TW201318632A - 新穎性乳酸菌載具降低酒精性肝損傷之用途與其組合物 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種乳酸菌株用於降低酒精性肝損傷之用途，及一種降低酒精性肝損傷之組合物，其包含具有降低酒精性肝損傷功能之乳酸菌株，其中，該乳酸菌株為唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius) BCRC14759或約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)BCRC17010所組成的群組。

Description

新穎性乳酸菌載具降低酒精性肝損傷之用途與其組合物

本發明係關於可降低酒精性肝損傷之乳酸菌株的用途，以及一種降低酒精性肝損傷之組合物。

國人肝臟疾病罹患率甚高，根據行政院衛生署統計(2009)，98年國人十大死因，慢性肝病以及肝硬化位居第八位，每年死亡人數在超過4900人；而在男女癌症十大死因中，肝癌分別為第一及第二位，而罹患率有年輕化的趨勢，且佔總死亡人口比重亦逐年增加。酒精進入體內90%以上是通過肝臟代謝，其代謝產物及它所引起的肝細胞代謝紊亂，是導致酒精性肝損傷的主要原因。

根據學者指出酒精對肝臟所造成的傷害與攝取的量呈正比(Lelbach,1972,Dtsch Med Wochenschr. 97:1435-1436.)。另外，也有學者認為性別、人種與基因同樣佔有很大的影響力(Morgan and Sherlock,1977,Br Med J. 1:939-941.;Llop et al.,1995,Rev Med Chil. 123:687-693)，例如大約50%東方人缺乏酒精代謝所需的重要酵素-乙醛去氫酶(alcohol dehydrogenase,ALDH)，因此對酒精的耐受力較差，而造成傷害。酒精若攝取超量或長期攝取下，很造成營養代謝紊亂，而傷害到人體健康。這些傷害包括了維生素B群與維生素A的缺乏(Leevy and Baker,1963,Arch Environ Health.7:453-459.)，導致末梢神經與眼睛視力方面的傷害。此外酒精也會對生物體三大營養素的需求產生紊亂的傷害，包括：

(1)改變醣類的代謝、抑制葡萄糖誘導之胰島素分泌、降低葡萄糖耐受與造成酒精性低血壓(Linder,1984,Sem liver Dis. 4:264-276.)。

(2)　抑制腸內蛋白質的吸收、尿氮素的排泄增加，造成總體蛋白質的流失(Mezey,1975,Ann NY Acad Sci. 252: 215-227.)。

(3)　體內氧化還原電位的改變(酒精代謝產生大量NADH，增加了NADH：NAD+的比例)，生成大量酮體(acetoacetate,β-hydroxybytyrate)，抑制脂質分解與降低體內游離脂肪酸，造成肝內triglycerides的堆積(Hirsch et al.,1998,Nutrition. 14:437-442.;Akanji and Hockaday,1990,Am J Clin Nutr. 51:112-118.)等。這些現象均是造成急性及慢性酒精性肝臟疾病的原因。

近年來關於的乳酸菌研究，並不再侷限於活菌體，其所衍生之物質亦具有保健功效，包括活菌、死菌、菌體萃取物及其代謝產物等。乳酸菌已有多種可作為人類益生菌的菌株被發表，而其主要的保健功效包括：

(1)　減緩乳糖不耐症(Scheinbach,1998,Biotechnol Adv. 16:581-608.)。

(2)　穩定並健全腸道菌相(O'Sullivan and O'Morain,2000,Dig Liver Dis. 32:294-301.;Malin et al.,1996,Ann Nutr Metab. 40:137-145.;Venturi et al.,1999,Aliment Pharmacol Ther. 13:1103-1108;Oksanen etal.,1990,Ann Med. 22:53-56.;Wang et al.,2004,Am J Clin Nutr. 280:737-741.)。

