TW201305340A

TW201305340A - 人葡萄糖激酶突變體編碼基因、其編碼的酶、重組載體及宿主，其醫藥組合物及其應用

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Publication number: TW201305340A
Application number: TW100126721A
Authority: TW
Inventors: hai-dong Huang
Original assignee: hai-dong Huang
Priority date: 2011-07-28
Filing date: 2011-07-28
Publication date: 2013-02-01

Abstract

本發明提供了一種人葡萄糖激酶突變體編碼基因，其具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或除前述核苷酸序列的第487位至第1884位的開放閱讀框外，其餘部分與前述核苷酸序列相同的核苷酸序列，並且該核苷酸序列的開放閱讀框與SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的開放閱讀框編碼相同的胺基酸序列。本發明還提供了由所述基因表達的人葡萄糖激酶突變體、攜帶所述基因的重組載體、含有該重組載體的宿主、含有它們的醫藥組合物，它們的應用以及使用它們預防和治療疾病的方法。本發明的基因所表達的人葡萄糖激酶突變體，其活性高於野生型人葡萄糖激酶，從而為控制血糖或預防和治療糖代謝紊亂，尤其是為預防和治療糖尿病提供了有力的新途徑。

Description

人葡萄糖激酶突變體編碼基因、其編碼的酶、重組載體及宿主，其醫藥組合物及其應用

本發明涉及一種人葡萄糖激酶突變體編碼基因，由所述基因表達的人葡萄糖激酶突變體，攜帶所述人葡萄糖激酶突變體編碼基因的重組載體、含有該重組載體的宿主，含有選自所述的人葡萄糖激酶突變體編碼基因、人葡萄糖激酶突變體、重組載體和宿主中的一種或幾種的醫藥組合物，所述的人葡萄糖激酶突變體編碼基因、人葡萄糖激酶突變體、重組載體和宿主在製備控制血糖的藥物或預防和治療糖代謝紊亂的藥物中的應用，所述的人葡萄糖激酶突變體編碼基因、人葡萄糖激酶突變體、重組載體和宿主在製備預防和治療糖尿病的藥物中的應用，使用它們的控制血糖或預防和治療糖代謝紊亂的方法，以及使用它們的預防和治療糖尿病的方法。

葡萄糖激酶(Glucokinase，GK)是己糖激酶(hexose kinase)家族中的一個重要成員，其基本的生物學活性是催化葡萄糖的磷酸化。人的葡萄糖激酶編碼基因位於7號染色體的短臂上，有10個外顯子。GK由465個胺基酸構成，特異性存在於成熟肝細胞和胰島β細胞中，參與糖代謝與胰島素分泌過程中的多個重要環節。

目前已經證明體內胰島素分泌反應的強度與葡萄糖在胰島β細胞內的代謝率成正比，因而控制葡萄糖流入細胞速率的酶類被認為是調節胰島素釋放的葡萄糖感測器，葡萄糖激酶(Glucokinase，GK)就是胰島β細胞內的葡萄糖感受器。當葡萄糖通過轉運體2進入胰島β細胞，在葡萄糖激酶的作用下進行磷酸化並進入糖酵解途徑產生ATP，其數量與進入β細胞的葡萄糖成正比；ATP可關閉β細胞膜上的鉀離子通道，從而引起去極化，進而引起鈣離子內流並最終導致胰島素的分泌。葡萄糖激酶(GK)的活性直接或間接受血中葡萄糖濃度的調節，從而改變葡萄糖在胰島β細胞內的代謝率，調節胰島素分泌。同時，葡萄糖激酶(GK)又可通過促進肝糖原合成催化葡萄糖轉化為6-磷酸葡萄糖來調節血糖濃度，因而葡萄糖激酶(GK)活性異常在糖代謝紊亂的發生發展中起著重要的作用。

