TW201410292A

TW201410292A - 結合低功率單點雷射與可降解性神經導管以促進截斷周邊神經之再生修復方法

Info

Publication number: TW201410292A
Application number: TW101133565A
Authority: TW
Inventors: Bai-Shuan Liu
Original assignee: Univ Central Taiwan Sci & Tech
Priority date: 2012-09-13
Filing date: 2012-09-13
Publication date: 2014-03-16

Abstract

一種結合低功率單點雷射與可降解性神經導管以促進截斷周邊神經之再生修復方法，包括：將一具有生物降解性之神經導管的兩端連接於一斷損之周邊神經之近端和遠端；沿著該斷損神經之近端和遠端以經皮穿透方式照射低功率單點雷射，雷射光為磷化鎵鋁砷(GaAlAsP)二極體雷射，波長為660 nm，功率為50 mW，雷射光束區域為0.1 cm2，為連續式光束，每次照射時間為2分鐘，每天照射一次，連續10天。實驗結果顯示，上述方式具有加速斷損神經之再生修復效果。

Description

結合低功率單點雷射與可降解性神經導管以促進截斷周邊神經之再生修復方法

本案與促進周邊神經之修復方法有關，更詳而言之，係一種結合低功率單點雷射與可降解性神經導管以促進截斷周邊神經之再生修復方法。

許多病人因周邊神經受傷而導致終身殘疾，這種傷害每年在世界各地造成重大的損失並增加醫療費用。周圍神經缺損的傳統治療手段係採自體神經移植，移植的神經提供近端神經殘端之軸突發芽的結構支持。但是，可供自體神經移植的部份極為有限，可能造成神經供應部位的功能殘缺，並適用於小距離的神經斷損。同種異體移植例如靜脈和具生物降解性的導管可應用於大距離的神經斷損。但神經再生是一個複雜的過程，是通過調節各種相互作用的蛋白質和細胞信號而構成的。如果沒有細胞的輔助，同種異體移植法使軸突再生的人工神經是很有限的。使用生物相容性材料為支架，並整合細胞生物學可發展一個如同自體神經移植的組織工程支架，提供對組織/器官再生有利的微環境。

目前，組織工程支架的材料係選自血管，膠原蛋白，合成聚合物，包括聚乳酸(PLA)和聚乙醇酸(PGA)等。但是，這些材料在修復週期中會產生強烈的酸性環境，對細胞功能是有害的。近日，組織工程支架與細胞外基質(ECM)的組合物已成為新的研究方向。膠原蛋白和明膠為細胞外基質的主要成分，他們可以促進細胞貼附和增殖，其降解產物不具細胞毒性。他們也被證明參與組織修復過程，並已廣泛用於燒燙創傷面的敷料。此外，這類的組合物已被發現具有吸引和改善周圍神經再生的功能。因此，我們開發了一種具生物降解性之神經導管，此神經導管以綠梔子素(Genipin)交聯明膠(Gelatin)並添加三鈣磷酸鹽陶瓷粉末(Tricalcium phosphate,TCP)，簡稱為GGT神經導管。以前的實驗中，神經導管植入大鼠坐骨神經斷端8週，GGT在這實驗期間成為斷端神經軸突生長及連接的渠道，並提供相當的機械強度支持神經斷端的軸突生長。

物理方法也可以做為促進神經再生的手段。許多的物理治療方法被應用於促進神經再生，例如：電療、超音波以及低功率雷射(low-level laser,LLL)。在1970年，低功率雷射首先被應用在神經的再生及功能回復，但所得到的結果並不具有一致的再現性。許多動物實驗和臨床研究，表示低功率雷射照射能減輕組織損傷、促進修復、並激發神經軸突發生長及繁殖，但是，對於它的作用機轉並不是很清楚。且在以往的文獻中，使用的低功率雷射波長介於632-904 nm，但雷射的波長、平均功率、持續時間、照射方式皆因為病變類型的不同而有明確差異，這阻礙了我們瞭解如何以有效的方法使用低功率雷射來促進神經再生。

