TW201321754A - 胃癌之生物標記 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種藉由偵測BCL6B基因之抑制表現來診斷及確定個體之胃癌預後之方法，該BCL6B基因之抑制表現在一些情況下歸因於此基因之基因組序列中甲基化程度增加。亦提供一種適用於該種方法之套組及裝置。此外，本發明提供一種藉由增加BCL6B基因表現或活性來治療胃癌之方法。

Description

胃癌之生物標記
胃癌(gastric cancer)，亦稱為胃癌(stomach cancer)，為世界範圍內第四常見癌症，每年診斷出約1,000,000個病例。胃癌為一種具有高死亡率之疾病(每年約800,000人死亡)，從而使其成為世界範圍內繼肺癌之後癌症死亡之第二常見原因。胃癌之發生率在男性之中及在發展中國家(包括許多亞洲國家)中顯著更高。
胃癌在其早期，通常保持無症狀或僅表現出非特異性症狀，因此在許多情況下在疾病達至晚期之前無法作出診斷。此導致通常不良預後：診斷為胃癌之個體之80-90%發生轉移，早期診斷出之個體之65%及晚期診斷出之個體之少於15%具有6個月之存活率。
由於胃癌之盛行性及其對患者之預期壽命之重大意義，因此需要用以診斷、監測及治療胃癌之新方法。本發明滿足此需求及其他相關需求。
在第一態樣中，本發明提供一種偵測個體之胃癌之方法。該方法包括以下步驟：(a)量測取自個體之樣品中BCL6B之表現程度；及(b)將在步驟(a)中所獲得之表現程度與標準對照組進行比較。當標準對照組偵測到BCL6B之表現程度與標準對照組相比減少時，指示個體可能患有胃癌。典型地，該方法中所用之樣品為胃黏膜樣品，例如包括胃上皮細胞之胃黏膜樣品。 在一些實施例中，BCL6B之表現程度為BCL6B蛋白質濃度。在其他實施例中，BCL6B之表現程度為BCL6B mRNA濃度。當量測BCL6B蛋白質濃度時，步驟(a)可包括使用可特異性結合BCL6B蛋白質之抗體進行免疫分析。舉例而言，可使用西方墨點分析(Western Blot analysis)。在其他情況下，步驟(a)可包括質譜分析或基於雜交之分析(諸如與微陣列、螢光探針或分子信標之雜交)。
在一些實施例中，步驟(a)可包括擴增反應，諸如聚合酶鏈反應(PCR)，尤其為逆轉錄酶-PCR(RT-PCR)。在一些情況下，偵測步驟包括聚核苷酸雜交分析，例如南方墨點分析(Southern Blot analysis)、北方墨點分析(Northern Blot analysis)或原位雜交分析。在一些情況下，聚核苷酸探針用於聚核苷酸雜交分析中以便與SEQ ID NO：9、10、11、12、18、19或20或其互補序列雜交。聚核苷酸探針視情況包括或具有與其連接之可偵測部分。
在某些實施例中，當進行胃癌測試之個體首先被指示患有胃癌時，該方法可進一步包括在一段時間之後使用來自個體之樣品類型樣品(亦即藉由相同或相似方式自胃之一般組織類型或解剖學位置收集之樣品)重複步驟(a)。當在該段時間之後觀測到BCL6B(蛋白質抑或mRNA)之表現程度比初始步驟(a)之量增加時，指示胃癌有改善，而減少時指示胃癌有惡化。
在第二態樣中，本發明提供一種偵測個體之胃癌之方法。該方法包括此等步驟：(a)用可差異性地修飾甲基化及 未經甲基化DNA之試劑處理取自該個體之樣品；及(b)在步驟(a)之處理之後，分析(諸如定序)含CpG之基因組序列以確定各CpG經甲基化抑或未經甲基化，該含CpG之基因組序列為SEQ ID NO：9、18、19或20之至少一個區段(達至且包括SEQ ID NO：9、18、19或20之全長)且含有至少一個CpG二核苷酸對。含CpG之基因組序列中一個甲基化CpG之存在指示個體可能患有胃癌。
在一些實施例中，含CpG之基因組序列含有兩個或兩個以上CpG(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或10個以上CpG對)，且當所有CpG之至少50%經甲基化時，指示個體可能患有胃癌。含CpG之基因組序列之長度可變化，但應足夠長以包括至少一個CpG。典型地，含CpG之基因組序列為SEQ ID NO：9、18、19或20之至少15個連續核苷酸之區段，且可為SEQ ID NO：9、18、19或20之至少20、30、50、100、200或200個以上連續核苷酸之區段，或甚至為SEQ ID NO：9、18、19或20之全長。在一個實例中，含CpG之基因組序列為BCL6B啟動子序列-95至+95 bp(相對於轉錄起始位點)(SEQ ID NO：18)之區段。在另一個實例中，含CpG之基因組序列為SEQ ID NO：19，其含有9個CpG位點。所有CpG中之至少5個經甲基化指示個體患有胃癌。
典型地，樣品為胃黏膜樣品或包含上皮細胞之胃組織樣品。所主張之方法可進一步包括一些重複步驟。舉例而言，當受檢驗之個體被指示患有胃癌時，可在一段時間之 後使用來自個體之樣品類型樣品(亦即藉由相同或相似方式自胃之一般組織類型或解剖學位置收集之樣品)重複步驟(a)及(b)。在該段時間之後甲基化CpG數目比自初始步驟(b)測定之甲基化CpG數目增加時指示胃癌有惡化，而減少時指示胃癌有改善。
在一些實施例中，可差異性地修飾甲基化及未經甲基化DNA之試劑為優先分裂甲基化DNA之酶、優先分裂未經甲基化DNA之酶或亞硫酸氫鹽。在其他實施例中，步驟(b)包括擴增反應及/或對DNA分子進行定序之過程。
在第三態樣中，本發明提供一種偵測個體之胃癌之套組。該套組含有(1)可提供BCL6B蛋白質或BCL6B mRNA之平均量之標準對照組；及(2)可特異性且定量鑑定BCL6B蛋白質或BCL6B mRNA之試劑。在一些情況下，試劑可為可特異性結合BCL6B蛋白質之抗體，或試劑可為可與BCL6B mRNA雜交之聚核苷酸探針。舉例而言，聚核苷酸探針具有SEQ ID NO：12所示之核苷酸序列。典型地，試劑包括可偵測部分。在一些情況下，該套組可包括一些其他組分，諸如可在擴增反應中特異性擴增SEQ ID NO：10或11或該等序列之互補序列之至少一個區段的兩個寡核苷酸引子。在一些情況下，該套組將進一步包括說明書手冊。
在第四態樣中，本發明提供一種抑制胃癌細胞生長之方法。該方法包含以下步驟：將胃癌細胞與有效量之(1)包含SEQ ID NO：17所示之胺基酸序列之多肽；(2)包含編碼SEQ ID NO：17之聚核苷酸序列之核酸；或(3)去甲基化試劑(諸 如5-氮雜-2'-脫氧胞苷或5-Aza)接觸。在一些情況下，核酸為包含可操作地連接於編碼SEQ ID NO：17之聚核苷酸序列(諸如包含SEQ ID NO：10或11所示之核苷酸序列之核酸)之啟動子的表現卡匣。啟動子視情況為上皮細胞特異性啟動子。抑制胃癌細胞生長之方法可活體外(例如當胃癌細胞位於細胞培養物中時)、離體(例如當胃癌細胞取自患者且隨後保持於細胞培養物中時)或活體內(例如當胃癌細胞位於患者體內時)進行。
在第五態樣中，本發明提供一種衍生自BCL6B基因之cDNA或基因組序列之分離核酸，其可用作偵測或擴增BCL6B序列之探針或引子。該核酸可具有與SEQ ID NO：9、10、11、12、18、19或20之約20-100個連續核苷酸之區段至少95%一致、視情況100%一致的核苷酸序列，或其可具有為該種區段之互補序列之核苷酸序列。在一些實施例中，該核酸與可偵測部分結合。
此外，本發明提供一種偵測胃癌之套組。該套組包含：(1)可差異性地修飾甲基化及未經甲基化DNA之試劑；及(2)指示物，其在用該試劑處理來自進行胃癌測試之個體之樣品之後，可確定含CpG之基因組序列中之各CpG經甲基化抑或未經甲基化。含CpG之基因組序列為SEQ ID NO：9、18、19或20之至少一個區段且包含至少一個CpG。本發明亦提供一種抑制胃癌細胞生長之組合物。該組合物含有有效量之(1)包含SEQ ID NO：17所示之胺基酸序列之多肽(例如由SEQ ID NO：17之胺基酸序列組成之多肽)；或 (2)包含編碼SEQ ID NO：17之聚核苷酸序列之核酸(例如包含SEQ ID NO：10或11之聚核苷酸序列之核酸序列)；及醫藥學上可接受之載劑。在此方面，本發明提供一種包含SEQ ID NO：17所示之胺基酸序列之多肽(例如由SEQ ID NO：17之胺基酸序列組成之多肽)或包含編碼SEQ ID NO：17之聚核苷酸序列之核酸(例如包含SEQ ID NO：10或11之聚核苷酸序列之核酸序列)的用途，其用於製備用於抑制胃癌細胞生長之藥劑中。此外，本發明提供一種包含SEQ ID NO：9、10、11、12、18、19或20或其互補序列之區段或由SEQ ID NO：9、10、11、12、18、19或20或或其互補序列之區段組成之聚核苷酸序列的用途，其用於製備用於偵測胃癌之套組中。該區段典型地為SEQ ID NO：9、10、11、12、18、19或20之約20-100個連續核苷酸。
定義
如本文中所用之術語「 BCL6B基因」或「BCL6B蛋白質」係指任何天然存在之變異體或突變體、種間同系物或直系同源物、或人類BCL6B基因或BCL6B蛋白質的人工變異體。人類BCL6B基因位於染色體17p13.1上(Sakashita等人，Biochem Biophys Res Commun,291,567-573,2002)。人類野生型BCL6B基因之cDNA序列如GenBank寄存編號NM_181844.3所示(本文中作為SEQ ID NO：11提供)，其編碼480個胺基酸之BCL6B蛋白質(本文中作為SEQ ID NO：17提供)，該蛋白質為一種轉錄阻遏蛋白。本申請案含義內 之BCL6B蛋白質典型地與人類野生型BCL6B蛋白質具有至少80%或90%或95%或更高之序列一致性。
在本發明中，術語「胃癌(gastric cancer)」及「胃癌(stomach cancer)」具有相同含義，且係指胃部或胃細胞之癌症。該等癌症可為發生於胃內層(黏膜或胃上皮)中之腺癌，且可位於胃之幽門部、體部或賁門部(下部、體部及上部)中。「胃癌細胞」為具有胃癌特徵之胃上皮細胞且涵蓋癌前細胞，該癌前細胞處於向癌細胞轉化之早期或傾向於轉化為癌細胞。該等細胞可展現出癌細胞之一或多種表型性狀特徵。
在本發明中，除非內容中明確表明，否則術語「或」通常以其包括「及/或」之意義使用。
如本文中所用，術語「基因表現」用於指DNA轉錄形成編碼特定蛋白質(例如人類BCL6B蛋白質)之RNA分子；或由聚核苷酸序列所編碼之蛋白質之轉譯。換言之，在本發明中，由所關注基因(例如人類BCL6B基因)所編碼之mRNA濃度及蛋白質濃度兩者均涵蓋在術語「基因表現」內。
在本發明中，術語「生物樣品」或「樣品」包括諸如活檢及屍檢樣品之組織切片；及出於組織學目的採集之冷凍切片；或該等樣品中任一者之經加工形式。生物樣品包括血液及血液成分或產物(例如血清、血漿、血小板、紅血球及其類似物)、痰或唾液、淋巴及舌組織、培養之細胞(例如原代培養物、外植體及轉型之細胞)、大便、尿液、 胃活檢組織等。生物樣品典型地獲自真核生物，該真核生物可為哺乳動物、可為靈長動物且可為人類個體。
在本發明中，術語「活檢」係指移除組織樣品用於診斷或預後評估之過程及組織樣品本身。此項技術中已知之任何活檢技術均可應用於本發明之診斷及預後方法。所應用之活檢技術將視待評估之組織類型(例如舌、結腸、前列腺、腎、膀胱、淋巴結、肝、骨髓、血細胞、胃組織等)以及其他因素而定。代表性活檢技術包括(但不限於)切除活檢、切口活檢、針吸活檢、手術活檢及骨髓活檢，且可包括結腸鏡檢。各種活檢技術為熟習此項技術者所熟知，該等熟習此項技術者將用最少實驗在該等活檢技術之間作出選擇且實施其。
在本發明中，術語「分離的」核酸分子意謂與通常與該分離之核酸分子相聯之其他核酸分子隔開的核酸分子。因此，「分離的」核酸分子包括(但不限於)不含生物基因組(自其衍生分離之核酸)中天然側接於核酸之一端或兩端之核苷酸序列的核酸分子(例如藉由PCR或限制性核酸內切酶消化產生之cDNA或基因組DNA片段)。通常將該種分離之核酸分子引入載體(例如選殖載體或表現載體)中，以便方便操作或產生融合核酸分子。此外，分離之核酸分子可包括經工程改造之核酸分子，諸如重組或合成核酸分子。存在於例如核酸庫(例如cDNA或基因組庫)或含有限制性消化之基因組DNA之凝膠(例如瓊脂糖或聚丙烯醯胺)內之數百至數百萬其他核酸分子之中的核酸分子不為「分離的」核 酸。
術語「核酸」或「聚核苷酸」係指單股抑或雙股形式之脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特別限制，夠則術語涵蓋含有天然核苷酸之已知類似物的核酸，該等類似物具有與參照核酸相似之結合性質且以與天然存在之核苷酸相似之方式代謝。除非另有指示，否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其經保守修飾之變異體(例如簡併密碼子取代)、對偶基因、直系同源物、單核苷酸多形現象(SNP)及互補序列以及明確指示之序列。特定言之，簡併密碼子取代可藉由產生一或多個所選(或全部)密碼子之第三位置經混合鹼基及/或脫氧肌苷殘基取代的序列來達成(Batzer等人，Nucleic Acid Res. 19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem. 260：2605-2608(1985)；以及Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。術語核酸可與基因、cDNA及基因編碼之mRNA互換使用。
術語「基因」意謂參與產生多肽鏈之DNA區段；其包括編碼區前後參與基因產物轉錄/轉譯及轉錄/轉譯調節之區域(前導區及尾區)，以及個別編碼區段(外顯子)之間的介入序列(內含子)。
