TW201343917A - 聚合酶連鎖反應的量測方法 - Google Patents

Abstract

一種聚合酶連鎖反應的量測方法，係先將一含有螢光物質的反應樣品置入於一反應試管並加熱，接著取得反應試管的一第一溫度並進行螢光量測而取得一第一螢光值，而後進行聚合酶反應，最後進行量測步驟，其利用溫度控制使反應試管達到一第二溫度，再次量測該反應試管內因該螢光物質所發出之螢光，並取得一第二螢光值，其中，該第二溫度與該第一溫度之差異不超過攝氏5度。本發明藉由控制反應後的該第二溫度與該第一溫度不超過攝氏5度，而可避免該螢光物質因為溫度變化而有螢光值量測不準確，進而造成該反應樣品之反應數量的判斷誤差的問題。

Description

聚合酶連鎖反應的量測方法

    本發明係有關一種量測方法，尤指一種聚合酶連鎖反應的量測方法。

    以聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)擴增特定核酸序列，如去氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid, DNA）等，為目前相當成熟的技術，其為醫學及生物技術之重要技術，其反應過程主要有三個階段：「變性反應（Denaturation）」、「引子黏和反應（Primer Annealing）」以及「延展反應（Extension）」，其中這三個階段所需要的反應溫度皆不相同。現今商業化之PCR設備，所需反應樣本包含欲擴增之模板DNA、與模板DNA各股上特定序列互補之寡核苷酸引子對、熱安定性DNA聚合酶、以及去氧核苷三磷酸(dNTP)。PCR設備藉由反覆加熱與冷卻反應樣本，使反應樣本在三種不同溫度間循環，藉以擴增模板DNA核酸序列之特定部分。

    PCR第一個步驟為變性反應，其為將反應樣本加熱至高溫，以讓雙股之模板DNA分離成為單股DNA，典型地變性反應之溫度為介於90℃至95℃之範圍。

    PCR第二個步驟為引子結合反應，其為先將分離成為單股DNA的反應樣本冷卻至較低溫度，以讓引子與第一個步驟形成之單股DNA結合，而形成DNA與引子之複合物，典型地引子結合反應之溫度係依據所用引子之解鏈溫度(melting temperature, Tm)而選擇，通常介於35℃至65℃之範圍。

    PCR第三個步驟為延展反應，其為將形成DNA與引子的複合物的反應樣本維持於適當溫度，藉由DNA聚合酶的作用，使引子得以延展，形成與模板DNA各股互補的新單股DNA，典型聚合反應之溫度為72℃。

    因此由上述三階段組成的每一次循環，可以複製兩倍的模板DNA，將包含變性反應、引子結合反應及延展反應等三個溫度各異之步驟的PCR循環重複約20至40次，可生產出數百萬個標的核酸序列之複製物。

    而目前PCR技術中發展出一較低成本且製程簡易的隔絕式恆溫核PCR(ii PCR)技術，其係將一反應樣本裝填入圓形的毛細管中，藉由加熱器與冷卻裝置的作用，於該毛細管內形成循環流動。因此毛細管各區域具不同的溫度，而當反應樣本在各區域間循環時，PCR的三個步驟可依序並重複地發生。而於反應過程中，為了量測反應前之DNA數量以及反應後的DNA數量之差異，以瞭解反應過程的情況以及反應速率等情形，一般會於毛細管內一併添加螢光物質，而藉由量測與DNA之數量成正比相關的螢光物質便可快速的得知DNA在PCR反應中的反應情形。請配合參閱「圖1」所示，經過發明人多次實驗之結果，發現螢光物質會隨著溫度的變化而使量測到的螢光值發生變化，如第一螢光物質所代表的第一螢光曲線1，其在攝氏60度時達到最大發光螢光值，接著隨著溫度增高而螢光值漸減；但第二螢光物質所代表的第二螢光曲線2，其在攝氏70度時達到最大發光螢光值，但之後便不隨著溫度增高而有顯著的螢光變化。由此可知，不同的螢光物質便會隨著溫度而有不同的變化，且單一螢光物質在溫度不同時，也會有不同的螢光值變化。造成在PCR反應前後之螢光值變化並非僅以DNA之數量變化為應變變因，而有可能因為溫度差異影響螢光值，造成量測數據不準確的問題。

    本發明之主要目的，在於解決螢光物質因為溫度變化造成量測數據不準確的問題。

    為達上述目的，本發明提供一種聚合酶連鎖反應的量測方法，包含有以下步驟：

    一準備步驟，將一含有一螢光物質的反應樣品置入一反應試管；

    一取樣步驟，取得該反應試管的一第一溫度，並量測該反應試管內因該螢光物質所發出的螢光，以取得一第一螢光值；

    一聚合酶反應步驟，藉由控制該反應試管之溫度而使該反應試管內的反應樣品進行連鎖反應；及

    一量測步驟，控制該反應試管於一第二溫度，並再次量測該反應試管內因該螢光物質所發出之螢光，並取得一第二螢光值，其中，該第二溫度與該第一溫度之差異不超過攝氏5度。

    由上述說明可知，本發明藉由控制經過聚合酶反應後的該第二溫度相同或接近於該第一溫度，避免螢光物質因為溫度改變而有螢光值變化的問題，藉此取得準確的螢光值而正確估測經過聚合酶連鎖反應後的DNA數量，減少因螢光值不準確產生的DNA數量誤判情形。