(3)　預防癌症、與致癌物質及致癌物質前驅物結合(Zhang and Ohta,1993,Can J Microbiol. 39:841-845.)。

(4)　抑制有害菌所產生的酵素活性(Goldin and Gorbach,1984,Am J Clin Nutr. 39:756-761.)。

(5)　降低腸道pH值(Scheinbach,1998,Biotechnol Adv. 16:581-608.)。

(6)　增加宿主免疫功能(Kato et al.,1994,Int J Immunopharmacol. 16:29-36.)。

(7)　降低膽固醇(Klaver and van der Meer,1993,Appl Environ Microbiol. 59:1120-1124.)。

(8)　增強免疫能力(Naidu et al.,1999,Crit Rev Food Sci Nutr. 39:13-126.)和降血壓(Nakamura et al.,1995,J Dairy Sci. 78:1253-1257.)。

(9)　改善或預防急性與慢性肝臟疾病(Ewaschuk et al.,2007,Hepatology. 46:841-850.;Loguercio et al.,2005,J Clin Gastroenterol. 39:540-543.)。

目前這方面之研究已有動物(Ewaschuk et al.,2007;Han et al.,2005,Arch Pharmacol Res. 28:325-329.;Osman et al.,2008,Dig Dis Sci. 53:2464-2473.)及人體實驗(Daubioul et al.,2005,Eur J Clin Nutr. 59:723-726.;Liu et al.,2004,Hepatology 39:1441-1449;Loguercio et al.,2005)都證實益生菌(probiotic)及益菌生(prebiotic)可改善或預防肝臟疾病，包括酒精性肝臟疾病(alcohol liver disease,ALD)。

Loguercio等人(2005,J Clin Gastroenterol. 39:540-543)曾針對酒精性肝硬化、非酒精性脂肪肝、HCV檢測陽性肝臟發炎者以及HCV檢測陽性伴隨肝硬化之慢性肝病患者，給予使用複合型乳酸菌-VSL#3(VSL#3內含8種不同的乳酸菌株)。另外，Kirpich等人(2008,Alcohol. 42:675-682)的研究中，選出66位有酒精性肝病的病人，探討在治療過程中，同時補充益生菌對恢復腸道菌叢及改善肝酵素的影響。Segawa et al.(2008,Int J Food Microbiol. 128:371-377.)的研究更發現，給予C57BL/6N小鼠熱致死乳酸菌菌體(Lactobacillus brevis SBC8803)，可以預防酒精所造成的肝臟疾病。Chen等人(2005,World J Gastroenterol. 11:5795-5800.)曾餵食大鼠富含Se的乳酸菌株後，以四氯化碳(tetrachloromethane,CC14)誘導其肝臟損傷。而Zsivkovits et al.,(2003,Carcinogenesis.24:1913-1918)曾將四株製作優格用的乳酸菌株(Lactobacillus bulgaricus 291,Streptococcus thermophilus F4,S. thermophilus V3 and Bifidobacterium longum BB536)餵食小鼠，並利用Heterocyclic aromatic amines(HCAs，為肉類烹煮過程中易產生之化合物)，誘發小鼠產生DNA傷害，結果顯示有給予乳酸菌的實驗組，其DNA傷害較低。

綜合以上文獻結果，乳酸菌活菌體或熱致死菌體可能具預防酒精性肝傷害的潛力，是否可預防酒精性肝傷害，卻少有研究報導與評估。而市面上對於具護肝功能之乳酸菌產品，亦不多見。因此，乳酸菌菌體超音波破碎及熱致死菌體培養液護肝功能研究與開發，將有助於肝臟相關疾病的預防。

本發明是將菌株及其培養液經超音玻破碎製備成菌株破碎培養液，以及熱致死菌株培養液，以酒精性傷害細胞模式進行篩選。

本發明係提供一種乳酸菌株用於降低酒精性肝損傷之用途，其中該乳酸菌株係唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius) BCRC 14759或約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)BCRC 17010，以上兩株菌株係寄存於台灣新竹食品工業發產研究所。

本發明之具體實施例中，該降低酒精性肝損傷的乳酸菌株可為活的菌株或去活性菌株。

如本文所用的，術語“活性菌株”及“去活性菌株”，活的菌株經過特定溫度加熱或其他常用以殺死乳酸菌的方式處理後，可得到去活性菌株。

本發明提供一種乳酸菌株用於降低酒精性肝損傷的用途，其中該乳酸菌株係唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius)寄存標號為BCRC14759或約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)寄存標號為BCRC17010，上述兩株菌株係寄存於台灣新竹食品工業發產研究所。