在本申請案中，術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」可在本文中互換使用來指胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於其中一或多個胺基酸殘基為相應天然存在之胺基酸之人工化學模擬物的胺基酸聚合物以及天然存在之胺基酸聚合物及非天然存在之胺基酸聚合物。如本文中所用，該等術 語涵蓋具有任何長度之胺基酸鏈，包括全長蛋白質(亦即抗原)，其中胺基酸殘基藉由共價肽鍵連接。
術語「胺基酸」係指天然存在及合成胺基酸以及以與天然存在之胺基酸相似之方式發揮功能的胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然存在之胺基酸為由遺傳密碼編碼之胺基酸以及隨後經修飾之彼等胺基酸，例如羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸及O-磷絲胺酸。出於本申請案之目的，胺基酸類似物係指具有與天然存在之胺基酸相同之基本化學結構(亦即結合至氫、羧基、胺基及R基之碳)的化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。該等類似物具有經修飾之R基(例如正白胺酸)或經修飾之肽主鏈，但保留與天然存在之胺基酸相同之基本化學結構。出於本申請案之目的，胺基酸模擬物係指具有與胺基酸之通常化學結構不同之結構但以與天然存在之胺基酸相似之方式發揮功能的化合物。
胺基酸可包括具有非天然存在之D-對掌性之胺基酸(如WO 01/12654中所揭示)，其可改良包含一或多個該等D-胺基酸之多肽的穩定性(例如半衰期)、生物可用性及其他特徵。在一些情況下，治療性多肽之一或多個且可能全部胺基酸具有D-對掌性。
在本文中，胺基酸可藉由通常已知之三字母符號抑或藉由IUPAC-IUB生物化學命名委員會(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推薦之單字母符號來提及。同樣，核苷酸可藉由核苷酸之通常接受之單字母 代碼來提及。
如本文中所用，術語「一致的」或「一致性」百分比在描述兩個或兩個以上聚核苷酸或胺基酸序列之情形下係指：當如使用以下序列比較演算法中之一者或藉由人工比對及目視檢查進行量測，在比較窗或指定區域內比較且比對最大對應性時，所得為相同或具有指定百分比之相同胺基酸殘基或核苷酸的兩個或兩個以上序列或子序列(例如本發明方法中所用(例如用於治療胃癌)之變異體BCL6B蛋白質與參照序列(例如野生型人類BCL6B蛋白質)具有至少80%序列一致性，較佳85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性)。該等序列隨後被稱為「實質上一致的」。關於聚核苷酸序列，此定義亦指測試序列之互補序列。一致性較佳存在於為至少約50個胺基酸或核苷酸長的區域上，或更佳存在於為75-100個胺基酸或核苷酸長的區域上。
為了序列比較，一個序列典型地充當與測試序列進行比較之參照序列。當使用序列比較演算法時，將測試及參照序列輸入電腦，必要時，指定子序列座標，且指定序列演算法程式參數。可使用預設程式參數，或可指定替代性參數。隨後基於程式參數，序列比較演算法計算出測試序列相對於參照序列之序列一致性百分比。在核酸及蛋白質之序列比較中，使用下文論述之BLAST及BLAST 2.0演算法及預設參數。
如本文中所使用，「比較窗」包括參考具有選自由20至 600、通常約50至約200、更通常約100至約150組成之群之連續位置數中任一者的區段，其中可在將一個序列與具有相同連續位置數之參照序列進行最佳比對後，將該兩個序列進行比較。用於比較之序列比對方法為此項技術中所熟知。可藉由以下來進行用於比較之序列最佳比對：例如Smith & Waterman,Adv.Appl.Math.2：482(1981)之局部同源性演算法、Needleman & Wunsch,J.Mol.Biol.48：443(1970)之同源性比對演算法、Pearson & Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)之相似性檢索方法、此等演算法之電腦化實施(威斯康辛遺傳學套裝軟體(Wisconsin Genetics Software Package)中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，遺傳學電腦集團(Genetics Computer Group),575 Science Dr.,Madison,WI)或人工比對及目視檢查(參見例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人編1995增刊))。
適用於測定序列一致性百分比及序列相似性之演算法的實例為BLAST及BLAST 2.0演算法，其分別描述於Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410及Altschul等人。(1977)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中。可在國家生物技術資訊中心(the National Center for Biotechnology Information)網站ncbi.nlm.nih.gov公開獲得用於執行BLAST分析之軟體。該演算法包括首先藉由鑑定查詢序列中長度為W之短字符來鑑定高計分序列對(HSP)，查詢序列中長度為W之該等短字符在與資料庫序列中具有相同長 度之字符比對時，匹配抑或滿足某正值之臨限計分T。T被稱為鄰近字符計分臨限(Altschul等人，前述)。此等初始鄰近字符命中充當起始檢索之基礎以得到含有其之更長HSP。隨後，將字符命中沿各序列向兩個方向延伸，直至可增加累加比對計分。就核苷酸序列而言，使用參數M(匹配殘基對之獎勵計分；始終>0)及N(錯配殘基之處罰計分；始終<0)來計算累加計分。就胺基酸序列而言，使用計分矩陣來計算累加計分。當出現以下情況時停止各方向上之字符命中延伸：累加比對計分自其最大達成值下降X量；累加計分因一或多個負計分殘基比對之累積而達至零或零以下；或達至任一序列之末端。BLAST演算法參數W、T及X決定了比對之敏感性及速度。BLASTN程式(就核苷酸序列而言)使用字長(W)28、期望值(E)10、M=1、N=-2及雙股比較作為預設值。就胺基酸序列而言，BLASTP程式使用字長(W)3、期望值(E)10及BLOSUM62計分矩陣作為預設值(參見Henikoff及Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))。
BLAST演算法亦執行兩個序列之間的相似性之統計分析(參見例如Karlin及Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。BLAST演算法提供之一項相似性量度為最小和機率(P(N))，其提供兩個核苷酸或胺基酸序列之間偶然發生匹配之機率的指示。舉例而言，若在測試核酸與參照核酸比較中，最小和機率小於約0.2、更佳小於約0.01且最佳小於約0.001，則認為該核酸與參照序列為相 似的。
如下文所述，兩個核酸序列或多肽實質上一致之指示為由第一核酸編碼之多肽與針對由第二核酸編碼之多肽產生的抗體具有免疫交叉反應性。因此，例如在一個多肽與第二多肽僅在保守取代方面不同時，該等兩個肽典型地為實質上一致的。如下文所述，兩個核酸序列實質上一致之另一指示為兩個分子或其互補序列可在嚴格條件下彼此雜交。兩個核酸序列實質上一致之又另一指示為可使用相同引子來擴增該序列。
在本發明中，術語「嚴格雜交條件」及「高嚴格性」係指探針雜交至其標靶子序列(典型地位於複雜核酸混合物中)但不至其他序列所處之條件。嚴格條件為序列依賴性的，且在不同情況下將不同。較長之序列在較高之溫度下特異性地雜交。核酸雜交之廣泛指導見於Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)中，且將容易為熟習此項技術者所理解。一般而言，嚴格條件經選擇為比確定之離子強度、pH值下特定序列之熱熔點(Tm)低約5-10℃。Tm為平衡時與標靶互補之探針中之50%雜交至標靶序列所處的溫度(在確定之離子強度、pH值及核酸濃度下)(因為標靶序列係以過量存在，所以在Tm下，在平衡時，50%探針被佔據)。亦可在添加諸如甲醯胺之去穩定劑的情況下達成嚴格條件。就選擇性或特 異性雜交而言，正信號為背景之至少兩倍，較佳為10倍於背景之雜交。例示性嚴格雜交條件可為如下：在42℃下50%甲醯胺、5×SSC及1% SDS培育；或在65℃下5×SSC、1% SDS培育，在65℃下0.2×SSC及0.1% SDS中洗滌。
若在嚴格條件下不彼此雜交之核酸所編碼之多肽為實質上一致的，則其仍為實質上一致的。舉例而言，當使用遺傳密碼所允許之最大密碼子簡併性產生核酸複本時，發生此情況。在該等情況下，核酸典型地在中等嚴格雜交條件下雜交。例示性「中等嚴格雜交條件」包括：在37℃下在40%甲醯胺、1 M NaCl、1% SDS之緩衝液中雜交，及在45℃下在1×SSC中洗滌。正雜交為背景之至少兩倍。熟習此項技術者將容易認識到，替代性雜交及洗滌條件可用於提供具有相似嚴格性之條件。用於確定雜交參數之其他準則提供於眾多參考文獻中，例如Current Protocols in Molecular Biology，編者Ausubel等人。
「表現卡匣」為重組或合成產生之核酸構築體，其具有允許特定聚核苷酸序列在宿主細胞中轉錄之一系列指定核酸元件。表現卡匣可為質體、病毒基因組或核酸片段之一部分。典型地，表現卡匣包括可操作地連接於啟動子之待轉錄之聚核苷酸。在此情形下，「可操作地連接」意謂將兩個或兩個以上遺傳元件(諸如聚核苷酸編碼序列及啟動子)置於允許元件發揮適當生物功能(諸如啟動子導引編碼序列轉錄)之相對位置。可存在於表現卡匣中之其他元件包括可增強轉錄(例如增強子)及終止轉錄(例如終止子)之 元件，以及賦予表現卡匣所產生之重組蛋白質某種結合親和力或抗原性的元件。
如本文中所用之術語「亞硫酸氫鹽」涵蓋能夠將胞嘧啶(C)化學轉化為尿嘧啶(U)而不會化學修飾甲基化胞嘧啶且因此可用來基於DNA之甲基化狀態差異性地修飾DNA序列之所有類型的亞硫酸氫鹽，諸如亞硫酸氫鈉。
如本文中所用，可「差異性地修飾」甲基化或未經甲基化DNA之試劑涵蓋在一過程中可與甲基化及未經甲基化DNA差異性反應之任何試劑，經由該過程，自甲基化及未經甲基化DNA產生可區別之產物或可定量區別之結果(例如結合或沈澱之程度)，從而允許鑑定DNA甲基化狀態。該等過程可包括(但不限於)化學反應(諸如藉由亞硫酸氫鹽之未經甲基化C→U之轉化)、酶處理(諸如藉由甲基化依賴性核酸內切酶之分裂)、結合及沈澱。因此，優先分裂甲基化DNA之酶為在DNA經甲基化時能以高得多之效率分裂DNA分子之酶，而優先分裂未經甲基化DNA之酶在DNA未經甲基化時展現現出顯著更高之效率。在本發明之情形下，「差異性地修飾」甲基化或未經甲基化DNA之試劑亦指在其與DNA序列結合或DNA序列之沈澱中視其甲基化狀態而表現出差異性能力的任何試劑。該等試劑中之一類由甲基化DNA結合蛋白質組成。
如本文中所用之「含CpG之基因組序列」係指位於個體之基因組中確定位置之DNA序列區段。典型地，「含CpG之基因組序列」為至少15個連續核苷酸長的，且含有至少 一個CpG對。在一些情況下，其可為至少18、20、25、30、50、80、100、150、200、250或300個連續核苷酸長的，且含有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30個CpG對。就給定位置處(例如人類BCL6B基因組序列區域(諸如含有啟動子及外顯子1之區域內))之任一「含CpG之基因組序列」而言，核苷酸序列變異可存在於個體間及甚至同一個體之對偶基因間。此外，「含CpG之基因組序列」可涵蓋轉錄或不轉錄為蛋白質產物之核苷酸序列，且核苷酸序列可為蛋白質編碼序列、非蛋白質編碼序列(諸如轉錄啟動子)或其組合。
術語「免疫球蛋白」或「抗體」(本文中可互換使用)係指具有由兩個重鏈及兩個輕鏈組成之基本四多肽鏈結構的抗原結合蛋白，該等鏈例如藉由鏈間二硫鍵來穩定化，該抗原結合蛋白具有特異地結合抗原之能力。重鏈及輕鏈兩者均摺疊為結構域。
術語「抗體」亦指可用於免疫親和力分析中之抗體抗原結合片段及抗原決定基結合片段，例如Fab片段。存在很多充分表徵之抗體片段。因此，例如，胃蛋白酶消化鉸鏈區中之二硫鍵之C端的抗體以產生F(ab)'2，即Fab之二聚體，該Fab自身為藉由二硫鍵連接至VH-CH1之輕鏈。可在溫和條件下還原F(ab)'2以破壞鉸鏈區中之二硫鍵，從而將(Fab')2二聚體轉化為Fab'單體。Fab'單體本質上為具有一部分鉸鏈區之Fab(關於其他抗體片段之更詳細描述，參見例如Fundamental Immunology,Paul編，Raven Press,N.Y. (1993))。儘管根據完整抗體之消化來定義各種抗體片段，但技術人員應理解，可化學地抑或藉由利用重組DNA方法來重新合成片段。因此，術語抗體亦包括藉由整個抗體之修飾產生抑或使用重組DNA方法合成的抗體片段。
當在描述特定分子與蛋白質或肽之結合關係的情形下使用時，片語「特異性地結合」係指可在蛋白質及其他生物製劑之異質群體中確定蛋白質之存在的結合反應。因此，在指定結合分析條件下，指定結合劑(例如抗體)結合至特定蛋白質至少兩倍於背景，且實質上不以顯著量結合至樣品中存在之其他蛋白質。在該等條件下，抗體之特異性結合可能需要選擇對特定蛋白質具有特異性之抗體，或對一蛋白質但不對其相似「姐妹」蛋白質具有特異性之抗體。多種免疫分析模式可用於選擇與特定蛋白質或以特定形式具有特異性免疫反應性之抗體。舉例而言，固相ELISA免疫分析常規地用於選擇與蛋白質具有特異性免疫反應性之抗體(關於可用於測定特異性免疫反應性之免疫分析模式及條件之描述，參見例如Harlow & Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(1988))。特異性或選擇性結合反應典型地為背景信號或雜訊之至少兩倍，且更典型地大於背景之10至100倍。另一方面，當在提及一個聚核苷酸序列與另一聚核苷酸序列形成雙股複合物之情形下使用時，術語「特異性地結合」描述基於華特生-克里克(Watson-Crick)鹼基配對之「聚核苷酸雜交」(如在術語「聚核苷酸雜交方法」之定義中所提供)。