研究發現，在第2型糖尿病患者及一些動物模型中，如饑餓鼠，高脂飲食誘導的第2型糖尿病大鼠肝細胞葡萄糖激酶(GK)活性均比正常明顯下降；另一些研究結果還表明，提高葡萄糖激酶(GK)活性可顯著降低血糖，現在研究己證實葡萄糖激酶(GK)基因變異與第2型糖尿病的一個亞型-幼年發病的成年型糖尿病(maturity onset diabetes of the young，MODY)的發病密切相關，其基因突變在MODY的發病中起著決定作用。

本發明要解決的技術問題在於如何能提供一種人葡萄糖激酶突變體編碼基因，由該基因表達的人葡萄糖激酶突變體的葡萄糖激酶(GK)活性高於野生型，從而為控制血糖，糖代謝紊亂以及糖尿病特別是第2型糖尿病的治療提供了新途徑。

本發明提供了一種人葡萄糖激酶突變體編碼基因，其中，所述基因具有：

(1)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或者

(2)除SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的第487位至第1884位的開放閱讀框外，其餘部分與SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列相同的核苷酸序列，並且該核苷酸序列的開放閱讀框與SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的開放閱讀框編碼相同的胺基酸序列。

現有技術一般認為，由於蛋白質編碼基因的開放閱讀框中鹼基的錯義突變(missense mutation)、無義突變(nonsense mutation)以及移碼突變(frameshift mutation)能導致其蛋白質產物的胺基酸序列一級結構變化，從而通常只有發生在蛋白質編碼基因的外顯子部位的突變能夠引起蛋白質產物性能的較大改變。而對於蛋白質編碼基因的內含子目前還不清楚其具有什麼功能，並且一般而言，內含子的改變很難對蛋白質產物的性能帶來根本性顯著影響。本發明的發明人意外地發現，與上述現有技術有關內含子和外顯子的通常結論相反，在野生型人葡萄糖激酶的內含子區域內發生突變的人葡萄糖激酶突變體基因，其表達的人葡萄糖激酶突變體也產生了與野生型相比明顯提高的葡萄糖激酶(GK)活性。

本發明還提供了一種人葡萄糖激酶突變體，其中，所述人葡萄糖激酶突變體的編碼基因是本發明所述的人葡萄糖激酶突變體編碼基因。

本發明還提供了一種重組載體，所述重組載體包括載體及其攜帶的目的基因，其中，所述目的基因是本發明所述的人葡萄糖激酶突變體編碼基因。

本發明還提供了一種宿主，其中，所述宿主含有本發明所述的重組載體。

本發明還提供了一種醫藥組合物，其中，所述醫藥組合物含有藥學上可接受的賦形劑以及選自本發明所述的人葡萄糖激酶突變體編碼基因、本發明所述的人葡萄糖激酶突變體、本發明所述的重組載體和本發明所述的宿主中的一種或幾種。

本發明還提供了本發明所述的人葡萄糖激酶突變體編碼基因、本發明所述的人葡萄糖激酶突變體、本發明所述的重組載體和本發明所述的宿主在製備控制血糖的藥物或預防和治療糖代謝紊亂的藥物中的應用。

本發明還提供了本發明所述的人葡萄糖激酶突變體編碼基因、本發明所述的人葡萄糖激酶突變體、本發明所述的重組載體和本發明所述的宿主在製備預防和治療糖尿病的藥物中的應用。

本發明還提供了一種控制血糖或預防和治療糖代謝紊亂的方法，其中，將選自本發明所述的人葡萄糖激酶突變體編碼基因、本發明所述的人葡萄糖激酶突變體、本發明所述的重組載體、本發明所述的宿主以及本發明所述的藥物組合物所組成的群組物質給藥給患者。

本發明還提供了一種預防和治療糖尿病的方法，其中，將選自本發明所述的人葡萄糖激酶突變體編碼基因、本發明所述的人葡萄糖激酶突變體、本發明所述的重組載體、本發明所述的宿主以及本發明所述的醫藥組合物所組成的組中的物質給藥給患者。