然而，經由本案申請人所屬之研究團隊以大鼠斷損坐骨神經為實驗標的，以上述GGT神經導管連接斷損神經，於植入神經導管之重點部位進行大面積照射低功率雷射，雷射光為磷化鋁鎵銦(AlGaInP)二極體雷射，波長為660 nm，功率為50 mW，頻率50 Hz，照射面積為314平方厘米，能量密度為3.84 J/cm²，功率密度為0.0032 W/cm²，雷射照射從手術後的第1天開始，每天照射5分鐘，持續21天。實驗結果顯示，上述方式具有加速斷端神經之再生修復效果。本案申請人亦將以上實驗結果申請發明專利在案(申請案號100111655)。

基於先前技術證實了以GGT神經導管配合大面積照射低功率雷射的方式可加速斷損神經的修復，因此本案發明人在這個基礎上繼續研究以不同結構特性的神經導管(EGT神經導管)配合低功率單點雷射方式，期使加速神經的修復的成效更優於先前技術。

本發明之目的係在提供一種結合低功率單點雷射與可降解性神經導管以促進截斷周邊神經之再生修復方法，是以低功率單點雷射對神經導管接合的斷損神經的遠端和近端進行經皮雷射激點療法。與先前技術所指之發明專利申請案100111655相較，本發明修復大距離(15 mm)神經斷損的表現優於先前技術。

本發明採用之低功率單點雷射為磷化鎵鋁砷(GaAlAsP)二極體雷射，波長為660 nm，功率為50 mW，雷射光束區域為0.1 cm²，為連續式光束，每次照射時間為2分鐘，每天照射一次，連續10天。

本發明採用之可降解性神經導管為EGT神經導管，它是由1-乙基-3-(3-二甲氨基兩基)碳二亞胺(1-ethyl-3(3-dimethyl aminopropyl)-carbodimide,EDC)、明膠(Gelatin)以及三鈣磷酸鹽陶瓷粉末(Tricalcium phosphate,TCP)所製成。

本案以低功率單點雷射做為神經再生的刺激源，使神經透過EGT神經導管而再生。為證明促進神經再生之效能，我們將EGT神經導管植入實驗鼠的坐骨神經斷端，實驗動物隨機分為2個組別，第一組為未接受雷射治療之控制組(EGT)；第二組為接受雷射治療(EGT/Laser)的雷射治療組，於術後八週比較兩組實驗大鼠的巨視觀察、複合肌肉動作電位測試、坐骨功能指數分析、以及組織切片型態評估，並以比對結果證實單點雷射激點療法對於大距離神經斷損的治療效果。

EGT神經導管製備

本案EGT神經導管之製造材料選用1-乙基-3-(3-二甲氨基兩基)碳二亞胺(1-ethyl-3(3-dimethyl aminopropyl)-carbodimide,EDC)、明膠(Gelatin)以及三鈣磷酸鹽陶瓷粉末(Tricalcium phosphate,TCP)。

製備導管過程如下：首先將水浴槽加熱至60℃，取50 ml含有去離子水(deionized water)的離心管，將已秤重好的明膠粉末(Bloom number 300,Sigma,Saint Louis,MO)倒入，以製成18%明膠溶液，並將此明膠溶液的離心管放入置60℃的水浴槽中加熱，待明膠粉末溶解完全後，加入與明膠的重量比例為1：2之三鈣磷酸鹽(TCP；β-Tricalcium phosphate,Fluka #21218,Germany)陶瓷粉末至明膠溶液中，攪拌均勻後，以直徑1.2 mm之矽膠管(Helix Medical,Inc.,Carpinteria,CA)充當神經導管內徑，將矽膠管分別完全浸入明膠溶液以及含有三鈣磷酸鹽的明膠溶液中，再緩慢地筆直拉起，尚待風乾後，依照前述步驟重複3次。上述步驟完成後，等待材料完全風乾，隨即將包覆於矽膠管外部的導管材料浸泡於1%的EDC溶液(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)中，並於4℃溫度下進行交聯2天，之後將導管材料取出，以去離子水清洗殘餘的EDC交聯劑。最後將包覆於導管材料內的矽膠管取出，以形成中空狀之EGT神經導管，接著將此神經導管於室溫下風乾後，裁切成全長1.7 cm，並且將材料進行冷凍乾燥。冷乾之後的神經導管以25 kGy的⁶⁰Coγ-ray(中國生化公司，台中，臺灣)滅菌，並且將神經導管存放於電子防潮箱中，以備後續實驗之進行。