如本申請案中所用，「增加」或「減少」係指與比較對照在量上可偵測出之正或負變化，該比較對照例如為建立之標準對照組(諸如非癌性胃組織中可見之BCL6B mRNA或蛋白質之平均表現程度)。增加為典型地為對照值之至少10%或至少20%或50%或100%之正變化，且可高達對照值之至少2倍、至少5倍或甚至10倍。相似地，減少為典型地為對照值之至少10%或至少20%、30%或50%或甚至高達至少80%或90%之負變化。指示與比較基準之量變化或差異之其他術語(諸如「多於」、「少於」、「高於」及「低於」)在本申請案中以與上述相同之方式使用。相比之下，術語「實質上相同的」或「實質上無變化的」指示與標準對照組值在量上具有極小變化或無變化，與標準對照組之變化典型地在標準對照組之±10%以內，或±5%、±2%或甚至更小以內。
如本文中所用之「聚核苷酸雜交方法」係指基於預定聚核苷酸序列在適當雜交條件下與具有已知序列之聚核苷酸探針形成華特生-克里克鹼基配對之能力，來偵測預定聚核苷酸序列之存在及/或量的方法。該等雜交方法之實例包括南方墨點、北方墨點及原位雜交。
如本文中所用之「引子」係指可在擴增方法(諸如聚合酶鏈反應(PCR))中用來基於對應於所關注基因(例如人類BCL6B之cDNA或基因組序列或其一部分)之聚核苷酸序列擴增核苷酸序列的寡核苷酸。用於擴增聚核苷酸序列之至少一個PCR引子典型地對彼聚核苷酸序列具有序列特異 性。引子之確切長度將視多種因素而定，該等因素包括溫度、引子來源及所用方法。舉例而言，在診斷及預後應用中，視標靶序列之複雜性而定，寡核苷酸引子典型地含有至少10或15或20或25或25個以上核苷酸，但其可含有更少核苷酸或更多核苷酸。確定引子適當長度中涉及之因素容易為一般熟習此項技術者所知。特定實施例中所用之引子如本發明之表1中所示，其中指定了其特定應用。在本發明中，術語「引子對」意謂雜交至標靶DNA分子之相反股或至側接於待擴增核苷酸序列之標靶DNA區域的引子對。在本發明中，術語「引子位點」意謂與引子雜交之標靶DNA或其他核酸的區域。
「標記」、「可偵測標記」或「可偵測部分」為可藉由光譜學、光化學、生物化學、免疫化學、化學或其他物理方式進行偵測之組成部分。舉例而言，適用之標記包括32P、螢光染料、電子密度試劑、酶(例如如ELISA中常用之酶)、生物素、地高辛(digoxigenin)或可成為可偵測的(例如藉由將放射性組分併入肽中)或用於偵測抗體與肽之特異性反應的半抗原及蛋白質。可偵測標記典型地連接至具有確定結合特徵之探針或分子(例如具有已知結合特異性之多肽或聚核苷酸)，以便允許可容易地偵測探針(及因此其結合標靶)之存在。
如本文中所用之「標準對照組」係指存在於建立之正常無疾病組織樣品(例如正常胃上皮組織樣品)中之預定量或濃度的聚核苷酸序列或多肽(例如BCL6B mRNA或蛋白 質)。標準對照組值適用於本發明方法，以充當用於比較測試樣品中所存在之BCL6B mRNA或蛋白質之量的基準。充當標準對照組之建立樣品提供在不患有如習知地定義之任何胃病(尤其胃癌)之平均、健康人之胃上皮組織樣品(例如胃黏膜)中典型的BCL6B mRNA或蛋白質平均量。標準對照組值可視樣品之性質以及其他因素而變化，該等其他因素諸如為建立該種對照值所基於之個體的性別、年齡、種族。
當在描述無如習知地定義之任何胃病(尤其胃癌)之健康人的情形下使用時，術語「平均」係指可代表隨機選擇之無任何胃病(尤其胃癌)之健康人群之人之胃組織(例如上皮組織或胃黏膜)中可見的某些特徵，尤其為人類BCL6B mRNA或BCL6B蛋白質之量。此所選之群應包含充足數目之人，以使得此等個體之中之胃黏膜中之BCL6B mRNA或蛋白質的平均量可以合理準確性反映一般健康人群中BCL6B mRNA/蛋白質之對應量。此外，所選之人群通常與胃組織樣品被用於測試胃癌指示之個體具有相似年齡。此外，亦應考慮諸如性別、種族、病史之其他因素，且較佳在測試個體與所選之建立「平均」值之個體之群的概況之間密切匹配。
如本申請案中所用之術語「量(amount)」係指樣品中存在之所關注聚核苷酸或所關注多肽(例如人類BCL6B mRNA或蛋白質)的量。該量可以絕對方式(亦即樣品中聚核苷酸或多肽之總量)或以相對形式(亦即樣品中聚核苷酸或多肽 之濃度)來表示。
如本申請案中所用之術語「治療(treat)」或「治療(treating)」描述可導致消除、減輕、緩解、逆轉或預防或延遲相關病況之任何症狀發生或復發的行為。換言之，「治療」病況涵蓋針對該病況之治療性及預防性干預兩者。
如本文中所用之術語「有效量」係指在量上足以產生所要效應之給定物質的量。舉例而言，編碼BCL6B mRNA之聚核苷酸之有效量為可達成增加之BCL6B蛋白質表現程度或生物活性，以使得出於治療性目的給予聚核苷酸之患者中胃癌症狀被減輕、逆轉、消除、預防或延遲發生之該聚核苷酸的量。足以實現此之量被定義為「治療有效劑量」。劑量範圍隨所投與之治療劑之性質及諸如投與途徑及患者病況之嚴重程度等其他因素而變化。
如本文中所用之術語「個體」或「需要治療之個體」包括因處於胃癌風險或實際罹患胃癌而尋求醫學關注之個體。個體亦包括尋求治療方案改進之當前正經歷治療的個體。需要治療之個體(Subject或individual)包括表現出胃癌症狀或處於罹患胃癌或其症狀之風險中的個體。舉例而言，需要治療之個體包括具有胃癌之遺傳傾向性或家族史之個體、過去已遭受相關症狀之個體、已暴露於觸發物質或事件之個體以及遭受慢性或急性病況之症狀的個體。「需要治療之個體」可處於生命之任何年齡。
BCL6B蛋白質之「抑制劑」、「活化劑」及「調節劑」分 別用以指使用BCL6B蛋白質結合或信號傳導之活體外及活體內分析鑑定的抑制性、活化性或調節性分子，例如配位體、激動劑、拮抗劑及其同系物及模擬物。術語「調節劑」包括抑制劑及活化劑。抑制劑為例如可部分或完全阻斷碳水化合物結合、降低BCL6B蛋白質活性、阻止BCL6B蛋白質活性、延遲活化BCL6B蛋白質、使BCL6B蛋白質失活、使BCL6B蛋白質活性去敏感化或下調BCL6B蛋白質活性的試劑。在一些情況下，抑制劑直接或間接結合至BCL6B蛋白質，諸如中和抗體。如本文中所用之抑制劑與失活劑及拮抗劑同義。活化劑為例如可刺激BCL6B蛋白質活性、增加BCL6B蛋白質活性、促進BCL6B蛋白質活性、增強BCL6B蛋白質活化、使BCL6B蛋白質活性敏感化或上調BCL6B蛋白質活性的試劑。調節劑包括BCL6B蛋白質配位體或結合搭配物，包括經修飾之天然存在之配位體及合成地設計之配位體、抗體及抗體片段、拮抗劑、激動劑、包括含碳水化合物之分子之小分子、siRNA、RNA適體及其類似物。
發明之詳細描述 I.引言
由於胃癌在其早期發展階段期間缺乏明確症狀之性質，所以胃癌患者通常面臨嚴酷之預後。因此，胃癌之早期偵測對改良患者存活率至關重要。
本發明人首次發現胃癌細胞中BCL6B蛋白質之表現受到抑制。此BCL6B蛋白質之抑制表現係由於BCL6B基因組序 列中(尤其該基因之啟動子區中)之甲基化增加，其導致BCL6B mRNA之轉錄減少。此發現為偵測、監測及治療胃癌提供重要方法。
II.一般方法
本發明之實踐利用分子生物學領域中之常規技術。揭示本發明中所用一般方法之基礎教材包括Sambrook及Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第3版，2001)；Kriegler,Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；及Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人編，1994))。
就核酸而言，大小係以千鹼基對(kb)抑或鹼基對(bp)給出。核酸大小為自瓊脂糖或丙烯醯胺凝膠電泳、自定序之核酸或自公開之DNA序列得到之估計值。就蛋白質而言，大小係以千道爾頓(kDa)或胺基酸殘基數給出。蛋白質大小係自凝膠電泳、自定序之蛋白質、自導出之胺基酸序列或自公開之蛋白質序列估計的。
可例如如Van Devanter等人，Nucleic Acids Res. 12：6159-6168(1984)中所述，根據Beaucage及Caruthers,Tetrahedron Lett. 22：1859-1862(1981)首先描述之固相亞磷醯胺三酯法、使用自動化合成儀來化學地合成無法購得之寡核苷酸。使用任何技術公認之策略(例如天然丙烯醯胺凝膠電泳或如Pearson及Reanier,J.Chrom. 255：137-149(1983)中所述之陰離子交換高效液相層析(HPLC))來進行寡核苷酸之純化。
可使用例如Wallace等人，Gene 16：21-26(1981)之對雙股模板進行定序之鏈終止法來驗證本發明中所用之所關注序列，例如人類BCL6B基因之聚核苷酸序列及合成寡核苷酸(例如，引子)。
III.組織樣品之獲得及BCL6B mRNA或DNA之分析
本發明係關於量測BCL6B mRNA之量或分析人胃組織(尤其胃上皮樣品)中之BCL6B基因組DNA之甲基化模式，其作為偵測胃癌之存在、評估患上胃癌之風險及/或監測胃癌之進展或治療功效的方法。因此，實踐本發明之第一步驟為自測試個體獲得胃上皮組織樣品且自該樣品提取mRNA或DNA。
A.胃組織樣品之獲取及製備
自待使用本發明方法測試或監測胃癌之人獲得胃組織樣品。根據醫院或診所通常遵循之標準方案(諸如在內窺鏡檢期間)進行自個體收集胃上皮組織樣品。收集適當量之胃上皮，且可在進一步製備之前根據標準程序進行儲存。
可使用例如胃黏膜來進行本發明之患者胃上皮樣品中可見之BCL6B mRNA或DNA的分析。製備用於核酸提取之組織樣品之方法在熟習此項技術者之中為熟知。舉例而言，應首先處理個體之胃黏膜樣品來破壞細胞膜，以便釋放細胞內所含之核酸。
B. RNA之提取及定量
存在眾多用於自生物樣品提取mRNA之方法。可遵循mRNA製備之一般方法(例如由Sambrook及Russell, Molecular Cloning：A Laboratory Manual第3d版，2001所述)；亦可使用各種市售試劑或套組自測試個體之生物樣品獲得mRNA，該等市售試劑或套組諸如為Trizol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)、Oligotex Direct mRNA套組(Qiagen,Valencia,CA)、RNeasy Mini套組(Qiagen,Hilden,Germany)及PolyATtract® Series 9600TM(Promega,Madison,WI)。亦可使用此等方法中大於一者之組合。
必須自RNA製備物消除所有污染DNA。因此，在擴增及定量步驟中應小心處理樣品、用DNase進行澈底處理且使用適當陰性對照。
1.基於PCR之mRNA濃度定量測定
自樣品提取出mRNA後，即可對人類BCL6B mRNA之量進行定量。測定mRNA濃度之較佳方法為基於擴增之方法，例如藉由聚合酶鏈反應(PCR)，尤其逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)。
在擴增步驟之前，必須合成人類BCL6B mRNA之DNA複本(cDNA)。此係藉由逆轉錄達成，該逆轉錄可以單獨步驟形式或以均相(homogeneous)逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)(即用於擴增RNA之聚合酶鏈反應之改進)形式進行。適用於核糖核酸PCR擴增之方法如以下所述：Romero及Rotbart，Diagnostic Molecular Biology：Principles and Applications第401-406頁；Persing等人編，Mayo Foundation,Rochester,MN,1993；Egger等人，J.Clin.Microbiol. 33：1442-1447,1995；及美國專利第5,075,212號。
PCR之一般方法為此項技術中所熟知，且因此不在本文中詳細描述。關於PCR方法、方案及設計引子之原理的綜述，參見例如Innis等人，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications,Academic Press,Inc.N.Y.,1990。PCR試劑及方案亦可獲自商業供應商，諸如Roche Molecular Systems。
最通常用熱穩定酶以自動化過程來進行PCR。在此過程中，使反應混合物之溫度自動地經由變性區、引子黏接區及延伸反應區進行循環。尤其適合於此目的之機器可自商品購得。
儘管在實踐本發明中典型地使用標靶mRNA之PCR擴增法，然而，熟習此項技術者應認識到，可藉由任何已知方法來完成母體血液樣品中此等mRNA種類之擴增，該等方法諸如為連接酶鏈反應(LCR)、轉錄介導之擴增及自主序列複製或基於核酸序列之擴增法(NASBA)，其每一者均提供充分擴增。最近開發之分支DNA技術亦可用於定量性測定母體血液中mRNA標記之量。關於用於臨床樣品中核酸序列之直接定量法之分支DNA信號擴增的綜述可參見Nolte,Adv.Clin.Chem. 33：201-235,1998。
2.其他定量方法