本發明的基因所表達的人葡萄糖激酶突變體，其活性明顯高於野生型人葡萄糖激酶，從而為控制血糖或預防和治療糖代謝紊亂，尤其是為預防和治療糖尿病提供了有力的新途徑。

(1)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或者

優選地，所述人葡萄糖激酶突變體編碼基因具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。從正常人體的白細胞中可分離出編碼人葡萄糖激酶的基因，其具有序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，即野生型編碼人葡萄糖激酶的基因(GENBANK登錄號BC001890、M88011.、NM033508和NM033507)。本發明的人葡萄糖激酶突變體編碼基因SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列與野生型相比，在第2643位處缺失了1個C。

應當理解，本領域技術人員可以根據密碼子的簡並性(codon-degeneracy)以及在不同物種中的表達偏好，合成不同於SEQ ID NO：2的，但同樣編碼本發明人葡萄糖激酶突變體的核苷酸序列。即，除SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的第487位至第1884位的開放閱讀框外，其餘部分與SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列相同的核苷酸序列，並且該核苷酸序列的開放閱讀框與SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的開放閱讀框編碼相同的胺基酸序列。

本領域公知，組成蛋白質的20種不同的胺基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分別為單一密碼子編碼外，其他18種胺基酸分別由2-6個密碼子編碼(Sambrook等，分子克隆，冷泉港實驗室出版社，紐約，美國，第二版，1989，見950頁附錄D)。即由於遺傳密碼子的簡並性(codon-degeneracy)，決定一個胺基酸的密碼子大多不止一個，三聯體密碼子中第三個核苷酸的置換，往往不會改變胺基酸的組成，因此編碼相同胺基酸序列的蛋白的核苷酸序列可以不同。本領域人員根據公知的密碼子表，從本發明公開的SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，通過生物學方法(如PCR方法、點突變方法)或化學合成方法得到所述核苷酸序列，應用到重組技術以及基因治療當中，因此該部分核苷酸序列都應該包括在本發明範圍內。相反，利用本文公開的DNA序列，也可以通過本領域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港實驗室出版社，紐約，美國，第二版，1989)進行，通過修改本發明提供的核酸序列。

其中，所述目的基因還可以包括調控序列，例如所述一種或幾種目的基因表達的啟動子、終止子和增強子。所述目的基因也可以包括標記基因(例如，編碼β-半乳糖苷酶、綠色螢光蛋白或其它螢光蛋白的基因)或其產物調節其它基因表達的基因。所述目的基因除可以是DNA外，還可以是mRNA、tRNA或rRNA，還可以包括通常與轉錄序列相關的相關轉錄調控序列，例如轉錄終止信號(transcriptional termination signal)、聚腺苷酸化位點(polyadenylation site)和下游增強子元件(down-stream enhancer element)。

所述載體可以是本領域常用的各種能攜帶目的基因的載體以及技術發展改進的可用的各種能攜帶目的基因的載體。所述載體例如，質粒(plasmid)(裸DNA(naked DNA))、脂質體(liposome)、分子耦聯體(molecular conjugate)、多聚物和病毒。

所述質粒(plasmid)(裸DNA(naked DNA))可以攜帶目的基因，該攜帶有目的基因的質粒可以直接注射或通過基因槍、電穿孔及電融合技術導入到組織細胞中。此外，超聲波有助於提高質粒的轉移效率。超聲波配合微泡回聲比差劑可提高細胞膜的通透性，從而顯著提高裸DNA的轉移和表達效率。這項胞膜滲透技術可在細胞膜表面瞬間製造小孔，DNA則趁機進入細胞內。

所述脂質體是由脂質雙分子層組成的顆粒，可介導目的基因穿過細胞膜。所述脂質可以是來源於蛋黃和大豆的卵磷脂(磷脂醯膽鹼，PC)為主的天然磷脂；也可以是二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)等合成磷脂；還可以含有膽固醇。優選的脂質體為陽離子脂質體，其主要由帶正電荷的脂類及中性輔助脂類以等莫爾(mole)混合而成。該帶正電荷的脂質體與帶負電荷的DNA之間可有效地形成複合物，並通過內吞作用移入細胞內。

