幹細胞之條件培養基中之HGF生成之ELISA測定結果，n=10。第7F圖：經抗-CD3/28活化之周邊血液白血球之增殖，單獨培養或與經siRNA轉染之間葉幹細胞共培養72小時，以流式細胞儀分析CFSE，n=9；a,p<0.05與經抗-CD3/28活化之周邊血液白血球與間葉幹細胞共培養者比較。除非另有說明，所有實驗數據均來自3次獨立實驗之平均，並以平均值±SEM表示；,p<0.01；^＊,p<0.001，除非另行說明，否則均與對照組比較。

第8圖顯示CD14⁺單核細胞為HGF對T淋巴細胞功能之免疫調節作用所必須。第8A&8B圖：c-Met之表現，於T淋巴細胞株(Jurkat)、單核細胞株(U937)、及從周邊血液白血球所純化之初級CD14⁺細胞(B；n=7)；MFI，螢光強度平均值。 第8C圖：周邊血液白血球(白色柱)或去除CD14⁺細胞之周邊血液白血球(黑色柱)單獨培養或經抗-CD3/28珠粒刺激，經rhHGF處理或否；n=15。經rhHGF處理之周邊血液白血球之增殖程度，以對經抗-CD3/28-活化之周邊血液白血球或去除CD14⁺細胞之周邊血液白血球之相對百分比呈現；a,p<0.01；b,p<0.05與以HGF處理之經抗-CD3/28-活化之周邊血液白血球相較。第8D圖：CD4⁺ T細胞之增殖，單獨培養或經抗-CD3/28珠粒刺激，經rhHGF處理之CD14⁺細胞處理或否，培養72小時(CD14⁺與CD4⁺ T細胞之比例：1/10、1/5、1/2、1/1)。將經刺激之CD4⁺ T細胞之增殖作用設定為100%，其定義為以流式細胞儀分析經CFSE染色之CD4⁺ T細胞有>90%產生細胞分裂；a,p<0.05線性趨勢。第8E圖：與經rhHGF處理之CD14⁺細胞共培養與否之經抗-CD3/28-活化之CD4⁺ T細胞之IFN-γ、IL-4及IL-13之胞內生成。T細胞之總數設為100%。除非另有說明，所有實驗數據均來自3次獨立實驗之平均，並以平均值±SEM表示；#,p<0.05；^＊,p<0.001，除非另行說明，否則均與對照組比較。

第9A圖顯示CD14⁺細胞上表現之樹突細胞(DC)-及巨噬細胞-相關之表面分子，以rhHGF處理(灰色及斜線柱)、未以rhHGF處理(黑色柱)，以流式細胞儀分析72小時培養物。同位素對照組(白色柱)之MFI表現量設為1。所有實驗數據均來自3次獨立實驗之平均，並以平均值±SEM表示。第9B圖顯示周邊血液白血球上之CD14及CD16之表現，以rhHGF處理或否，以流式細胞儀分析，n=8。

第10圖顯示HGF係增加單核細胞中IL-10生成量。第10A圖： Th1/2之細胞激素圖譜，CD14⁺細胞單獨培養3日(白色柱)、與間葉幹細胞共培養3日(黑色柱)，以細胞激素定量陣列檢測(n=1)。第10B圖：CD14⁺細胞之IL-10生成量，以rhHGF、MSC-CM、siHGF-MSC-CM處理或否，以ELISA測量。第10C圖：接受rmHGF注射之小鼠之骨髓及脾細胞之產生IL-10之單核細胞群(IL10⁺CD11b⁺細胞)。細胞總數設為100%。所有實驗數據均來自3次獨立實驗之平均，並以平均值±SEM表示；#,p<0.05；除非另行說明，否則均與對照組比較。

第11圖顯示CD14⁺單核細胞經HGF誘導之IL-10生成係經由ERK1/2途徑所調控。第11A圖：以RT-PCR於預定時間點檢測經rhHGF處理之U937細胞之IL-10表現，並以β-肌動蛋白作為內部對照組。第11B圖：以西方墨點法檢測經rhHGF處理之U937細胞之磷酸化之(p-)ERK1/2、p-STAT3、p-p38、及p-AKT之表現，並以ERK1/2、STAT3、p38、AKT、及α-管蛋白作為內部對照組。第11C圖：經rhHGF處理，並以ERK1/2抑制劑U0126、p38 MAPK抑制劑SB203580、或STAT3抑制劑cpd188預處理之U937細胞之IL-10基因表現，以RT-PCR檢測。第11D圖：以抑制劑U0126或SB203580預處理，並以rhHGF處理(黑色柱)或未以rhHGF處理(白色柱)之U937細胞之IL-10蛋白質表現；n=3；數據以平均值±SEM表現；,p<0.01；^＊,p<0.001，與對照組相較。

第12圖顯示HGF在CD14⁺單核細胞中誘發IL-10生成之機制。

Claims (20)

1. 一種產生免疫調節細胞之方法，包括：以肝細胞生長因子處理周邊單核細胞，以誘發該周邊單核細胞分化成免疫調節性白血球。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該周邊單核細胞係來自一哺乳動物。
3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該肝細胞生長因子為一重組蛋白質或一自然蛋白質。
4. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中，該肝細胞生長因子係來自一間葉幹細胞。
5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該免疫調節性白血球係包括骨髓衍生抑制細胞、單核細胞、或前述之組合。
6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中，該免疫調節性白血球係抑制經活化之同種異體淋巴細胞之增殖。
7. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中，該骨髓衍生抑制細胞所表現之細胞標記為CD14^-CD11b⁺CD33⁺。
8. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中，該骨髓衍生抑制細胞係產生精胺酸酶及一氧化氮合成酶。
9. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中，該骨髓衍生抑制細胞係誘導調節型T細胞。
10. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中，該單核細胞所表現之細胞標記為CD14⁺CD16^-IL10⁺。
11. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中，該單核細胞係產生IL-10。
12. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中，該單核細胞係產生抗發炎細胞激素。
13. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中，該單核細胞係調節免疫反應，使其主要傾向Th2型反應(Th2-dominant response)。
14. 一種免疫調節細胞，係依據申請專利範圍第1項所述之方法所製備。
15. 如申請專利範圍第14項所述之免疫調節細胞，其為CD14^-CD11b⁺CD33⁺之骨髓衍生抑制細胞。
16. 如申請專利範圍第14項所述之免疫調節細胞，其為CD14⁺CD16^-IL10⁺之單核細胞。
17. 一種治療由異常免疫反應所致疾病之方法，包括：對患有該疾病之病患投予肝細胞生長因子；誘發該病患之周邊單核細胞分化成免疫調節性白血球；及調節該異常免疫反應。
18. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中，該由異常免疫反應所致疾病係包括自體免疫疾病、或器官移植之移植排斥。
19. 如申請專利範圍第18項所述之方法，其中，該自體免疫疾病係包括系統性紅斑狼瘡、多發性硬化症、類風濕性關節炎、第1型糖尿病、乳糜瀉、修格連氏症候群、橋本氏甲狀腺炎、葛瑞夫茲氏症、或免疫性血小板缺乏紫斑症。
20. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中，該肝細胞生長因子係來自間葉幹細胞。