EGT神經導管之表面形態

神經導管的表面型態觀察，分為巨觀與微觀兩部份。巨視觀察部份，首先以肉眼直接觀察神經導管的顏色外觀、中空管徑是否貫穿神經導管以及神經導管的結構強度。微觀觀察部份，由於神經導管為不易導電基材，首先將冷凍乾燥後的神經導管材料黏貼於碳膠載檯上經表面鍍金(Model E-1010 Ion Sputter,Hitachi,Japan)以提高導電性，然後利用掃描式電子顯微鏡(SEM,Model S-3000N,Hitachi,Japan)觀察神經導管的表面型態，如神經導管之內、外管壁的表面光滑度，並進一步測量神經導管的內管直徑與管壁厚度等。

第一圖至第三圖為EGT神經導管表面型態之外觀圖、縱剖面圖、橫斷面圖。EGT神經導管包括一管狀本體10，其中心具有一貫穿該管狀本10兩端的通道11；第四圖至第六圖EGT神經導管的掃瞄式電子顯微鏡的微觀照片，呈現神經導管的橫切面、縱切面及外管壁。EGT神經導管之管內徑大約為1.2~1.3 mm，而管壁厚度大約為0.3 mm；由縱切面圖顯示神經導管的內管壁12表面平整且結構緻密，此平整的內管壁將有助於神經生長因子的傳遞與無礙於神經軸突的生長，有利於缺損神經的再生修復。EGT神經導管的外管壁13呈緻密的粗糙度，緻密的外管壁將可阻止其他外在其他細胞(如纖維母細胞)的侵入(infiltration)，進而避免阻礙神經軸突的生長。

EGT神經導管吸水率(Water uptake ratio)測試

將製備完成及冷凍乾燥後EGT神經導管，秤量導管材料的初始重量(W₀)，於室溫下將導管材料放入離心管中，並且加入3 ml去離子水中，分別浸泡3、6、12、24、48及72小時之後，將導管材料取出，擦拭導管材料外部與去除導管內部多餘水份後秤重，此為潤濕材料重(W_t)，最後利用下列公式計算於室溫下EGT神經導管浸泡於去離子水中不同時間之吸水率參數。

Water uptake ratio(△W%)=[(W_t-W₀)/W₀]×100%

測試結果顯示，3小時內EGT神經導管的膨潤速率約為33.3%/hr；浸泡72小時EGT神經導管其吸水率約99%左右，此結果亦顯示EGT神經導管為低吸水率。此外，雖然EGT神經導管之管壁吸水而造成膨潤，由肉眼巨觀觀察，顯示導管外觀與管狀結構皆保持堅固完整。

EGT神經導管體外酶降解試驗(In vitro enzymatic degradation test)

實驗方法為將EGT神經導管材料進行秤重(W₀)，然後將導管材料放入15 ml的離心管中，且每支離心管中加入每10 ml之PBS溶液裡含有20 U/mg的膠原蛋白酶(Collagenase,Sigma)，最後將導管材料置放於37℃恆溫培養箱裡，分別浸泡1、4、7、14、28、42天，再經過冷凍與乾燥各一天之後，再將各導管材料進行秤重(W_t)。利用下列公式計算神經導管浸泡於無菌PBS酶蛋白溶液不同時間的降解失重比率(Degradable weight loss ratio)，藉此可觀察神經導管在不同浸泡時段的降解失重比率之變化趨勢。