所述多聚物，即利用陽離子多聚體，如多聚左旋賴氨酸(poly-L-lysine)上的正電荷與DNA上的負電荷結合發生電性中和而形成穩定的多聚物/DNA複合物。所得陽離子多聚體與DNA的複合物仍帶正電荷，可與細胞表面帶負電荷的受體結合，而被滲入至細胞內。

所述分子耦聯體是將目的基因外源性DNA共價結合到細胞表面特異受體的配基或單克隆抗體或病毒胞膜蛋白上，利用特異的結合特性介導外源性基因導入至特定類型的細胞中。

病毒通常可以高效率地進入特定的細胞，表達自身蛋白，產生新的病毒粒子，因此被改造的病毒首先成為了基因治療的載體。例如，反轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體及單純皰疹病毒載體等。其中，所述腺相關病毒屬於非致病性的微小病毒科家族成員，只有依賴於輔助病毒才可能增殖。腺相關病毒基因組很小，如2型腺相關病毒是由4681個核苷酸組成的單鏈DNA，包含2個基因，即rep基因(編碼負責調節病毒複製、結構基因表達和整合到宿主基因組中的蛋白)及cap基因(編碼衣殼結構蛋白)，基因組的1個末端存在1個145bp的末端重複區。腺相關病毒可感染分裂期及靜止期細胞，能插入到宿主細胞染色體內，或以染色體外串聯體DNA的形式長期穩定表達，可有效地轉導腦、骨骼肌及肝臟等類型的細胞，具有抗原性、毒性小及不致病等特點。

優選地，所述載體選自由克隆載體(cloning vector)、真核表達載體(eukaryotic expression vector)、原核表達載體(prokaryotic expression vector)和穿梭載體(shuttle vector)(例如穿梭質粒pShuttle2)所組成的組中，以實現對目的基因擴增及表達當用於基因治療時，優選採用誘導型表達載體，例如pIRES2-EGFP。更優選所述載體選自由pIRES2-EGFP、pCMVp-NEO.BAN、pEGFT-Actin和腺病毒載體所組成的組中。最優選的載體為腺病毒載體。腺病毒是無包膜的線性雙鏈DNA病毒，在自然界分佈廣泛，至少存在100種以上的血清型。腺病毒基因組長度約為36kb，兩端各有1個反向末端重複區，其內側為病毒包裝信號。腺病毒基因組上分佈著4個早期轉錄元(E1、E2、E3和E4)承擔調節功能，和1個晚期轉錄元負責結構蛋白編碼。作為基因治療的載體，腺病毒載體具有如下優點：1.基因包裝容量較大，因而可插入大片段外源基因，最多可達35kb；2.感染效率高，可高效地轉導不同類型的人組織細胞，體外實驗轉導效率接近100%轉導效率；3.可轉導非分裂細胞；4.在細胞培養物中有高滴度的重組病毒產量；5.進入細胞內並不整合到宿主細胞基因組，僅瞬間表達，因而安全性較高。目前最新的腺病毒載體缺失了全部的(無病毒載體)或大部分腺病毒基因(微型腺病毒載體)，僅保留反向末端重複區和包裝信號序列，最多可插入35kb的基因，且所引起的細胞免疫反應更弱，在它的載體中引入核基質附著區基因可使外源基因保持長期表達，並可增加穩定性。