亦可使用熟習此項技術者所熟知之其他標準技術來偵測BCL6B mRNA。儘管典型地在偵測步驟之前進行擴增步驟，但本發明方法未必需要擴增。舉例而言，無論是否先進行擴增步驟，均可藉由大小分級法(例如凝膠電泳)來鑑 定mRNA。在瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠中運作樣品且根據熟知技術用溴化乙錠進行標記(參見例如Sambrook及Russell，如前述文獻)之後，與標準對照組具有相同大小之條帶之存在即指示標靶mRNA之存在，隨後可基於條帶之強度將該標靶mRNA之量與對照物進行比較。或者，可採用對BCL6B mRNA特異性之寡核苷酸探針來偵測該mRNA種類之存在，且基於探針賦予之信號強度，在與標準對照組之比較下指示mRNA之量。
序列特異性探針雜交為偵測包含其他種類核酸之特定核酸的熟知方法。在充分嚴格雜交條件下，探針僅特異性雜交至實質上互補之序列。可放鬆雜交條件之嚴格性，以容許不同量之序列錯配。
此項技術中熟知許多雜交模式，包括(但不限於)液相、固相或混合相雜交分析。以下文章提供多種雜交分析模式之概況：Singer等人，Biotechniques 4：230,1986；Haase等人，Methods in Virology，第189-226頁，1984；Wilkinson,In situ Hybridization,Wilkinson編，IRL Press,Oxford University Press,Oxford；及Hames及Higgins編，Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach,IRL Press,1987。
根據熟知技術偵測雜交複合物。可藉由典型地用於偵測雜交核酸存在之數種方法中之任一者來標記能夠特異性雜交至標靶核酸(亦即mRNA或擴增之DNA)之核酸探針。一種常見偵測方法為使用用3H、125I、35S、14C或32P或其類 似物標記之探針的自動放射攝影術。放射性同位素之選擇視歸因於合成便利性、穩定性及所選同位素之半衰期的研究偏好而定。其他標記包括化合物(例如生物素及地高辛)，其結合至用螢光團、化學發光試劑及酶標記之抗配位體或抗體。或者，探針可與諸如螢光團、化學發光試劑或酶之標記直接結合。標記之選擇視所需敏感性、與探針結合之便利性、穩定性需要及可用儀器配備而定。
可使用熟知技術合成及標記實踐本發明所需之探針及引子。可如Needham-Van Devanter等人，Nucleic Acids Res. 12：6159-6168,1984中所述，根據Beaucage及Caruthers,Tetrahedron Lett. 22：1859-1862,1981首先描述之固相亞磷醯胺三酯法、使用自動化合成儀來化學地合成用作探針及引子之寡核苷酸。可藉由天然丙烯醯胺凝膠電泳抑或Pearson及Reanier,J.Chrom. 255：137-149,1983中所述之陰離子交換HPLC進行寡核苷酸之純化。
C. BCL6B基因組序列中甲基化之偵測
研究含有一或多個CpG(胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸)對之BCL6B基因組序列區段之甲基化狀態，以提供關於測試個體是否罹患胃癌、個體是否處於患上胃癌之風險中或個體之胃癌惡化抑或改良的指示。
典型地，分析包括5'非轉譯區(諸如啟動子區)且包括一或多個CpG核苷酸對之BCL6B基因組序列區段的甲基化模式。舉例而言，SEQ ID NO：9、18或19或其一部分可用於測定序列內有多少CpG對經甲基化及有多少未經甲基化。 所分析之序列應足夠長以含有至少1個CpG二核苷酸對，且此CpG位點處之甲基化偵測典型地足以指示胃癌細胞之存在。所分析之序列之長度通常為至少15或20個連續核苷酸，且可為更長，具有至少25、30、50、100、200、300、400或400個以上連續核苷酸。序列內存在至少1個，典型地2個或2個以上，通常3、4、5、6、7、8、9或9個以上CpG核苷酸對。在分析多個(2個或2個以上)CpG位點之甲基化狀態的情況下，當所分析之基因組序列內至少50%CpG對顯示為經甲基化時，所測試之個體被認為患有胃癌或具有增加之患胃癌風險。舉例而言，圖8及圖9中所示之SEQ ID NO：19(即BCL6B基因組序列區段(相對於轉錄起始位點之-72至+49))含有9個CpG對。如此等圖中所說明，在建立之胃癌細胞株及取自胃癌之樣品中，發現此區域中之大多數CpG對經甲基化，而非癌性胃上皮細胞顯示極少(若存在的話)甲基化CpG位點。為了確定BCL6B基因組序列之甲基化模式，亞硫酸氫鹽處理、隨後DNA定序尤其適用，此係因為亞硫酸氫鹽將未經甲基化胞嘧啶(C)轉化為尿嘧啶(U)同時保持甲基化胞嘧啶不變，從而允許經由DNA定序過程進行直接鑑定。視情況，在亞硫酸氫鹽轉化之後且DNA定序之前，包括諸如PCR之擴增過程。
1. DNA提取及處理
自生物樣品提取DNA之方法為熟知的，且在分子生物學領域中常規地實踐，參見例如Sambrook及Russell，前述。應消除RNA污染以避免干擾DNA分析。隨後，用能以甲基 化差異性方式修飾DNA之試劑處理DNA，亦即在處理之後將自甲基化胞嘧啶(C)殘基及未經甲基化C殘基產生不同且可區別之化學結構。典型地，該種試劑可與DNA分子中之未經甲基化C殘基反應，且將各未經甲基化C殘基轉化為尿嘧啶(U)殘基，而甲基化C殘基保持不變。此未經甲基化C→U之轉化允許基於核酸之一級序列之變化進行甲基化狀態之偵測及比較。適用於此目的之例示性試劑為亞硫酸氫鹽，諸如亞硫酸氫鈉。使用用於DNA化學修飾之亞硫酸氫鹽的方法為此項技術中所熟知(參見例如Herman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：9821-9826,1996)。
如熟習技術人員將認識到，本文未提及但具有差異性地化學(或經由任何其他機制)修飾甲基化及未經甲基化DNA之相同性質的任何其他試劑均可用於實踐本發明。舉例而言，亦可藉由甲基化敏感性限制酶來實現DNA之甲基化特異性修飾，該等酶中之一些典型地分裂未經甲基化DNA片段但不分裂甲基化DNA片段，而其他酶(例如甲基化依賴性核酸內切酶McrBC)分裂含甲基化胞嘧啶之DNA，但不分裂未經甲基化DNA。此外，化學修飾及限制酶處理之組合(例如組合亞硫酸氫鹽限制分析(COBRA)(Xiong等人1997 Nucleic Acids Res. 25(12)：2532-2534))適用於實踐本發明。其他可用之偵測DNA甲基化之方法包括例如藉由南方墨點抑或PCR分析之甲基化敏感性限制性核酸內切酶(MSRE)分析、甲基化特異性或甲基化敏感性PCR(MS-PCR)、甲基化敏感性單核苷酸引子延伸(Ms-SnuPE)、高解 析度熔融(HRM)分析、亞硫酸氫鹽定序、焦磷酸定序、甲基化特異性單股構形分析(MS-SSCA)、甲基化特異性變性梯度凝膠電泳(MS-DGGE)、甲基化特異性熔融曲線分析(MS-MCA)、甲基化特異性變性高效液相層析(MS-DHPLC)、甲基化特異性微陣列(MSO)。此等分析可為PCR分析、用螢光標記之定量分析或南方墨點分析。例示性甲基化敏感性DNA分裂試劑(諸如限制酶)包括AatII、AciI、AclI、AgeI、AscI、Asp718、AvaI、BbrP1、BceAI、BmgBI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsmBI、BspDI、BsrFI、BssHII、BstBI、BstUI、ClaI、EagI、EagI-HFTM、FauI、FseI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HinP1I、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、NarI、NgoMIV、NotI、NotI-HFTM、NruI、Nt.BsmAI、PaeR7I、PspXI、PvuI、RsrII、SacII、SalI、SalI-HFTM、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI或TspMI。
2.視情況選用之擴增及序列分析
在以甲基化差異性方式修飾DNA之後，經處理DNA隨後經受基於序列之分析，以便可確定BCL6B基因組序列之甲基化狀態。在甲基化特異性修飾之後序列分析之前，視情況進行擴增反應。多種聚核苷酸擴增方法為明確的，且頻繁用於研究中。舉例而言，用於聚核苷酸序列擴增之聚合酶鏈反應(PCR)之一般方法為此項技術中所熟知，且因此在本文不詳細描述。關於PCR方法、方案及設計引子之原理之綜述，參見例如Innis等人，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications,Academic Press,Inc.N.Y.,1990。PCR試劑及方案亦可獲自商業供應商，諸如Roche Molecular Systems。
儘管在實踐本發明中典型地使用PCR擴增，但熟習此項技術者應認識到，可藉由任何已知方法來實現相關基因組序列之擴增，該等方法諸如為連接酶鏈反應(LCR)、轉錄介導之擴增及自主序列複製或基於核酸序列之擴增(NASBA)，其每一者均提供充分擴增。
用於聚核苷酸序列測定之技術亦為明確的，且在相關研究領域中廣泛實踐。舉例而言，聚核苷酸定序之基本原理及一般技術描述於多種諸如以下之關於分子生物學及重組遺傳學之研究報導及論文中：Wallace等人，，前述；Sambrook及Russell，前述；及Ausubel等人，前述。研究實驗室中常規地實踐之手動抑或自動化DNA定序方法均可用於實踐本發明。在實踐本發明方法中，適用於偵測聚核苷酸序列中之變化(例如C→U)之其他方法包括(但不限於)質譜分析、引子延伸、聚核苷酸雜交、即時PCR、熔融曲線分析、高解析度熔融分析、異雙螺旋分析、焦磷酸定序及電泳。
IV.多肽之定量 A.獲得樣品
實踐本發明之第一步驟為自待測試、評估或監測胃癌、患上胃癌之風險或病況嚴重程度/進展的個體獲得胃上皮之樣品。應自對照組(未罹患任何胃病、尤其瘤形成之正 常個體)及測試組(例如待測試可能之胃癌之個體)兩者採集相同類型之樣品。如先前章節中所陳述，出於此目的，典型地遵循醫院及診所中常規地使用之標準程序。
為了偵測測試個體中胃癌之存在或評估患上胃癌之風險，可採集個別患者之胃黏膜樣品，且量測人類BCL6B蛋白質之濃度，且隨後將其與標準對照組進行比較。若觀測到人類BCL6B蛋白質濃度在與對照濃度比較時減少，則認為測試個體患有胃癌或具有增加之患該病況風險。為了監測胃癌患者之疾病進展或評估治療功效，可在不同時間點採集個別患者之胃上皮樣品，以便可量測人類BCL6B蛋白質之濃度來提供指示疾病狀態之資訊。舉例而言，當患者之BCL6B蛋白質濃度顯示出隨時間大體上增加之趨勢時，認為患者之胃癌之嚴重程度正在改良或認為患者已接受之治療為有效的。另一方面，患者BCL6B蛋白質濃度缺乏變化或持續減少趨勢指示病況之惡化及給予患者之治療無效。一般而言，患者中觀察到之更低之BCL6B蛋白質濃度指示患者所罹患胃癌之更嚴重形式及疾病之更差預後(如表現為更短預期壽命、更高轉移率、對治療之抗性等)。
B.製備用於BCL6B蛋白質偵測之樣品
來自個體之胃組織樣品適用於本發明，且可藉由熟知方法且如先前章節中所述獲得。在本發明之某些應用中，胃黏膜可為較佳樣品類型。
C.測定人類BCL6B蛋白質之濃度
可使用多種免疫學分析來偵測任何特定種類之蛋白質 (諸如BCL6B蛋白質)。在一些實施例中，可藉由用對多肽具有特異性結合親和力之抗體自測試樣品捕獲多肽來進行夾心分析。隨後，可用對多肽具有特異性結合親和力之標記抗體來偵測其。可使用微流體裝置(諸如微陣列蛋白質晶片)來進行該等免疫學分析。亦可藉由凝膠電泳(諸如二維凝膠電泳)及使用特異性抗體之西方墨點分析來偵測所關注蛋白質(例如人類BCL6B蛋白質)。或者，可使用適當抗體，使用標準免疫組織化學技術來偵測指定蛋白質(例如人類BCL6B蛋白質)。單株及多株抗體(包括具有所要結合特異性之抗體片段)兩者均可用於多肽之特異性偵測。可藉由已知技術來產生該等抗體及其對特定蛋白質(例如人類BCL6B蛋白質)具有特異性結合親和力之結合片段。
在實踐本發明中，亦可利用其他方法來量測BCL6B蛋白質濃度。舉例而言，已基於質譜分析技術開發出多種方法來快速且精確定量標靶蛋白質(甚至在大量樣品中)。此等方法涉及高度複雜設備，諸如使用多反應監測(MRM)技術之三重四極(triple Q)儀器、基質輔助雷射脫附/離子化飛行時間聯合質譜儀(MALDI TOF/TOF)、使用選擇性離子監測(SIM)模式之離子阱儀器及基於電噴霧離子化(ESI)之QTOP質譜儀。參見例如Pan等人，J Proteome Res.2009 2月；8(2)：787-797。
V.建立標準對照組
為了建立用於實踐本發明方法之標準對照組，首先選擇無如習知地定義之任何胃病(尤其任何形式之腫瘤，諸如 胃癌)之一組健康人。若可適用，則為了使用本發明方法篩檢及/或監測胃癌，此等個體處於適當參數之內。個體視情況具有相同性別、相似年齡或相似種族背景。
藉由明確、常規地使用之方法來證實所選個體之健康狀態，該等方法包括(但不限於)個體之一般身體檢查及其病史之一般回顧。
此外，所選之健康個體組必須具有合理大小，以使得獲自該組之胃組織樣品中之人類BCL6B mRNA或BCL6B蛋白質的平均量/濃度可合理視為代表一般健康人群之中之正常或平均濃度。所選之組較佳包含至少10個人類個體。
一旦基於所選健康對照組之各個體中所見之個別值建立BCL6B mRNA或BCL6B蛋白質之平均值，則此平均值或中值或代表值或概況被視為標準對照組。在相同過程期間亦確定標準差。在一些情況下，可為具有不同特徵(諸如年齡、性別或種族背景)之單獨定義之組建立單獨標準對照組。
VI.胃癌之治療