Degradable weightloss ratio(△W%)=[(W₀-W_t)/W₀]×100%。

實驗結果發現，當導管材料浸泡於第14天時，EGT神經導管的失重比率僅為6.07%，於第14至42天期間的浸泡，可以發現其降解失重比率有趨於平緩的現象，此結果顯示以EDC溶液作為交聯劑，可以有效地減緩導管材料於膠原蛋白酶溶液中的降解現象。當導管材料浸泡第42天時，EGT神經導管的降解失重比率6.74%，計算出的平均降解速率分別為0.16%/天。從上述實驗結果顯示EGT神經導管具有低的體外降解速率。神經導管浸泡於膠原蛋白酶溶液中42天之後，EGT神經導管外觀外觀仍保持完整的型態。由上述實驗結果可以推估EGT神經導管植入生物體內不至於因為酵素的攻擊而快速地崩解，進而失去作為神經修復導管的功能。

EGT神經導管機械性質分析

良好生物可降解性的導管材料需要具備優異的機械性質，將神經導管植入動物體內中，才不會被周圍的肌肉組織擠壓影響而造成神經修復困難。本實驗藉由動態機械分析儀(Dynamic Mechanical Analyzer,DMA)評估EGT神經導管材料的壓縮性質，實驗方法為將神經導管裁切全長約10 mm，利用動態機械分析儀在37℃下測試，在測試軟體中輸入導管材料的長度、導管內徑與導管壁厚，以利軟體計算壓縮等參數。

測試結果EGT神經導管的壓縮模數為2.34±0.03 MPa，此壓縮模式已足以應付植入動物體內承受肌肉擠壓力，因此EGT神經導管於植入動物體內後可提供良好的中空管腔，有利受損的神經再生修復。

外科手術

對實驗鼠施以麻醉及外科手術，將其左腳的坐骨神經以鈍性分離的方式，造成神經斷端的近端和遠端，近端和遠端相距約15 mm，以17 mm的EGT神經導管的兩端分別以手術縫線連接於神經斷端的近端和遠端。

雷射治療

將上述實驗鼠分為控制組以及雷射治療組，每組6隻。控制組施以假照射控制，雷射治療組施以低功率單點雷射。方式是沿著該斷損神經之近端和遠端設定兩個觸發點，在本實驗中觸發點的位置大約是在距離手術縫合傷口左右側相距2公分的位置，以經皮穿透方式照射低功率單點雷射，雷射光為磷化鎵鋁砷(GaAlAsP)二極體雷射，直接貼在上述的觸發點，波長為660 nm，功率為50 mW，雷射光束區域為0.1 cm²，為連續式光束，從術後第1天開始照射，每次照射時間為2分鐘，每天照射一次，連續10天。

實驗結果評估

為控制組和雷射治療組進行坐骨神經功能(SFI)分析、電生理評估(Electrophysiological evaluation)、組織學評估(Histological assessment)、免疫組織化學染色(immunohistochemical stain)，並將所得結果進行統計分析。

坐骨神經功能(SFI)分析

由於坐骨神經有控制動物後足行走的功能，坐骨神經功能指數(Sciatic function index,SFI)可以評估神經功能損傷後的修復情況。由未經坐骨神經截斷手術的正常後肢其SFI值為0，但神經完全損傷時的患側後肢其SFI值則為-100，其數值介於-60至-40之間時，表示其功能修復為中度良好；當坐骨神經功能指數恢復至-20時，則表示神經功能恢復情況良好。而SFI值越趨近於0，表示神經的修復情形愈佳，藉此測試可做為大鼠坐骨神經功能復原的評估指標之一。

