TW201325622A - 基於肽之活體內ｓｉＲＮＡ傳遞系統 - Google Patents

Abstract

本發明係針對用於在活體內將RNA干擾(RNAi)聚核苷酸靶向傳遞至肝細胞的組合物。靶向RNAi聚核苷酸係與聯合靶向之蜂毒素傳遞肽一起投與。傳遞肽提供用於將該等RNAi聚核苷酸自該細胞外部移動至該細胞內部的膜滲透功能。可逆修飾法提供對該等傳遞肽之生理反應。

Description

基於肽之活體內siRNA傳遞系統

聚核苷酸及其他實質上細胞膜不可滲透性化合物向活細胞中之傳遞高度受限於細胞之複雜膜系統。用於反義、RNAi及基因療法中之藥物為相對大之親水性聚合物且常帶較大負電荷。此兩個物理特徵均嚴格限制其跨細胞膜直接擴散。出於此原因，聚核苷酸傳遞之主要障礙為聚核苷酸跨細胞膜向細胞質或細胞核傳遞。

曾用於活體內傳遞小核酸之一種手段已將核酸連接於小靶向分子或者脂質或固醇。儘管用此等結合物已觀測到某些傳遞及活性，但利用此等方法所需要的極大核酸劑量係不切實際的。

亦已開發出在活體外達成將聚核苷酸相當高效地傳遞至細胞中之眾多轉染試劑。然而，使用此等相同轉染試劑在活體內傳遞聚核苷酸很複雜且因活體內毒性、不利的血清相互作用或不良靶向而變得無效。在活體外良好起作用之轉染試劑、陽離子聚合物及脂質通常形成大的陽離子靜電粒子且使細胞膜不穩定化。活體外轉染試劑之正電荷有助於經由電荷-電荷(靜電)相互作用與核酸締合，由此形成核酸/轉染試劑複合物。正電荷亦有益於載體非特異性結合細胞且有益於膜融合、不穩定化或破裂。膜之不穩定化有助於實質上細胞膜不可滲透性聚核苷酸跨細胞膜傳遞。儘管此等性質有助於活體外核酸轉移，但其會在活體內引起毒性及無效靶向。陽離子電荷導致與血清組份相互作用， 引起聚核苷酸-轉染試劑相互作用之不穩定化、不良生物可用性及不良靶向。在活體外可有效之轉染試劑的膜活性常常在活體內導致毒性。

對於活體內傳遞，載體(核酸及相關傳遞劑)應較小，直徑小於100 nm且較佳小於50 nm。小於20 nm或小於10 nm之甚至更小之複合物將更有用。大於100 nm之傳遞載體在活體內極少達到除血管細胞以外之細胞。藉由靜電相互作用形成之複合物在曝露於生理鹽濃度或血清組份時傾向於聚集或分開。此外，活體內傳遞載體上之陽離子電荷導致不利的血清相互作用且因此導致不良生物可用性。有趣的是，高負電荷亦可藉由干擾供靶向所必需之相互作用(亦即靶向配位體結合於細胞受體)來抑制靶向活體內傳遞。因此，活體內分佈及靶向需要接近中性之載體。在不仔細調控的情況下，當活體內使用時，膜破裂或不穩定化活性係有毒的。在活體外比在活體內更易於平衡載體毒性與核酸傳遞。

Rozema等人在美國專利公開案20040162260中說明一種可逆調控膜活性聚胺之膜破裂活性之手段。該膜活性聚胺提供一種使細胞膜破裂之手段。pH值依賴性可逆調控提供一種限制進入靶細胞核內體之活性、由此限制毒性的手段。其方法依賴於用2-丙酸-3-甲基順丁烯二酸酐修飾聚胺上之胺。

此修飾經由將一級胺轉化成數對羧基(β羧基及γ羧基)來使聚陽離子轉化成聚陰離子且可逆地抑制聚胺之膜活性。Rozema等人(Bioconjugate Chem.2003,14,51-57)報導，β羧基不展現完全的表觀負電荷且無法獨自抑制膜活性。據報導，添加γ羧基為有效抑制膜活性所必需的。為能夠進行核酸與傳遞載體之共傳遞，將核酸共價連接於傳遞聚合物。使用其生物不穩定之結合物傳遞系統，其能夠顯示在活體外將聚核苷酸傳遞至細胞中。然而，因為在核酸與經修飾聚合物兩者均具有高負電荷密度之情況下，載體帶高負電荷，所以此系統不可高效進行活體內傳遞。負電荷可能抑制細胞特異性靶向且增強由網狀內皮系統(RES)進行之非特異性攝取。

Rozema等人在美國專利公開案20080152661中藉由消除經修飾膜活性聚合物之高負電荷密度而改良了美國專利公開案20040162260之方法。藉由用中性親水性靶向性(半乳糖)及空間穩定性(PEG)基團取代2-丙酸-3-甲基順丁烯二酸酐之γ羧基，Rozema等人能夠保留總體水溶性及對膜活性之可逆抑制，同時併入有效活體內肝細胞靶向。如以前一樣，聚核苷酸共價連接於轉染聚合物。維持聚核苷酸與轉染聚合物之共價連接以藉由防止聚核苷酸自轉染聚合物解離來確保在活體內投與期間，聚核苷酸與轉染聚合物共傳 遞至靶細胞中。需要聚核苷酸與轉染聚合物之共傳遞，係因為提供轉染聚合物用於聚核苷酸自細胞外部或自內飲區室內部至細胞質之跨細胞膜轉運。美國專利公開案20080152661說明使用此新穎之經改良生理反應性聚結合物，可在活體內將聚核苷酸，詳言之RNAi寡核苷酸高效傳遞至肝臟細胞中。

然而，核酸與聚胺之共價連接具有固有侷限。修飾轉染聚合物以連接核酸與掩蔽劑兩者因電荷相互作用而變得複雜。帶負電荷核酸與帶正電荷聚合物之連接傾向於聚集，藉此限制混合物之濃度。聚集可藉由存在過量聚陽離子或聚陰離子來克服。然而，此解決方案限制了所能調配之核酸與聚合物之比率。此外，帶負電荷核酸連接於未經修飾之陽離子聚合物上導致複合物之縮合及聚集且抑制聚合物修飾。形成帶負電荷聚合物之聚合物修飾損害了核酸之連接。

Rozema等人在美國臨時申請案61/307,490中進一步改良了美國專利公開案20080152661中所述之技術。在美國臨時申請案61/307,490中，Rozema等人說明，藉由仔細選擇靶向分子，且將適當靶向分子獨立地連接於siRNA與傳遞聚合物兩者，可使siRNA及傳遞聚合物解偶合，但仍保留兩種成分在活體內對於細胞之有效靶向且達成siRNA之高效功能性靶向傳遞。美國專利公開案20080152661與美國臨時申請案61/307,490兩者中使用之傳遞聚合物均為相對大之合成聚合物，聚(乙烯基醚)及聚(丙烯酸酯)。較大聚 合物能夠用供細胞特異性結合之靶向配位體與供增加遮蔽之PEG兩者來修飾。較大聚合物為可能經由增加膜活性及改良對細胞核內體內之核酸之保護進行有效傳遞所必需的。較大聚陽離子更強烈地與膜及與陰離子型RNA相互作用。

吾等現已開發出一種使用小得多的傳遞肽之改良siRNA傳遞系統。該改良系統提供毒性減小且因此治療窗較寬之高效siRNA傳遞。

在一較佳實施例中，本發明之特徵在於一種用於在活體內將RNA干擾聚核苷酸傳遞至肝臟細胞中之組合物，其包含：a)脫唾液酸醣蛋白(asialoglycoprotein)受體(ASGPr)靶向之可逆掩蔽的蜂毒素(melittin)肽(傳遞肽)及b)與含有至少20個碳原子之疏水性基團結合之RNA干擾聚核苷酸(RNA結合物)。傳遞肽及siRNA結合物係分別合成且可供應於各別容器或單一容器中。RNA干擾聚核苷酸不與傳遞肽結合。

在另一較佳實施例中，本發明之特徵在於一種用於在活體內將RNA干擾聚核苷酸傳遞至肝臟細胞中之組合物，其包含：a)ASGPr靶向之可逆掩蔽的蜂毒素肽(傳遞肽)及b)與半乳糖簇結合之RNA干擾聚核苷酸(RNA結合物)。傳遞肽及siRNA結合物係分別合成且可供應於各別容器或單一容器中。RNA干擾聚核苷酸不與聚合物結合。

在一較佳實施例中，ASGPr靶向之可逆掩蔽的蜂毒素肽 包含藉由使該肽上之一級胺與含有ASGPr配位體之掩蔽劑反應來可逆修飾之蜂毒素肽。若修飾基團之裂解使胺恢復，則該胺係經可逆修飾。用本文所揭示之掩蔽劑可逆修飾蜂毒素肽可逆地抑制蜂毒素肽之膜活性。在經掩蔽狀態下，可逆掩蔽之蜂毒素肽不展現膜破裂活性。抑制膜活性且提供細胞靶向功能需要可逆修飾蜂毒素肽上超過80%或大於90%之胺，亦即形成可逆掩蔽之蜂毒素肽。

一種含有ASGPr配位體之較佳掩蔽劑具有中性電荷且包含具有雙取代之順丁烯二酸酐胺反應性基團之半乳糖胺或半乳糖胺衍生物。另一含有ASGPr配位體之較佳掩蔽劑包含具有肽酶可裂解之二肽-對醯胺基苯甲基胺反應性碳酸酯衍生物之半乳糖胺或半乳糖胺衍生物。胺反應性碳酸酯與胺之反應可逆地修飾該胺以形成醯胺基苯甲基胺基甲酸酯鍵聯。

在一較佳實施例中，蜂毒素肽包含小蜜蜂(Apis florea)(小蜜蜂(little honey bee)或矮蜜蜂(dwarf honey bee))蜂毒素、義大利蜂(Apis mellifera)(西方蜜蜂(western honey bee)或歐洲蜜蜂(European honey bee)或者大蜜蜂(big honey bee))、大蜜蜂(Apis dorsata)(大蜜蜂(giant honey bee))、中華蜜蜂(Apis cerana)(東方蜜蜂(oriental honey bee))或其衍生物。較佳蜂毒素肽包含序列：Xaa₁-xaa₂-Xaa₃-Ala-Xaa₅-Leu-Xaa₇-Val-Leu-Xaa₁₀-Xaa₁₁-Xaa₁₂-Leu-Pro-Xaa₁₅-Leu-Xaa₁₇-Xaa₁₈-Trp-Xaa₂₀-Xaa₂₁-Xaa₂₂-Xaa₂₃-Xaa₂₄-Xaa₂₅-Xaa₂₆，其中： Xaa₁為白胺酸、D-白胺酸、異白胺酸、正白胺酸、酪胺酸、色胺酸、纈胺酸、丙胺酸、二甲基甘胺酸、甘胺酸、組胺酸、苯丙胺酸或半胱胺酸，Xaa₂為異白胺酸、白胺酸、正白胺酸或纈胺酸，Xaa₃為甘胺酸、白胺酸或纈胺酸，Xaa₅為異白胺酸、白胺酸、正白胺酸或纈胺酸，Xaa₇為離胺酸、絲胺酸、天冬醯胺、丙胺酸、精胺酸或組胺酸，Xaa₁₀為丙胺酸、蘇胺酸或白胺酸，Xaa₁₁為蘇胺酸或半胱胺酸，Xaa₁₂為甘胺酸、白胺酸或色胺酸，Xaa₁₅為蘇胺酸或丙胺酸，Xaa₁₇為異白胺酸、白胺酸、正白胺酸或纈胺酸，Xaa₁₈為絲胺酸或半胱胺酸，Xaa₂₀為異白胺酸、白胺酸、正白胺酸或纈胺酸，Xaa₂₁為離胺酸或丙胺酸，Xaa₂₂為天冬醯胺或精胺酸，Xaa₂₃為離胺酸或丙胺酸，Xaa₂₄為精胺酸或離胺酸，Xaa₂₅為離胺酸、丙胺酸或麩醯胺酸，Xaa₂₆為視情況選用的且若存在，則為麩醯胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸-NH₂或半胱胺酸-NH₂；且，且Xaa₂₁、Xaa₂₃及Xaa₂₅中之至少兩者為離胺酸。