藉由說明BCL6B蛋白質之抑制表現與胃癌之相關性，本發明進一步提供一種治療罹患胃癌之患者的方法：經由增加BCL6B蛋白質表現或生物活性。如本文中所用，胃癌治療涵蓋減輕、逆轉、減少或消除胃癌之一或多種症狀，以及預防或延遲一或多種相關症狀發生。
A.增加BCL6B表現或活性 1.編碼BCL6B蛋白質之核酸
可經由使用編碼功能性BCL6B蛋白質之核酸來達成BCL6B基因表現之增強。該等核酸可為可在有利條件下轉譯為活性形式之BCL6B蛋白質的單股核酸(諸如mRNA)或雙股核酸(諸如DNA)。
在一個實施例中，以表現卡匣之形式提供BCL6B編碼核酸，該表現卡匣典型地經重組產生，且具有可操作地連接於編碼BCL6B蛋白質之聚核苷酸序列的啟動子。在一些情況下，啟動子為在所有或多數組織類型中導引基因表現之通用啟動子；在其他情況下，啟動子為在上皮細胞、尤其胃上皮細胞中特異性地導引基因表現之啟動子。投與該等核酸可增加標靶組織(例如胃上皮)中之BCL6B蛋白質表現。因為已知人類BCL6B基因序列為GenBank寄存編號NM_181844.3，且在本文作為SEQ ID NO：11提供，所以吾人可自序列、物種同系物及此等序列之變異體得出適合BCL6B編碼核酸。
2. BCL6B蛋白質
亦可藉由向罹患胃癌且表現出受抑制之BCL6B蛋白質表現或活性的患者直接投與有效量之活性BCL6B蛋白質來有效治療疾病。舉例而言，此可藉由向罹患胃癌之患者投與重組產生之具有其生物活性之BCL6B蛋白質來達成。遞送基於蛋白質或多肽之治療劑之調配物及方法為此項技術中所熟知。
3. BCL6B蛋白質之活化劑
可用能活化BCL6B蛋白質表現或增強BCL6B蛋白質活性 之試劑來達成BCL6B蛋白質活性增加。舉例而言，去甲基化試劑(例如5-Aza)可能能藉由移除由BCL6B基因之啟動子區之甲基化所引起之BCL6B基因表現抑制來活化此基因表現。其他活化劑可包括對BCL6B啟動子及/或增強子特異性之轉錄活化劑。可使用本文中實例中所述之BCL6B表現分析來篩檢及鑑定該等活化劑。
BCL6B蛋白質之激動劑(諸如活化抗體)為另一種BCL6B蛋白質之活化劑。該等活化劑藉由增強BCL6B蛋白質之生物活性，典型地(但並非必須)藉由與BCL6B蛋白質及/或其相互作用蛋白質直接結合來作用。該等激動劑之初步篩檢可起始於用於鑑定與BCL6B蛋白質物理相互作用之分子的結合分析。
B.醫藥組合物 1.調配物
本發明化合物適用於醫藥組合物或藥劑之製造。可將醫藥組合物或藥劑投與至個體用於治療胃癌。
本發明中所用之化合物(例如BCL6B蛋白質、編碼BCL6B蛋白質之核酸或BCL6B基因表現之活化劑)適用於製造包含有效量之該等化合物與適於應用之賦形劑或載劑結合或混合的醫藥組合物或藥劑。
用於增強BCL6B表現之例示性醫藥組合物包含(i)包含如本文中所述之編碼人類BCL6B蛋白質之聚核苷酸序列的表現卡匣，及(ii)醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。術語醫藥學上可接受的及生理學上可接受的在本文中同義地使 用。可以治療有效劑量提供表現卡匣用於如本文中所述之治療方法中。
可經由脂質體來投與BCL6B蛋白質或編碼BCL6B蛋白質之核酸，該等脂質體用來將結合物靶向至特定組織，以及增加組合物之半衰期。脂質體包括乳劑、發泡體、微胞、不溶性單層、液晶、磷脂分散劑、片狀層及其類似物。在此等製劑中，將待遞送之抑制劑單獨或與結合至例如標靶細胞(例如皮膚細胞)之中普遍之受體的分子或與其他治療性或免疫原性組合物結合併入為脂質體之一部分。因此，用本發明之所要抑制劑填充之脂質體可被導引至治療位點，其中隨後脂質體遞送所選抑制劑組合物。用於本發明中之脂質體係自標準囊泡形成脂質形成，該等囊泡形成脂質通常包括中性及帶負電之磷脂及甾醇(諸如膽固醇)。通常藉由以下考慮因素來導引脂質之選擇，例如脂質體大小、血流中脂質體之酸不穩定性及穩定性。如例如Szoka等人(1980)Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467、美國專利第4,235,871號、第4,501,728號及第4,837,028號中所述，多種方法可用於製備脂質體。
可使用一或多種生理學上可接受之載劑或賦形劑、藉由標準技術來調配用於本發明中之醫藥組合物或藥劑。適合醫藥載劑描述於本文中及E.W.Martin之「Remington's Pharmaceutical Sciences」中。可將本發明化合物及藥劑及其生理學上可接受之鹽及溶劑合物調配用於藉由任何適合途徑進行投與，該等途徑包括吸入、局部、經鼻、經口、 非經腸或經直腸。
用於局部投與之典型調配物包括乳膏、軟膏、噴霧劑、洗劑及貼片。然而，醫藥組合物可調配為用於任何類型之投與，例如用注射器或其他裝置之皮內、皮下、靜脈內、肌肉內、鼻內、腦內、氣管內、動脈內、腹膜內、膀胱內、胸膜內、冠狀動脈內或瘤內注射。亦考慮用於藉由吸入(例如氣溶膠)投與或用於經口、經直腸或經陰道投與之調配物。
2.投與途徑
用於局部施用於例如皮膚及眼睛之適合調配物較佳為此項技術中熟知之水性溶液、軟膏、乳膏或凝膠。該等調配物可含有增溶劑、穩定劑、張力增強劑、緩衝劑及防腐劑。
用於經皮施用之適合調配物包括有效量之本發明化合物或藥劑與載劑。較佳之載劑包括可吸收之藥理學上可接受之溶劑以輔助通過宿主皮膚。舉例而言，經皮裝置呈繃帶形式，其包含支持部件、含有化合物與視情況選用之載劑之貯器，視情況選用之速率控制障壁及將裝置固定於皮膚之構件，該速率控制障壁以受控且預定之速率在長時間段內將化合物遞送至宿主皮膚。亦可使用基質經皮調配物。
就經口投與而言，醫藥組合物或藥劑可呈例如用醫藥學上可接受之賦形劑藉由習知方法製備之錠劑或膠囊形式。較佳為包含以下之錠劑及明膠膠囊：活性成分，亦即BCL6B蛋白質或編碼BCL6B蛋白質之核酸；以及(a)稀釋劑 或填充劑，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纖維素(例如乙基纖維素、微晶纖維素)、甘胺酸、果膠、聚丙烯酸酯及/或磷酸氫鈣、硫酸鈣；(b)潤滑劑，例如矽石、滑石、硬脂酸、其鎂或鈣鹽、金屬硬脂酸鹽、膠態二氧化矽、氫化植物油、玉米澱粉、苯甲酸鈉、乙酸鈉及/或聚乙二醇；就錠劑而言，亦包含(c)黏合劑，例如矽酸鎂鋁、澱粉糊、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯啶酮及/或羥丙基甲基纖維素；必要時，包含(d)崩解劑，例如澱粉(例如，馬鈴薯澱粉或澱粉鈉)、乙醇酸鹽、瓊脂、褐藻酸或其鈉鹽或起泡混合物；(e)濕潤劑，例如月桂基硫酸鈉；及/或(f)吸收劑、著色劑、調味劑及甜味劑。
可根據此項技術中已知之方法用薄膜包覆抑或用腸溶衣包覆錠劑。用於經口投與之液體製劑可呈例如溶液、糖漿或懸浮液形式，或其可以乾燥產品形式呈現，其在使用之前用水或其他適合媒劑組配。可用醫藥學上可接受之添加劑、藉由習知方法來製備該等液體製劑，該等添加劑例如為懸浮劑，例如山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化可食脂肪；乳化劑，例如卵磷脂或阿拉伯樹膠；非水性媒劑，例如杏仁油、油酯、乙醇或分級植物油；及防腐劑，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸。視情況，製劑亦可含有緩衝鹽、調味劑、著色劑及/或甜味劑。必要時，經口投與之製劑可經適當調配以得到活性化合物之控制釋放。
本發明化合物及藥劑可經調配用於藉由注射(例如藉由快速注射或連續輸注)來非經腸投與。用於注射之調配物可呈現為單位劑型，例如添加有防腐劑之安瓿或多劑量容器。可注射組合物較佳為水性等張溶液或懸浮液，且栓劑較佳係自脂肪乳液或懸浮液製備。組合物可為無菌的及/或含有佐劑，例如防腐劑、穩定劑、濕潤劑或乳化劑、溶解促進劑、調節滲透壓之鹽及/或緩衝劑。或者，活性成分可呈粉末形式，其在使用之前用適合媒劑(例如無菌無熱原質水)組配。此外，其亦可含有其他有治療價值之物質。組合物分別係根據習知混合、粒化或包覆方法來製備，且含有約0.1至75%、較佳約1至50%活性成分。
就藉由吸入投與而言，宜藉助於適合推進劑以自受壓包裝或噴霧器之氣溶膠噴霧呈遞形式遞送活性成分(例如BCL6B蛋白質或編碼BCL6B蛋白質之核酸)，該推進劑例如為二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適合氣體。在受壓氣溶膠之情況下，可藉由提供閥來遞送既定量，從而確定劑量單位。例如用於吸入器或吹入器中之明膠之膠囊或筒可經調配為含有化合物與適合粉末基質(例如乳糖或澱粉)之粉末混合物。
亦可以將抑制劑調配為經直腸組合物，例如栓劑或保留灌腸劑，其(例如)含有習知栓劑基質(例如可可脂或其他甘油酯)。
此外，可將活性成分調配為儲槽式製劑。該等長效調配物可藉由植入(例如皮下或肌肉內)或肌肉內注射來投與。 因此，例如，活性成分可與適合聚合或疏水性物質(例如作為可接受之油中之乳液)或離子交換樹脂一起調配，或可經調配為微溶衍生物，例如微溶鹽。
本發明醫藥組合物或藥劑包含(i)有效量之如本文中所述可增加BCL6B蛋白質濃度或活性之化合物，及(ii)另一治療劑。當與本發明化合物一起使用時，該治療劑可單獨、依次或與一或多種其他該等治療劑(例如第一治療劑、第二治療劑及本發明化合物)組合使用。投與可藉由相同或不同投與途徑或於同一醫藥調配物中一起進行。
3.劑量
可以可預防、治療或控制如本文中所述之胃癌之治療有效劑量向個體投與醫藥組合物或藥劑。以足以引發個體中之有效治療反應之量向個體投與醫藥組合物或藥劑。
所投與之活性劑之劑量視個體之體重、年齡、個別狀況、待治療區域之表面積或體積及投與形式而定。劑量大小亦由特定個體中特定化合物之投與所伴隨之任何不良效應的存在、性質及程度決定。舉例而言，各類型BCL6B蛋白質或編碼BCL6B蛋白質之核酸將可能具有獨特劑量。用於向約50至70 kg之哺乳動物經口投與之單位劑量可含有約5與500 mg之間的活性成分。典型地，本發明活性化合物之劑量為足以達成所要效應之劑量。最佳給藥時程可自個體體內之藥劑累積之量測值來計算。一般而言，可每天、每週或每月一或多次地給予劑量。一般熟習此項技術者可容易地確定最佳劑量、給藥方法及重複率。
為了達成所要治療效應，可以治療有效日劑量分多日投與化合物或藥劑。因此，可治療個體中本文中所述之相關病況或疾病之化合物的治療有效投與需要週期性(例如每日)投與，其持續範圍介於三天至兩週或更長之時間。典型地，藥劑之投與將持續至少連續三天，通常至少連續五天，更通常至少連續十天，且有時連續20、30、40或更多天。儘管連續日劑量為達成治療有效劑量之較佳途徑，但即使不每天投與藥劑，只要足夠頻繁地重複投與以維持個體中藥劑之治療有效濃度，亦可達成治療有益效應。舉例而言，吾人可每隔一天、每三天一次投與藥劑，或若更高劑量範圍被使用且能為個體所耐受，則每週投與一次。
該等化合物或藥劑之最佳劑量、毒性或治療功效可視個別化合物或藥劑之相對功效而變化，且可藉由細胞培養物或實驗動物中之標準醫藥程序(例如藉由測定LD50(導致50%群體死亡之劑量)及ED50(在50%群體中治療有效之劑量))來測定。毒性與治療效應之間的劑量比為治療指數，且可表示為比率LD50/ED50。展現出大治療指數之藥劑較佳。儘管可使用展現出毒性副效應之藥劑，但應考慮設計可將該等藥劑靶向至受影響組織位點之遞送系統，以將對正常細胞之潛在破壞減至最小，且從而減少副效應。
自例如細胞培養分析及動物研究獲得之資料可用於調配適用於人類之劑量範圍。該等化合物之劑量較佳位於包括ED50、具有較小毒性或無毒性之循環濃度範圍內。劑量可在此範圍內視所用劑型及投與途徑而變化。就本發明方法 中所用之任何藥劑而言，治療有效劑量最初可自細胞培養分析來估算。可在動物模型中調配劑量，以達成包括如細胞培養中所測定之IC50(達成最大症狀抑制之一半之藥劑濃度)的循環血漿濃度範圍。該資訊可用於更精確地確定人類中適用之劑量，可例如藉由高效液相層析(HPLC)量測血漿中之濃度。一般而言，就典型個體而言，藥劑之劑量當量為約1 ng/kg至100 mg/kg。
提供本文中所述之BCL6B蛋白質或編碼BCL6B蛋白質之核酸的例示性劑量。當玻璃體內投與時，BCL6B編碼核酸(諸如表現卡匣)之劑量可在每眼0.1-0.5 mg之間(例如5-30 mg/kg)。可以5-1000 mg之間經口，或藉由以10-500 mg/ml之間靜脈內輸注來投與小有機化合物活化劑。可每週5次以以下量藉由靜脈內注射或輸注來投與單株抗體活化劑：50-500 mg/ml(120分鐘內)；1-500 mg/kg(60分鐘內)；或1-100 mg/kg(快速注射)。可以10-500 mg皮下；0.1-500 mg/kg靜脈內每天兩次或約50 mg每週一次或25 mg每週兩次投與BCL6B蛋白質或肽活化劑。
本發明醫藥組合物可單獨或與至少一種其他治療化合物組合投與。例示性有利治療化合物包括全身及局部抗發炎劑、疼痛舒解劑、抗組織胺劑、麻醉化合物及其類似物。其他治療化合物可與主要活性成分(例如BCL6B蛋白質或編碼該蛋白質之核酸)同時或甚至於同一組合物中投與。其他治療化合物亦可以單獨組合物或與主要活性成分不同之劑型單獨投與。視個體之特定症狀及特徵而定，主要成 分(諸如BCL6B蛋白質或編碼BCL6B蛋白質之核酸)之一些劑量可與其他治療化合物同時投與，而其他劑量單獨投與。
可在整個治療期間，視症狀之嚴重程度、復發頻率及對治療方案之生理反應而調節本發明醫藥組合物之劑量。熟習此項技術者通常參與該等治療方案之調節。
VII.套組及裝置
本發明提供用於實踐本文中所述之方法來評估個體中BCL6B mRNA或BCL6B蛋白質濃度之組合物及套組，其可用於多種目的，諸如在患者中偵測或診斷胃癌之存在、確定患上胃癌之風險及監測胃癌之進展。
