TW201322038A - 用於結構解析之奈米粒子及結構解析方法 - Google Patents

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本發明提供一種結構解析方法，包含將複數個用於交聯欲解析之一巨分子的分子接附於一奈米粒子的一表面以形成一經修飾的奈米粒子，擷取該經修飾的奈米粒子的複數影像，基於該等影像將該表面上的該巨分子依其推測之一立體方位分類以及以一電腦程式計算該巨分子的立體結構。

Description

用於結構解析之奈米粒子及結構解析方法
本發明係屬於結構生物學領域，特別是利用奈米粒子來進行3D分子立體結構之解析。
蛋白質要在生物體內執行應有之功能，與其三度空間結構極為相關。因此，以結構為導向之策略是探索蛋白質功能之重要方針。
在結構生物學領域中，目前已知大部份生物巨分子的三維結構，主要是靠X-光繞射及核磁共振(NMR)兩種工具求出。就蛋白質資料庫(Protein Data Bank，PDB)而言，目前大約有15,000種蛋白質已被解析出來，其中有80%是利用X-光繞射解析出來的，另有20%是利用NMR解析。所謂X-光繞射結晶法即是利用X-光射向蛋白質晶體使X-光產生繞射，經由繞射使照相底片曝光而產生一投影圖形，再將此繞射圖案作分析，作出電子密度圖，經過一連串的計算之後，即可判定出蛋白質的立體結構。以X光繞射解析蛋白質結構時，需要將待解析的蛋白質先形成結晶，要獲得蛋白質結晶，首先必須要先大量製備所需蛋白質，例如利用載體將記載蛋白質序列的核酸插入到生產蛋白質的菌體中，如此便可大量製造出純度高的蛋白質，而後將含有高濃度的蛋白質溶液加入適當的溶劑，慢慢降低蛋白質的溶解度，使其接近自發性的沉澱狀態時，蛋白質分子將在整齊的堆疊下形成晶體。但是並非所有蛋白質皆能得到良好的結晶。另一方面，某些水溶性蛋白質，在水環境下能維持在有功能的分子構型，將其結晶後，離開了水的環境，失去固定而變成另一種沒有功能的構型。
相較之下，雖然以NMR解析的生物巨分子沒有X-光繞射來的多，但以NMR解析三維結構時不需要形成蛋白質的長單晶(single crystal)，只需要將蛋白質溶於水溶液當中即可，較符合生物巨分子的生理狀態。不過，NMR的解析度有其限制，一般來說只能解析五萬個Dalton以下的蛋白質，因此更大的蛋白質無法利用NMR解析結構。
電子顯微鏡早在二戰前由德國魯斯卡(Ruska,Nobel Physics 1990)所發明，接近一世紀時間，由於工藝不斷進步，早已達到原子解析度，成為材料學家的利器。在1950年由於負染色法(Negative stain)的發展，使生物學家可以有效固定生物樣品並提供極佳的對比。在1975年，科學家更發現在液態溫度下紫菌膜蛋白的二維晶體可以繞射至原子解析度，經歷15年的發展，才以傅利葉影像分析法結合電子繞射解析出紫菌膜蛋白的原子結構。更由於速凍法的進步，得以將蛋白質粒子保存在無序冰中，得到非常好的對比，從此冷凍電鏡(cryo-TEM)迅速竄起，成為與X光繞射和NMR同等重要的高解析度結構生物學方法。
Cryo-TEM和傳統電子顯微鏡最大的不同處在於觀察時直接將急速冷凍於液態氮等冷凍劑中的樣品切片觀察，目前以Cryo-EM觀察的樣品厚度小於1μm，適用於觀察蛋白質複合物(protein complex)、病毒以及細菌上的結構。Cryo-TEM的好處在於樣品的處理不需經由化學固定、脫水及染色等步驟，可以保存樣品最原始的樣貌。近年來Cyro-TEM搭配影像重建，已經成為檢驗病毒與研究病毒的結構的主要工具。
近年來，由於奈米科技之發展，利用金屬奈米粒子做為細胞影像觀察媒介(contrast agent)之技術日趨成熟，其原理為利用金屬奈米粒子對於光波(紫外線、可見光、近紅外線範圍)具有表面電漿共振(Surface Plasmon Resonance；SPR)效應。特別是金或銀奈米粒子，其具有許多自由電子，這些電子容易隨外在電磁場而運動，並由外往內逐漸形成障蔽作用(shielding effect)，使得內部電子無法感受到外在電磁場的變化；但是若金或銀粒子直徑夠小(約小於200 nm以下)，整顆金屬粒子內的所有自由電子做集體式運動時，這會對於入射光波造成極大的吸收及散射，此種現象稱為表面電漿子共振效應。