根據本發明之具體實施例中，上述菌株具有降低麩胺草醋酸轉移酶(GOT)、麩胺丙酮酸轉移酶(GPT)、伽瑪麩胺醯轉移酶(γ-GT)、脂質過氧化物-丙二醛(malondialdehyde,MAD)或三酸甘油酯(TG)活性之功能。

本發明另提供一種降低酒精性肝損傷之組合物，其包含具有降低酒精性肝損傷功能之乳酸菌株，其係唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius)寄存標號為BCRC14759或約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)寄存標號為BCRC17010。

根據本發明之具體實施例，當個體服用本發明之組合物係能降低麩胺草醋酸轉移酶(GOT)、麩胺丙酮酸轉移酶(GPT)、伽瑪麩胺醯轉移酶(γ-GT)、脂質過氧化物-丙二醛(malondialdehyde,MAD)或三酸甘油酯(TG)等之活性，並降低個體的肝臟所產生氧化傷害，能進一步降低酒精性肝損傷發生之機率，達到保護肝臟的效果。

如本文所用的，術語“個體”係哺乳類動物，其較佳係人類。

根據本發明之組合物之具體實施例中，其可被製成適合用於非經腸道、局部或口服投藥劑型。較佳地，本發明之組合物可被製成溶液、乳劑、粉末、錠劑、膠囊或供用於口服投藥的其他形式。

本發明之具體實施例中，該組合物可做為包括，但不限於：膳食補充劑、食品、飲料、乳品或上述形式之組合；其中乳品可為流體乳品(如：牛奶與濃縮牛奶)、發酵乳品(優酪乳、酸乳、冷凍優格、乳酸菌發酵飲料)、奶粉、冰淇淋、乳酪、乾酪、豆奶與發酵豆奶等。飲料可為蔬果汁、果汁及運動飲料等。食品可為甜點、糖果、嬰兒食品、動物飼料等。

茲以下列實施方式予以詳細說明本發明，惟並不意味本發明僅侷限於此等實施方式所揭示之內容。

實驗材料

A：細胞株：human hepatoblastoma cell line-Hep G2(肝癌細胞株-Hep G2，接近正常肝細胞之肝癌細胞)。

B：動物：SD大鼠56隻，購自樂斯科生物科技公司。

C：菌株與菌體：乳酸菌株，共2株菌種，其包含H13及H14。

D：細菌培養基：MRS broth(醣類肉湯培養基購自Difco Laboratories(Detroit,MI,USA)之產品；半胱氨酸(free base)均購自Sigma公司(Louis,MO.,USA)。以上試藥皆為試藥一級或分生級純度。

實例1　乳酸菌樣品製備 1-1　乳酸菌菌株活化與菌種保存

將保存於甘油之乳酸菌菌株接種於含有3毫升MRS(含0.5% cysteine)培養基中，於37℃下，靜置培養24小時。之後，將活化第一次的菌液接入含有5毫升MRS(含0.5% cysteine)培養基中，於37℃下，靜置培養24小時。乳酸菌菌種保存方法為菌液添加20%甘油抗凍劑，置於-80℃保存。

1-2　乳酸菌菌數調整

利用血球計數法，取10^-4倍稀釋菌液加在血球計數盤上後，蓋上蓋玻片後，在顯微鏡下計數並以MRS培養液調整每株乳酸菌菌數量約為2×10⁹ cfu/ ml後，開始進行後續試驗。

1-3　乳酸菌經超音波及加熱處理之培養液製備

取1毫升上述調整好菌數之乳酸菌菌體培養液加入1.5毫升微量離心管，插入於碎冰中，經超音波破碎儀(20 KHz)進行菌體破碎。破碎條件為超音波破碎10分鐘，休息2分鐘；再破碎10分鐘，休息數分鐘後；最後再破碎10分鐘，即為超音波處理之菌體破碎培養液。熱致死菌體培養液則是取1毫升上述調整好菌數之乳酸菌菌體培養液加入1.5毫升微量離心管中，以高溫高壓殺菌釜進行滅菌後，即為加熱處理之菌體培養液。