    有關本發明之詳細說明及技術內容，現就配合圖式說明如下：

   請參閱「圖2」、「圖3」、「圖4」及「圖5」所示，本發明係為一種聚合酶連鎖反應的量測方法，在說明本發明之量測方法之前，先行說明利用本發明之方法的機構，其包含有一底座10、一與該底座10連接的加熱座20、一與該加熱座20連接的輔助加熱件30、至少一反應試管40、一固定該反應試管40於該輔助加熱件30上的固定連接座50，以及一觀測模組60。該底座10包含有一光源11（於本實施例中為發光二極體），其用以照射容置於該反應試管40中的一含有螢光物質的反應樣品，並將螢光物質反應之光線送至該觀測模組60以進行後續分析，該加熱座20內包含有一主要加熱件21。本發明之量測方法包含有以下步驟：

    S1：一準備步驟，將該反應試管40的一端固定於該加熱座20上，其中該主要加熱件21之位置對應該反應試管40的一底部41，且該輔助加熱件30與該主要加熱件21間隔一距離而對應至該反應試管40的一中間段42，而為了加強加熱的效果，該反應試管40的底部41圈繞有一高導熱件80，而使該反應試管40透過該高導熱件80與該主要加熱件21接觸。該輔助加熱件30於本實施例中為鋁材質，可透過鋁擠形的方式製成，且透過一與該輔助加熱件30連接之溫度控制裝置70控制該輔助加熱件30之加熱溫度。除此之外，為了避免外界溫度的干擾，請配合參閱「圖6」所示，於準備步驟中更包含有一封閉步驟S1A：將該反應試管40、該加熱座20及該輔助加熱件30設置於一封閉殼體90內。

    S2：一取樣步驟，取得該反應試管40的一第一溫度，並量測該反應試管40內因該螢光物質所發出的螢光，以取得一第一螢光值，更詳細的說明，其控制該主要加熱件21以及該輔助加熱件30於該第一溫度，而後藉由該觀測模組60先進行該第一螢光值的取得並記錄，其中該第一溫度係可依據該螢光物質隨溫度變化的螢光值而設定，較佳地，係可選擇自螢光值變化較為平穩的溫度範圍。

    S3：一反轉錄步驟，需說明的是，當該反應樣品為一核糖核酸（Ribonucleic Acid, RNA）樣品時才需要進行本步驟，若該反應樣品已經為去氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid, DNA）樣品，則可跳過本步驟進行下一階段。本步驟為使該加熱座20之主要加熱件21維持在一起始溫度，使該核糖核酸樣品轉換為去氧核糖核酸樣品，該起始溫度介於45℃至55℃之間。

    S4：一聚合酶反應步驟，藉由控制該反應試管40之溫度而使該反應試管40內的反應樣品進行連鎖反應，更詳細的說明，於聚合酶反應步驟中，更包含有兩步驟：

    S4A：一加溫步驟，提升該加熱座20之主要加熱件21的溫度至一變性溫度，另外，使該輔助加熱件30升溫至一輔助加熱溫度，該輔助加熱溫度小於該變性溫度，其中變性溫度介於90℃～98℃之間，該輔助加熱溫度介於40℃～50℃之間。

    S4B：一連鎖反應步驟，控制該加熱座20維持於該變性溫度，以進行連鎖反應，更進一步的說明，其係控制該主要加熱件21維持於該變性溫度，並控制該輔助加熱件30維持於該輔助加熱溫度，以利連鎖反應的進行，而可於該反應試管40的不同位置進行變性反應、引子黏和反應以及延展反應。

    S5：一量測步驟，控制該反應試管40於一第二溫度，並再次藉由該觀測模組60量測該反應試管40內因該螢光物質所發出之螢光，並取得一第二螢光值，其中，該第二溫度與該第一溫度之差異不超過攝氏5度，較佳的，該第一溫度與該第二溫度之差異不超過攝氏2度，藉此避免因溫度差異所造成的螢光值不同。