由於奈米粒子本身的物理及化學性質，提供了許多新的應用方向，例如：將金屬或半導體奈米粒子應用至生物疾病檢測或藥物篩選(screening)已是科學家現今幾年重要的研究目標。美國專利US 7,226,794揭示了利用表面增強拉曼光譜(SERS)偵測奈米粒子的技術內容，表面增強拉曼是增強拉曼訊號的方法之一，主要是將樣品吸附在惰性金屬(如銅，銀，金等…)表面，利用表面電漿共振的原理來增強訊號強度。藉由在奈米粒子表面進行修飾之後，奈米粒子可作為偵測生物分子的工具、或者作為靈敏的生物標記工具，再結合電子元件轉換為可讀取的電流訊號。
運用奈米粒子適合用於生物感測的特性，在藥物傳輸及癌症治療上亦有長足的進步。研究發現表面包覆一層高子作為外殼的奈米粒子可藉由將藥物封入內部，使水溶性的藥物不易遺漏在血液中，同時攜帶藥物到特定位置後再將其釋出，如此便可大大地提昇療效，也降低副作用。除了以奈米粒子包覆藥物之外，更可結合不同的抗體，一方面準確找到癌細胞的位置，另一方面也作為顯影劑，同時應用在電腦斷層與核磁共振診斷造影，使醫師得以根據影像分析癌細胞基因特質，針對不同病患研擬最佳治療方法(J. Am. Chem. Soc.,2010,132(38),pp 13270-13278)。
有鑑於目前結構生物學領域在蛋白質立體結構解析之限制，本案發明人結合奈米粒子的特性與冷凍電鏡之影像分析能力，催生了本發明「用於結構解析之奈米粒子及結構解析方法」的構想。以下為本發明之簡要說明。
本發明有關於一種用於結構解析之奈米粒子及結構解析方法，其係利用具有分子自組裝特性的奈米粒子結合冷凍電鏡技術、數學運算及影像處理，來進行生物分子立體結構解析。本發明中的自組裝奈米粒子為具有類似病毒的外蛋白內奈米粒子核心構造，因此能夠以現有解析病毒殼蛋白結構的工具，如冷凍電鏡等技術，應用於蛋白質的3-D結構解析。
本發明之主要目的在於提供一種結構解析方法，包含將複數個交聯分子接附於一奈米粒子的一表面以形成一經修飾的奈米粒子，此一奈米粒子表面藉由分子自組裝原理能以方向控制之方式吸附具有特定序列之蛋白質，而該組裝方位能經由此特定序列區段表現於該蛋白質之位置加以調控。在自組裝完成並經冷凍電鏡觀察之奈米粒子-蛋白質複合物取得複數影像後，可基於該等影像構型將該表面上的該待測巨分子分類以及以一電腦程式計算該巨分子的立體結構。除此，該奈米粒子可藉由表面電漿共振以鐳射光束局部快速增溫，改變巨分子進行原位動態分析。而奈米粒子可透過表面長鏈分子如去氧核糖核酸之自組裝而規則排列，利於影像截取與影像分析。
本發明之又一主要目的在於提供一種結構解析方法，包含改變一奈米粒子的一表面性質，擷取該奈米粒子的複數影像，基於該等影像將該奈米粒子上的複數表面分子進行分類以及計算該等表面分子的一立體結構。
本發明之下一主要目的在於提供一種用於結構解析之奈米粒子，包含複數個表面分子，該複數表面分子與複數待測巨分子交聯而接附於該奈米粒子的一表面上，使該已接附的奈米粒子具有一自我組裝該複數待測巨分子之能力，藉此，該奈米粒子被應用至一影像分析系統及一電腦程式至少其中之一，以得出該複數巨分子的一立體結構。
本發明之再一主要目的在於提供一種結構解析套組，包含複數奈米粒子，各奈米粒子的一表面上具有與複數待測分子接合的複數位置，該奈米粒子被應用至一影像分析系統及一電腦程式至少其中之一，以得出該複數待測分子的一立體結構。
本發明之再一主要目的在於提供一種結構解析方法，包含改變一奈米粒子的一表面性質，擷取該奈米粒子上的複數待測分子的複數影像以及計算該等待測分子的一立體結構。
本發明之再一主要目的在於提供一種結構解析方法，包含擷取在一奈米粒子上的複數待測分子的複數影像以及計算該等待測分子的一立體結構。
本發明之再一主要目的在於提供一種結構解析方法，包含程式化運算在一奈米粒子上的複數待測分子而獲知該等待測分子的一立體結構。
為了讓本發明之上述目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：