1-4　菌種鑑定

將有預防酒精性肝損傷功效佳的乳酸菌，採用API 50 CHL套組進行菌種鑑定。首先以無菌棉棒在培養24至36小時之目標菌的平板培養基上塗抹取菌。再將塗有菌體之棉棒放入含有2毫升PBS緩衝液之玻璃小瓶中，調製成菌體懸浮液，以玻璃吸管吸取此菌液滴入含有5毫升PBS緩衝液之玻璃小瓶中，調製成混濁度為McFarland 2之懸濁液，並記取所製備之滴數(n)。打開含有10毫升API 50 CHL培養液之玻璃管，吸取原先製備成2毫升菌體懸浮液，滴入2n滴之菌液於10毫升API 50 CHL培養液中，調製成試驗用菌液，以無菌吸管注入約90微升之試驗用菌液至每個測試條之孔洞中，須避免氣泡產生，並覆蓋一層無菌礦物油，置於37℃培養，並於24及48小時進行判讀。最後以API LAB software系統鑑定受試菌株之種別。

實例2　細胞培養實驗 2-1　Hep G2細胞培養與繼代

Hep G2細胞株，均以DMEM完全培養液培養於37℃、5%CO₂的培養箱中；繼代培養(subculture)時，先用PBS(磷酸緩衝溶液)清洗1至2次，再以胰蛋白酶-乙二胺四乙酸-葡萄糖(Trypsin-EDTA-Glucose，TEG)(0.05 mM胰蛋白酶、2.5 mM乙二胺四乙酸(EDTA)和2.8 mM葡萄糖)處理數分鐘，使細胞與培養皿底分離，最後分種於新的細胞培養皿中，每一培養皿注入約7毫升的細胞培養液，細胞培養液每兩天更換一次。

2-2　乳酸菌超音波菌體破碎培養液及熱致死菌體培養液與細胞共同培養試驗

細胞生長至約八分滿後，分別加入破碎培養液與50 mM酒精共同培養24及72小時後，以PBS清洗2次，收集其細胞培養液與細胞進行各種分析。

2-3　肝功能生化指數的檢測

收集經超音波破碎及熱致死之菌體培養液處理過之細胞懸浮液，以冷凍離心機於4℃下每分鐘3500 rpm離心5分鐘，取上清液。再以自動生化分析儀檢測肝功能生化指數GOT(AST)、GPT(ALT)，GOT及GPT檢測原理是依據Reitman&Frankel(1957)及國際聯邦臨床化學(IFCC,1986a,b)的標準方法。

2-4　實驗數據統計分析

實驗數據以mean±S.D表示，並用Statistical Program for Social Sciences(社會科學統計軟體)進行變方分析(1-way and 2-way ANOVA)。當F值為顯著時，再以Scheffe’s test測定組與組間差異之顯著性，P＜0.05視為具顯著性差異。

結果

本發明將人類肝癌細胞株-Hep G2與H13及H14菌株，上述菌株寄存於台灣新竹食品工業發產研究所(表一)，將上述之熱致死乳酸菌菌體培養液共同培養24小時後，如圖1顯示GOT與GPT濃度皆有顯著下降(P<0.05)，其中GOT部分，H13下降46.9%及H14下降41.7%；GPT則別分降低55.4%(H13)及55.6%(H14)。

伽瑪麩胺醯轉移酶(γ-GT)是一種肝、膽分泌的酵素，為目前臨床上評估酒精性肝病指標之一。本發明進一步分析血漿中γ-GT的濃度，如圖2結果顯示，在與酒精處理組相較之下，H13及H14各菌株之菌體培養液處理組，γ-GT依序下降72.8%及79.9%。其後並將該兩株菌體培養液與細胞株Hep G2培養後，如圖3結果顯示可明顯降低丙二醛的濃度，其效果為H14>H13。