本實驗將控制組與雷射治療組之實驗大鼠手術後的1、2、4、6、8、10、12週進行坐骨神經功能指數實驗，實驗設計為製作一個透明的走道，長80公分、寬10公分，終端遮住光線，形成直線且狹長無光的小徑。接著把白紙裁成60 cm×10 cm的長條形，平放於步道上，再將老鼠的左右兩隻後腳均勻沾上紅色印泥後，將老鼠置入步道上行走使其後腳的足跡印在白紙上。測試過程中，環境為安靜無聲使大鼠不受到干擾的留下足印，而坐骨神經功能指數的測量數據則取自這些足印。

藉由實驗大鼠的足印上可取得評估坐骨神經功能指數的數據，其足印可得到下列三個測量值：

(1)足跡的長度(Print length,PL)：從腳後跟到第三趾頭的距離。

(2)腳趾的伸展距離(Toe spread,TS)：第一趾頭和第五趾頭的距離。

(3)中間腳趾的伸展距離(Intermediary toe spread,ITS)：第二趾頭和第四趾頭的距離。

上述所有測量值，皆取自於大鼠的左腳實驗組(E)與右腳正常組(N)，而坐骨神經功能指數(SFI)的計算有三個重要的係數(PLF、TSF、ITF)須分別套入Bain-Mackinnon-Hunter公式，計算其坐骨神經功能指數(SFI)值。

坐骨神經功能指數三個重要係數為：

(一)足跡長度係數(PLF)=(EPL-NPL)/NPL。

(二)腳趾的伸展距離係數(TSF)=(ETS-NTS)/NTS。

(三)中間腳趾的伸展距離係數(ITF)=(EIT-NIT)/NIT。

將上述3個重要係數套入Bain-Mackinnon-Hunter公式為：SFI=-38.3×PLF+109.5×TSF+13.3×ITF-8.8。

表1顯示控制組及雷射治療組的實驗大鼠於術後十二週的神經功能恢復指數。由表中顯示控制組及雷射治療組的實驗大鼠於術後的坐骨神經功能指數(SFI)皆隨著神經修復期的增長而有逐漸地改善。實驗大鼠手術後其SFI值，分別從第二週的-91.63±1.50(控制組)、-90.42±1.93(雷射治療組)提升至第十二週的-71.27±2.14(控制組)、-67.94±2.14(雷射治療組)。此外，雷射治療組於每個植入時期的SFI值皆高於控制組，此結果顯示雷射治療組的神經功能恢復比控制組好。

複合肌肉動作電位(CMAP)測試

由於坐骨神經被切斷後，損傷修復需要經過相當長的時間，因此本實驗為手術後12週，以複合肌肉動作電位(Compound muscle action potential,CMAP)測試來評估神經軸突的生長情形。首先分離出實驗鼠附於脛骨之股二頭肌、腓腸肌以及附著於坐骨神經分支周圍之脂肪層，並以誘發電位儀(Neuropack Four Mini,Nihon Kohden Co,Japan)作為神經肌肉複合動作電位之誘發，其步驟如下：將誘發電位儀連接至DC電刺激器(ML856 Power Lab 26T,AD Instruments,Sydney,Australia)的刺激電極接至近端神經進行刺激，而接地電極則插入老鼠尾巴，以進行電生理檢測。刺激神經參數設定為：脈衝頻率4 Hz，強度200 mV及0.2 ms的脈衝持續時間，藉此參數來引發神經肌肉複合動作電位。而記錄電極則插入腓腸肌中，可藉由記錄腓腸肌的肌肉收縮而連接至誘發電位儀的電腦軟體(LabChart^®7,AD Instrument,Sydney,Australia)可顯示出神經肌肉複合動作電位的波形。

第七圖為實驗大鼠飼養十二週犧牲前使用CMAP結果。雷射治療組之恢復指數(peak amplitude)54.7±4.2高於控制組41.9±3.3，雷射治療組的恢復指數(area under the CMAP curve)47.1±3.0高於控制組37.5±4.4，顯示雷射治療組的神經功能恢復比控制組好