本發明提供了一種用於結構解析之奈米粒子，由於該奈米粒子的表面經由表面分子的修飾，使該奈米粒子具有與待測巨分子以特定方位自我組裝的能力，可形成一自我聚集單層膜(self-assembly monolayer;SAM)，故稱為「自組裝奈米粒子」或「SAM奈米粒子」。
符合本發明用於結構解析之奈米粒子必須滿足以下條件：
(1)具有能形成類似病毒構造之大小，以便運用既有的病毒分子結構解析工具解析未知生物分子(如蛋白質或DNA)的結構。
(2)使蛋白質或DNA排列在奈米粒子的表面上，進行影像分析時可呈現出蛋白質或DNA的各種角度。較佳地，該蛋白質或DNA是有規則地排列於奈米粒子表面上。
為使奈米粒子具有類似病毒的結構，必須在奈米粒子的表面上接附交聯分子，該交聯分子視操作者的需要，可為一鏈狀分子、蛋白質或者DNA。以奈米粒子模擬病毒的核心，而以長鏈分子模擬病毒外殼的蛋白質，如第一圖中自組裝奈米粒子100所示。
奈米粒子的材質，一般多為金屬，較常見者為金或銀奈米粒子。金奈米粒子現在已廣泛地應用在生化材料上，主要因為它的表面與帶電的配位子、硫基能以微弱的鍵結而穩定結合，使得粒子表面很容易修飾。銀粒子表面薄膜帶的吸收係數比金奈米粒子大4倍。因此，在光學偵測系統的運用上比金奈米粒子更加適合。除了單一金屬材質的奈米粒子以外，許多金屬氧化物也是適合做為奈米粒子的新型材質，如氧化鐵、氧化銀、二氧化矽等等。除此，奈米粒子可為有機分子例如枝狀體(dendrimer)，聚乳酸甘油酸(PLGA)等奈米粒子。
奈米粒子還需要透過表面修飾的步驟，才能夠在表面形成自組裝單層，進而改變奈米粒子表面的極性，又稱為奈米粒子的“改質”。經由改質過程可以使奈米粒子與表面分子間形成穩定的配位結合，例如以硫醇化分子與奈米粒子結合，就是一種常用的改質方法。
在本文中，該術語“交聯分子”意指能一端結合奈米粒子，而另一端與待測分子之一或多個部位產生吸附或鍵結，此一分子多半但非全然部份具有直線分子構造，包括但不限於nickel nitrilotriacetate(Ni-NTA)、去氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、核苷酸、寡核苷酸、核苷、蛋白質、胜肽、多肽以及抗體、配體(ligand)等。較佳地，該交聯分子為Ni-NTA,含硫醇之長鏈分子、DNA及蛋白質。當該長鏈分子為DNA時，其立體結構可為單股、雙股或者三股，且不限於天然或合成的。DNA可作為組裝轉錄複合體(transcription complex)之載體(carrier)。
在本文所使用的術語“奈米粒子”，意指最長方向具上有約1000 nm或更小的結構。奈米粒子可為大小介於1至1000 nm的粒子，其任一方向的直徑小於或等於1000 nm，包括但不限於1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、50、100、500及750 nm。奈米粒子可與藥物、生物材料、有機化合物、官能基及其他相關材料共同反應，而使這些材料吸收或接附於奈米粒子上。
本發明之奈米粒子可具有各種形狀與尺寸。在一實例中，該奈米粒子實質為球形。但除此外型也可以包含各種可能，例如將奈米粒子製造為立方體、多面體、柱狀體等等。
在本發明較佳實施例中，奈米粒子為氧化鐵奈米粒子，但本領域具通常知識者可依其需要運用其他合適的材質，例如：金、銀、鉑、鈀、銠、鐵、銅、鈷、鎘、鎳及矽等。或者，以合金的材質製造奈米粒子，如金-銀、鐵-鈷、銅-金、鉑-釕、銀-鈀、鈷-銅、鐵-金、鐵-鉑等等，以及在金屬氧化物材料，如二氧化矽(SiO2)、二氧化鋯(ZrO2)、二氧化鈦(TiO2)、鐵氧化物、氧化鋅(ZnO)、二氧化錫(SnO2)以及其他類似金屬氧化物。奈米粒子亦可以為如PLGA之非金屬有機成份。
在本文中，該術語“自組裝奈米粒子”或“SAM奈米粒子”可互換使用，意指包含一個或多個不同化學實體的族群的結構，該一個或多個化學實體彼此形成奈米等級的結構。本發明中所提及的自組裝奈米粒子，其大小介於1-200 nm之間，較佳為4-40 nm。