綜合以上結果發現，在細胞試驗中，H13與H14兩株菌株，除了降低三項肝臟損傷指標的效果外，對於酒精所誘發的脂質過氧化亦有明顯抑制效果(P<0.05)。

實例3　動物實驗設計 3-1：組別

經過細胞培養篩選預防酒精性肝損傷功能性乳酸菌試驗後，將兩株乳酸菌(H13及H14)之超音波菌體破碎培養液或熱致死菌體培養液進行動物試驗。

本發明購自樂斯科生物科技公司的雄性SD大鼠(200-250克)，共56隻，隨機將大鼠分成每組8隻，研究組別共7組，(1)正常對照組：正常飲食組；(2)負對照組：酒精處理組；(3)正對照組：水飛薊素(Silymarin)處理組；(4)菌體處理培養液A中劑量組：根據人體建議攝取菌體量；(5)菌體處理培養液A高劑量組：人體建議攝取量之5-10倍(6)菌體處理培養液B中劑量組：根據人體建議攝取菌體量；(7)菌體處理培養液B高劑量組：人體建議攝取量之5-10倍。

3-2　酒精誘導大白鼠急性肝損傷的方法

以酒精單一高劑量誘發大白鼠急性肝損傷實驗模式。實驗前將大鼠隨機分為7組，每組8隻：

A組為正常飲食組：管餵正常水飛薊素(Normal saline)(1 ml/kg body weight)。

B組為酒精處理組：管餵酒精(1 ml of 6g/kg B.W.)。

C組為水飛薊素處理組：管餵酒精(1 ml of 6g/kg B.W.)+水飛薊素(200 mg/kg)。

D組為菌體處理培養液A中劑量組：管餵酒精(1 ml of 6g/kg B.W.)+處理培養液A。

E組為菌體處理培養液A高劑量組：管餵酒精(1 ml of 6g/kg B.W.)+處理培養液A。(人體建議攝取量之5-10倍)

F組為菌體處理培養液B中劑量組：管餵酒精(1 ml of 6g/kg B.W.)+處理培養液B。

G組為菌體處理培養液B高劑量組：管餵酒精(1 ml of 6g/kg B.W.)+處理培養液B。(人體建議攝取量之5-10倍)

3-3　實驗步驟

大鼠適應一週後，在第1、3、5、7、9天，A、B組以胃管灌餵Normal saline，在C組灌胃予水飛薊素(Silymarin)(200 mg/kg)，在D、E、F、G組則管餵予試驗樣品，共為期10天。最後於第10天，給予管餵單一劑量之酒精(1 ml of 6g/kg B.W.)後，全部犧牲，以腹腔大動脈採血檢驗肝臟生化功能(GOT、GPT、γ-GT)。另外將其餘肝臟依解剖相關位置分為五袋，分別進行檢測脂質過氧化物濃度(MDA)、超氧歧化酶(SOD)與觸酶(Catalase)等酵素活性。

3-4　流程圖

3-5　丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量之測定

取1毫升細胞上清液或肝組織均質液加入10.5 μl 2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)(終濃度為.50 mM)，防止在強酸中加熱時造成的脂質自動過氧化。其後分別加入2毫升之7.5%三氯醋酸(TCA)溶液冰浴靜置5分鐘使蛋白質沉澱，以冷凍離心機於4℃下每分鐘2500 rpm離心10分鐘取得上清液。取得1毫升上清液與1毫升之0.7%硫代巴比妥酸(TBA)溶液，混合後，以乾浴器95℃加熱10分鐘。待冷卻後，加入等量的正丁醇(n-butanol)萃取出TBARS，離心(1000xg，5分鐘)，以螢光分光光度計分析(Ex：515 nm，Em：555 nm)。本實驗以1,1,3,3,-四甲氧丙烷(1,1,3,3-tetramethoxypropane，TMP)在與1 N硫酸(H₂SO₄)作用後所生成之MDA當作標準品，硫巴比妥酸反應物質(TBARS)產量以nmol/10⁵ cells表示。