實驗大鼠之肌肉萎縮評估

實驗動物犧牲後，使用手術顯微鏡將每隻大鼠的左腳(手術側L)與右腳(未手術側R)之腓腸肌附近開刀，取下腓腸肌之後，立即進行秤重。每隻大鼠的腓腸肌重量比(手術側/未手術側，L/R)是按照下列公式計算：L/R=手術側的重量/未手術側的重量。

第八圖實驗結果顯示控制組L/R比為0.35±0.02，顯著地低於雷射治療組的0.49±0.05，此結果顯示雷射治療組比控制組更具有減緩腓腸肌肉萎縮的作用。

坐骨神經的再生

實驗大鼠術後十二週，直接將動物以過量麻醉犧牲，然後將神經連同EGT神經導管剪下，將控制組與雷射治療組兩組之實驗動物體內的EGT神經導管材料剝除後，可發現於截斷受損部位已有新生的神經組織。實驗結果觀察到具有神經髓鞘的軸突生長穿越了EGT神經導管的管道，以及軸突的發芽從神經遠端穿越過管腔進行神經修復。從型態學上觀察顯示，控制組與雷射治療組兩組的神經損傷修復相當良好，且雷射治療組顯示較控制組有更佳的軸突生長。

組織型態學評估

所有的實驗老鼠在做完坐骨神經功能指數及複合肌肉動作電位的記錄後，直接將動物以過量麻醉犧牲取出植入的人工神經導管。接著置入包埋盒並標上組別後，置入10%福馬林固定液，組織固定24小時後，接著以低濃度至高濃度酒精(50~100%)進行梯度脫水，隨即利用Spur樹脂包埋，並將含再生神經組織之樹脂置入60~70℃烤箱中約16小時，待樹脂硬化後，取包埋之再生神經組織作橫向2-4 μm切片。染色前再佐以溶蠟、脫蠟等水合步驟，然後進行HE組織染色後脫水並封片。

第九圖為控制組及雷射治療組在術後十二週之再生的神經組織的縱向部分。如第九圖(a)控制組可觀察到神經再生，第九圖(b)雷射治療組則有顯著的神經再生和線狀有序結構，神經組織更加緊密完整並具有連結性。從質量來看，雷射治療組的新生組織截斷面顯示了眾多的大的良好的髓鞘軸突以及密實的組織，這個結果表示雷射治療組加速改善了周邊神經損傷之修復。

免疫組織化學染色分析

大鼠飼養十二週後以手術剪取下包含EGT神經導管與略大於兩端縫合點的神經長約2公分的坐骨神經幹，將其置於標本瓶內，瓶內盛裝有4%福馬林(Paraformaldehyde)溶液。最後將浸泡過福馬林溶液的神經組織，置放於一個自製的鋁箔包裝盒內，包裝盒中倒入組織冷凍膠(Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature Compound,USA)，立即以液態氮急速冷凍，並置放於-20℃冰箱保存。經過低溫冷凍保存的組織檢體即可以進行冷凍切片。冷凍切片機溫度設定-25℃，切片厚度為10 μm，將切下的切片組織以載玻片黏起，將含有組織樣本的玻片浸泡於5%的牛奶溶在0.01 M之PBS溶液中，於室溫下反應30分鐘。取出後以PBS溶液清洗數次，分別加入Rabbit polyclonal antibodies against NGF(1：50,Epitomic,Burlingame,California)與Rabbit polyclonal anti-neurofilament(NF)(1：200,Chemicon,Billerica,USA)於4℃冰箱中反應至隔夜，再次以PBS溶液清洗數次，培養於Super PicTure ^TM Polymer Detection Kit(Invitrogen,Cat.No.87-8963,Carlsbad,CA,USA)室溫下20分鐘，以DAB與hematoxylin進行染色，再以PBS溶液清洗數次後，最後將切片利用封片膠封片，全程需避光處理，再以顯微鏡(Olympus IX-71,Inc,Trenton,NJ,USA)觀察並拍照記錄。