用於進行測定BCL6B mRNA濃度之分析的套組典型地包括至少一種適用於與BCL6B編碼序列或其互補序列之至少一個區段特異性雜交之寡核苷酸。視情況，用可偵測部分標記此寡核苷酸。在一些情況下，套組可包括至少兩個可在藉由PCR(尤其藉由RT-PCR)擴增BCL6B DNA或mRNA之至少一個區段中使用的寡核苷酸引子。
用於進行測定BCL6B蛋白質濃度之分析的套組典型地包括至少一種適用於特異性結合至BCL6B蛋白質胺基酸序列之抗體。視情況，用可偵測部分標記此抗體。抗體可為單株抗體抑或多株抗體。在一些情況下，套組可包括至少兩種不同抗體，一種用於特異性結合至BCL6B蛋白質(亦即初級抗體)，且另一種用於偵測初級抗體(亦即二級抗體)，該二級抗體通常連接至可偵測部分。
典型地，套組亦包括適當標準對照組。標準對照組指示未罹患胃癌之健康個體之胃上皮中之BCL6B蛋白質或BCL6B mRNA的平均值。在一些情況下，可以設定值之形式提供該標準對照組。此外，本發明套組可提供說明書手冊，以導引使用者分析測試樣品及評估測試個體中胃癌之存在、風險或狀態。
在另一態樣中，亦可以一裝置或包含一或多個該等裝置之系統來體現本發明，該裝置或系統能進行本文中所述之所有或部分方法步驟。舉例而言，在一些情況下，在收到自為了偵測胃癌、評估患上胃癌之風險或監測病況進展而受測試之個體採集的胃組織樣品(例如胃黏膜樣品)後，裝置或系統執行以下步驟：(a)測定樣品中BCL6B mRNA或BCL6B蛋白質之量或濃度；(b)將該量或濃度與標準對照組值進行比較；及(c)提供指示個體中是否存在胃癌或個體是否處於患上胃癌風險中或個體胃癌病況是否有變化(亦即惡化或改良)的輸出。在其他情況下，在執行步驟(a)且將來自(a)之量或濃度輸入裝置中之後，本發明裝置或系統執行步驟(b)及(c)之任務。裝置或系統較佳為部分或完全自動化的。
實例
僅經由說明而非限制之方式提供以下實例。熟習此項技術者應容易認識到，可改變或修改各種非關鍵參數來產生基本相同或相似之結果。
材料及方法 人胃樣品 組織樣品
在任何治療性干預之前自12名胃癌患者在香港中文大學威爾斯親王醫院(the Prince of Wales Hospital,the Chinese University of Hong Kong)進行內窺鏡檢期間獲得來自胃原發腫瘤及鄰近非腫瘤部位的配對活檢樣品。此等樣品用於BCL6B基因表現程度比較中。
檢查已證實有胃腺癌之兩個患者群組，以評估胃癌(GC)患者中BCL6B甲基化狀態之臨床顯著性。第一群組(群組I)包括在廣州中山大學第一附屬醫院(the First Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University,Guangzhou)診斷之208名患者，而第二群組(群組II)之101名成員在香港中文大學威爾斯親王醫院得到診斷。群組II用於進一步驗證群組I中之發現。群組I包括127名男性及81名女性，平均年齡為57.2±12.7歲，且群組II包括55名男性及46名女性，平均年齡為65.6±12.9歲。亦確定其他臨床病理學特徵，諸如幽門螺旋桿菌(H.pylori)感染、T NM期及分化狀態。藉由使用快速尿素酶測試(RUT)，發現在群組I中，43名患者感染幽門螺旋桿菌且98名患者為幽門螺旋桿菌感染陰性；而在群組II中，30名患者為陽性且32名患者為陰性。在群組I中，T NM I、II、III及IV期中之患者數目為30、31、62及72，而在群組II中，四期之數目分別為15、17、29及28。在群組I中，有122、39名患者具有低分化GC，且57、31名患者具有發展之中度或高度分化GC；而在群組II中，數目分別 為39及31。一些資訊並不完整。所有腫瘤組織均獲自進行手術時之患者。此外，包括20個正常胃黏膜樣品作為對照，其亦獲自香港中文大學威爾斯親王醫院。
將樣品瞬間冷凍於液氮中且儲存於-80℃，用於分子學分析。將剩餘組織樣品固定於10%福馬林(formalin)中且包埋於石蠟中，用於常規組織學檢查。所有個體均提供獲得研究樣品之知情同意書。研究方案獲得香港中文大學道德規範委員會(the Ethics Committee)批准。
腫瘤細胞株
本研究中使用九種胃癌細胞株(AGS、BGC823、Kato III、MGC803、MKN28、MKN45、SNU1、SNU16及SNU719)。將細胞株維持於具有10%胎牛血清(Gibco BRL)之RPMI-1640培養基(Gibco BRL,Rockville,MD)中。所有此等細胞株均於具有95%空氣及5% CO2之培育箱中37℃下培育。每二至四天更新培養基。使用0.25%胰酶-EDTA溶液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)以1：3至1：4比率分裂細胞。
BCL6B基因之生物資訊學分析
使用加州大學聖克魯茲分校(University of California Santa Cruz，UCSC)之基因組生物資訊學(網址：genome.ucsc.edu)之在線資料庫獲得BCL6B基因之相關資訊。
藉由CpG島搜尋器(網址：cpgislands.usc.edu；Takai及Jones,In Silico Biol.,3(3),235-240,2003)來預測BCL6B基 因啟動子區之CpG島。CpG島被定義為大於500 bp、GC含量高於55%且觀測到/預期之CpG比高於0.65的DNA區(Takai及Jones,PNAS,99(6),3740-3745,2002)。前述方法及工具將對熟習此項技術者顯而易見。
基因表現分析 RNA分離
使用Quizol試劑(Qiagen,Valencia,CA,USA)分離總RNA。首先，使約5-10×106個細胞或30 mg組織於1 mL Qiazol試劑中均質化，且在室溫下培育10分鐘。向各樣品添加0.2 mL氯仿。將混合物劇烈震盪15秒，且在室溫下再靜置3分鐘。將樣品在4℃下以12,000 g離心20分鐘，且樣品分為兩層。將含RNA之上部水相轉移至新管中，與0.7 ml異丙醇混合，在室溫下培育10分鐘，且隨後在4℃下以12,000 g離心10分鐘。捨棄上清液後，用1 mL 75%乙醇洗滌RNA離心塊兩次；風乾5分鐘，且將其用不含RNase之H2O重新溶解。藉由不含RNase之DNaseI消化(GE Healthcare,Buckinghamshire,England)去除DNA污染。藉由使用NanoDrop ND-1000(NanoDrop Technologies,Wilmington,DE,USA)量測260 nm/280 nm下之吸光度來測定總RNA之品質及量。經純化之RNA儲存於-80℃下直至使用。
cDNA合成
使用MultiScribe逆轉錄酶套組(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)來合成cDNA。反應混合物含有1× 逆轉錄酶緩衝液、1×dNTP、1×隨機引子(由套組提供)、2.5 U/μL逆轉錄酶、1 U/μL RNase抑制劑及2 μg總RNA。將混合物在25℃下培育10分鐘，隨後37℃下培育120分鐘，隨後85℃下培育5分鐘來使酶失活。cDNA儲存於-80℃直至其他應用。
半定量逆轉錄PCR(RT-PCR)
以總體積25 μL之反應物進行半定量RT-PCR，該反應物含有GeneAmp 1×PCR緩衝液II(Applied Biosystems)、2.5 mM MgCl2、200 μM各dNTP、200 nM各引子、0.5 U AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems)及30至50 ng cDNA。PCR程式起始於95℃持續10分鐘之初始變性，隨和為32-35個擴增循環(94℃持續30秒、58℃持續30秒及72℃持續30秒)，在72℃下進行10分鐘之最終延伸。在紫外光下觀測PCR條帶並攝影。藉由充當內部對照之管家基因β-肌動蛋白之表現將標靶基因之表現標準化。用於擴增轉錄物之所有引子均列於表1中。
蛋白質提取
藉由使用CytoBuster蛋白質提取試劑(Merck Chemicals，Nottingham，UK)製備蛋白質。將細胞以3000 g離心10分鐘。隨後使用100 μL/106個細胞將離心塊再懸浮於CytoBuster中。將混合物在室溫下培育5分鐘。隨後將管在4℃下以15,000 g離心10分鐘，且將上清液轉移至新管中。
十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及西方墨點
藉由5%上部凝膠及10%下部凝膠使四十微克蛋白質分離。SDS-PAGE後，藉由半乾機在15 V下持續40分鐘將蛋白質轉移至平衡之聚偏二氟乙烯(PVDF)薄膜(Amersham Biosciences，Buckinghamshire，UK)上。在室溫下在震盪下將薄膜在溶解於TBS/T溶液(Tris緩衝生理食鹽水(Invitrogen)及0.1% Tween 20(Sigma-Aldrich))之5%無脂乳中阻斷1小時。
阻斷後，在4℃下在震盪下將薄膜在稀釋於5%無脂乳中之初級抗體中培育隔夜。在室溫下與二級抗體一起培育1小時後，藉由增強化學發光(ECL,Amersham Corporation,Arlington.Heights,IL,USA)偵測蛋白質。
DNA甲基化分析 基因組DNA提取
藉由使用DNA微型套組(Qiagen)、根據套組方案自GC細胞株及組織樣品分離基因組DNA。在56℃下將約25 mg樣品在1.5 mL微離心管中之180 μL QIAamp ATL緩衝液及20 μL蛋白酶K中溶解1小時。添加四微升RNase A(100 mg/ml，QIAgen)，且藉由脈衝渦動混合15秒，隨後在室溫下培育2分鐘。隨後，將200 μL AL緩衝液添加至溶胞物中，且將樣品在70℃下培育10分鐘。添加200 μL無水乙醇後，藉由脈衝渦動來混合溶液15秒。隨後，如製造商所說明，經QIAamp管柱純化溶胞物。將基因組DNA稀釋於200 μL不含DNase之H2O中。藉由使用NanoDrop ND-1000(NanoDrop)量測260 nm/280 nm下之吸光度來測定DNA之 品質及量。
亞硫酸氫鈉轉化法
如Tao等人，Hum.Mol.Genet.,11(18)：2091-2101,2002所述，用偏亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA。簡言之，將含於30 μL TE緩衝液(Sigma-Aldrich)中之5 μg基因組DNA與3.3 μL 3 mM NaOH混合至最終濃度為0.3 mM，且在37℃下培育15分鐘。將變性之DNA與333 μL亞硫酸氫鹽溶液混合，且在55℃下在暗處處理4小時。亞硫酸氫鹽溶液係製成2.4 M偏亞硫酸氫鈉(pH 5.0-5.2)(Sigma-Aldrich)及0.5 mM氫醌(Sigma-Aldrich)。使用Qiaex II套組(Qiagen)，根據套組提供之方案，將經處理之DNA脫鹽且純化。隨後用0.3 M NaOH在37℃下處理DNA 15分鐘，且用3 M乙酸銨及3體積乙醇進行沈澱。將回收之DNA溶解於100 μL TE緩衝液(pH 8.0)中且儲存於-20℃下。
使用5-氮雜-2'-脫氧胞苷(「5-Aza」)之去甲基化處理法
以每100 mm培養皿1×105個之密度接種細胞，且使細胞生長24小時。隨後用2 μM 5-氮雜-2'-脫氧胞苷(「5-Aza」)(Sigma-Aldrich)處理細胞5天。每天補充5-Aza。使用半定量RT-PCR評估BCL6B之基因表現。
甲基化特異性PCR(MSP)
設計甲基化特異性引子及未經甲基化特異性引子來評估GC細胞株中之甲基化狀態。PCR混合物含有1×PCR緩衝液II(Applied Biosystems)、2 mM MgCl2、200 μM各dNTP、600 nm各引子、0.5 U AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems)及20 ng亞硫酸氫鹽處理之DNA。PCR程式為95℃持續10分鐘，隨後為38個擴增循環(94℃持續30秒、60℃持續30秒及72℃持續30秒)，在72℃下最終延伸5分鐘。在紫外光下觀測MSP條帶且攝影。
組合亞硫酸氫鹽限制分析法(COBRA)
組合亞硫酸氫鹽限制分析法為在亞硫酸氫鈉修飾後，藉由使用限制酶切位點對甲基化及未經甲基化DNA進行半定量之技術。使用2 μL經亞硫酸氫鹽處理之DNA的PCR擴增法可得到具有190 bp之PCR產物，其涵蓋相對於轉錄起始位點之-95至+95 bp之BCL6B啟動子區(SEQ ID NO：18)。此區域含有9個CpG二核苷酸及1個BstUI限制位點。用BstUI(New England Biolabs,Ipswich,MA)消化PCR產物，該BstUI在其識別序列中之CpG位點內僅具有C。BstUI分裂序列5'-CGCG-3'，該序列保留於亞硫酸氫鹽處理之甲基化DNA中，但不保留於未經甲基化DNA中。將DNA消化物在非變性聚丙烯醯胺凝膠中分離且用溴化乙錠染色。COBRA用於描述GC細胞株、正常胃及GC樣品中之甲基化狀態。
亞硫酸氫鹽基因組定序(BGS)
用COBRA中之引子來擴增亞硫酸氫鹽處理之DNA。將PCR產物選殖至pCR4-Topo載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，隨機選擇七至八株且進行定序。藉由SeqScape軟體(Applied Biosystems,Foster City,CA)進行定序分析。
生物學功能分析 BCL6B之選殖及表現載體之構建