3-6　超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性分析

實驗參照Marklund(1974,Eur. J. Biochem. 47: 469-474)所描述之方法進行，將肝組織用冰食鹽水(ice-cold saline)洗淨，在漏斗上滴乾鹽水，加入適量緩衝液(0.32 mol/1 sucrose、1 mmol/1 EDTA、10 nmol/1 Tris-HCl,pH 7.4)打碎使成10%之均質漿(homogenate)。高速離心30分鐘(13600 xg)，取上清液50微升，再加上Tris-cacodylic acid buffer(pH 8.2,50 mM)100微升。溶液再加上超純水，使體積成為980微升，再加上鄰苯三酚(pyrogallol)20微升(0.2 mM)，劇烈搖盪混均，以分光光度計於420 nm測量吸光值(A)，每隔20秒測量一次，總共測量5分鐘，計算△A/△T。

分析過程中以SOD標準品，作出標準線(standard curve)，再進行分析。單位時間內抑制鄰苯三酚自動氧化速率達50%時之酵素量，定為一單位(U)；肝組織SOD活性，以每單位蛋白質所含SOD單位量表示(U per milligram of protein)。

3-7　過氧化氫酶(catalase,CAT)活性分析

實驗參照Aebi(1984,Methods in Enzymol. 105: 121-126)所描述之方法進行。將肝組織用冰食鹽水(ice-cold saline)洗淨，在漏斗上滴乾鹽水，加入適量磷酸鹽緩衝溶液，打碎使成10%之均質漿(homogenate)，離心(700 xg)10分鐘，取上層液9份加入1份Triton X-100(1%)成為儲存均質漿[stock homogenate (S.H.)]。取S.H.加入適量之磷酸緩衝溶液進行稀釋，調整酸鹼度至pH 7成為稀釋均質漿[dilute homogenate(D.H.)]，取D.H.2毫升加入1毫升H2O2(0.03 M)，劇烈搖盪混均，以分光光度計於溫控25℃、波長240 nm之條件下測量吸光值(A)，每隔15秒測量一次，總共測量2次，計算求得反應速率常數K。

K=(2.3/Δt)log(A1/A2)

Δt：時間間隔(15秒鐘)

A1:T1時段，樣品之吸光值-空白吸光值。

A2: T2時段，樣品之吸光值-空白吸光值。

肝組織CAT活性，以每單位蛋白質所含反應速率K表示。(K per milligram of protein)。

3-8　肝功能生化指數的檢測

所有大白鼠血液樣品在室溫下放置一小時以使其凝結，再以冷凍離心機於4℃下每分鐘12000 rpm離心5分鐘，來分離血清(Lin et al.,1997,Am. J. Chin. Med. 25: 325-332)，再以自動生化分析儀檢測肝功能生化指數，如GOT(AST)、GPT(ALT)、γ-GT、TG、Cholesterol等，其中GOT(AST)及GPT(ALT)檢測原理是依據Reitman&Frankel(1957)及國際聯邦臨床化學(IFCC,1986a,b)的標準方法。

3-9　蛋白質定量

利用Bio-Rad Protein Assay kits分析。分析套組中的Coomassie Brilliant blue試劑與樣品蛋白質結合產生藍色產物，再以分光光度計(Spectrophotometer)測定595 nm之吸光值，以BSA製作標準曲線，並換算樣品吸光值及各樣品蛋白質總濃度。

3-10　實驗數據統計分析

實驗數據以mean±S.D表示，並用SPSS電腦統計軟體進行變方分析(1-way and 2-way ANOVA)，當F值為顯著時，再以Scheffe’s test測定組與組間差異之顯著性，P＜0.05視為具顯著性差異。

結論

本發明將上述菌株進行動物實驗，評估其菌體培養液在體內之護肝功效。其結果分述如下，由表二結果顯示，SD(Sprague-Dawley)大鼠餵食熱致死菌體培養液10天後，最終體重平均約為275.6公克，各組間在統計上並無顯著差異，結果顯示餵食熱致死菌體培養液並不會影響動物的正常生長狀況。在臟器重量方面，SD大鼠肝臟和腎臟於各組間均無顯著性差異；另外，SD大鼠餵食熱致死菌體培養液後，無論是H13或H14菌株，其各組間之體重和臟器重量百分比，在統計上亦無顯著差異(P>0.05)。因此，由結果得知SD大鼠管餵熱致死菌體培養液並不會影響到肝臟和腎臟的正常生理代謝或是產生異常生理反應。