在本文中，該術語“自組裝”意指一個或多個不同組成的分子，受到分子間共價或非共價鍵作用力的影響，而自然發生自組裝排列現象。該術語“非共價鍵作用力”包括氫鍵、凡得瓦爾力、靜電力、離子鍵及親疏水作用力等。
自組裝奈米粒子的製備：
以下製備方法參考公告號I295177專利及申請號097116609專利，提供鐵-金奈米粒子及氧化鐵奈米粒子之製備實施例。
實例一：鐵/金核殼型複合奈米粒子之製備
本實例係以微乳化法製備鐵/金核殼型複合奈米粒子，於溴化十六烷三甲基銨(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)之逆微胞下，使用1-丁醇(1-butanol)當作界面輔助活性劑，並以異辛烷(isooctane)當作油相，再將含有所需金屬離子或含有還原劑的水相加入其混合物。其所製成的逆微胞大小，可藉由水相和界面活性劑的莫耳比控制，其實際操作步驟如下：將所有使用溶劑與水通入氬氣2小時，然後分別配製0.2 M硫酸亞鐵(FeSO4)與0.5M硼氫化鈉(NaBH4)之水溶液；配製兩等體積之溴化十六烷三甲基銨(CTAB)/1-丁醇/異辛烷混合液，一加入硫酸亞鐵水溶液之金屬鹽類，另一加入硼氫化鈉水溶液，分別製得微乳化液(水溶液/CTAB/1-丁醇/異辛烷之重量百分比為21%/18%/53%/8%)；將含FeSO4與NaBH4之微乳化液等體積混合，置於氬氣的氣氛中反應，即可得到奈米鐵核心部分；另分別配製0.2 M氯金酸(HAuCl4)(可由0.05 M HAuCl4替代，分四次添加)與0.8 M NaBH4之水溶液；配置兩等體積之CTAB/1-丁醇/異辛烷混合液，一加入HAuCl4水溶液之金屬鹽類，另一加入硼氫化鈉水溶液，分別製得微乳化液(水溶液/CTAB/1-丁醇/異辛烷重量百分比為17.3%/14.5%/57.8%/10.4%)；-將含HAuCl4先加入已形成奈米鐵核心部分的微乳化液，再將NaBH4之微乳化液加入混合，置於氬氣的氣氛下反應，即可得到鐵/金核殼型複合奈米粒子；將所製得之鐵/金核殼型複合奈米粒子以乙醇溶液和永久磁鐵洗滌，以移除介面活性劑及多餘的金奈米粒子。
鐵/金核殼型複合奈米粒子的平均粒徑大約為18.22±4.39 nm，其中外殼部分約為4至6奈米。重覆以上試驗，但改變金鹽的添加方式為將0.2M的金鹽微乳化液以0.05M的金鹽微乳化液逐次加入取代四次，則製得平均粒徑為約9.6±2.95 nm的鐵/金核殼型複合奈米粒子，其中外殼部分約為0.7至1奈米。(I295177專利)
實例二：氧化鐵奈米粒子之製備與改質
本實施例利用兩階段式之保護試劑(protective agent)與化學共沉澱(coprecipitation)的方法來製備具有水溶性與分散性之氧化鐵奈米粒子。將氯化鐵(FeCl3‧6H2O>99%)與氯化亞鐵(FeCl2‧6H2O>99%)分別溶於2M鹽酸中，製得1M氯化鐵與2M氯化亞鐵之鹽酸溶液。將這兩種溶液以FeIII/FeII=2的比例混合，再加入有機酸做為附著劑。接著將溶液的pH值調整至大於10並加入適量之附著劑使奈米粒子之表面完全被NH3 +所覆蓋，可得到黑色的具有分散性的奈米氧化鐵奈米粒子之水溶液。
將溴乙酸(0.52g,3.75 mmol)溶於氫氧化鈉溶液(3 ml,5N)並在0℃下冷卻。在0℃下將Nε-(苄氧羰基)-L-賴胺酸(0.42g,1.5mmol)溶於5N氫氧化鈉的溶液(3ml)逐滴加入上述溶液中並同時攪拌。兩個小時後，將冰浴移除，再對混合物迴流加熱隔夜。將混合液冷卻後，加入5N鹽酸溶液並攪拌半個小時。所得之產物利用過濾收集後用1N鹽酸清洗，可製得產率為78%的白色固體Na,Na-雙(羧甲基)-Nε-(苄氧羰基)-L-賴胺酸(Nε-Z-NTA,0.44g)。
將以上步驟製得之Na,Na-雙(羧甲基)-Nε-(苄氧羰基)-L-賴胺酸(1.09g,2.75mmol)溶於甲醇水溶液(甲醇/水=20/l,40ml)。加入一小匙Pd/C(10%)後，將混合物在室溫下氫化。三小時後反應結束，反應期間用TLC(MeCN/H2O=4/1)監控並用UV顯像。將催化劑過濾掉後，在0℃下使產物結晶兩天。在真空中收集並乾燥此結晶(0.617g)，最終的產率為85%。