第十圖的螢光顯微照片顯示術後十二週的再生神經縱向部份。許旺氏細胞主要是周邊神經系統的膠質細胞。由於許旺氏細胞的功能為促進神經生長和分泌神經生長因子，故在神經之生長發育及再生修復上扮演非常重要角色。透過p75^NTR表現的NGF蛋白表示許旺細胞的存在。第十圖(a)再生的神經節段的縱向部分中觀察到的NGF信號。免疫組織結果表明，控制組有低量的NGF蛋白，這表示控制組有神經再生的現象，但神經再生恢復卻是有限的。但雷射治療組則表現了高量的NGF蛋白，此結果顯示雷射治療有促進神經再生的功能且也可以協調神經損傷的區域，形成一有利神經修復的微環境。神經絲蛋白(NF)亦為神經元和軸突的重要組成。如第十圖(b)控制組表現出淺色和間歇性的神經絲蛋白NF，這可能表明，神經再生的效果是在進步的。雷射治療組則表現出深色的、明顯的、連續的神經絲蛋白，十二週後，受損的神經組織已完全癒合。

髓鞘的神經再生評估

將神經檢體浸泡於4% Paraformaldehyde溶液中冷藏24小時，冷藏後以0.1 M磷酸緩衝液(phosphate-buffered saline,PBS)清洗，再以1%鋨酸(Sigma,O5500,Saint Louis,MO,USA)浸泡固定，最後將檢體以梯度脫水的方式進行石蠟包埋。經過處理及包埋後的神經組織，以切片機將神經組織切片，厚度為4 μm，於正立式光學顯微鏡下觀察到導管中段及自體移植組切片染色結果並拍照記錄，以比較各組神經中段修復情形。神經組織的切片染色結果，以Image Pro^® Plus計算神經中斷面積、神經纖維直徑、神經纖維數目、軸突直徑與髓鞘厚度等參數。

第十一圖為利用光學顯微鏡拍攝大鼠術後十二週橫截面的再生神經組織。利用光學顯微鏡可以清楚地定性分析控制組與雷射治療組的差異。第十一圖(a)為控制組，髓鞘神經纖維密度較低且較不明顯。第十一圖(b) 為雷射治療組在導管材料植入部位的神經中段裡，則有較厚的髓鞘神經纖維產生。從光學顯微鏡更高的倍率觀看，可以觀察到許多神經纖維正在發育逐漸形成具髓鞘化神經。使用雷射治療大鼠的再生神經組織裡的髓鞘纖維神經大量分布於神經束裡。高放大倍率可以清楚地看見較厚的髓鞘直徑與導管植入神經中段部位有新生血管的分佈，此結果顯示血管的生成為新生神經組織再生的過程。由上述的定性分析結果顯示雷射治療組的再生神經組織有較多的髓鞘數目，髓鞘也生成較為完整且也有較緻密的組織型態。

表2為定量分析控制組與雷射治療組再生神經組織差異。所有測得再生神經組織的實驗數據中，雷射治療組顯著地高於控制組(P<0.05)。除此之外，雷射治療組在神經纖維的數目、神經纖維與軸突直徑以及髓鞘厚度等也較控制組再生修恢復的更好。定量分析結果顯示接受低功率單點雷射治療的實驗大鼠，在缺損神經的再生修復比未接受雷射治療組來得好。上述實驗結果顯示周邊神經損傷若輔以低功率單點雷射光治療，將可促進與增進神經組織的再生修復。

結論

本案以低功率單點雷射做為神經再生的刺激源，使神經透過EGT神經導管而再生。生物學作用可能是基於以下原因：(一)光動力作用於細胞膜，使細胞內鈣質增加，刺激細胞更新。(二)與神經和肌肉生長有關的關鍵物質銅-鋅超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)因雷射光之作用而產生復活作用。(三)一氧化氮的金屬複合物經光分解作用釋放而使血管擴張。(四)刺激許旺細胞，以提高神經管形成。(五)激活神經營養因子，加快軸漿產生。(六)增量形成新血管，供應充足營養和氧氣。