一般而言，當肝細胞受到傷害時，肝中的GOT、GPT會從肝中脫逸到血漿或血清中，因此成為評估肝臟損傷最常用的臨床生化指標(Sturgill and Lambert,1997,Clin Chem. 43:1512-1526)；另外，γ-GT是一種肝、膽分泌的酵素，在肝細胞受到破壞時，γ-GT會上升，而酒精性肝傷害或酗酒時，也會誘發γ-GT值升高。目前亦被作為臨床上酒精性肝病的生化指標(Lee et al,2004,Free Radic Res.38:535-539)。由圖4結果顯示，給予SD大鼠高劑量酒精(6g/kg body waight)，會誘發GOT、GPT及γ-GT濃度上升，在给予H13或H14乳酸菌之熱致死發酵培養液後，除了HH13(高劑量H13；1×10¹¹ cfu/kg body weight)處理組可有效降低GOT外，其餘處理組對於GOT、GPT的抑制並無影響。但是對於γ-GT有顯著的抑制效果，且具有劑量關係(P<0.05)，LH13(低劑量H13；1×10¹⁰ cfu/kg body weight)和HH13處理組抑制率分別是23.3%和43.9%，LH14(低劑量H14；1×10¹⁰ cfu/kg body weight)和HH14(高劑量H14；1×10¹¹ cfu/kg body weight)處理組的抑制率分別是25.9%和34.1%。

硫代巴比妥酸反應物(thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)數值的測試主要在測定脂質過氧化二級產物-丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量，是一種脂質過氧化(lipid peroxidation)程度和脂質氧化壓力(oxidative stress)常用的指標。如圖5所示，SD大鼠在給予高劑量酒精後，會誘發其肝臟產生氧化傷害，肝臟中脂質過氧化物的濃度顯著的增加(P<0.05)，然而給予水飛薊素之組別(正控制組)與酒精傷害組相比，能夠顯著降低肝臟中MDA濃度25%(P<0.05)；而在以熱致死菌體培養液處理方面，LH13和HH13處理組與酒精傷害組相較，可降低傷害達39.7%、39.8%；LH14和LH14處理組與傷害組相較，可夠降低達34.5%、42%，其中又以HH14處理組的抑制效果最為明顯。

如圖6顯示，SD大鼠在給予高劑量酒精後，其肝臟中的觸酶(catalase)活性明顯下降，然而，給予silymarin之組別(正控制組)與酒精傷害組相較，能夠增加肝臟中觸酶活性；而在以熱致死菌體培養液處理方面，除了HH13處理組，可顯著增加因酒精處理所導致觸酶活性下降(約16%;P<0.05)外，其於組別均無顯著差異。

如圖7顯示，SD大鼠在給予高劑量酒精後，其肝臟中超氧歧化酶(superoxidase dismutase,SOD)活性並無明顯改變，其餘處理組別亦無差異。由此結果得知，各處理組中僅HH13可有效提升肝臟中觸酶的活性，而對於超氧歧化酶的活性，各處理組均無影響。

因過量攝入酒精會導致血中三酸甘油酯(triglyceride,TG)過高造成高脂血症(hypertriglyceridemia)，亦會伴隨極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)上升(Mukamal and Rimm,2008,Curr Atheroscler Rep. 10:536-543)。SD大鼠餵食熱致死發酵培養液連續十天後，並給予高劑量酒精誘發傷害，由表三結果顯示，各處理組之血漿中高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)、總膽固醇(total cholesterol,T-CHO)與控制組相並無顯著差異(P>0.05)；然而，血漿中三酸甘油酯方面，給予LH13菌株之熱致死發酵培養液，可顯著降低高劑量酒精所誘發之TG濃度(P<0.05)，與酒精組相較LH13處理組可降低約34%，而H14處理組則無。