在室溫下，將修飾有NH3的氧化鐵奈米粒子(1ml,0.1μM)加入所製得之NTA(1ml,0.2M)與戊二醛(400μl,55%w/w)中並攪拌8個小時。將氧化鐵奈米粒子與NTA結合後，加入硫酸亞鎳(NiSO4’2ml,1.0 M)並在室溫下攪拌八小時。反應完成後，將混合物在13000 rpm下離心分離5分鐘並移除上層液體。然後將沉澱物Fe3O4-NTA-Ni重新分散在2ml水中，再在13000 rpm下離心分離5分鐘以及除去過量的Ni2+離子。最後再次將Fe3O4-NTA-Ni分散在1ml水中，得到水溶性並修飾有氮三乙酸鎳(Nickel-nitrilotriacetate,Ni-NTA)的氧化鐵奈米粒子。
在本實施例中，利用修飾6-組氨酸胜肽鏈的待測分子使其對應於氮三乙酸鎳。由實施例二所製得之Fe3O4-NTA-Ni奈米粒子具有兩個可與多組氨酸結構之融合胜肽結合的位置。鎳離子的兩個空軌域可以與多組氨酸胜肽鏈中可供應電子的位置結合(如以下流程圖所示)。為了使待測分子-6-His複合物與Fe3O4-NTA-Ni奈米粒子結合，將上述複合物與奈米粒子以10:1的莫耳比在室溫下混合，並溫和攪拌10分鐘，然後利用磁性分離並洗去未結合的胜肽。接著將粒子重新懸浮於含有10%羊血清蛋白的磷酸鹽緩衝液，製得可用於與待測分子結合的奈米粒子。(申請號097116609)
請參閱第一圖，其為本案以奈米粒子解析待測分子立體結構的示意圖。自組裝奈米粒子100中包含一奈米粒子110及複數個接附於奈米粒子110表面的表面分子120，通常為藉由交聯分子自組裝於其表面的蛋白質或DNA。排列於奈米粒子110上的表面分子120因折疊而具有立體結構。DNA結構可包括單股、雙股或三股。以顯微鏡觀察時，自組裝奈米粒子100的外觀及大小類似於病毒，具有中央的核心與外圍的突出構造。雖然本案第一圖所示之奈米粒子為球形，但除此外型也可以包含各種可能，例如將奈米粒子製造為立方體、多面體、柱狀體等等。本發明中所提及的自組裝奈米粒子，其大小介於1-200 nm之間，較佳為4-40 nm。
第二圖為第一圖中自組裝奈米粒子100與待測分子結合之細部結構圖。如上述製備實施例中所揭露的Ni-NTA氧化鐵奈米粒子，第二圖(a)中之Ni-NTA作為交聯分子，其一端與奈米粒子結合，另一端與修飾6-組氨酸的蛋白質結合。除了依據上述製備實施例製得之奈米粒子之外，本領域具通常知識者也可以硫醇基做為交聯分子與奈米粒子結合，如第二圖(b)所示，作為本發明用於解析待測分子立體結構之自組裝奈米粒子。
經過改質的奈米粒子(即SAM奈米粒子)具有不同的表面性質，由於接附交聯分子可以使奈米粒子具有與待測巨分子結合的能力，若奈米粒子以DNA修飾，又可利用DNA鹼基配對的特性而控制奈米粒子特定方式與距離排列，或者利用其他自組裝設計使SAM奈米粒子以預定方式排列於其他基材，如此有助於軟體設計之自動化取像分類。
繼續參閱第一圖，獲得自組裝奈米粒子之後，接下來便是進行自組裝奈米粒子的取像與影像分析。如圖所示，利用電子顯微鏡擷取表面分子各種角度的影像後，將這些影像儲存於電腦中，用於下一階段的電腦運算過程中。當排列於奈米粒子表面上的表面分子有規則地排列時，有助於取得各種不同角度的影像。
根據上述的自組裝奈米粒子，本發明提供一種結構解析套組，適合用於解析各種待測分子的結構，主要是蛋白質結構，其中包含複數奈米粒子，各奈米粒子的表面上具有與複數待測分子接合的複數位置。該奈米粒子被應用至一影像分析系統及一電腦程式至少其中之一，以得出該複數待測分子的立體結構。該奈米粒子上更具有可供標定物質結合的位置，使奈米粒子可據以使標定物質自組裝於粒子表面，提供集中的分子各面向的影像訊號。以下提供兩個奈米粒子結合待測巨分子的具體實施例。
(以下實施例是根據期刊Nanotechnology 17(2006)4174-4182及成大工程科學系博士論文《單分子DNA微型磁箝操作平台之研發》之內容撰寫而成，請謝教授依本發明實際情形進一步修改)
1.結合修飾6-組氨酸的蛋白質與Fe3O4-NTA-Ni奈米粒子