本案採用之低功率單點雷射，是以該斷損神經之近端和遠端為觸發點，以經皮穿透方式照射磷化鎵鋁砷(GaAlAsP)二極體雷射，波長為660 nm，功率為50 mW，雷射光束區域為0.1 cm²，為連續式光束，從術後第1天開始照射，每次照射時間為2分鐘，每天照射一次，連續10天。

本案採用1-乙基-3-(3-二甲氨基兩基)碳二亞胺(1-ethyl-3(3-dimethyl aminopropyl)-carbodimide,EDC)、交聯明膠(Gelatin)並添加三鈣磷酸鹽陶瓷粉末(Tricalcium phosphate,TCP)製成EGT神經導管。將EGT神經導管植入實驗鼠的坐骨神經斷端。實驗動物隨機分為2個組別，第一組為未接受雷射治療之控制組(EGT)；第二組為接受雷射治療(EGT/Laser)的雷射治療組，於術後八週比較兩組實驗大鼠的巨視觀察、坐骨神經功能指數分析、複合肌肉動作電位測試以及組織切片型態評估。

實驗結果顯示雷射治療組無論在體重的增加比率、毛髮的色澤與濃密度以及手術傷口的恢復皆比對照組來得好；接著由步跡的分析結果顯示兩組實驗老鼠於神經接合手術後的坐骨功能指數(SFI)，皆隨著神經修復時間的增長而顯著地改善，而且每一個植入時期的SFI值，雷射治療組皆高於控制組組，特別於手術後的第4、6、8週時，兩組的SFI值具有顯著的差異存在(P<0.05)。由電生理檢測之神經肌肉複合動作電位(CMAP)的振幅與神經傳導速率進行比較，亦顯示雷射治療組皆顯著地高於控制組(P<0.05)。最後由組織切片之再生神經組織進行觀察，也都顯示雷射治療組無論是在再生神經組織型態、血管增生與神經內外膜型態等定性觀察或是再生神經纖維密度、軸突直徑、再生神經髓鞘化厚度、再生神經組織面積等量化數據皆優於控制組。

因此由上述實驗結果顯示利用磷化鎵鋁砷(GaAlAsP)二極體雷射的生物刺激理論，經由外部皮膚之單點照射於EGT神經導管的植入部位，確實有加速神經再生修復的效果，且本發明之方法可修復15 mm大斷距之斷損神經。

10‧‧‧神經導管

11‧‧‧通道

12‧‧‧內管壁

13‧‧‧外管壁

第一圖本案EGT神經導管之立體外觀圖。

第二圖本案EGT神經導管之縱剖面圖。

第三圖為本案EGT神經導管之橫斷面圖。

第四圖為本案EGT神經導管表面型態之SEM微觀照片(一)。

第五圖為本案EGT神經導管表面型態之SEM微觀照片(二)。

第六圖為本案EGT神經導管表面型態之SEM微觀照片(三)。

第七圖為本案實驗大鼠飼養十二週犧牲前複合肌肉動作電位(CMAP)測試結果。

第八圖為本案實驗大鼠之肌肉萎縮評估圖。

第九圖為控制組及雷射治療組在術後十二週之再生的神經組織的H&E染色縱剖面圖。

第十圖為術後十二週的再生神經縱向部份的螢光顯微照片。

第十一圖為光學顯微鏡拍攝大鼠術後十二週橫截面的再生神經組織影像。

Claims

一種結合低功率單點雷射與可降解性神經導管以促進截斷周邊神經之再生修復方法，包括：將一具有生物降解性之神經導管的兩端連接於一斷損之週邊神經之近端和遠端；以該斷損神經之近端和遠端為激發點，於該二激發點分別以經皮穿透方式照射低功率單點雷射；雷射光波長為660 nm、功率為50 mW，雷射光束區域為0.1 cm²，為連續式光束。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該雷射光為磷化鎵鋁砷(GaAlAsP)二極體雷射。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，每次照射時間為2分鐘，每天照射一次，連續10天。