更佳蜂毒素包含序列：Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Ala-Xaa₅-Leu- Xaa₇-Val-Leu-Xaa₁₀-Xaa₁₁-Xaa₁₂-Leu-Pro-Xaa₁₅-Leu-Xaa₁₇-Ser-Trp-Xaa₂₀-Lys-Xaa₂₂-Lys-Arg-Lys-Xaa₂₆，其中：Xaa₁為白胺酸、D-白胺酸、正白胺酸或酪胺酸，Xaa₂為異白胺酸、白胺酸、正白胺酸或纈胺酸，Xaa₃為甘胺酸、白胺酸或纈胺酸，Xaa₅為異白胺酸、纈胺酸、白胺酸或正白胺酸，Xaa₇為離胺酸、絲胺酸、天冬醯胺、丙胺酸、精胺酸或組胺酸，Xaa₁₀為丙胺酸、蘇胺酸或白胺酸，Xaa₁₁為蘇胺酸或半胱胺酸，Xaa₁₂為甘胺酸、白胺酸或色胺酸，Xaa₁₅為蘇胺酸或丙胺酸，Xaa₁₇為異白胺酸、白胺酸或正白胺酸，Xaa₂₀為異白胺酸、白胺酸或正白胺酸，Xaa₂₂為天冬醯胺或精胺酸，且Xaa₂₆為麩醯胺酸或半胱胺酸。

最佳蜂毒素包含序列：Xaa₁-Xaa₂-Gly-Ala-Xaa₅-Leu-Lys-Val-Leu-Ala-Xaa₁₁-Gly-Leu-Pro-Thr-Leu-Xaa₁₇-Ser-Trp-Xaa₂₀-Lys-Xaa₂₂-Lys-Arg-Lys-Xaa₂₆，其中：Xaa₁、Xaa₂、Xaa₅、Xaa₁₇及Xaa₂₀獨立地為異白胺酸、白胺酸或正白胺酸，Xaa₁₁為蘇胺酸或半胱胺酸，Xaa₂₂為天冬醯胺或精胺酸，且Xaa₂₆為麩醯胺酸或半胱胺酸。

較佳掩蔽劑包含中性親水性雙取代烷基順丁烯二酸酐： 其中R1包含細胞靶向基團。較佳烷基為甲基或乙基。較佳靶向基團包含脫唾液酸醣蛋白受體配位體。經取代之烷基順丁烯二酸酐之一實例由2-丙酸-3-烷基順丁烯二酸酐衍生物組成。藉由經2-丙酸-3-烷基順丁烯二酸酐γ-羧基將中性親水性基團連接於2-丙酸-3-烷基順丁烯二酸酐來形成中性親水性2-丙酸-3-烷基順丁烯二酸酐衍生物： 其中R1包含中性ASGPr配位體且n=0或1。在一個實施例中，ASGPr配位體經由短PEG連接子連接於該酸酐。

較佳掩蔽劑包含親水性肽酶(蛋白酶)可裂解之二肽-對醯胺基苯甲基胺反應性碳酸酯衍生物。本發明之酶可裂解連接子採用連接於醯胺基苯甲基活化之碳酸酯部分的二肽。ASGPr配位體連接於二肽之胺基末端。醯胺基苯甲基活化之碳酸酯部分係在該二肽之羧基末端處。適於與本發明一起使用之肽酶可裂解連接子具有結構： 其中R4包含ASGPr配位體且R3包含胺反應性碳酸酯部分，且R1及R2為胺基酸R基團。較佳經活化碳酸酯為對硝基酚。然而，此項技術中已知之其他胺反應性碳酸酯易於取代對硝基酚。經活化碳酸酯與蜂毒素胺之反應使靶向化合物脫唾液酸醣蛋白受體配位體經由肽酶可裂解之二肽-醯胺基苯甲基胺基甲酸酯鍵聯連接於蜂毒素肽。酶裂解二肽會自肽移除靶向配位體且觸發引起肽胺再生之消除反應。

二肽Glu-Gly、Ala-Cit、Phe-Cit(「Cit」為胺基酸瓜胺酸)顯示於實例3中。儘管亦允許帶電荷之胺基酸，但中性胺基酸較佳。

較佳掩蔽劑經由對於細胞表面受體之親和力來提供靶向功能，亦即該掩蔽劑含有細胞表面受體之配位體。較佳掩蔽劑含有對ASGPr具有親和力之醣，包括(但不限於)：半乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺及半乳糖衍生物。對ASGPr具有親和力之半乳糖衍生物在此項技術中為熟知的。可逆修飾之蜂毒素之一基本特徵在於，超過80%之蜂毒素胺(在肽群體中)係藉由經生理上不穩定之可逆共價鍵連接ASGPr配位體來進行修飾。

在另一實施例中，本發明之蜂毒素肽在胺基或羧基末端處藉由共價連接空間穩定劑或ASGPr配位體-空間穩定劑結合物來進一步修飾。可使用此項技術中之標準方法，在合 成期間將胺基或羧基末端修飾連接於肽。或者，可經由修飾具有胺基或羧基末端半胱胺酸殘基之蜂毒素肽上的半胱胺酸殘基來進行胺基或羧基末端修飾。較佳空間穩定劑為聚乙二醇。較佳聚乙二醇具有1至120個伸乙基單元。在另一實施例中，較佳聚乙二醇之大小係小於5 kDa。對於ASGPr配位體-空間穩定劑結合物，較佳空間穩定劑為具有1至24個伸乙基單元之聚乙二醇。

RNAi聚核苷酸結合物及傳遞肽係於醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑中向哺乳動物投與。在一個實施例中，傳遞肽及RNAi聚核苷酸結合物可在向哺乳動物投與之前以溶液形式組合。在另一實施例中，傳遞肽及RNAi聚核苷酸結合物可以各別溶液形式向哺乳動物共投與。在又一實施例中，傳遞肽及RNAi聚核苷酸結合物可依序向哺乳動物投與。對於依序投藥，傳遞肽可在投與RNAi聚核苷酸結合物之前投與。或者，對於依序投藥，RNAi聚核苷酸結合物可在投與傳遞肽之前投與。

當結合附圖一起考慮時，本發明之其他目的、特徵及優勢將自以下[實施方式]顯而易知。

本文描述一種用於在活體內將RNA干擾(RNAi)聚核苷酸傳遞至哺乳動物之肝臟細胞中之改良方法。吾等描述一種採用源於蜂毒肽之小傳遞肽蜂毒素以及獨立靶向RNAi聚核苷酸的活體內RNAi聚核苷酸傳遞系統。藉由使用靶向肝臟之RNAi聚核苷酸結合物分子及靶向脫唾液酸醣蛋白 受體之可逆抑制的蜂毒素肽，觀測到RNAi聚核苷酸向肝臟之高效傳遞。

因為蜂毒素及RNAi聚核苷酸獨立地靶向肝細胞，所以蜂毒素及聚核苷酸之濃度及其之間的比率僅受限於各組份之溶解性，而非相關複合物之溶解性或製造複合物之能力。此外，聚核苷酸與蜂毒素可在投與之前任何時間混合，或甚至分別投與，因此允許各組份以溶液或乾燥形式分開儲存。

本發明包括具有以下組成之結合物傳遞系統：Y-蜂毒素-(L-M) _x 加N-T，其中N為RNAi聚核苷酸，T為聚核苷酸靶向部分(具有20個或大於20個碳原子之疏水性基團或半乳糖簇)，蜂毒素為如本文所述之蜂毒蜂毒素肽或衍生物，且掩蔽劑M含有經由生理上不穩定之可逆鍵聯L共價連接於蜂毒素的如本文所述之ASGPr配位體。L之裂解使蜂毒素上未經修飾之胺恢復。Y為視情況選用的且若存在，則包含連接於蜂毒素之胺基末端、羧基末端或者胺基或羧基末端半胱胺酸之聚乙二醇(PEG)或ASGPr配位體-PEG結合物。較佳Y連接於胺基末端或胺基末端半胱胺酸。x為大於1之整數。在蜂毒素之未經修飾狀態下，其具有膜活性。然而，傳遞肽蜂毒素-(L-M) _x 不具有膜活性。藉由連接M來對蜂毒素一級胺進行可逆修飾會使蜂毒素之膜活性受到可逆抑制或不活化。修飾足夠百分比之蜂毒素一級胺以抑制聚合物之膜活性且提供肝細胞靶向。較佳地，如藉由在不存在任何掩蔽劑下 蜂毒素上胺之量所確定，x具有超過80%且更佳大於90%之蜂毒素上之一級胺之值。更詳言之，x具有超過80%且高達100%之蜂毒素上之一級胺之值。應注意蜂毒素通常含有3至5個一級胺(胺基末端(若未經修飾)及通常2至4個離胺酸殘基)。因此，一定百分比之胺之修飾意欲反映蜂毒素肽群體中之胺上一定百分比的修飾。在裂解可逆鍵聯L後，未經修飾之胺得以恢復，藉此將蜂毒素恢復成其未經修飾之膜活性狀態。較佳可逆鍵聯為pH值不穩定鍵聯。另一較佳可逆鍵聯為蛋白酶可裂解鍵聯。蜂毒素-(L-M) _x (一種靶向ASGPr之可逆掩蔽之膜活性聚合物)(傳遞肽)及T-N(一種聚核苷酸結合物)係分別合成或製造。T及N均不直接或間接共價連接於蜂毒素、L或M。聚核苷酸之活體內肝臟傳遞不需要聚核苷酸或聚核苷酸結合物與經掩蔽或未掩蔽聚合物之靜電或疏水性締合。經掩蔽聚合物及聚核苷酸結合物可供應於同一容器或各別容器中。其可在投與之前組合、共投與或依序投與。

親水性基團為定性術語，指示化學部分為喜水的。通常，該等化學基團可溶於水，且在水存在下為氫鍵供體或接受體。親水性基團可帶電荷或不帶電荷。帶電荷基團可帶正電荷(陰離子)或帶負電荷(陽離子)或帶兩種電荷(兩性離子)。親水性基團之實例包括以下化學部分：碳水化合物、聚氧化乙烯、某些肽、寡核苷酸、胺、醯胺、烷氧基醯胺、羧酸、硫及羥基。

疏水性基團為定性術語，指示化學部分為避水的。通 常，該等化學基團不可溶於水，且不傾向於形成氫鍵。親脂性基團溶於脂肪、油、脂質及非極性溶劑中且很少能甚至不能形成氫鍵。含有兩(2)個或兩個以上碳原子之烴、某些經取代之烴、膽固醇及膽固醇衍生物為疏水性基團及化合物之實例。

疏水性基團較佳為僅含有碳及氫原子之烴。然而，可允許維持疏水性且包括例如氟之非極性取代或非極性雜原子。該術語包括脂族基團、芳族基團、醯基、烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基及芳炔基，其各自可為直鏈、分支鏈或環狀。術語疏水性基團亦包括：固醇、類固醇、膽固醇，以及類固醇及膽固醇衍生物。

如本文所用，膜活性肽為能夠針對生物膜誘導以下一或多種效應之表面活性、兩親性肽：使膜改變或破裂以允許非膜可滲透分子進入細胞或跨越膜、在膜中形成孔、使膜分裂或者使膜破裂或溶解。如本文所用，膜或細胞膜包含脂質雙層。可藉由以下至少一種分析中之肽活性，以功能性界定膜之改變或破裂：紅血球溶解(溶血)、脂質體滲漏、脂質體融合、細胞融合、細胞溶解及核內體釋放。可引起細胞膜溶解之膜活性肽亦稱為膜溶解肽。讓核內體或溶酶體比質膜優先破裂之肽被認為具有核內體溶解性。膜活性肽對細胞膜之影響可為短暫性。膜活性肽對膜具有親和力且使雙層結構變性或變形。

聚核苷酸向細胞之傳遞係由蜂毒素肽介導，該蜂毒素肽使質膜或內部小泡膜(諸如核內體或溶酶體)破裂或不穩定 化，包括在膜中形成孔或使核內體或溶酶體小泡破裂，藉此允許小泡之內含物釋放至細胞質中。

核內體溶解性肽為因映核內體特異性環境因素(諸如pH值降低或存在溶解酶(蛋白酶))而能夠引起核內體破裂或溶解或使得通常細胞膜不可滲透性化合物(諸如聚核苷酸或蛋白質)自細胞內膜封閉之小泡(諸如核內體或溶酶體)釋放的肽。核內體溶解性聚合物在核內體中經歷其物理化學性質之改變。此改變可為由電荷、疏水性或親水性之改變所致的聚合物之溶解性或與其他化合物或膜相互作用之能力的變化。例示性核內體溶解性肽具有對pH值不穩定或酶敏感性之基團或鍵。因此，其中掩蔽劑經由pH值不穩定鍵連接於聚合物之可逆性掩蔽膜活性肽可視為核內體溶解性聚合物。