本發明還提供了一種宿主，其中，所述宿主含有本發明所述的重組載體。將含有本發明人葡萄糖激酶突變體編碼基因的重組載體轉化宿主，一方面，可以用於研究其與糖代謝以及胰島素分泌之間的關係，另一方面可以用於生產製備具有活性的葡萄糖激酶突變體。優選所述宿主選自大腸桿菌、239細胞、min-6細胞和人胰島β細胞中的一種或幾種。其中，大腸桿菌作為基因工程菌，既可以含有本發明重組克隆載體以實現對本發明人葡萄糖激酶突變體編碼基因的擴增，也可以含有本發明重組表達載體以實現對本發明人葡萄糖激酶突變體的大量表達。當所述重組載體為重組腺病毒載體時，該載體可以在239細胞中得到擴增。min-6細胞為小鼠胰島β細胞株，具有較強的分泌胰島素的功能，可以作為本發明真核表達載體的宿主，生產本發明人葡萄糖激酶突變體並檢驗其葡萄糖激酶(GK)活性。所述人胰島β細胞可以是商購的細胞系，也可以是來自于例如糖尿病患者的受試者的人胰島β細胞。在基因治療過程中，優選來自於受試者自體的人胰島β細胞，導入本發明的人葡萄糖激酶突變體編碼基因後，重新移植至該受試者不容易發生免疫排斥反應。

所述藥物接受的賦形劑指無毒固態、半固態或液態填充劑、稀釋劑、包囊材料或其他製劑輔料，例如，包括但不限於鹽水、緩衝鹽液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其混合物。所述醫藥組合物適於胃腸外、舌下、腦池內、陰道內、腹膜內、直腸內、頰內或表皮給藥。

胃腸外給藥包括靜脈內、肌內、腹膜內、胸骨內、皮下、關節內注射和輸注。適於胃腸外給藥的醫藥組合物包括無菌水溶液或非水溶液、分散液、懸浮液或乳液，以及用於在臨使用前在無菌可注射溶液或分散液中配製的粉末。適宜的水性或非水性載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、甘油、內二醇、聚乙二醇、羧甲基纖維素、植物油和可注射的有機酯如油酸乙酯。這些組合物還可以含有防腐劑、潤濕劑、乳化劑、保護劑和分散劑佐劑，例如肌醇、山梨醇和蔗糖。優選加入滲透壓調節劑如糖類、氯化鈉、氯化鉀。

表皮給藥包括在皮膚、黏膜上以及在肺和眼表面給藥。這樣的醫藥組合物包括粉劑、軟膏、滴劑、透皮貼劑、離子電滲療法裝置以及吸入劑等。直腸或陰道給藥的組合物優選為栓劑，它可以通過將本發明的重組載體與適宜的非刺激性賦形劑如可哥脂、聚乙二醇或栓劑蠟混合製備，所述賦形劑或載體在室溫為固態，在體溫下為液態，因此在直腸或陰道腔內熔化並釋放出活性化合物。

優選地，所述醫藥組合物為注射液，所述注射液包括藥學上可接受的賦形劑以及選自本發明所述的人葡萄糖激酶突變體編碼基因和本發明所述的重組載體中的一種或幾種。

所述藥學上可接受的賦形劑為pH值為4.0-9.0的磷酸緩衝液；每毫升注射液中含有102-1010拷貝的所述人葡萄糖激酶突變體編碼基因或含有102-1010拷貝的所述重組載體。

所述注射液還含有保護劑和/或滲透壓調節劑；以所述注射液為基準，所述保護劑的含量為0.01-30wt%，所述保護劑選自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一種或幾種；所述滲透壓調節劑的含量使所述注射液的滲透壓為200-700毫滲摩爾/千克(mOsm/Kg)，所述滲透壓調節劑為氯化鈉和/或氯化鉀。

使用所述注射液進行時，給予受試者10²-10¹⁰拷貝範圍的所述人葡萄糖激酶突變體編碼基因，優選10⁵-10⁸拷貝，更優選10⁶-10⁸拷貝；或含有10²-10¹⁰拷貝的所述重組載體，優選10⁵-10¹⁰拷貝，更優選10⁶-10¹⁰拷貝；進一步優選所述重組載體是重組腺病毒載體，給予的該腺病毒載體的量範圍為10³-10¹⁰空斑形成數(plaque forming unit,pfu)、優選10⁵-10¹⁰pfu、更優選10⁶-10¹⁰pfu。當注射本發明所述藥用組合物時，注射用量可以為本領域常用的劑量，至多500微升(μl)、一般1-200微升(μl)、優選1-10微升(μl)；但是根據所述接種部位，也可以使用至多10毫升(ml)的劑量。因為本領域技術人員能夠容易地確定最佳給藥途徑和劑量，所以所述給藥途徑和劑量僅作為參考。所述劑量可以根據各種參數、尤其根據待治療患者的年齡、體重和病症、疾病或病症的嚴重程度以及給藥途徑來確定。本發明所述醫藥組合物注射液也可以系統給藥，也可以將本發明的醫藥組合物注射液注射到局部部位(例如，骨骼肌內)。