藉由PCR選殖產生BCL6B基因表現載體之全長cDNA。將來自人胃之總RNA(Ambion，Austin，TX，USA)逆轉錄為cDNA。藉由PCR來擴增對應於BCL6B之開放閱讀框架(ORF)之序列。根據製造商之導引(Invitrogen)，將PCR產物次選殖至pCDNA3.1 TOPO TA表現載體中。簡言之，將1 μL PCR產物接合至含有240 mM NaCl及12 mM MgCl2之總體積2.5 μL中的0.5 μL TOPO載體。在室溫下培育混合反應物30分鐘，隨後進行熱休克轉化。
使用JM109化學勝任大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)細胞(Promega，Madison，WI，USA)進行熱休克轉化。將JM109勝任細胞(50 μL)在冰上解凍，且將2 μL連接產物添加至細胞中。在冰上培育20分鐘後，使細胞於42℃水浴中不震盪下熱休克45秒，隨後立即將管轉移至冰上持續5分鐘。向細胞添加S.O.C.培養基(250 μL)，且將管在震盪培育器中以220 rpm在37℃下震盪1小時。培育後，將150 μL細胞展佈於含0.1 mg/ml安比西林(ampicillin)之Luria-Bertani(LB)瓊脂盤上且於37℃下培育隔夜。
藉由PCR來鑑定細菌群落。將陽性群落培養於含0.1 mg/ml安比西林之LB培養基中。藉由定序來檢查插入DNA。使用HiSpeed Plasmid Maxi套組(Qiagen)分離具有非突變標靶基因之質體。簡言之，將細菌在1 mL含0.1 mg/ml安比西林之LB培養基中於37℃下在250 rpm震盪下培養隔夜。隨後，再將0.5 mL細菌培養物接種至100 mL含 0.1 mg/ml安比西林之LB培養基中，且使其在37℃下在250 rpm震盪下生長16小時。藉由4℃下6000 g離心15分鐘來收集細菌離心塊。將離心塊再懸浮於10 mL緩衝液P1中。用10 mL緩衝液P2使細菌蛋白質、染色體及質體DNA變性。將管顛倒六次，且隨後將其置於室溫下5分鐘。用10 mL緩衝液P3中和混合物，隨後在室溫下培育10分鐘。藉由用QIA濾筒進行過濾來清除細胞溶胞物中之碎片。將經過濾之溶胞物經由重力流動施加至套組中提供之樹脂管柱中，且質體DNA與樹脂管柱結合。用30 mL QC緩衝液藉由重力流動洗滌管柱，以移除質體製備期間之所有污染物及來自細菌菌株之碳水化合物。用15 mL緩衝液QF溶離質體DNA。藉由異丙醇沈澱使DNA沈澱，且用70%乙醇洗滌DNA離心塊。將DNA離心塊風乾，且用1 mL不含DNase之H2O溶解。
BCL6B基因轉染
將細胞以1×104至2.5×104個細胞接種於不含抗生素之24孔盤中，持續約24小時，直至細胞密度達至約90%匯合。隨後，使用脂染胺(Lipofectamine)2000(Invitrogen)，分別用0.8 μg BCL6B及對照載體(pCDNA3.1)轉染細胞。將稀釋於50 μL Opti-MEM(Invitrogen)中之脂染胺2000(2.0 μL)在室溫下培育5分鐘。隨後，將稀釋於50 μL Opti-MEM中之質體DNA與脂染胺混合物合併。在5% CO2培育箱中37℃下培育24至48小時後，收集細胞，用於轉殖基因表現之測試。就穩定細胞株而言，以1：10比率將細胞繼代至含有適 當濃度之新黴素(G418)(Invitrogen)之新鮮生長培養基中。選擇14-21天之後收集穩定轉染細胞，用於功能分析。
群落形成分析
轉染兩天後，隨後以1：20比率將細胞分至具有於10% FBS中、含有500 μg/mL新黴素(G418)之RPMI1640的六孔盤中。選擇14-18天後，用70%乙醇固定細胞10分鐘，且用0.5%結晶紫溶液染色10分鐘。對每群落大於50個細胞之群落進行計數。以三個獨立一式三份樣品進行實驗。
細胞生存力分析
使用CellTiter 96 AQueous One溶液細胞增殖分析套組(Promega)進行MTS測定，MTS分析為3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑分析之簡稱。用胰蛋白酶處理經轉染細胞且進行計數。將細胞以5,000個細胞/100 μL稀釋於RPMI1640培養基中。在96孔盤中之各孔中接種100 μL細胞。在5% CO2培育箱中於37℃下培育盤。48小時後，將20 μL MTS試劑添加至培養基中。將培養物在CO2培育箱中37℃下培育30分鐘至2小時。轉染48小時後，在490 nm下量測樣品之吸光度。重複此實驗3次。
膜聯蛋白V細胞凋亡分析
膜聯蛋白V為可在發生細胞凋亡之後且在喪失膜完整性之前結合細胞膜之蛋白質。使用膜聯蛋白V及7-胺基-放射菌素(7-AAD)複染色法評估細胞凋亡細胞之比例。簡言之，將用1×PBS洗滌之細胞再懸浮於100 μL冰冷膜聯蛋白 結合緩衝液(10 mM HEPES、140 mM NaCl及2.5 mM CaCl2，pH 7.4)中，該緩衝液含有5 μL與Alexa Fluor 488(Invitrogen)結合之膜聯蛋白V及2 μL 7-AAD染色液。在室溫下培育15分鐘後，將細胞與另外400 μL冰冷膜聯蛋白結合緩衝液混合，且使用流動式細胞量測術進行分析。
活體內腫瘤發生
分別將用pCDNA3.1-BCL6B轉染或僅用pCDNA3.1轉染之BGC823細胞(於0.1 mL PBS中1×107個細胞)皮下注射至5週大之雄性Balb/c裸小鼠之背部左側。在腫瘤可見之後，每兩天量測腫瘤大小一次，持續3週。藉由量測腫瘤之最長及最短直徑且如下計算來估計腫瘤體積(mm3)：體積=(最短直徑)2×(最長直徑)×0.5。動物之照護及所有實驗程序得到香港中文大學動物道德規範委員會批准。3週後，殺死小鼠，且將腫瘤稱重且固定於福馬林中用於組織學分析。
免疫組織化學
在脫石蠟後之配對石蠟切片上進行免疫組織化學(IHC)。用含於PBS中之3% H2O2對切片進行過氧化酶淬滅。隨後將切片於水中洗滌，且用正常山羊血清預阻斷10分鐘。在初級抗體反應中，在室溫下用抗BCL6B抗體(Abcam)培育切片1小時。隨後，將切片用生物素標記之二級抗體(1：400)培育45分鐘。在PBS洗滌步驟之後，施加抗生物素蛋白質-生物素複合物(Strept ABComplex；DAKO,CA)。
統計分析
進行Mann-Whitney U測試來比較腫瘤與鄰近非腫瘤組織之間BCL6B蛋白質表現之差異。進行獨立樣品t測試來分析對照與BCL6B過度表現細胞在群落形成、MTS分析、膜聯蛋白V及7-AAD複染色分析及裸小鼠腫瘤重量方面之統計顯著差異。卡方檢定(chi-square test)用於分析患者特徵。卡本-麥爾(Kaplan-Meier)存活曲線及對數等級檢定用於評估對應於BCL6B甲基化狀態之總體存活資料。藉由重複量測方差分析(ANOVA)來確定用BCL6B表現載體及對照載體穩定轉染之2組小鼠之間腫瘤生長速率之差異。當P小於0.05時，認為資料為統計上顯著的；且當P小於0.01時，認為資料為極顯著的。
結果 BCL6B基因之資料採擷 BCL6B
BCL6B為B細胞CLL/淋巴瘤6(BCL6)之同系物，且充當序列特異性轉錄阻遏蛋白。使用加州大學聖克魯茲分校(UCSC)之基因組生物資訊學資料庫，本發明者獲得BCL6B基因位於染色體17p13.1上之資訊。BCL6B編碼具有480個胺基酸之轉錄阻遏蛋白。
BCL6B CpG島
使用CpG島搜尋器，跨越啟動子區及第一外顯子鑑定CpG島：GC含量為63%；觀測到/預期之CpG比為0.668；在902 bp區(SEQ ID NO：20)中有58個CpG位點。根據CpG 島分析結果，設計MSP引子及COBRA/BGS引子(圖1及表1)。圖1展示BCL6B之啟動子區及第一外顯子之一部分。將轉錄起始位點標記為TSS。亦呈現COBRA/BGS區及COBRA/BGS區內之9個CpG位點。
BCL6B基因表現 BCL6B表現於大多數人類組織中
為了確定BCL6B之表現圖譜，在人類正常組織中檢測BCL6B表現程度。使用半定量RT-PCR，本發明人發現BCL6B表現於大多數人類組織中，尤其於如肝臟、脾臟、胰臟、胃、小腸、結腸及直腸之消化器官中。
癌細胞株中BCL6B受表觀遺傳學上抑制
為了表徵BCL6B於GC中之表觀遺傳學效應，檢測9種GC細胞株中之BCL6B基因之表現程度及甲基化狀態。圖2展示GC細胞株中之BCL6B mRNA表現及啟動子甲基化。藉由RT-PCR來測定細胞株中BCL6B之mRNA表現。進行β-肌動蛋白之擴增作為RNA品質之內部對照。進行MSP及COBRA來偵測甲基化狀態。(M：藉由甲基化引子擴增之條帶，U：藉由未經甲基化引子擴增之條帶)
BCL6B基因在9種(100%)細胞株中減少或沉默，但明顯表現於正常胃組織中(圖2)。
為了評估BCL6B之沉默或下調是否與啟動子區之甲基化狀態匹配，使用甲基化特異性引子及未經甲基化特異性引子進行MSP及COBRA。MSP擴增子覆蓋相對於轉錄起始位點之-59 bp至+48 bp之區域(此區域之DNA序列如SEQ ID NO：9所示)。在8種GC細胞株(AGS、BGC823、KatoIII、MGC803、MKN28、MKN45、SNU1及SNU719)中偵測到完全或部分甲基化。除SNU16細胞株之外之GC細胞株中之甲基化狀態與表現程度充分匹配，在該SNU16細胞株中，BCL6B沉默，但未偵測到甲基化。SNU16中BCL6B基因可能因其他機制(諸如組蛋白修飾或上游轉錄調控)而沉默。
在去甲基化處理之後，BCL6B表現可恢復
為了證實BCL6B表現受啟動子甲基化抑制，使用5-Aza藥理學上干擾AGS、MKN28、NCI87及SNU719之甲基化細胞株中之啟動子甲基化。圖3展示如藉由RT-PCR測定之5-Aza去甲基化處理之GC細胞株中的BCL6B基因表現。如圖3中所示，5-Aza處理可恢復所有此等細胞株之表現，說明啟動子甲基化促進GC細胞株中BCL6B之表觀遺傳學抑制。
配對癌症及鄰近正常樣品中之BCL6B表現
為了評估原發腫瘤中BCL6B基因之臨床顯著性，本發明人使用免疫組織化學(IHC)比較12對GC活檢體及其鄰近非腫瘤組織中BCL6B之表現程度。自1(陽性染色細胞少於20%)至3(陽性染色細胞多於50%)對BCL6B染色程度進行計分，且由兩名獨立研究者以盲法形式進行計分，該等研究者之評估充分相關。發現與鄰近非腫瘤組織相比，原發腫瘤樣品中之BCL6B蛋白質顯著下調(P<0.001，圖4A及4B)。
功能分析 BCL6B對細胞增殖之抑制
藉由細胞生存力分析及群落形成分析，檢測不表現BCL6B之細胞株(AGS及BGC823)中BCL6B對細胞生長之活體外生物學效應。使用MTS分析來量測細胞生存力。此等GC細胞株中BCL6B之異位表現導致細胞生存力顯著下降(圖5)。藉由群落形成分析進一步證實對GC細胞生長之抑制效應。BCL6B轉染之細胞中所形成之群落顯著少於且小於(在大小方面)空載體轉染之細胞(降至載體對照之22%-44%，P<0.01)(圖6)。群落形成及MTS分析兩者均有力地證實，BCL6B可活體外抑制GC細胞之細胞生長。
BCL6B對細胞凋亡之誘導
為了檢測細胞凋亡對所觀測到之BCL6B轉染細胞之生長抑制的貢獻，用膜聯蛋白V及7-AAD複染色法藉由流動式細胞量測術測定細胞凋亡。
結果表明，與對照載體轉染之AGS細胞相比，BCL6B轉染之AGS細胞中之早期細胞凋亡細胞(13.14%±0.65%相較於6.58%±0.52%，P<0.001)及晚期細胞凋亡細胞(5.82%±0.63%相較於4.30%±0.16%，P<0.05)之數目均增加。與對照載體轉染之細胞相比，BCL6B轉染之BGC823細胞中之早期細胞凋亡細胞(15.99%±0.15%相較於10.42%±0.63%，P<0.001)及晚期細胞凋亡細胞(6.86%±0.42%相較於4.53%±0.62%，P<0.01)之比例均顯著增加。
活體內腫瘤抑制
將BGC823/BCL6B或對照細胞株BGC823/載體隨機注射至裸小鼠之背側中，以比較活體內腫瘤生長模式。
用BCL6B或空載體穩定轉染之BGC823之活體內腫瘤生長曲線展示於圖7A中。BCL6B轉染之裸小鼠中之腫瘤體積顯著小於載體對照小鼠(P<0.0001)。在實驗結束時，分離腫瘤並稱重。BCL6B轉染之裸小鼠中之平均腫瘤重量顯著低於載體對照小鼠(P<0.05)(圖7B)，表明BCL6B在胃癌發生中充當腫瘤抑制劑。
GC患者中之甲基化狀態
BCL6B表現在原發腫瘤及其鄰近非腫瘤組織中顯著不同，且展示與癌細胞株中甲基化狀態之相關性。
藉由BGS所得之GC細胞株中之甲基化狀態
進行BGS以評估4種GC細胞株(AGS、BGC823、Kato III及SNU16)之甲基化狀態。BGS結果與MSP及COBRA之結果一致(圖8)。
GC組織及正常胃組織中之甲基化狀態
藉由COBRA研究來自兩個獨立群組及20個正常胃活檢樣品之309例原發胃癌中之BCL6B甲基化狀態。在169個腫瘤組織(309中之169，55%)中偵測到異常甲基化，而20個正常胃活檢樣品根本不顯示甲基化(圖9A)，表明BCL6B甲基化為腫瘤特異性的。一些樣品之詳細BGS分析亦證實：BCL6B啟動子在原發GC中被頻繁甲基化，但在正常胃組織中不如此(圖9B)。
BCL6B甲基化與臨床特徵之間的關聯
為了評估BCL6B在胃腫瘤中之臨床應用，本發明人分析BCL6B甲基化與臨床特徵之間的相關性，且臨床特徵包括 兩個群組中之患者年齡、性別、腫瘤階段、幽門螺旋桿菌感染狀態、勞倫類型(Lauren type)、腫瘤分化及存活資料。在群組I中，BCL6B甲基化與臨床病理學特徵(諸如年齡、幽門螺旋桿菌狀態、組織類型或病理階段)之間不存在相關性，而在群組II中，發現BCL6B甲基化僅與勞倫類型相關。
在群組I之單變量Cox回歸分析中，BCL6B甲基化與癌症相關死亡風險之顯著增加相關(RR：1.60；95%置信區間：1.07-2.39；p=0.023)。腫瘤階段(P<0.0001)亦為結果之顯著預測因素。在對潛在混雜因素進行調節之後，多變量Cox回歸分析顯示：BCL6B甲基化為GC患者之較差存活之預測因素(RR：2.14；95%置信區間：1.36-3.36；P=0.001)。多變量分析揭示：腫瘤TNM階段為總體存活之另一獨立預測因素。當與IV期腫瘤患者相比時，I-III期患者具有顯著更佳存活。如卡本-麥爾存活曲線所示，BCL6B經甲基化之胃癌患者比其他患者具有顯著更短存活(P=0.021，對數等級檢定)(圖10A)。