如本文所用，蜂毒素為一種小的兩親性膜活性肽，包含約23至約32個胺基酸，來源於天然存在蜂毒蛋白肽之蜂毒素。天然存在之蜂毒素含有26個胺基酸，且在胺基末端主要為疏水性且在羧基末端主要為親水性(陽離子)。本發明之蜂毒素可自生物來源分離或其可為合成性。合成聚合物係藉由「人工」化學方法調配或製造，且並非藉由天然存在之生物方法產生。如本文所用，蜂毒素涵蓋蜂毒素家族的天然存在之蜂毒肽，其可見於例如以下物種之毒液中：小蜜蜂、義大利蜂、中華蜜蜂、大蜜蜂、額斑黃胡蜂(Vespula maculifrons)、大胡蜂(Vespa magnifica)、黑胸胡蜂(Vespa velutina)、馬蜂屬(Polistes sp.)HQL-2001及亞非 馬蜂(Polistes hebraeus)。如本文所用，蜂毒素亦涵蓋胺基酸序列與天然存在之蜂毒素肽一致或類似之合成肽。詳言之，蜂毒素胺基酸序列涵蓋第1圖中所示者。除保留蜂毒素固有的高膜活性之胺基酸外，亦可添加1至8個胺基酸至肽之胺基或羧基末端。詳言之，可添加半胱胺酸殘基至胺基或羧基末端。第1圖中之清單不意欲為詳盡的，因為易於設想其他保守性胺基酸取代。合成蜂毒素肽可含有天然存在之L型胺基酸或對映異構D型胺基酸(翻轉(inverso))。然而，蜂毒素肽應含有基本上全部L型或全部D型胺基酸，但可在胺基末端或羧基末端處附加具有相對立體中心之胺基酸。蜂毒素胺基酸序列亦可逆轉(反向(retro))。反向蜂毒素可具有L型胺基酸或D型胺基酸(反向翻轉(retroinverso))。兩個蜂毒素肽亦可共價連接以形成蜂毒素二聚物。蜂毒素可具有除掩蔽劑以外之增強組織靶向或促進活體內循環之修飾基團，其連接於肽之胺基末端或羧基末端。然而，如本文所用，蜂毒素不包括含有彼此共價連接或共價連接於另一聚合物或骨架之超過兩個蜂毒素肽的鏈或聚合物。

掩蔽

本發明之蜂毒素肽包含可逆修飾之蜂毒素肽，其中可逆修飾可抑制膜活性，中和蜂毒素以減少正電荷並形成帶接近中性電荷之聚合物，且提供細胞類型特異性靶向。經由可逆修飾該肽上之一級胺來對蜂毒素進行可逆修飾。

本發明之蜂毒素肽能夠使質膜或溶酶體/內飲膜破裂。 然而，當活體內投與肽時，膜活性會引起毒性。因此，可逆掩蔽蜂毒素之膜活性為活體內使用所必需的。此掩蔽係經由將掩蔽劑可逆連接於蜂毒素以形成可逆掩蔽之蜂毒素(亦即傳遞肽)來達成。除抑制膜活性之外，掩蔽劑亦提供細胞特異性相互作用，亦即靶向。

掩蔽劑之一基本特徵為，在聚集狀態下其抑制聚合物之膜活性且提供活體內肝細胞靶向。蜂毒素在未經修飾(未掩蔽)狀態下具有膜活性且在修飾(掩蔽)狀態下不具有膜活性(不活化)。足夠數目之掩蔽劑連接於肽以達成所需不活化程度。藉由連接掩蔽劑達成之所需蜂毒素修飾程度易於使用適當肽活性分析來確定。舉例而言，若蜂毒素在既定分析中具有膜活性，則將足夠含量之掩蔽劑連接於肽以在彼分析中達到所需膜活性抑制程度。如藉由在不存在任何掩蔽劑下肽上一級胺之量所確定，較佳蜂毒素肽群體上80%或90%之一級胺基團得到修飾。掩蔽劑之一較佳特徵亦在於，其連接於肽會減少聚合物之正電荷，由此形成更趨於中性之傳遞肽。理想的是掩蔽肽保留水溶性。

如本文所用，若經修飾蜂毒素不展現膜活性且展現活體內細胞特異性(亦即肝細胞)靶向，則該肽經掩蔽。若將掩蔽劑連接於肽之鍵裂解使得肽上之胺恢復，藉此恢復膜活性，則蜂毒素經可逆掩蔽。

另一基本特徵為，掩蔽劑係經由生理上不穩定之可逆鍵共價結合於蜂毒素。藉由使用生理上不穩定之可逆鍵聯或鍵，掩蔽劑可在活體內自肽裂解，藉此使肽未經掩蔽且恢 復未掩蔽肽之活性。藉由選擇適當可逆鍵聯，有可能形成一種結合物，其在已傳遞至或靶向所要細胞類型或細胞位置之後恢復蜂毒素之活性。鍵聯之可逆性提供對於蜂毒素之選擇性活化。可逆共價鍵聯含有可選自包含以下之群之可逆或不穩定鍵：生理上不穩定之鍵、細胞生理上不穩定之鍵、pH值不穩定鍵、pH值很不穩定鍵、pH值極端不穩定鍵及蛋白酶可裂解鍵。

如本文所用，掩蔽劑包含具有ASGPr配位體及胺反應性基團之較佳呈中性(不帶電荷)之化合物，其中胺反應性基團與肽上之胺之反應使得ASGPr配位體經由生理上不穩定之可逆共價鍵與肽鍵聯。胺反應性基團經選擇以使反應適當生理條件(例如，如在核內體/溶酶體中之pH值降低，或如在核內體/溶酶體中之酶促裂解)之裂解引起蜂毒素胺之再生。ASGPr配位體為對脫唾液酸醣蛋白受體具有親和力之基團，通常為醣。本發明之較佳掩蔽劑能夠在水溶液中修飾聚合物(與聚合物形成可逆鍵)。

較佳胺反應性基團包含雙取代之順丁烯二酸酐。較佳掩蔽劑由以下結構表示： 其中R1包含脫唾液酸醣蛋白受體(ASGPr)配位體且R2為烷基，諸如甲基(-CH₃)、乙基(-CH₂CH₃)或丙基(-CH₂CH₂CH₃)。

在一些實施例中，半乳糖配位體經由PEG連接子連接於胺反應性基團，如以下結構所說明： 其中n為介於1與19之間的整數。

另一較佳胺反應性基團包含由以下結構表示之二肽-醯胺基苯甲基胺反應性碳酸酯衍生物： 其中：R1為胺基酸1之R基團，R2為胺基酸2之R基團，R3為-CH₂-O-C(O)-O-Z，其中Z為鹵化物， 且R4包含ASGPr配位體。

經活化碳酸酯與蜂毒素胺之反應使ASGPr配位體經由肽酶可裂解之二肽-醯胺基苯甲基胺基甲酸酯鍵聯連接於蜂毒素肽。

二肽之酶促裂解將靶向配位體自肽移除且觸發引起肽胺再生之消除反應。儘管以上結構顯示單一掩蔽劑連接於蜂毒素肽，但在實踐中，若干掩蔽劑連接於蜂毒素肽；較佳使蜂毒素肽群體上超過80%之胺經修飾。

二肽Glu-Gly、Ala-Cit、Phe-Cit(「Cit」為胺基酸瓜胺酸)顯示於實例3中。關於以上結構，Glu-Gly、Ala-Cit、Phe-Cit表示R2-R1。儘管允許帶電荷之胺基酸，但中性胺基酸較佳。其他胺基酸組合係可能的，其限制條件為其由內源性蛋白酶裂解。此外，亦可使用3至5個胺基酸作為醯胺基苯甲基與靶向配位體之間的連接子。

如同基於順丁烯二酸酐之掩蔽劑一樣，ASGPr配位體可 經由PEG連接子連接於肽酶可裂解之二肽-醯胺基苯甲基碳酸酯。

膜活性聚胺可在過量掩蔽劑存在下結合於掩蔽劑。過量掩蔽劑可在投與傳遞肽之前自經結合傳遞肽移除。

在另一實施例中，本發明之蜂毒素肽在胺基或羧基末端處藉由共價連接空間穩定劑或ASGPr配位體-空間穩定劑結合物來進一步修飾。較佳修飾疏水性末端；即具有「正常序列」之蜂毒素之胺基末端及反向蜂毒素之羧基末端。較佳空間穩定劑為聚乙二醇。可使用此項技術中之標準方法，在合成期間將胺基或羧基末端修飾連接於肽。或者，可經由修飾具有胺基或羧基末端半胱胺酸殘基之蜂毒素肽上的半胱胺酸殘基進行胺基或羧基末端修飾。較佳聚乙二醇具有1至120個伸乙基單元。在另一實施例中，較佳聚乙二醇之大小係小於5 kDa。對於ASGPr配位體-空間穩定劑結合物(NAG-PEG修飾)，較佳空間穩定劑為具有1至24個伸乙基單元之聚乙二醇。當末端PEG修飾與可逆掩蔽組合時，其進一步降低蜂毒素傳遞肽之毒性。末端NAG-PEG修飾會增強功效。

空間穩定劑

如本文所用，空間穩定劑為一種非離子型親水性聚合物(天然、合成或非天然)，相對於不含空間穩定劑之分子，其阻止或抑制其所連接之分子的分子內或分子間相互作用。空間穩定劑阻礙其所連接之分子參加靜電相互作用。靜電相互作用為兩種或兩種以上物質由於正電荷與負電荷 之間的吸引力而產生的非共價締合。空間穩定劑可抑制與血液組份之相互作用且因此抑制由網狀內皮系統進行之助噬、吞噬及攝取。因此，空間穩定劑可增加其所連接之分子之循環時間。空間穩定劑亦可抑制分子聚集。較佳空間穩定劑為聚乙二醇(PEG)或PEG衍生物。適於本發明之PEG分子具有約1至120個乙二醇單體。

ASGPr配位體

靶向部分或基團增強其所連接之結合物之藥物動力學或生物分佈性質，從而改良結合物之細胞特異性分佈及細胞特異性攝取。已使用半乳糖及半乳糖衍生物在活體內使分子經由其與肝細胞表面上表現之脫唾液酸醣蛋白受體(ASGPr)之結合來靶向肝細胞。如本文所用，ASGPr配位體(或ASGPr配位體)包含半乳糖及對ASGPr之親和力等於或大於半乳糖對ASGPr之親和力的半乳糖衍生物。半乳糖靶向部分與ASGPr之結合有助於傳遞肽以細胞特異性方式靶向肝細胞且將傳遞肽內飲至肝細胞中。

ASGPr配位體可選自包含以下之群：乳糖、半乳糖、N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)、半乳糖胺、N-甲醯基半乳糖胺、N-乙醯基-半乳糖胺、N-丙醯基半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺及N-異丁醯基-半乳糖胺(Iobst,S.T.及Drickamer,K.J.B.C.1996,271,6686)。ASGPr配位體可為單體(例如具有單一半乳糖胺)或多聚體(例如具有多個半乳糖胺)。

在一個實施例中，藉由使ASGPr配位體掩蔽劑連接於肽 上80%或90%之一級胺來可逆掩蔽蜂毒素肽。

不穩定鍵聯

鍵聯或連接子為兩個原子之間的連接，其使一個相關化學基團或區段經由一或多個共價鍵連接於另一相關化學基團或區段。舉例而言，鍵聯可使掩蔽劑連接於肽。鍵聯之形成可將兩個各別分子連接形成單一分子，或其可連接同一分子中之兩個原子。鍵聯可為電中性的或可攜帶正電荷或負電荷。可逆或不穩定鍵聯含有可逆或不穩定鍵。鍵聯可視情況包括增加兩個接合原子之間之距離的間隔子。間隔子可進一步為鍵聯添加可撓性及/或長度。間隔子可包括(但不限於)烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基；其各自可含有一或多個雜原子、雜環、胺基酸、核苷酸及醣。間隔子基團在此項技術中為熟知的且前述清單不意欲限制本發明之範疇。