上述實施例僅為說明書本發明之原理及其功效，而非限制本發明。因此，習於此技術之人士對上述實施例所做之修改及變化仍不違背本發明之精神。本發明之權利範圍應如後述之申請專利範圍所列。

圖1為熱致死菌體培養液對於酒精(100 mM)誘發Hep G2細胞株產生麩胺草醋酸轉移酶(glutamate oxaloacetate transaminase,GOT)及麩胺丙酮酸轉移酶(glutamate pyruvate transaminase,GPT)之影響，為麩胺草醋酸轉移酶，為麩胺丙酮酸轉移酶。

圖2為熱致死菌體培養液(1×10⁸cfu/ml)對於酒精(100 mM)誘發Hep-G2細胞株產生麩胺醯轉移酶(gamma-glutamyl transferase,γ-GT)之影響。

圖3為熱致死菌體培養液(1×10⁸ cfu/ml)對於酒精(100 mM)誘發Hep-G2細胞株產生的脂質過氧化之影響。

圖4為熱致死菌體培養液對於酒精誘發SD大鼠產生麩胺草醋酸轉移酶(GOT)、麩胺丙酮酸轉移酶(GPT)及伽瑪麩胺醯轉移酶(γ-GT)的影響，為麩胺草醋酸轉移酶，為麩胺丙酮酸轉移酶，麩胺醯轉移酶。(英文字母的標示是為了表示統計上有無差異。各組間若標示有相同英文字母，表示各組間經由科學統計後並無差異，若英文字母不相同即代表有統計上的差異，可稱為顯著差異。)

圖5為熱致死菌體培養液對於酒精誘發SD大鼠產生脂質過氧化物(malondialdehyde,MDA)濃度的影響。(英文字母的標示是為了表示統計上有無差異。各組間若標示有相同英文字母，表示各組間經由科學統計後並無差異，若英文字母不相同即代表有統計上的差異，可稱為顯著差異。)

圖6為熱致死菌體培養液對於酒精誘發SD大鼠肝臟中觸酶(catalase)活性的影響。(英文字母的標示是為了表示統計上有無差異。各組間若標示有相同英文字母，表示各組間經由科學統計後並無差異，若英文字母不相同即代表有統計上的差異，可稱為顯著差異。)

圖7為熱致死菌體培養液對於酒精誘發SD大鼠肝臟中超氧歧化酶(superoxidase dismutase,SOD)活性的影響。(英文字母的標示是為了表示統計上有無差異。各組間若標示有相同英文字母，表示各組間經由科學統計後並無差異，若英文字母不相同即代表有統計上的差異，可稱為顯著差異。)

Claims (7)

1. 一種乳酸菌株用於降低酒精性肝損傷之用途，其中該乳酸菌株係唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius) BCRC 14759或約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)BCRC 17010。
2. 如申請專利範圍第1項所述之用於降低酒精性肝損傷之用途，其中降低酒精性肝損傷係降低麩胺草醋酸轉移酶、麩胺丙酮酸轉移酶、伽瑪麩胺醯轉移酶、脂質過氧化物-丙二醛或三酸甘油酯。
3. 如申請專利範圍第1項所述之用於降低酒精性肝損傷之用途，其中該乳酸菌株為活的菌株或去活性菌株。
4. 一種降低酒精性肝損傷之組合物，其包含具有降低酒精性肝損傷功能之乳酸菌株，該乳酸菌株係唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius) BCRC 14759或約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)BCRC 17010。
5. 如申請專利範圍第4項所述之降低酒精性肝損傷之組合物，其中降低酒精性肝損傷係降低麩胺草醋酸轉移酶、麩胺丙酮酸轉移酶、伽瑪麩胺醯轉移酶、脂質過氧化物-丙二醛或三酸甘油酯。
6. 如申請專利範圍第4項所述之降低酒精性肝損傷之組合物，其中該乳酸菌株為活的菌株或去活性菌株。
7. 如申請專利範圍第4項所述之降低酒精性肝損傷之組合物，其為膳食補充劑、食品、乳品、飲料或上述形式之組合。