本發明還提供了一種控制血糖或預防和治療糖代謝紊亂的方法，其中，將選自本發明所述的人葡萄糖激酶突變體編碼基因、本發明所述的人葡萄糖激酶突變體、本發明所述的重組載體、本發明所述的宿主以及本發明所述的醫藥組合物所組成的組中的物質給藥給患者。

以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。除非特別說明本發明所用到的試劑、培養基均為市售商品。

實施例一化學合成本發明人葡萄糖激酶突變體基因(G262)

具有如SEQ ID No：2所示的核苷酸序列的人葡萄糖激酶突變體基因，全長2748bps。分析序列後，該基因內部有三個單一的酶切位點HindIII、SacI和BamHI，酶切位點分別位於SEQ ID No：2的第2443位、第1327位和第2250位上。合成策略為採用固相亞磷醯胺三酯法(solid phase phosphoramidite trimester approach)分別合成部分DNA片段，連接所合成的片段，對連接好基因測序驗證，修復錯誤連接。

1.合成A片段由起始位置至Sacl酶切位點，共1360bps；

2.測序鑒定結果步驟1得到了完整的A片段，修復末端連入載體PCR2.1(英傑公司Invitrogen)，HindIII/Sacl；

3.合成B片段由Sacl酶切位點至BamHI酶切位點，共939bps；

4.測序鑒定結果步驟3得到了完整的B片段，修復末端連入載體PCR2.1，Sacl/BamHI；

5.合成C片段由BamHI至末端，共551bps；

6.測序鑒定結果步驟5得到了完整的C片段，C片段連入含有B片段的載體，得到了片段D，共1457bps；

7.測序鑒定結果步驟6得到了完整的D片段，用SacI內切酶將待連接的A片段和D片段進行酶切，獲得粘末端的DNA片段，再進行T4DNA聚合酶參與的DNA連接反應。最終得到如SEQ ID No：2所示的核苷酸序列的人葡萄糖激酶突變體基因。所用的酶以及緩衝液均購自克隆技術公司(clontech)，並且按照clontech提供的操作手冊完成酶切和連接過程。

合成片段末端均帶有部分保護序列，在合成完成後便於序列的修復，因此合成長度都略大於實際長度。所述保護序列是指：由於內切酶對於處於DNA末端的酶切位點存在空間位阻效應無法正常的結合DNA進行酶切，因此在末端的酶切位元點通常需要人為的補充8至20個堿基的保護序列，保護堿基的序列來自內切酶的生產商clontech公司。同時DNA鏈會從末端開始降解，保護鹼基的存在可以保護酶切位點在操作過程中不受到損傷。所述修復過程是指，用內切酶對DNA片段進行酶切，去除保護鹼基。所採用的內切酶和T4連接酶和所採用的反應緩衝液和實驗體系均來自clontech公司，該公司網站提供了(http://www.clontech.com/)相應產品介紹及其標準操作流程。

步驟7連接好的基因序列後通過PCR擴增，測序結果與SEQ ID No：2一致，-20℃下保存以用於連接表達載體。

對比例一野生型人葡萄糖激酶編碼基因的製備(G261)

參見實施例一的方法，按照如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列製備野生型人葡萄糖激酶編碼基因的製備。