    而本發明更具有一步驟S6：一比較步驟，比較該第一螢光值與該第二螢光值之數值，而取得該反應樣品經過連鎖反應後的差異變化。

    綜上所述，由於本發明藉由控制經過連鎖反應後的該第二溫度相同或接近於該第一溫度，避免螢光物質因為溫度改變而有螢光值變化的問題，藉此取得準確的螢光值而正確估測經過聚合酶連鎖反應後的DNA數量，減少因螢光值不準確產生的DNA數量誤判情形。更精確的，控制該第一溫度與該第二溫度之差異不超過攝氏2度。除此之外，本發明亦利用該主要加熱件以及該輔助加熱件之設置而分別控制該反應試管的底部以及中間段的溫度，藉此使該反應試管內之反應樣品於穩定的溫度控制中進行變性反應、引子黏和反應以及延展反應，以增加聚合酶連鎖反應的速度。

    因此本發明極具進步性及符合申請發明專利之要件，爰依法提出申請，祈鈞局早日賜准專利，實感德便。
以上已將本發明做一詳細說明，惟以上所述者，僅爲本發明之一較佳實施例而已，當不能限定本發明實施之範圍。即凡依本發明申請範圍所作之均等變化與修飾等，皆應仍屬本發明之專利涵蓋範圍內。

1．．．第一螢光曲線

2．．．第二螢光曲線

10．．．底座

11．．．光源

20．．．加熱座

21．．．主要加熱件

30．．．輔助加熱件

40．．．反應試管

41．．．底部

42．．．中間段

50．．．固定連接座

60．．．觀測模組

70．．．溫度控制裝置

80．．．高導熱件

90．．．封閉殼體

S1~S6、S1A、S4A、S4B．．．步驟

圖1，為螢光物質隨溫度變化之螢光值曲線示意圖。

圖2，為本發明一較佳實施例之步驟流程示意圖。

圖3，為本發明一較佳實施例之立體結構示意圖。

圖4，為本發明一較佳實施例之部分立體分解示意圖。

圖5，為本發明一較佳實施例之局部剖面示意圖。

圖6，為本發明一較佳實施例之殼體裝設示意圖。

S1~S6、S1A、S4A、S4B．．．步驟

Claims (12)

1. 一種聚合酶連鎖反應的量測方法，包含有以下步驟：
   一準備步驟，將一含有一螢光物質的反應樣品置入一反應試管；
   一取樣步驟，取得該反應試管的一第一溫度，並量測該反應試管內因該螢光物質所發出的螢光，以取得一第一螢光值；
   一聚合酶反應步驟，藉由控制該反應試管之溫度而使該反應試管內的反應樣品進行連鎖反應；及
   一量測步驟，控制該反應試管於一第二溫度，並再次量測該反應試管內因該螢光物質所發出之螢光，並取得一第二螢光值，其中，該第二溫度與該第一溫度之差異不超過攝氏5度。
2. 如申請專利範圍第1項所述之聚合酶連鎖反應的量測方法，其中於準備步驟中，其係將該反應試管的一端固定於一加熱座上。
3. 如申請專利範圍第2項所述之聚合酶連鎖反應的量測方法，其中於準備步驟中，使該加熱座內之一主要加熱件之位置對應該反應試管的一底部，且將一輔助加熱件與該主要加熱件間隔一距離而對應至該反應試管的一中間段。
4. 如申請專利範圍第3項所述之聚合酶連鎖反應的量測方法，其中於準備步驟中更包含有一封閉步驟：將該反應試管、該加熱座以及該輔助加熱件設置於一封閉殼體內。
5. 如申請專利範圍第3項所述之聚合酶連鎖反應的量測方法，其中該聚合酶反應步驟中更包含有兩步驟：
   一加溫步驟，提升該加熱座之溫度並加熱至一變性溫度；以及
   一連鎖反應步驟，控制該加熱座維持於該變性溫度，以進行連鎖反應。
6. 如申請專利範圍第5項所述之聚合酶連鎖反應的量測方法，其中於該加溫步驟中，使該輔助加熱件升溫至一輔助加熱溫度，該輔助加熱溫度小於該變性溫度。
7. 如申請專利範圍第6項所述之聚合酶連鎖反應的量測方法，其中該輔助加熱溫度介於40℃～50℃之間。
8. 如申請專利範圍第5項所述之聚合酶連鎖反應的量測方法，其中該變性溫度介於90℃～98℃之間。
9. 如申請專利範圍第2項所述之聚合酶連鎖反應的量測方法，其中該反應樣品為一核糖核酸樣品，且於該取樣步驟及該聚合酶反應步驟之間更具有一反轉錄步驟：使該加熱座維持在一起始溫度，並使該核糖核酸樣品轉換為一去氧核糖核酸樣品。
10. 如申請專利範圍第9項所述之聚合酶連鎖反應的量測方法，其中該起始溫度介於45℃至55℃之間。
11. 如申請專利範圍第1項所述之聚合酶連鎖反應的量測方法，其中該第一溫度與該第二溫度之差異不超過攝氏2度。
12. 如申請專利範圍第1項所述之聚合酶連鎖反應的量測方法，其中在量測步驟之後，更具有一比較步驟，比較該第一螢光值與該第二螢光值之數值，而取得該反應樣品經過連鎖反應後的差異變化。