不穩定鍵為除與氫原子之共價鍵以外之共價鍵，其能夠在不會破壞或裂解同一分子中之其他共價鍵之條件下選擇性地破壞或裂解。更詳言之，不穩定鍵為在適當條件下相較於同一分子中之其他非不穩定共價鍵，穩定性較低(熱力學)或破壞較快(動力學)之共價鍵。分子內不穩定鍵之裂解可導致形成兩個分子。對於熟習此項技術者，鍵之裂解或不穩定性一般用鍵裂解之半衰期(t_½)(半數鍵裂解所需之時間)來論述。因此，不穩定鍵涵蓋可比分子之其他鍵更快選擇性裂解之鍵。

適當條件由不穩定鍵之類型決定且在有機化學中為熟知 的。不穩定鍵可對pH值、氧化或還原條件或試劑、溫度、鹽濃度、酶(諸如酯酶，包括核酸酶及蛋白酶)之存在或所添加試劑之存在敏感。舉例而言，pH值增加或降低為適於pH值不穩定鍵之條件。

不穩定基團將經歷轉化之速率可藉由改變含有不穩定基團之分子之化學組份來控制。舉例而言，在不穩定基團附近添加特定化學部分(例如電子接受體或供體)可影響將要發生化學轉化之特定條件(例如pH值)。

如本文所用，生理上不穩定之鍵為在哺乳動物體內通常所遭遇之條件或在與哺乳動物體內所遭遇之條件類似之條件下可裂解的不穩定鍵。選擇生理上不穩定之鍵聯基團以使其在存在於某些生理條件下時經歷化學轉化(例如裂解)。

如本文所用，細胞生理上不穩定之鍵為在哺乳動物細胞內條件下可裂解之不穩定鍵。哺乳動物細胞內條件包括在哺乳動物細胞中所見或與哺乳動物細胞中所遭遇之條件類似之化學條件，諸如pH值、溫度、氧化或還原條件或試劑及鹽濃度。哺乳動物細胞內條件亦包括存在通常存在於哺乳動物細胞中之酶活性(諸如來自蛋白水解酶或水解酶之酶活性)。細胞生理上不穩定之鍵亦可反應醫藥學上可接受之外源試劑之投與而裂解。在適當條件下裂解之半衰期小於45分鐘的生理上不穩定之鍵被視為很不穩定。在適當條件下裂解之半衰期小於15分鐘的生理上不穩定之鍵被視為極端不穩定。

化學轉化(不穩定鍵之裂解)可藉由向細胞添加醫藥學上可接受之試劑來引發，或當含有不穩定鍵之分子到達適當細胞內及/或細胞外環境時可自發發生。舉例而言，當分子進入酸性核內體時，pH值不穩定鍵會裂解。因此，pH值不穩定鍵可視為核內體可裂解鍵。當曝露於酶(諸如存在於核內體或溶酶體或細胞質中之酶)時，酶可裂解鍵會裂解。當分子進入細胞質之還原性更高之環境時，二硫鍵會裂解。因此，二硫鍵可視為細胞質可裂解鍵。

如本文所用，pH值不穩定鍵為在酸性條件(pH<7)下選.擇性破壞之不穩定鍵。該等鍵亦可稱為核內體不穩定鍵，因為細胞核內體及溶酶體之pH值小於7。術語pH值不穩定包括為pH值不穩定、pH值很不穩定及pH值極端不穩定之鍵。

酸酐與胺反應形成醯胺及酸。對於許多酸酐，逆向反應(形成酸酐及胺)很緩慢且極為不利。然而，若酸酐為環狀酸酐，則與胺反應產生醯胺酸，即一種醯胺及酸處於同一分子中之分子。在同一分子中存在兩個反應性基團(醯胺及羧酸)會加速逆向反應。特定言之，一級胺與順丁烯二酸酐及順丁烯二酸酐衍生物之產物順丁烯醯胺酸比其非環狀類似物恢復回胺及酸酐快1×10⁹至1×10¹³倍(Kirby 1980)。

胺與酸酐反應形成醯胺及酸。

胺與環狀酸酐反應形成醯胺酸。

醯胺酸裂解形成胺及酸酐為pH值依賴性的且在酸性pH值下大幅加速。可利用此pH值依賴性反應性來形成可逆的pH值不穩定鍵及連接子。已使用順烏頭酸作為該種pH值敏感性連接子分子。γ-羧酸酯首先與分子偶合。在第二步驟中，α或β羧酸酯與第二分子偶合，形成兩個分子之pH值敏感性偶合。此連接子在pH 5下裂解之半衰期介於8小時與24小時之間。

順烏頭酸酐及順丁烯二酸酐之結構。

藉由向不穩定部分添加化學組份來控制使裂解發生之pH值。順丁烯醯胺酸轉化成胺及順丁烯二酸酐之速率強烈取決於順丁烯二酸酐系統之取代(R2及R3)。當R2為甲基時，轉化速率為當R2及R3為氫時之50倍。當在R2與R3兩者處存在烷基取代(例如2,3-二甲基順丁烯二酸酐)時，該速率之增加顯著：為未經取代之順丁烯二酸酐的10,000倍。在pH 5下裂解由用2,3-二甲基順丁烯二酸酐修飾胺所形成之 順丁烯醯胺酸酯鍵以恢復酸酐及胺的半衰期介於4分鐘與10分鐘之間。預期若R2及R3為大於氫之基團，則醯胺-酸轉化成胺及酸酐之速率將快於R2及/或R3為氫之情形。

pH值很不穩定鍵：pH值很不穩定鍵在pH 5下之裂解半衰期小於45分鐘。pH值很不穩定鍵之構造在化學技術中為熟知的。

pH值極端不穩定鍵：pH值極端不穩定鍵在pH 5下之裂解半衰期小於15分鐘。pH值極端不穩定鍵之構造在化學技術中為熟知的。

雙取代之環狀酸酐特別適用於將掩蔽劑連接於本發明之蜂毒素肽。其提供生理上pH值不穩定之鍵聯，易於修飾胺，且在細胞核內體及溶酶體中所見之降低之pH值下裂解後恢復彼等胺。其次，在與胺反應時產生之α或β羧酸基團似乎僅向聚合物貢獻約1/20之預期負電荷(Rozema等人Bioconjugate Chemistry 2003)。因此，用雙取代之順丁烯二酸酐修飾肽有效地中和肽之正電荷，而非產生具有高負電荷之肽。對於活體內傳遞，接近中性之傳遞肽較佳。

RNAi聚核苷酸結合物

吾等已發現RNAi聚核苷酸與聚核苷酸靶向部分(疏水性基團或半乳糖簇)結合及RNAi聚核苷酸結合物與上述傳遞肽之共投與會提供RNAi聚核苷酸至肝臟細胞(特定言之肝細胞)之活體內高效、功能性傳遞。功能性傳遞意謂RNAi聚核苷酸傳遞至細胞中且具有預期生物活性，即對於基因表現之序列特異性抑制。向哺乳動物之血管結構投與之許 多分子(包括聚核苷酸)通常由肝臟自身體清除。以下由肝臟達成之聚核苷酸清除不視為功能性傳遞：其中聚核苷酸降解或以其他方式加工以自身體移除及其中聚核苷酸不引起對於基因表現之序列特異性抑制。

RNAi聚核苷酸結合物係藉由將RNAi聚核苷酸共價連接於聚核苷酸靶向部分來形成。合成或修飾聚核苷酸以使其含有反應性基團A。亦合成或修飾靶向部分以使其含有反應性基團B。選擇反應性基團A及B以使其可使用此項技術中已知之方法經由共價鍵聯連接。

靶向部分可連接於RNAi聚核苷酸之3'或5'端。對於siRNA聚核苷酸，靶向部分可連接於有義股或反義股，但有義股較佳。

在一個實施例中，聚核苷酸靶向部分由疏水性基團組成。更詳言之，聚核苷酸靶向部分由具有至少20個碳原子之疏水性基團組成。用作聚核苷酸靶向部分之疏水性基團在本文中稱為疏水性靶向部分。例示性適合疏水性基團可選自包含以下之群：膽固醇、二膽固醇、生育酚(tocopherol)、二生育酚、二癸基、二(十二碳烷基)、二(十八碳烷基)、二(十二碳烷基)、二(十八碳烷基)、類異戊二烯及膽醯胺(choleamide)。具有6個或少於6個碳原子之疏水性基團不能有效作為聚核苷酸靶向部分，而具有8至18個碳原子之疏水性基團隨著疏水性基團之大小增加(亦即碳原子數增加)而增加聚核苷酸傳遞。疏水性靶向部分與RNAi聚核苷酸之連接在沒有共同投與傳遞肽下不會提供 活體內傳遞RNAi聚核苷酸之有效功能。儘管他人已報導siRNA-膽固醇結合物可在不存在任何其他傳遞載體下將siRNA(siRNA-膽固醇)活體內傳遞至肝臟細胞中，但需要高siRNA濃度且傳遞功效不良。當與本文所述之傳遞肽組合時，聚核苷酸之傳遞得以極大幅改良。藉由連同本發明之傳遞肽一起提供siRNA-膽固醇，siRNA-膽固醇之功效增加約100倍。

適用作聚核苷酸靶向部分之疏水性基團可選自由以下組成之群：烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基及芳炔基(其各自可為直鏈、分支鏈或環狀)、膽固醇、膽固醇衍生物、固醇、類固醇及類固醇衍生物。疏水性靶向部分較佳為僅含有碳及氫原子之烴。然而，可允許維持疏水性之取代或雜原子，例如氟。疏水性靶向部分可使用此項技術中已知之方法連接於RNAi聚核苷酸之3'或5'端。對於具有2股之RNAi聚核苷酸(諸如siRNA)，疏水性基團可連接於任一股。

在另一實施例中，聚核苷酸靶向部分包含半乳糖簇(半乳糖簇靶向部分)。如本文所用，半乳糖簇包含具有2至4個末端半乳糖衍生物之分子。如本文所用，術語半乳糖衍生物包括半乳糖與對脫唾液酸醣蛋白受體之親和力等於或大於半乳糖對脫唾液酸醣蛋白受體之親和力的半乳糖衍生物兩者。末端半乳糖衍生物經由其C-1碳連接於分子。脫唾液酸醣蛋白受體(ASGPr)為肝細胞所特有且結合分支之半乳糖末端醣蛋白。較佳半乳糖簇具有3個末端半乳糖胺 或半乳糖胺衍生物，各自對脫唾液酸醣蛋白受體具有親和力。更佳半乳糖簇具有3個末端N-乙醯基-半乳糖胺。此項技術中常見之其他術語包括三觸角半乳糖、三價半乳糖及半乳糖三聚物。已知三觸角半乳糖衍生物簇結合於ASGPr之親和力大於雙觸角或單觸角半乳糖衍生物結構(Baenziger及Fiete,1980,Cell,22,611-620；Connolly等人，1982,J.Biol.Chem.,257,939-945)。多價為達成nM親和力所需的。連接對脫唾液酸醣蛋白受體具有親和力之單一半乳糖衍生物不能使RNAi聚核苷酸在與傳遞肽共投與時活體內功能性傳遞至肝細胞中。

半乳糖簇含有3個半乳糖衍生物，各自連接於中心分支點。半乳糖衍生物經由醣之C-1碳連接於中心分支點。半乳糖衍生物較佳經由連接子或間隔子連接於分支點。較佳間隔子為可撓性親水性間隔子(美國專利5885968；Biessen等人J.Med.Chem.1995第39卷第1538-1546頁)。較佳可撓性親水性間隔子為PEG間隔子。較佳PEG間隔子為PEG₃間隔子。分支點可為允許連接3個半乳糖衍生物且進一步允許分支點連接於RNAi聚核苷酸之任何小分子。例示性分支點基團為二離胺酸。二離胺酸分子含有3個胺基，3個半 乳糖衍生物可經由其連接；及一個羧基反應性基團，二離胺酸可經由其連接於RNAi聚核苷酸。分支點連接於RNAi聚核苷酸可經由連接子或間隔子進行。較佳間隔子為可撓性親水性間隔子。較佳可撓性親水性間隔子為PEG間隔子。較佳PEG間隔子為PEG₃間隔子(3個伸乙基單元)。半乳糖簇可使用此項技術中已知之方法連接於RNAi聚核苷酸之3'或5'端。對於具有2股之RNAi聚核苷酸(諸如siRNA)，半乳糖簇可連接於任一股。

較佳半乳糖衍生物為N-乙醯基-半乳糖胺(GalNAc)。對脫唾液酸醣蛋白受體具有親和力之其他醣可選自包含以下之清單：半乳糖、半乳糖胺、N-甲醯基半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺、N-丙醯基-半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺及N-異丁醯基半乳糖胺。眾多半乳糖衍生物對脫唾液酸醣蛋白受體之親和力已得到研究(參見例如：Iobst,S.T.及Drickamer,K.J.B.C.1996,271,6686)或易於使用此項技術中之典型方法測定。