(1) 6-組氨酸重組蛋白質之純化：
利用大腸桿菌(E. coli)以基因重組方式生產帶有6-組氨酸之蛋白質，將含有N端修飾6-組氨酸序列的蛋白質全長之cDNA的載體轉殖進入E. coli細胞。將轉殖後的E. coli細胞培養於LB培養液中，在37℃下放置6-8小時，當細菌濃度達到A600-0.5-1.0時，加入1 mM異丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)誘發重組基因表現，於37℃下再培養24小時。以離心收集菌液並溶解細胞以獲得最後的菌液，然後將細胞液於13,000rpm，4℃再離心10分鐘，以除去沉澱物。
(2)　與Fe3O4-NTA-Ni奈米粒子結合：
將細胞液之懸浮液與如前述製備方法獲得之Fe3O4-NTA-Ni奈米粒子(32 mg/ml)混合，然後以磁性分離所需蛋白質，即得到與Fe3O4-NTA-Ni奈米粒子結合之蛋白質。
若需使蛋白質脫離奈米粒子，在高濃度的咪唑(imidazole)環境下，咪唑分子會競爭組氨酸分子的配位位置，當兩個組氨酸分子被競爭掉後就會使蛋白質脫離粒子表面，而且咪唑的濃度越高則置換蛋白質的效率越高，但為了避免有類似結構蛋白質的非特異性結合，所以在清洗溶液中加入低濃度的咪唑，洗去非特異性吸附的結合蛋白質，然後再以高濃度咪唑作為釋放溶液將目標蛋白質從粒子表面釋放出來。運用此一脫離的過程，使得本發明用於解析結構套組中的奈米粒子可重複使用。
2.　結合硫醇基修飾之DNA與金奈米粒子
(1)以硫醇基修飾DNA分子：
本方法使用的DNA為具有一個黏著端(sticky end)的DNA分子，為了使DNA上具有所需的硫醇基，使用商業上可得的4-硫代胸腺嘧啶-5’-三磷酸鹽(4-thiothymidine-5’-triphosphate，S4-dTTP)。利用DNA聚合酶I將一般的去氧核糖核苷三磷酸鹽(dNTP)加入DNA的黏著端，而為了在DNA黏著端上合成S4-dTTP，還需要使用Klenow片段(Klenow fragment，3’→5’exo- )。首先，將75μg/ml DNA與0.1 mM dATP、0.1mM dGTP、0.2 mM S4-dTTP、5單位的Klenow fragment與10 μl 1 X EcoPol緩衝液進行30分鐘的DNA聚合反應。最後以酚及氯仿方法移除多餘的dNTP與酵素，純化出修飾的DNA。再以酒精沈澱法分離出DNA，並溶在100μl的去離子水中，此時DNA濃度約為100μg/ml。
由於未加入dCTP與加入兩倍量的S4-dTTP，將造成S4-T：G配對(pairing)與S4-T：A配對。使得DNA的黏著端產生多個硫醇基修飾的核苷酸，以期增強硫-金(S-Au)鍵結效率。
(2)結合DNA與奈米粒子：
經硫醇基修飾的DNA分子與金奈米粒子共同反應約10分鐘，即可與金奈米粒子的表面形成S-Au共價鍵結而產生硫醇基修飾之DNA與金奈米粒子之結合。
由於本發明奈米粒子具有容易製備、可運用既有工具解析等優勢，因此可將任意的待測分子，如未知結構的蛋白質，接附於本發明結構解析套組中的奈米粒子表面上，以本發明解析結構方法的一般流程，搭配影像分析系統及電腦程式，即可得出未知蛋白質的立體結構。
本發明用於解析結構之一般流程如第二三圖所示。第三二圖為本發明結構解析方法之流程圖。首先於步驟2310將待測分子接附於奈米粒子的表面，在步驟2320形成自組裝奈米粒子。然後利用影像分析系統於步驟2330擷取影像，所擷取的影像在步驟2340經過電腦程式計算，最後可於步驟2350獲得待測分子的立體結構。
以電子顯微鏡所取得的影像首先經過分類，再經傅立葉轉換(Fourier Transform)等處理，進而發展出分子的三維結構。經由分類後所得到的二維投影，為同一個三維結構在不同方向上的投影結果。若有大量且清晰之二維投影影像，且知道這些二維投影影像間的取向關係，即可重組成三維之結構。不論是粒子的分類還是三維重組的過程，都需要大量的運算，因此需要藉助電腦程式的協助來完成，常用的軟體如：EMAN、Dentascan等等。