群組II用於進一步驗證群組I中之發現。相似地，群組II之單變量Cox回歸分析指示：BCL6B甲基化與癌症相關死亡風險之顯著增加相關(RR：1.92；95%置信區間：1.13-3.25；p=0.016)。腫瘤階段(P<0.006)亦為結果之顯著預測因素。在多變量Cox回歸分析中，BCL6B甲基化展示為具有與存活之邊緣關聯(P=0.055)。如卡本-麥爾存活曲線所示，BCL6B經甲基化之胃癌患者比其他患者具有顯著更短 存活(P=0.012及P=0.016，對數等級檢定)(圖10B)。
本申請案中所引用之所有專利、專利申請案及其他公開案(包括GenBank寄存編號)均係以全文引用之方式併入用於所有目的。
圖1展示一個實施例中之BCL6B CpG島。
圖2展示一個實施例中之細胞株中之BCL6B mRNA表現。
圖3展示在一個實施例中去甲基化試劑對BCL6B表現之效應。
圖4展示在一個實施例中胃癌細胞及相鄰正常組織之成 對樣品中BCL6B之相對蛋白質表現程度。
圖5展示在一個實施例中MTS分析中細胞之外源BCL6B表現。
圖6展示在一個實施例中群落形成分析中BCL6B表現對轉染之細胞之效應。
圖7展示在一個實施例中裸小鼠中BCL6B表現之生長抑制效應。
圖8展示在一個實施例中藉由BGS獲得之GC細胞株中BCL6B基因組序列(SEQ ID NO：19)之甲基化狀態。
圖9展示在一個實施例中原發性GC及正常胃組織樣品中BCL6B基因組序列(SEQ ID NO：19)之甲基化狀態。
圖10展示在一個實施例中胃癌患者存活之卡本-麥爾分析。
<110> 香港中文大學 於君 沈祖堯 李曉星 許麗霞
<120> 胃癌之生物標記
<130> 12C10746CN
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<141> 2012/08/07
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<151> 2011-09-12
<160> 20
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於偵測BCL6B mRNA表現之合成RT-PCR引子BCL6BRTF
<400> 1
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於偵測BCL6B mRNA表現之合成RT-PCR引子BCL6BRTR
<400> 2
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於結合亞硫酸氫鹽之限制性內切酶分析(COBRA)或亞硫酸氫鹽基因組定序(BGS)之合成引子BCL6BCOBRAF
<400> 3
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於結合亞硫酸氫鹽之限制性內切酶分析(COBRA)或亞硫酸氫鹽基因組定序(BGS)之合成引子BCL6BCOBRAR
<400> 4
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成甲基化特異性PCR(MSP)引子BCL6BmF1
<400> 5
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成甲基化特異性PCR(MSP)引子BCL6BmR1
<400> 6
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成甲基化特異性PCR(MSP)引子BCL6BuF1
<400> 7
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成甲基化特異性PCR(MSP)引子BCL6BuR1
<400> 8
<210> 9
<211> 107
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 合成甲基化特異性PCR(MSP)產物，相對於轉錄起 始位點之MSP擴增子區-59至+48
<400> 9
<210> 10
<211> 1413
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> B細胞CLL/淋巴瘤6，成員B(BCL6B)轉錄阻過蛋白編碼序列，部分cDNA
<400> 10
<210> 11
<211> 3544
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人類野生型B細胞CLL/淋巴瘤6，成員B(BCL6B)轉錄阻遏蛋白，全長cDNA
<400> 11
<210> 12
<211> 170
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於偵測BCL6B mRNA之合成B細胞CLL/淋巴瘤6，成員B(BCL6B)轉錄阻遏蛋白之部分編碼序列，聚核苷酸探針
<400> 12
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成甲基化特異性PCR(MSP)引子BCL6BmF2
<400> 13
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成甲基化特異性PCR(MSP)引子BCL6BmR2
<400> 14
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成甲基化特異性PCR(MSP)引子BCL6BuF2
<400> 15
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成甲基化特異性PCR(MSP)引子BCL6BuR2
<400> 16
<210> 17
<211> 480
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人類B細胞CLL/淋巴瘤6，成員B(BCL6B)轉錄阻遏蛋白
<400> 17
<210> 18
<211> 190
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 啟動子
<222> (1)...(190)
<223> 用於結合亞硫酸氫鹽之限制性內切酶分析(COBRA)之B細胞CLL/淋巴瘤6，成員B(BCL6B)轉錄阻遏蛋白基因之啟動子區，相對於轉錄起始位點之-95至+95
<400> 18
<210> 19
<211> 121
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 啟動子
<222> (1)...(121)
<223> 用於亞硫酸氫鹽基因組定序(BGS)之B細胞CLL/淋巴瘤6，成員B(BCL6B)轉錄阻遏蛋白基因之啟動子區，相對於轉錄起始位點之-72至+49
<400> 19
<210> 20
<211> 902
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 跨越B細胞CLL/淋巴瘤6，成員B(BCL6B)轉錄阻遏蛋白基因之啟動子區及第一外顯子之CpG島，相對於轉錄起始位點之-869至+33
<400> 20

Claims (43)

  1. 一種偵測個體之胃癌之方法，該方法包含以下步驟：(a)量測取自該個體之樣品中BCL6B之表現程度，及(b)將步驟(a)中所獲得之該表現程度與標準對照組進行比較，其中當與該標準對照組比較時，該BCL6B表現程度減少時指示該個體患有胃癌。
  2. 如請求項1之方法，其中該樣品為胃黏膜樣品。
  3. 如請求項1之方法，其中該BCL6B表現程度為BCL6B蛋白質濃度。
  4. 如請求項1之方法，其中該BCL6B表現程度為mRNA濃度。
  5. 如請求項3之方法，其中步驟(a)包含使用可特異性結合BCL6B蛋白質之抗體進行免疫分析。
  6. 如請求項5之方法，其中步驟(a)包含西方墨點分析法。
  7. 如請求項1之方法，其中步驟(a)包含質譜分析法或與微陣列、螢光探針或分子信標之雜交法。
  8. 如請求項4之方法，其中步驟(a)包含擴增反應。
  9. 如請求項8之方法，其中該擴增反應為聚合酶鏈反應(PCR)。
  10. 如請求項9之方法，其中該PCR為逆轉錄酶-PCR(RT-PCR)。
  11. 如請求項4之方法，其中該偵測步驟包含聚核苷酸雜交分析法。
  12. 如請求項11之方法，其中該聚核苷酸雜交分析法為南方墨點分析法或北方墨點分析法。
  13. 如請求項11之方法，其中該聚核苷酸雜交分析法為原位雜交分析法。
  14. 如請求項11之方法，其中聚核苷酸探針用於該聚核苷酸雜交分析法中，以便與SEQ ID NO：9、10、11、12、18、19或20或其互補序列雜交。
  15. 如請求項14之方法，其中該聚核苷酸探針包含可偵測部分。
  16. 如請求項1之方法，當該個體被指示患有胃癌時，該方法進一步包含在一段時間之後使用來自該個體之樣品類型樣品重複步驟(a)，其中在該段時間之後，該BCL6B表現程度比該最初步驟(a)中之該量增加時指示胃癌有改善，而減少時指示胃癌有惡化。
  17. 一種偵測個體之胃癌之方法，該方法包含以下步驟：(a)用可差異性地修飾甲基化及未經甲基化DNA之試劑處理取自該個體之樣品；及(b)確定含CpG之基因組序列中之各CpG經甲基化抑或未經甲基化，其中該含CpG之基因組序列為SEQ ID NO：9、18、19或20之至少一個區段且包含至少一個CpG，其中該含CpG之基因組序列中一個甲基化CpG之存在指示該個體患有胃癌。
  18. 如請求項17之方法，其中該含CpG之基因組序列包含兩 個或兩個以上CpG且其中所有CpG中之至少50%經甲基化時指示該個體患有胃癌。
  19. 如請求項17或18之方法，其中該含CpG之基因組序列為SEQ ID NO：9、18、19或20之至少15個連續核苷酸之區段。
  20. 如請求項17或18之方法，其中含CpG之基因組序列為SEQ ID NO：9、18、19或20之至少20個連續核苷酸之區段。
  21. 如請求項17或18之方法，其中含CpG之基因組序列為SEQ ID NO：9、18、19或20之至少50個連續核苷酸之區段。
  22. 如請求項17或18之方法，其中含CpG之基因組序列為SEQ ID NO：9、18、19或20。
  23. 如請求項17之方法，其中含CpG之基因組序列為SEQ ID NO：19且其中所有CpG中之至少5者經甲基化時指示該個體患有胃癌。
  24. 如請求項17之方法，其中該樣品為胃黏膜樣品。
  25. 如請求項17之方法，當該個體被指示患有胃癌時，該方法進一步包含在一段時間之後使用來自該個體之樣品類型樣品重複步驟(a)及(b)，其中在該段時間之後甲基化CpG數目比該最初步驟(b)測定之該甲基化CpG數目增加時指示胃癌有惡化，而減少時指示胃癌有改善。
  26. 如請求項17之方法，其中可差異性地修飾甲基化DNA及未經甲基化DNA之該試劑為優先分裂甲基化DNA之酶、 優先分裂未經甲基化DNA之酶或亞硫酸氫鹽。
  27. 如請求項17之方法，其中步驟(b)包含擴增反應。
  28. 如請求項17之方法，其中步驟(b)包含DNA分子之定序。
  29. 一種用於偵測個體之胃癌之套組，其包含(1)可提供BCL6B蛋白質或BCL6B mRNA之平均量之標準對照組；及(2)可特異性且定量鑑定BCL6B蛋白質或BCL6B mRNA之試劑。
  30. 如請求項29之套組，其中該試劑為可特異性結合BCL6B蛋白質之抗體。
  31. 如請求項29之套組，其中該試劑為可與BCL6B mRNA雜交之聚核苷酸探針。
  32. 如請求項31之套組，其中該聚核苷酸探針具有SEQ ID NO：12所示之核苷酸序列。
  33. 如請求項29之套組，其中該試劑包含可偵測部分。
  34. 如請求項29之套組，其進一步包含可在擴增反應中特異性擴增SEQ ID NO：10或11或其互補序列之至少一個區段之兩個寡核苷酸引子。
  35. 如請求項29之套組，其進一步包含說明書手冊。
  36. 一種抑制胃癌細胞生長之方法，該方法包含使該胃癌細胞與有效量之包含SEQ ID NO：17所示之胺基酸序列之多肽或包含編碼SEQ ID NO：17之聚核苷酸序列之核酸接觸。
  37. 如請求項36之方法，其中該核酸為包含可操作地連接於編碼SEQ ID NO：17之該聚核苷酸序列之啟動子的表現卡 匣。
  38. 如請求項37之方法，其中該啟動子為上皮細胞特異性啟動子。
  39. 如請求項36或35之方法，其中該核酸包含SEQ ID NO：10或11所示之核苷酸序列。
  40. 如請求項36之方法，其中該胃癌細胞位於患者體內。
  41. 一種分離之核酸，其具有與SEQ ID NO：9、10、11、12、18、19或20或其互補序列之約20-100個連續核苷酸之區段至少95%一致的核苷酸序列。
  42. 如請求項40之核酸，其具有與SEQ ID NO：9、10、11、12、18、19或20或其互補序列之約20-100個連續核苷酸之區段一致的核苷酸序列。
  43. 如請求項40或41之核酸，其結合至可偵測部分。
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