在分支點與核酸之間具有PEG間隔子之半乳糖簇

術語聚核苷酸或核酸或聚核酸為此項技術中之一個術語，意指含有至少2個核苷酸之聚合物。核苷酸為聚核苷酸聚合物之單體單元。具有少於120個單體單元之聚核苷酸常稱為寡核苷酸。天然核酸具有去氧核糖磷酸酯或核糖磷酸酯主鏈。非天然或合成聚核苷酸為在活體外或在無細胞系統中聚合且含有相同或類似鹼基但可含有除天然核糖磷酸酯或去氧核糖磷酸酯主鏈以外之類型之主鏈的聚核苷酸。聚核苷酸可使用此項技術中已知之任何技術合成。此項技術中已知之聚核苷酸主鏈包括：PNA(肽核酸)、硫代磷酸酯、亞磷醯二胺、嗎啉基及天然核酸之磷酸酯主鏈之其他變體。鹼基包括嘌呤及嘧啶，其進一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷及天然類似物。嘌呤及嘧啶之合成衍生物包括(但不限於)將新反應性基團(諸如(但不限於)胺、醇、硫醇、羧酸酯及烷基鹵化物)置於核苷酸上之修飾。術語鹼基涵蓋DNA及 RNA之已知鹼基類似物之任一者。聚核苷酸可含有核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、合成核苷酸或任何適合組合。聚核苷酸可在活體外聚合，其可為重組的，含有嵌合序列或此等基團之衍生物。聚核苷酸可在5'端、3'端或5'端與3'端兩者處包括末端帽部分。該帽部分可為(但不限於)翻轉之去氧無鹼基部分、翻轉之去氧胸苷部分、胸苷部分或3'甘油基修飾。

RNA干擾(RNAi)聚核苷酸為一種能夠經由與哺乳動物細胞之RNA干擾路徑機構相互作用從而以序列特異性方式降解或抑制轉殖基因之信使RNA(mRNA)轉錄物轉譯來誘導RNA干擾的分子。兩種主要的RNAi聚核苷酸為小(或短)干擾RNA(siRNA)及微RNA(miRNA)。RNAi聚核苷酸可選自包含以下之群：siRNA、微RNA、雙股RNA(dsRNA)、短髮夾RNA(shRNA)及編碼能夠誘導RNA干擾之RNA之表現卡匣。siRNA包含雙股結構，其通常含有15至50個鹼基對且較佳21至25個鹼基對，且核苷酸序列與在細胞內表現之靶基因或RNA中之編碼序列一致(完全互補)或接近一致(部分互補)。siRNA可具有二核苷酸3'突出物。siRNA可由兩個黏接之聚核苷酸或形成髮夾結構之單一聚核苷酸構成。本發明之siRNA分子包含有義區域及反義區域。在一個實施例中，結合物之siRNA係由兩個寡核苷酸片段組裝，其中一個片段包含siRNA分子之反義股之核苷酸序列且第二片段包含siRNA分子之有義區域之核苷酸序列。在另一實施例中，有義股經由連接子分子(諸如聚核苷酸連接子或 非核苷酸連接子)連接於反義股。微RNA(miRNA)為長約22個核苷酸之小非編碼RNA基因產物，其引導對其mRNA靶之破壞或轉譯阻遏。若miRNA與靶mRNA之間為部分互補，則靶mRNA之轉譯受阻遏。若互補性為廣泛的，則靶mRNA裂解。對於miRNA，複合物結合於通常位於mRNA之3'UTR中的靶位點，該等mRNA通常僅與miRNA共有部分同源性。「種子區域」，即miRNA之5'端上之與其靶形成完全鹼基配對之約七(7)個連續核苷酸的鏈段，在miRNA特異性方面起關鍵作用。RISC/miRNA複合物結合於mRNA可導致蛋白質轉譯之阻遏或mRNA之裂解及降解。新新資料指示，若沿miRNA及其靶之整個長度存在完全同源性而非僅在種子區域中顯示完全鹼基配對，則mRNA裂解優先發生(Pillai等人2007)。

RNAi聚核苷酸表現卡匣可在細胞中轉錄以產生小髮夾RNA，其可充當siRNA、獨立有義及反義股線性siRNA或miRNA。RNA聚合酶III轉錄之DNA含有選自包含以下之清單之啟動子：U6啟動子、H1啟動子及tRNA啟動子。RNA聚合酶II啟動子包括U1、U2、U4及U5啟動子、snRNA啟動子、微RNA啟動子及mRNA啟動子。

已知miRNA序列之清單可見於由諸如以下研究組織所維護之資料庫中：維爾康姆信託基金會桑格研究所(Wellcome Trust Sanger Institute)、賓夕法尼亞生物資訊學中心(Penn Center for Bioinformatics)、紀念斯隆凱特琳癌症中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)及歐洲分 子生物學實驗室(European Molecule Biology Laboratory)等。已知之有效siRNA序列及同源結合位點亦在相關文獻中得到充分闡述。RNAi分子易於藉由此項技術中已知之技術設計並產生。此外，存在增加發現有效及特異性序列基元之機會的計算工具(Pei等人2006，Reynolds等人2004，Khvorova等人2003，Schwarz等人2003，Ui-Tei等人2004，Heale等人2005，Chalk等人2004，Amarzguioui等人2004)。

本發明之聚核苷酸可經化學修飾。此等化學修飾之非限制性實例包括：硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯、2'-O-甲基核糖核苷酸、2'-去氧-2'-氟核糖核苷酸、2'-去氧核糖核苷酸、「通用鹼基」核苷酸、5-C-甲基核苷酸及翻轉之去氧無鹼基殘基併入。此等化學修飾在用於各種聚核苷酸構築體中時顯示會在細胞中保留聚核苷酸活性，而同時增加此等化合物之血清穩定性。化學修飾之siRNA亦可使人體中活化干擾素活性之可能性最小。

在一個實施例中，本發明之化學修飾之RNAi聚核苷酸包含具有兩股之雙螺旋體，該兩股中之一或兩者可經化學修飾，其中各股具有約19至約29個核苷酸。在一個實施例中，本發明之RNAi聚核苷酸包含一或多個經修飾核苷酸，同時維持在細胞或復原之活體外系統內部介導RNAi之能力。RNAi聚核苷酸可經修飾，其中化學修飾包含一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或10個以上)核苷酸。本發明之RNAi聚核苷酸可包含佔RNAi聚核 苷酸中存在之核苷酸總數一定百分比之經修飾核苷酸。因此，本發明之RNAi聚核苷酸一般可包含佔核苷酸位置之約5%至約100%(例如核苷酸位置之5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%)之經修飾核苷酸。既定RNAi聚核苷酸中存在之經修飾核苷酸之實際百分比取決於RNAi聚核苷酸中存在之核苷酸總數。若RNAi聚核苷酸為單股，則修飾百分比可基於單股RNAi聚核苷酸中存在之核苷酸總數。同樣，若RNAi聚核苷酸為雙股，則修飾百分比可基於有義股、反義股或有義股與反義股兩者中存在之核苷酸總數。此外，既定RNAi聚核苷酸中存在之經修飾核苷酸之實際百分比亦可取決於RNAi聚核苷酸中存在之嘌呤及嘧啶核苷酸之總數。舉例而言，其中RNAi聚核苷酸中存在之所有嘧啶核苷酸及/或所有嘌呤核苷酸皆經修飾。

RNAi聚核苷酸調節由基因編碼之RNA之表現。因為多個基因可彼此共有某一程度之序列同源性，所以RNAi聚核苷酸可經設計以靶向具有足夠序列同源性之一類基因。因此，RNAi聚核苷酸可含有與在不同基因靶中所共有或特定基因靶所特有之序列具有互補性之序列。因此，RNAi聚核苷酸可經設計以靶向RNA序列之在若干基因之間具有同源性之保存區域，藉此靶向基因家族中之若干基因(例如不同基因同功異型物、剪接變體、突變基因等)。在另一實施例中，RNAi聚核苷酸可經設計以靶向單一基 因之特定RNA序列所特有之序列。

術語互補性係指聚核苷酸藉由傳統沃森-克里克(Watson-Crick)類型或其他非傳統類型與另一聚核苷酸序列形成氫鍵之能力。關於本發明之聚核苷酸分子，聚核苷酸分子與其靶(效應物結合位點)或互補序列之結合自由能足以使聚核苷酸之相關功能得以進行，例如酶促mRNA裂解或轉譯抑制。核酸分子之結合自由能之測定在此項技術中為熟知的(Frier等人1986，Turner等人1987)。互補性百分比指示在第一聚核苷酸分子中之鄰接股中可與第二聚核苷酸序列形成氫鍵(例如沃森-克里克鹼基配對)的鹼基之百分比(例如10個中有5、6、7、8、9、10個為50%、60%、70%、80%、90%及100%互補)。完全互補意謂聚核苷酸序列之鄰接股中之所有鹼基將與第二聚核苷酸序列中相同數目之鄰接鹼基形成氫鍵。

抑制、下調或阻斷基因表現意謂，如藉由自基因轉錄之RNA之含量或自RNA轉譯之多肽、蛋白質或蛋白質次單元之含量所量測，基因表現降低至低於在不存在本發明之阻斷性聚核苷酸結合物下所觀測到之基因表現。用由本發明之組合物傳遞之聚核苷酸來抑制、下調或阻斷基因表現較佳低於在對照非活性核酸(即、具有攪亂序列或具有不活化錯配之核酸)存在下或在不存在聚核苷酸與經掩蔽聚合物之結合物下所觀測到之程度。

活體內投藥

在藥理學及毒理學中，投藥途徑為使藥物、流體、毒物 或其他物質與身體接觸所遵循之路徑。一般而言，投與供治療哺乳動物用之藥物及核酸之方法在此項技術中為熟知的且可應用於投與本發明之組合物。本發明之化合物可經由任何適合途徑，最佳為非經腸，以根據彼途徑適當定製之製劑形式投與。因此，本發明之化合物可藉由注射，例如靜脈內注射、肌肉內注射、皮內注射、皮下注射或腹膜內注射投與。因此，本發明亦提供包含醫藥學上可接受之載劑或賦形劑之醫藥組合物。

非經腸投藥途徑包括使用注射器及針或導管之血管內(靜脈內、動脈內)、肌肉內、腦實質內、真皮內、真皮下、皮下、腫瘤內、腹膜內、鞘內、硬膜下、硬膜外及淋巴內注射。本文中之血管內意謂在連接於體內組織或器官之稱為血管的管狀結構內。在管狀結構之腔內，體液流向身體部分或自身體部分流動。體液之實例包括血液、腦脊髓液(CSF)、淋巴液或膽汁。血管之實例包括動脈、小動脈、毛細血管、小靜脈、竇狀隙、靜脈、淋巴管、膽管及唾液腺管或其他外分泌腺管。血管內途徑包括經由諸如動脈或靜脈之血管傳遞。血液循環系統提供藥物之全身性散佈。

所述組合物係以醫藥學上可接受之載劑溶液形式注射。醫藥學上可接受係指就藥理學/毒理學觀點來看，彼等性質及/或物質為哺乳動物可接受的。片語醫藥學上可接受係指分子實體、組合物及性質係生理上可容許的且當向哺乳動物投與時通常不產生過敏或其他不利或毒性反應。較 佳地，如本文所用，術語醫藥學上可接受意謂由聯邦或州政府之管理機構核准或列於美國藥典(U.S.Pharmacopeia)或用於動物中且更特定言之人類中之其他一般認可的藥典中。

RNAi聚核苷酸-靶向部分結合物係與傳遞肽共投與。共投與意謂向哺乳動物投與RNAi聚核苷酸及傳遞肽以使兩者同時存在於哺乳動物中。RNAi聚核苷酸-靶向部分結合物及傳遞肽可同時投與或其可依序傳遞。對於同時投與，其可在投與之前混合。對於依序投與，可首先投與RNAi聚核苷酸-靶向部分結合物或傳遞肽。

對於RNAi聚核苷酸-疏水性靶向部分結合物，RNAi結合物可在投與傳遞肽之前至多30分鐘時投與。此外，對於RNAi聚核苷酸-疏水性靶向部分結合物，傳遞肽可在投與RNAi結合物之前至多兩小時時投與。