較佳地，上述電子顯微鏡為冷凍電鏡。以冷凍電鏡重建以上述方法製備的自組裝奈米粒子的三維影像時，包括以下步驟：(參考Micro mo Biol 1999,63:862-922，請謝教授依本發明修改此段內容)
(1)玻璃態樣品的製備：取2-5 μl、0.05-5 mg/ml已純化的樣本懸浮液，置於塗覆多孔碳支撐薄膜的電子顯微鏡格網上，使格網漂浮於水滴或低張緩衝液上，以除去多餘的鹽類，然後將格網固定在電子顯微鏡的樣品觀察區中。以冷凍電鏡觀察的液體樣本必須保持或低於去玻璃化溫度(devitrification temperature，約為-140℃)，以避免樣本中的水轉化為結晶狀態。
(2)粒子的採集：放入樣本後，經過一段時間以穩定樣本平台(>15分鐘)，冷凍電鏡的格網即開始選擇顆粒平均分佈的樣品區，進行定位和拍照。為了獲得高分辯的結果，需要採集大量的粒子。如在分析核糖體結構時，為達到1.5nm的分辯率，需要採集29000個粒子的圖像，而要使分辯率達到1.15nm,則要70000個粒子。
(3)粒子參數的確定與分類：不同粒子之間的空間關係的確立需要五個參數，其中包含三個歐拉角(Eulerian angle)θ、Φ及ω用於確定方向；二個平移元素x及y用於確定粒子的位置。粒子分類不僅將大量的原始資料依據類似的方位壓縮成若干類，而且在分類的過程中經過平均消除了雜訊。
(4)3D重建：逆傅立葉轉換(reverse Fourier transform method)和反投影法(back-projection method)都可以用不同方向粒子的圖像重建3D結構。當擁有大量優質的二維投影圖像，並且知道它們之間的相互關係，就可以用角重組法進行三維重建。角重組法的基本原理：同一個三維對象的兩個不同二維投影之間總能找到一個共同的一維投影。
(5)粒子參量的最佳化：在以模型為基礎的最佳化方法(Model-Based Refinement)中，一旦初始重建的投影被產生，以方位辨識及最佳化流程進行粒子參數的最佳化，新計算出來的重建圖像又被用於下一輪的最佳化。如此反覆，直到模型投影和原初的圖像重合。最佳化流程有助於結合大量的影像以提高最終重建影像的訊號噪聲比(signal-to-noise ratio)
(6)提高分辨率：雖然樣品更易於觀測，但圖像的傅立葉轉換須經過對比轉移函數(contrast transfer fuction，CTF)調整。為了得到高分辨率的重建圖像，不僅相位要調整到預定的分辨率區域，幅度也要調整以補償CTF經過區域的減少效應。
(7)分辨率評估和結構解析：通過確定在作為分辨率功能的相應空間的兩個獨立的重建圖像的一致性，而評估重建圖像的有效分辨率。
本發明所提出的解析結構之方法，不僅操作方便，而且只需要利用既有解析病毒表面蛋白質的工具，就能夠獲得許多未知生物分子的結構，且能夠達到大量分析的效果，適合做為結構生物學研究、標靶治療及藥物開發之平台。
實施例
1.　一種結構解析方法，包含：將複數個巨分子接附於一奈米粒子的一表面，以形成一經修飾的自組裝奈米粒子；擷取該經修飾的奈米粒子的複數影像；基於該等影像將該表面上的該巨分子分類；以及以一電腦程式計算該巨分子的一立體結構。
2.　如實施例1所述之方法，其中該巨分子為一寡核苷酸、一蛋白質及其複合體其中之一，在該奈米粒子上有規則地排列。
3.　如上述任一實施例所述之方法，其中該寡核苷酸具有單股、雙股及三股結構其中之一。
4.　如上述任一實施例所述之方法，其中該奈米粒子為金奈米粒子、銀奈米粒子、氧化鐵奈米粒子、聚乳酸甘油酸(PLGA)奈米粒子及矽奈米粒子至少其中之一。
5.　如上述任一實施例所述之裝置，其中該經修飾自組裝的奈米粒子為一自我聚集單層膜(self-assembly monolayer，SAM)奈米粒子。
6.　如上述任一實施例所述之裝置，其中該等影像係藉由一電子顯微鏡擷取，在該電腦程式中進行一傅立葉轉換。
7.　一種結構解析方法，包含：改變一奈米粒子的一表面性質；擷取該奈米粒子的複數影像；基於該等影像將該奈米粒子上的複數表面分子進行分類；以及計算該等表面分子的一立體結構。
8.　一種用於結構解析之奈米粒子，包含：複數個表面分子，該複數表面分子與複數待測巨分子交聯而接附於該奈米粒子的一表面上，使該已接附的奈米粒子具有一自我組裝該複數待測巨分子之能力；藉此，該奈米粒子被應用至一影像分析系統及一電腦程式至少其中之一，以得出該複數巨分子的一立體結構。
9.　一種結構解析套組，包含：複數奈米粒子，各奈米粒子的一表面上具有與複數待測分子接合的複數位置；該奈米粒子被應用至一影像分析系統及一電腦程式至少其中之一，以得出該複數待測分子的一立體結構。
10.　一種結構解析方法，包含：改變一奈米粒子的一表面性質；擷取該奈米粒子上的複數待測分子的複數影像；以及計算該等待測分子的一立體結構。
11.　一種結構解析方法，包含：擷取在一奈米粒子上的複數待測分子的複數影像；以及計算該等待測分子的一立體結構。
12.　一種結構解析方法，包含程式化運算在一奈米粒子上的複數待測分子而獲知該等待測分子的一立體結構。
是以，縱使本案已由上述之實施例所詳細敘述而可由熟悉本技藝之人士任施匠思而為諸般修飾，然皆不脫如附申請專利範圍所欲保護者。
100．．．自組裝奈米粒子
110．．．奈米粒子
120．．．表面分子
310．．．在奈米粒子表面接附待測分子
320．．．形成自組裝奈米粒子
330．．．擷取影像
340．．．電腦程式運算
350．．．獲得待測分子之立體結構
第一圖為本案以奈米粒子解析表面分子立體結構的示意圖。
第二圖為第一圖中自組裝奈米粒子100與待測分子結合之細部結構圖。
第三圖為本發明結構解析方法之流程圖。
100．．．自組裝奈米粒子
110．．．奈米粒子
120．．．表面分子

Claims (12)

  1. 一種結構解析方法，包含：將複數個巨分子接附於一奈米粒子的一表面，以形成一經修飾的自組裝奈米粒子；擷取該經修飾的奈米粒子的複數影像；基於該等影像將該表面上的該巨分子分類；以及以一電腦程式計算該巨分子的一立體結構。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該巨分子為一寡核苷酸、一蛋白質及其複合體其中之一，在該奈米粒子上有規則地排列。
  3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該寡核苷酸具有單股、雙股及三股結構其中之一。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該奈米粒子為金奈米粒子、銀奈米粒子、氧化鐵奈米粒子、聚乳酸甘油酸(PLGA)奈米粒子及矽奈米粒子至少其中之一。
  5. 如申請專利範圍第1項之裝置，其中該經修飾的自組裝奈米粒子為一自我聚集單層膜(self-assembly monolayer，SAM)奈米粒子。
  6. 如申請專利範圍第1項之裝置，其中該等影像係藉由一電子顯微鏡擷取，在該電腦程式中進行一傅立葉轉換。
  7. 一種結構解析方法，包含：改變一奈米粒子的一表面性質；擷取該奈米粒子的複數影像；基於該等影像將該奈米粒子上的複數表面分子進行分類；以及計算該等表面分子的一立體結構。
  8. 一種用於結構解析之奈米粒子，包含：複數個表面分子，該複數表面分子與複數待測巨分子交聯而接附於該奈米粒子的一表面上，使該已接附的奈米粒子具有一自我組裝該複數待測巨分子之能力；藉此，該奈米粒子被應用至一影像分析系統及一電腦程式至少其中之一，以得出該複數巨分子的一立體結構。
  9. 一種結構解析套組，包含：複數奈米粒子，各奈米粒子的一表面上具有與複數待測分子接合的複數位置；該奈米粒子被應用至一影像分析系統及一電腦程式至少其中之一，以得出該複數待測分子的一立體結構。
  10. 一種結構解析方法，包含：改變一奈米粒子的一表面性質；擷取該奈米粒子上的複數待測分子的複數影像；以及計算該等待測分子的一立體結構。
  11. 一種結構解析方法，包含：擷取在一奈米粒子上的複數待測分子的複數影像；以及計算該等待測分子的一立體結構。
  12. 一種結構解析方法，包含程式化運算在一奈米粒子上的複數待測分子而獲知該等待測分子的一立體結構。
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