對於RNAi聚核苷酸-半乳糖簇靶向部分結合物，RNAi結合物可在投與傳遞肽之前至多15分鐘時投與。此外，對於RNAi聚核苷酸-半乳糖簇靶向部分結合物，傳遞肽可在投與RNAi結合物之前至多15分鐘時投與。

治療效應

RNAi聚核苷酸可出於研究目的傳遞或可經傳遞以在細胞中產生治療性變化。活體內傳遞RNAi聚核苷酸適用於研究試劑及多種治療、診斷、靶驗證、基因組發現、遺傳工程及藥物基因組學應用。吾等已揭示導致肝細胞中之內源性基因表現受抑制之RNAi聚核苷酸傳遞。在傳遞聚核 苷酸之後量測之報導子(標記物)基因表現量指示可合理預期在傳遞其他聚核苷酸之後存在類似基因表現量。被一般技術者視為有益之治療程度在疾病與疾病之間不同。舉例而言，A型及B型血友病分別由X連鎖之凝血因子VIII及IX之缺陷所引起。其臨床過程受因子VIII或IX之正常血清含量百分比極大影響：<2%，重度；2-5%，中度；及5-30%，輕度。因此，在重度患者中，自循環因子之正常含量增加1%至2%可視為有益。大於6%之程度會阻止自發出血，但不阻止手術或損傷繼發之出血。類似地，對基因之抑制無需達到100%以提供治療益處。一般基因療法技術者將基於標記基因結果之足夠程度來合理地預期某一疾病所特有之基因的有益表現量。在血友病實例中，若標記基因表現所產生之蛋白質含量以體積計與因子VIII之正常含量之2%相當，則可合理地預期編碼因子VIII之基因亦將以類似含量表現。因此，報導基因或標記基因一般充當細胞內蛋白質表現之有用範例。

鑒於肝臟在代謝(例如各種高膽固醇血症中之脂蛋白代謝)及循環蛋白質(例如血友病中之凝血因子)之分泌中之重要作用，其為用於基因療法之最重要靶組織之一。此外，諸如慢性肝炎(例如B型肝炎病毒感染)及硬化之後天性病症為常見的且亦潛在地藉由基於聚核苷酸之肝臟療法加以治療。影響肝臟或受肝臟影響之許多疾病或病狀係潛在地經由阻斷(抑制)肝臟中之基因表現加以治療。該等肝臟疾病及病狀可選自包含以下之清單：肝癌(包括肝細胞癌 HCC)、病毒感染(包括肝炎)、代謝病症(包括高脂質血症及糖尿病)、纖維化及急性肝損傷。

欲投與之傳遞肽及RNAi聚核苷酸結合物之量(劑量)可憑經驗確定。吾等已顯示，使用每公斤動物重量0.1 mg至10 mg siRNA結合物及每公斤動物重量5 mg至60 mg傳遞肽有效阻斷基因表現。小鼠中之較佳量為0.25 mg/kg至2.5 mg/kg siRNA結合物及10 mg/kg至40 mg/kg傳遞肽。更佳地，投與約12.5 mg/kg至20 mg/kg傳遞肽。易於增加RNAi聚核苷酸結合物之量，因為其在較大劑量下通常無毒。

如本文所用，活體內意謂發生在生物體內部，且更詳言之意謂某一過程在諸如哺乳動物之整個活的多細胞生物體(動物)之活組織之中或之上進行，與部分或死亡者相對。

實例

實例1. 蜂毒素合成。所有蜂毒素肽皆使用此項技術中之標準肽合成技術製備。適合蜂毒素肽可為全L型胺基酸、全D型胺基酸(翻轉)。不管L型或D型，蜂毒素肽序列皆可逆轉(反向)。

實例2. 蜂毒素修飾。

蜂毒素衍生物之胺基末端修飾。於dH₂O中製備CKLK-蜂毒素(20 mg/ml)、TCEP-HCl(28.7 mg/ml，100 mM)及MES-Na(21.7 mg/ml，100 mM)之溶液。在20 ml閃爍小瓶中，使CKLK-蜂毒素(0.030 mmol，5 ml)與1.7莫耳當量TCEP-HCl(0.051 mmol，0.51 ml)反應且使其在室溫下攪拌30分鐘。接著添加一定量MES-Na(2 ml)及水(1.88 ml)以產生最 終濃度為10 mg/ml之蜂毒素及20 mM MES-Na。檢查pH值且調整至pH 6.5-7。於dH₂O中製備NAG-PEG₂-Br(100 mg/ml)之溶液。添加NAG-PEG₂-Br(4.75當量，0.142 mmol，0.61 ml)，且使溶液在室溫下攪拌48小時。

或者，在20 ml閃爍小瓶中，使Cys-蜂毒素(0.006 mmol，1 ml)與1.7莫耳當量TCEP-HCl(0.010 mmol，100 μl)反應且使其在室溫下攪拌30分鐘。添加一定量MES-Na(400 μl)及水(390 μl)以產生最終濃度為10 mg/ml之蜂毒素及20 mM MES-Na。檢查pH值且調整至pH 6.5-7。於dH₂O中製備NAG-PEG₈-順丁烯二醯亞胺(100 mg/ml)之溶液。添加NAG-PEG₈-順丁烯二醯亞胺(2當量，0.012 mmol，110 μl)，且使溶液在室溫下攪拌48小時。

在Luna 10 μ C18 100Å 21.2×250 mm管柱上純化樣品。緩衝液A：H₂O 0.1% TFA；及緩衝液B：MeCN，10%異丙醇，0.1% TFA。流速15 ml/min，在20分鐘內35% A至62.5% B。

使用類似手段進行其他胺基末端修飾。用具有羧基末端半胱胺酸之蜂毒素肽取代具有胺基末端半胱胺酸之蜂毒素來進行羧基末端修飾。

用於經修飾Cys-蜂毒素或蜂毒素-Cys之化合物：

n為1至120之整數(PEG分子量達約5 kDa)

在肽合成期間，使用此項技術中之典型方法在樹脂上產生具有乙醯基、二甲基、硬脂醯基、肉豆蔻醯基及PEG胺基或羧基末端修飾而非末端半胱胺酸殘基之肽。

實例3. 掩蔽劑合成。

A. pH值不穩定掩蔽劑：空間穩定劑CDM-PEG及靶向基團CDM-NAG(N-乙醯基半乳糖胺)合成。向CDM(300 mg，0.16 mmol)於50 mL二氯甲烷中之溶液中添加草醯氯(2 g，10重量當量)及二甲基甲醯胺(5 μl)。使反應進行隔夜，此後藉由旋轉蒸發移除過量草醯氯及二氯甲烷，產生CDM酸氯化物。將酸氯化物溶解於1 mL二氯甲烷中。向此溶液中添加含1.1莫耳當量聚乙二醇單甲基醚(平均MW 550；對於CDM-PEG)或(胺基乙氧基)乙氧基-2-(乙醯基胺基)-2-去氧-β-D-半乳哌喃糖苷(亦即胺基雙乙氧基-乙基NAG；對於 CDM-NAG)，及吡啶(200 μl，1.5當量)之10 mL二氯甲烷。接著攪拌溶液1.5小時。接著移除溶劑且將所得固體溶解於5 mL水中並使用逆相HPLC利用0.1% TFA水/乙腈梯度進行純化。

R1包含中性ASGPr配位體。掩蔽劑較佳不帶電荷。

R為甲基或乙基，且n為2至100之整數。較佳地，PEG含有5至20個伸乙基單元(n為5至20之整數)。更佳地，PEG含有10至14個伸乙基單元(n為10至14之整數)。PEG可具有可變長度且具有5至20個或10至14個伸乙基單元之平均長度。或者，PEG可為單分散的、均一的或離散的；具有例 如恰好11或13個伸乙基單元。

n為1至10之整數。如上所示，PEG間隔子可位於酸酐基團與ASGPr配位體之間。較佳PEG間隔子含有1至10個伸乙基單元。

或者，可在酸酐與N-乙醯基半乳糖胺之間使用烷基間隔子。

n為0至6之整數。

可在酸酐與N-乙醯基-半乳糖胺之間使用其他間隔子或連接子。然而，親水性中性(較佳不帶電荷)間隔子或連接子較佳。

B.蛋白酶(肽酶)可裂解掩蔽劑。亦可使用專用之酶可裂解連接子可逆修飾蜂毒素肽。此等酶可裂解連接子採用連接於醯胺基苯甲基活化之碳酸酯部分之二肽。經活化碳酸 酯與肽胺之反應將諸如脫唾液酸醣蛋白受體配位體之靶向化合物經由肽酶可裂解之二肽-醯胺基苯甲基胺基甲酸酯鍵聯連接於蜂毒素肽。二肽之酶裂解將靶向配位體自肽移除且觸發引起肽胺再生之消除反應。合成以下酶可裂解連接子：

顯示二肽Glu-Gly、Ala-Cit、Phe-Cit(「Cit」為胺基酸瓜胺酸)。可允許其他胺基酸組合。此外，3至5個胺基酸可用作醯胺基苯甲基與靶向配位體之間的連接子。另外，此項技術中已知之其他經活化碳酸酯易於取代以上化合物中使用之對硝基酚。

實例4. 可逆修飾/掩蔽蜂毒素。

A.用基於順丁烯二酸酐之掩蔽劑修飾。在修飾之前，自0.1%冰乙酸水溶液凍乾5×mg雙取代之順丁烯二酸酐掩蔽劑(例如CDM-NAG)。向乾燥之雙取代順丁烯二酸酐掩蔽劑中添加×mg蜂毒素於0.2×mL等張葡萄糖中之溶液及10×mg HEPES游離鹼。在酸酐完全溶解之後，在室溫下將溶液培育至少30分鐘，隨後向動物投與。雙取代之順丁烯二酸酐掩蔽劑與肽反應產生： 其中R為蜂毒素且R1包含ASGPr配位體(例如NAG)。在酸酐與聚合物胺之間的反應中產生之酸酐羧基展現約1/20之預期電荷(Rozema等人Bioconjugate Chemistry 2003)。因 此，膜活性聚合物經有效中和而非轉化成帶高負電荷之聚陰離子。

B.用蛋白酶可裂解掩蔽劑修飾。在1至10 mg/mL肽下藉由添加含NAG之蛋白酶可裂解受質之2至6×mg胺反應性對硝基苯基碳酸酯或N-羥基丁二醯亞胺碳酸酯衍生物來掩蔽1×mg肽及10×mg HEPES鹼。接著在室溫(RT)下將溶液培育至少1小時，隨後注入動物中。

實例5. siRNA。siRNA具有以下序列：

因子VII-齧齒動物

有義：(Chol)-5' GfcAfaAfgGfcGfuGfcCfaAfcUfcAf(invdT)3'(Seq ID 97)

反義：5' pdTsGfaGfuUfgGfcAfcGfcCfuUfuGfcdTsdT 3'(Seq ID 98)

或

有義5' GGAUfCfAUfCfUfCfAAGUfCfUfUfACfdTsdT 3'(Seq ID 99)

反義5' GUfAAGACfUfUfGAGAUfGAUfCfCfdTsdT 3'(Seq ID 100)

因子VII=靈長類動物

有義(chol)-5' uuAGGfuUfgGfuGfaAfuGfgAfgCfuCfaGf(invdT)3'(Seq ID 101)

反義5' pCfsUfgAfgCfuCfcAfuUfcAfcCfaAfcdTsdT 3'(Seq ID 102)

ApoB siRNA：

有義(cholC6SSC6)-5' GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA 3'(Seq ID 103)

反義5' uuGGAUcAAAuAuAAGAuUCcscsU 3'(Seq ID 104)

siLUC

有義(chol)5'-uAuCfuUfaCfgCfuGfaGfuAfcUfuCfgAf(invdT)-3'(Seq ID 105)

反義5'-UfcGfaAfgUfaCfuCfaGfcGfuAfaGfdTsdT-3'(Seq ID 106)

小寫=2'-O-CH₃取代

s=硫代磷酸酯鍵聯

在核苷酸後的f=2'-F取代

在核苷酸前的d='-去氧

在ÄKTA Oligopilot 100(GE Healthcare,Freiburg,Germany)上且以控制孔徑玻璃(CPG)作為固體支撐物，藉由習知胺基磷酸酯化學在固相上進行RNA合成。

實例6. siRNA-靶向分子結合物。

A.合成GalNAc簇。如美國專利公開案20010207799中所述合成GalNAc簇聚核苷酸靶向配位體。

B. GalNAc簇-siRNA結合物。如第2圖中所示且如下所述，將以上實例6A之GalNAc簇結合於siRNA。

(1)將化合物1 (150 mg，0.082 mmol，第2圖)溶解於無水甲醇(5.5 ml)中且添加42 μL甲醇鈉(25%甲醇溶液)。在室溫下在氬氣氛圍下攪拌混合物2小時。添加等量甲醇以及數份陰離子交換物質安伯來特(Amberlite)IR-120以產生約7.0之pH值。藉由過濾移除安伯來特。用Na₂SO₄乾燥溶液，且在減壓下移除溶劑。以定量產率獲得呈白色泡沫形式之化合物2。使用TLC(SiO₂，二氯甲烷(DCM)/MeOH 5：1 +0.1% CH₃COOH)：R_f 2=0.03；用於偵測硫酸(5%)之MeOH溶液，隨後加熱。ESI-MS，直接注射，負離子模式；[M-H]^-1 _計算：1452.7；[M-H]^1- _量測：1452.5。

(2)使化合物2 (20 mg，0.014 mmol，第2圖)與吡啶及二氯甲烷共蒸發。將殘餘物溶解於無水DMF(0.9 ml)中且在攪拌下在氬氣氛圍下添加N-羥基丁二醯亞胺(NHS)於DMF(1.6 mg，0.014 mmol)中之溶液。在0℃下，緩慢添加N,N'-二環己基碳化二亞胺(DCC)於DMF(3.2 mg，0.016 mmol)中之溶液。使反應升溫至室溫且攪拌隔夜。化合物3不經進一步純化即用於與RNA結合。

(3)合成胺基修飾之RNA。使用ÄKTA Oligopilot 100(GE Healthcare,Freiburg,Germany)且以控制孔徑玻璃作為固體支撐物，在1215 μmol規模下藉由標準亞磷醯胺化學在固相上產生在有義股之5'端處裝備有C-6胺基連接子之RNA。採用相應亞磷醯胺2'-O-甲基亞磷醯胺及TFA-己基胺基連接子醯胺化物(amidite)產生含有2'-O-甲基核苷酸之RNA。藉由此領域中已知之方法達成裂解及脫除保護基以及純化(Wincott F.等人，NAR 1995,23,14,2677-84)。

藉由陰離子交換HPLC表徵胺基修飾之RNA(純度：96.1%)且藉由ESI-MS確認身分([M+H]¹⁺ _計算：6937.4；[M+H]¹⁺ _量測：6939.0)。序列：5'-(NH₂C₆)GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA-3'；u、c：相應鹼基之2'-O-甲基核苷酸，s：硫代磷酸酯。

(4)GalNAc簇結合於RNA。將在5'端處裝備有C-6胺基連 接子之RNA(2.54 μmol)凍乾且溶解於250 μL硼酸鈉緩衝液(0.1 mol/L硼酸鈉(pH 8.5)、0.1 mol/L KCl)及1.1 mL DMSO中。在添加8 μL N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)之後，在連續攪拌下將化合物3(理論上0.014 mmol，第2圖)之DMF溶液緩慢添加至RNA溶液中。在35℃下攪動反應混合物隔夜。使用RP-HPLC(Resource RPC 3 ml，緩衝液：A：含100 mM乙酸三乙銨(TEAA，2.0 M，pH 7.0)之水，B：含100 mM TEAA之95%乙腈，梯度：5% B至22% B，20個管柱體積(CV))監測反應。在-20℃下使用含乙酸鈉(3 M)之EtOH使RNA沈澱之後，使用上述條件純化RNA結合物。彙集純溶離份，且使用乙酸鈉/EtOH使所需結合化合物4沈澱，產生純RNA結合物。分離出結合物4，產率59%(1.50 μmol)。藉由陰離子交換HPLC分析結合物4之純度(純度：85.5%)且藉由ESI-MS確認身分([M+H]¹⁺ _計算：8374.4；[M+H]¹⁺ _量測：8376.0)。

(5)結合物4(有義股)與2'-O-甲基修飾之反義股黏接。藉由混合等莫耳的互補股於黏接緩衝液(20 mM磷酸鈉(pH 6.8)；100 mM氯化鈉)中之溶液來產生siRNA結合物，在85-90℃水浴中加熱3分鐘，且在3至4小時時段內冷卻至室溫。藉由天然凝膠電泳確認雙螺旋體形成。

C.疏水性基團-siRNA結合物。

(1)siRNA結合於烷基。採用來自Glen Research(Virginia,USA)之5'-羧基修飾劑C10醯胺化物製備siRNA之5'-C10-NHS酯修飾之有義股(NHSC10-siRNA或COC9-siRNA)。仍 然連接於固體支撐物之經活化RNA用於與下表1中所列之親脂性胺結合。將100 mg有義股CPG(裝載60 μmol/g，0.6 μmol RNA)與0.25 mmol自Sigma Aldrich Chemie GmbH(Taufkirchen,Germany)或Fluka(Sigma-Aldrich,Buchs,Switzerland)獲得之相應胺混合。

在40℃下震盪混合物18小時。自固體支撐物裂解RNA且在45℃下用氫氧化銨水溶液(NH₃，33%)脫除保護基隔夜。在65℃下用TEA×3HF移除2'-保護基，持續3.5小時。藉由RP-HPLC(Resource RPC 3 ml，緩衝液：A：含100 mM TEAA之水，B：含100 mM TEAA之95% CH₃CN，梯度：自3% B至70% B，15個管柱體積；Nr 7除外：自3% B至100% B，15個管柱體積)純化粗寡核糖核苷酸。

為了自RNA單股產生siRNA，將等莫耳量之互補有義股及反義股混合於黏接緩衝液(20 mM磷酸鈉(pH 6.8)；100 mM氯化鈉)中，在80℃下加熱3分鐘，且在3至4小時時段內冷卻至室溫。藉由凝膠電泳表徵針對因子VII mRNA之siRNA。

(2)siRNA結合於膽固醇-使用此項技術中之標準方法合 成siRNA-膽固醇結合物。膽固醇可連接於siRNA之有義股或反義股之5'或3'端。較佳連接於siRNA之有義股之5'端。亦可利用此項技術中之標準方法，使用含有反應性基團(例如硫醇、胺或羧基)之RNA股在siRNA合成後製備siRNA-膽固醇。

活體內siRNA傳遞

實例7. 活體內投與RNAi聚核苷酸且傳遞至肝細胞中。如上所述合成RNAi聚核苷酸結合物及經掩蔽蜂毒素肽。自Harlan Sprague Dawley(Indianapolis IN)獲得6至8週齡之小鼠(品系C57BL/6或ICR，各自約18至20 g)。小鼠在注射之前圈養至少2天。用Harlan Teklad齧齒動物膳食(Harlan,Madison WI)進行任意餵養。將0.2 mL傳遞肽溶液及0.2 mLsiRNA結合物注入小鼠之尾部靜脈中。對於同時注射傳遞肽及siRNA，在注射之前添加siRNA結合物至經修飾肽中且注射全部量。在生理條件下組合物為可溶及非聚集的。藉由輸注將溶液注入尾部靜脈中。預期向其他血管中注射(例如眼眶後注射)同等有效。

自Charles River(Wilmington,MA)獲得175至200 g之Wistar Han大鼠。大鼠在注射之前圈養至少1週。大鼠之注射體積通常為1 ml。

血清ApoB含量測定。在藉由下頜下放血來收集血清之前，使小鼠禁食4小時(對於大鼠而言為16小時)。對於大鼠，自頸靜脈收集血液。藉由標準夾心ELISA方法測定血清ApoB蛋白質含量。簡言之，分別使用多株山羊抗小鼠 ApoB抗體及兔抗小鼠ApoB抗體(Biodesign International)作為捕捉抗體及偵測抗體。之後施用結合HRP之山羊抗兔IgG抗體(Sigma)以結合ApoB/抗體複合物。接著藉由Tecan Safire2(Austria,Europe)微盤讀取器在450 nm下量測四甲基-聯苯胺(TMB，Sigma)比色顯色之吸光度。

血漿因子VII(F7)活性量測。藉由遵循標準程序將血液(9體積)(對於小鼠，藉由下頜下放血；或對於大鼠，自頸靜脈放血)收集至含有0.109 mol/L檸檬酸鈉抗凝血劑(1體積)之微量離心管中，來製備動物之血漿樣品。遵循製造商之推薦，使用BIOPHEN VII套組(Hyphen BioMed/Aniara,Mason,OH)用顯色法量測血漿中之F7活性。使用Tecan Safire2微盤讀取器在405 nm下量測比色顯色之吸光度。

實例8. 在傳遞ApoB siRNA與蜂毒素傳遞肽之後活體內之內源性ApoB含量減低-蜂毒素肽之劑量反應。如上所述用CDM-NAG可逆修飾蜂毒素。接著共注射指定量之蜂毒素與200 μg ApoB siRNA-膽固醇結合物。如上所述確定對ApoB含量之影響。

^a相對於注射等張葡萄糖之動物減低

實例9. 在大鼠中傳遞ApoB siRNA與蜂毒素傳遞肽之後活體內之內源性因子VII含量減低。如上所述用5×CDM-NAG可逆修飾指定蜂毒素。接著將指定量之蜂毒素(以每公斤動物重量之毫克數計)與3 mg/kg膽固醇-因子VII siRNA共注射。如上所述確定對因子VII含量之影響。

^a每公斤動物重量之mg肽

^b相對於注射等張葡萄糖之動物減低

實例10. 在小鼠中傳遞ApoB siRNA與蜂毒素傳遞肽之後活體內之內源性ApoB含量減低，L型蜂毒素相對於D型蜂毒素。如上所述用CDM-NAG可逆修飾蜂毒素。接著共注射指定量之蜂毒素與50 μg ApoB siRNA-膽固醇結合物。如上所述確定對ApoB含量之影響。

表4. 在用ApoB-siRNA膽固醇結合物及指定CDM-NAG可逆抑制之蜂毒素肽處理的小鼠中之正常肝臟細胞中ApoB活性的抑制

實例11. 在小鼠中傳遞ApoB siRNA與蜂毒素傳遞肽之後活體內之內源性ApoB含量減低，正常序列相對於逆轉(反向)序列。如上所述用CDM-NAG(5×)可逆修飾蜂毒素。接著共注射指定量之蜂毒素與指定量之ApoB siRNA-膽固醇結合物。如上所述確定對ApoB含量之影響。

^a-反向翻轉=正常蜂毒素胺基酸序列經逆轉且所有胺基酸皆為D型胺基酸(甘胺酸(G)為非對掌性的)

實例12. 在小鼠中傳遞ApoB siRNA與蜂毒素傳遞肽之後 活體內之內源性ApoB含量減低，蜂毒素修飾程度。如上所述用指定量之CDM-NAG可逆修飾蜂毒素。接著共注射50 μg蜂毒素與100 μg ApoB siRNA-膽固醇結合物。如上所述確定對ApoB含量之影響。

藉由TNBS分析針對肽上之游離胺測定蜂毒素胺修飾百分比。將20 μg肽吸移入含有190 μL 50 mM BORAX緩衝液(pH 9)及16 μg TNBS之96孔澄清盤(NUNC 96)中。使樣品與TNBS在室溫下反應約15分鐘且接著在Safire盤讀取器上量測A₄₂₀。如下計算經修飾胺%：(A_對照-A_樣品)/(A_對照-A_空白)×100。修飾超過80%之胺提供最佳蜂毒素掩蔽及活性。

^a藉由TNBS分析測定

實例13. 在小鼠中傳遞ApoB siRNA與蜂毒素傳遞肽之後活體內之內源性ApoB含量減低，蜂毒素肽衍生物。如上所述用CDM-NAG(5×)可逆修飾具有指定序列之蜂毒素肽。接著共注射指定量之蜂毒素與指定量之ApoB siRNA-膽固醇結合物。如上所述確定對ApoB含量之影響。

表7. 在用ApoB-siRNA膽固醇結合物及指定CDM-NAG可逆抑制之蜂毒素肽處理的小鼠中之正常肝臟細胞中

^a每隻小鼠之μg肽

^b每隻小鼠之μg siRNA

dMel=具有D型胺基酸之蜂毒素肽

實例14. 在小鼠中傳遞ApoB siRNA與蜂毒素傳遞肽之後活體內之內源性ApoB含量減低，酶可裂解掩蔽劑。如上所述用指定量之酶可裂解掩蔽劑可逆修飾蜂毒素。接著共注射200至300 μg經掩蔽蜂毒素與50至100 μg ApoB siRNA-膽固醇結合物。如上所述確定對ApoB含量之影響。肽酶可 裂解之二肽-醯胺基苯甲基胺基甲酸酯修飾之蜂毒素為一種有效的siRNA傳遞肽。較佳與酶可裂解掩蔽劑組合使用D型蜂毒素肽。儘管達成相同程度之靶基因阻斷需要較多肽，但因為肽掩蔽更穩定，所以治療指數不改變或得到改良(相較於用CDM-NAG掩蔽相同肽)。

^a用於掩蔽反應中的每個蜂毒素胺之掩蔽劑量。

實例15. 在小鼠中傳遞ApoB siRNA與蜂毒素傳遞肽之後活體內之內源性ApoB含量減低，胺修飾之蜂毒素肽。如上所述合成含有指定PEG胺基末端修飾之蜂毒素肽。接著如上所述用5×CDM-NAG可逆修飾經PEG胺基末端修飾之蜂毒素肽。接著共注射指定量之蜂毒素與100至200 μg ApoB siRNA-膽固醇結合物。如上所述確定對ApoB含量之影響。添加大小低於5 kDa之PEG使蜂毒素肽之毒性降低。用高於5 kDa之PEG進行胺基末端修飾導致功效降低(資料未示)。

實例16. 已知具有膜活性之其他蜂毒素衍生物序列。

實例17. 在由蜂毒素傳遞肽傳遞因子VII siRNA之後靈長類動物中之因子VII減低。如上所述藉由與10×CDM-NAG反應來掩蔽NAG-PEG2-G1L蜂毒素。如上所述藉由與5×CDM-NAG反應來掩蔽G1L蜂毒素。在第1天，將1 mg/kg經掩蔽NAG-PEG2-G1L蜂毒素、1 mg/kg經掩蔽G1L蜂毒素或3 mg/kg經掩蔽G1L蜂毒素與2 mg/kg膽固醇-因子VII siRNA一起共注入食蟹獼猴(Cynomolgus macaque)(食蟹猴(Macaca fascicularis))靈長類動物(雄性，3.0至8.0 kg)中。使用22至25規格之靜脈內導管將2 ml/kg注入隱靜脈中。作為對照，用10 mg/kg G1L蜂毒素與2 mg/kg對照siRNA膽固醇-Luciferasr siRNA共注射另一組靈長類動物。在指定時間點(指示於第3至5圖中)，抽取血液樣品且分析因子VII及毒性標記物。自股靜脈收集血液且在所有血液收集之前使靈長類動物禁食。根據製造商之推薦，在Cobas Integra 400(Roche Diagnostics)上進行關於血脲氮(BUN)、丙胺酸轉胺酶(ALT)、天冬胺酸胺基轉移酶(AST)及肌酸酐(creatinine)之血液測試。如上所述測定因子VII含量。在小於1 mg/kg肽劑量下觀測到因子VII顯著減低。在10 mg/kg之肽劑量下未觀測到顯著毒性。因此，經掩蔽蜂毒素肽之治療指數為5至10。

實例18. 在由蜂毒素傳遞肽傳遞ApoB siRNA之後靈長類動物中之ApoB減低。如上所述藉由與5×CDM-NAG反應來掩蔽G1L蜂毒素。在第1天，將2 mg/kg經掩蔽G1L蜂毒素與2 mg/kg膽固醇-ApoB siRNA一起共注入食蟹獼猴(食蟹猴)靈長類動物中。在指定時間點(表11)，抽取血液樣品且分析ApoB蛋白質含量及毒性標記物。根據製造商之推薦，在Cobas Integra 400(Roche Diagnostics)上進行關於血脲氮(BUN)、丙胺酸轉胺酶(ALT)、天冬胺酸胺基轉移酶(AST)及肌酸酐之血液測試。如上所述測定ApoB含量。未觀測到BUN、肌酸酐或AST增加。僅在第2天(注射之後1天)觀測到AST之短暫微小升高。ApoB之減低在第11天達到接近100%且保持低量31天。

第1圖：列舉適用於本發明中之蜂毒素肽的表格。

第2圖：說明GalNAc簇與RNA之鍵聯的圖。

第3圖：說明用可逆修飾之蜂毒素siRNA傳遞肽及siRNA-膽固醇結合物處理之靈長類動物體內之(A)血脲氮 (BUN)含量及(B)肌酸酐含量的圖。

第4圖：說明用可逆修飾之蜂毒素siRNA傳遞肽及siRNA-膽固醇結合物處理之靈長類動物體內之(A)天冬胺酸胺基轉移酶(AST)含量及(B)丙胺酸轉胺酶(ALT)含量的圖。

第5圖：說明用可逆修飾之蜂毒素siRNA傳遞肽及siRNA-膽固醇結合物處理之靈長類動物體內之內源性因子VII含量減低的圖。

<110> 美商愛羅海德麥迪森公司

<120> 基於肽之活體內siRNA傳遞系統

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<170> PatentIn version 3.5

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<213> 北美螢火蟲

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Claims (20)

1. 一種用於在活體內將RNA干擾聚核苷酸傳遞至肝臟細胞之結合物傳遞系統組合物，其包含：RNAi-A+蜂毒素-(L-Gal) _x 其中，蜂毒素為具有以下序列之蜂毒素肽：Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Ala-Xaa₅-Leu-Xaa₇-Val-Leu-Xaa₁₀-Xaa₁₁-Xaa₁₂-Leu-Pro-Xaa₁₅-Leu-Xaa₁₇-Xaa₁₈-Trp-Xaa₂₀-Xaa₂₁-Xaa₂₂-Xaa₂₃-Xaa₂₄-Xaa₂₅-Xaa₂₆，其中：Xaa₁為白胺酸、D-白胺酸、異白胺酸、正白胺酸、酪胺酸、色胺酸、纈胺酸、丙胺酸、二甲基甘胺酸、甘胺酸、組胺酸、苯丙胺酸或半胱胺酸，Xaa₂為異白胺酸、白胺酸、正白胺酸或纈胺酸，Xaa₃為甘胺酸、白胺酸或纈胺酸，Xaa₅為異白胺酸、白胺酸、正白胺酸或纈胺酸，Xaa₇為離胺酸、絲胺酸、天冬醯胺、丙胺酸、精胺酸或組胺酸，Xaa₁₀為丙胺酸、蘇胺酸或白胺酸，Xaa₁₁為蘇胺酸或半胱胺酸，Xaa₁₂為甘胺酸、白胺酸或色胺酸，Xaa₁₅為蘇胺酸或丙胺酸，Xaa₁₇為異白胺酸、白胺酸、正白胺酸或纈胺酸，Xaa₁₈為絲胺酸或半胱胺酸，Xaa₂₀為異白胺酸、白胺酸、正白胺酸或纈胺酸， Xaa₂₁為離胺酸或丙胺酸，Xaa₂₂為天冬醯胺或精胺酸，Xaa₂₃為離胺酸或丙胺酸，Xaa₂₄為精胺酸或離胺酸，Xaa₂₅為離胺酸、丙胺酸或麩醯胺酸，Xaa₂₆為視情況選用且若存在，則為麩醯胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸-NH₂或半胱胺酸-NH₂；且，且Xaa₂₁、Xaa₂₃及Xaa₂₅中之至少兩者為離胺酸；L為生理上不穩定之鍵聯，Gal為脫唾液酸醣蛋白受體(ASGPr)配位體，x為具有超過80%之蜂毒素之一級胺之值的整數，RNAi為RNA干擾聚核苷酸，且A為具有至少20個碳原子之疏水性基團或半乳糖簇。
2. 如請求項1之組合物，其中該RNA干擾聚核苷酸係選自由以下組成之群：DNA、RNA、dsRNA、siRNA及微RNA。
3. 如請求項1之組合物，其中該肝臟細胞由肝細胞組成。
4. 如請求項1之組合物，其中該等ASGPr配位體可逆地連接於複數個蜂毒素肽上至少90%之胺。
5. 如請求項1之組合物，其中該蜂毒素肽係選自由以下組成之清單：Sep.ID 7、Seq.ID 51、Seq.ID 57及Seq.ID 58。
6. 如請求項1之組合物，其中Xaa₁為白胺酸，Xaa₂₂為精胺 酸，Xaa₂₅為麩醯胺酸且Xaa₂₆不存在。
7. 如請求項1之組合物，其中該蜂毒素肽由D型胺基酸組成。
8. 如請求項1之組合物，其中L為雙取代之順丁烯醯胺酸酯。
9. 如請求項1之組合物，其中L為醯胺基苯甲基胺基甲酸酯。
10. 如請求項8之組合物，其進一步包含聚乙二醇(PEG)，其共價連接於該蜂毒素肽之胺基末端。
11. 如請求項8之組合物，其進一步包含ASGPr配位體-PEG結合物，其共價連接於該蜂毒素肽之胺基末端。
12. 如請求項9之組合物，其進一步包含聚乙二醇(PEG)，其共價連接於該蜂毒素肽之胺基末端。
13. 如請求項9之組合物，其進一步包含ASGPr配位體-PEG結合物，其共價連接於該蜂毒素肽之胺基末端。
14. 如請求項1之組合物，其中該ASGPr配位體係選自由以下組成之群：乳糖、半乳糖、N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)、半乳糖胺、N-甲醯基半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺、N-丙醯基半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺及N-異丁醯基半乳糖胺。
15. 如請求項1之組合物，其中該RNAi為經由生理上不穩定之鍵聯L ² 連接於A。
16. 如請求項15之組合物，其中L ² 為與L正交。
17. 如請求項1之組合物，其中該半乳糖簇由N-乙醯基半乳 糖胺三聚物組成。
18. 如請求項1之組合物，其中該疏水性基團由膽固醇組成。
19. 如請求項1之組合物，其中該組合物係含於醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑中提供。
20. 一種製造RNA干擾聚核苷酸傳遞組合物之方法，其包含：a)形成具有以下序列之蜂毒素肽：Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Ala-Xaa₅-Leu-Xaa₇-Val-Leu-Xaa₁₀-Xaa₁₁-Xaa₁₂-Leu-Pro-Xaa₁₅-Leu-Xaa₁₇-Xaa₁₈-Trp-Xaa₂₀-Xaa₂₁-Xaa₂₂-Xaa₂₃-Xaa₂₄-Xaa₂₅-Xaa₂₆，其中：Xaa₁為白胺酸、D-白胺酸、異白胺酸、正白胺酸、酪胺酸、色胺酸、纈胺酸、丙胺酸、二甲基甘胺酸、甘胺酸、組胺酸、苯丙胺酸或半胱胺酸，Xaa₂為異白胺酸、白胺酸、正白胺酸或纈胺酸，Xaa₃為甘胺酸、白胺酸或纈胺酸，Xaa₅為異白胺酸、白胺酸、正白胺酸或纈胺酸，Xaa₇為離胺酸、絲胺酸、天冬醯胺、丙胺酸、精胺酸或組胺酸，Xaa₁₀為丙胺酸、蘇胺酸或白胺酸，Xaa₁₁為蘇胺酸或半胱胺酸，Xaa₁₂為甘胺酸、白胺酸或色胺酸，Xaa₁₅為蘇胺酸或丙胺酸，Xaa₁₇為異白胺酸、白胺酸、正白胺酸或纈胺酸， Xaa₁₈為絲胺酸或半胱胺酸，Xaa₂₀為異白胺酸、白胺酸、正白胺酸或纈胺酸，Xaa₂₁為離胺酸或丙胺酸，Xaa₂₂為天冬醯胺或精胺酸，Xaa₂₃為離胺酸或丙胺酸，Xaa₂₄為精胺酸或離胺酸，Xaa₂₅為離胺酸、丙胺酸或麩醯胺酸，Xaa₂₆為視情況選用且若存在，則為麩醯胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸-NH₂或半胱胺酸-NH₂；且，且Xaa₂₁、Xaa₂₃及Xaa₂₅中之至少兩者為離胺酸；b)形成複數個不帶電荷之掩蔽劑，其各自包含共價連接於雙取代之順丁烯二酸酐或二肽醯胺基苯甲基胺反應性碳酸酯之ASGPr配位體；c)用步驟b之該等掩蔽劑修飾蜂毒素肽群體上超過80%之一級胺；d)將該RNA干擾聚核苷酸連接於具有至少20個碳原子之疏水性基團或半乳糖三聚物；f)將該RNA干擾聚核苷酸及該經修飾之蜂毒素肽以適於活體內投藥之溶液形式提供。