實施例二表達載體的構建

1-1)pIRES2-EGFP質粒載體的線性化

pIRES2-EGFP質粒是環形結構(參見圖三)，在進行細胞轉染前需將其線形化。選擇內切酶BstBI(TTCGAA)(New England Biolabs，NEB公司)，因為該酶在質粒上僅有一個酶切位點，酶切後不影響蛋白的表達。其中，IRSE(Intemal ribosome entry site)是一個內部核糖體進入位點，其特點是，當這段序列出現在一個開放性讀碼框(ORF)之後，能使本來已經翻譯終止的序列繼續翻譯其之後的編碼序列。使兩個都具有獨立編碼框的蛋白質多肽表達成一個融合蛋白。

pIRES2-EGFP質粒DNA　10 μg

酶切緩衝液　5 μl

限制性內切酶　10 unit

去離子水補足至　50 μl

37℃孵育3小時，酚氯仿法抽提總DNA，無水乙醇沉澱DNA，70%乙醇洗滌所述DNA沉澱，去離子水重溶沉澱，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒分子量，並純化線性化pIRES2-EGFP質粒載體。-20℃下保存備用。

1-2)連接線性化pIRES2-EGFP質粒和目的基因

將回收線性pIRES2-EGFP質粒載體　0.3μg

目的基因(實施例一或者對比例一)DNA　3μg

T4連接酶　10 unit

連接緩衝液　1.0 μl

去離子水補足體系至　10 μl

14℃孵育12小時，酚氯仿法抽提總DNA，無水乙醇沉澱DNA，70%乙醇洗滌所述DNA沉澱，去離子水重溶該沉澱，電泳檢測質粒分子量(其中實施例一的電泳結果見圖一，其中泳道1為實施例一完成連接後的總DNA電泳結果，泳道2為分子量標記，並且泳道1中分子量大於5000的條帶為連接成功的條帶。)，並分別回收純化攜帶有目的基因(實施例一或者對比例一)的pIRES2-EGFP質粒載體，-20℃下保存備用。

以上所採用的內切酶(BstBI)和T4連接酶以及所採用的反應緩衝液和實驗體系均來自NEB公司，按照相應產品介紹及其標準操作流程操作。

2)腺病毒表達載體的構建

2-1)本實施例選擇人5型血清型以及E1/E3缺陷型病毒構建重組穿梭質粒載體。

a)提供穿梭質粒pShuttle2-CMV(BD公司)(CMV指巨細胞病毒)；

b)用限制性內切酶EcoRV+NotI雙酶切步驟a)的質粒；

c)鹼性磷酸酶(CIP)末端去磷酸化；

d)回收3.4kb的載體片段；

e)將上述步驟1-2)所得的pIRES2-EGFP質粒載體用限制性內切酶EcoRV+NotI雙酶切，將酶切得到的G262-IRES2-EGFP或G261-IRES2-EGFP在T4連接酶的作用下分別插入步驟d)獲得的穿梭質粒載體片段，從而得到重組環狀穿梭質粒pShuttle2-CMV-G262-IRES2-EGFP或重組環狀穿梭質粒pShuttle2-CMV-G261-IRES2-EGFP；

f)用限制性內切酶NheI酶切步驟e)得到的穿梭質粒；

g)用DNA聚合酶克倫諾片段(klenow)補平步驟f)的酶切末端；

h)回收4.1kb的片段(該片段為插入外源基因以及兩頭帶有部分載體序列的DNA片段)。

2-2)鑒定得到環狀穿梭質粒pShuttle2-CMV-G262-IRES2-EGFP或環狀穿梭質粒pShuttle2-CMV-G261-IRES2-EGFP

用EcoRI酶切所述環狀穿梭質粒pShuttle2-CMV-G262-IRES2-EGFP或環狀穿梭質粒pShuttle2-CMV-G261-IRES2-EGFP，酶切所得產物在1.2%瓊脂糖凝膠電泳上得到鑒定：陽性克隆會出現兩條分子量分別4.7kb和2.8kb的帶，而陰性克隆近出現一條3.4kb的帶。鑒定結果見圖六，圖中M是分子量標記(1kb的DNA梯形條帶，從上到下是：8kb、7kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1.6kb、1kb、517bp、396bp和230bp)，泳道1-4(兩個pShuttle2-CMV-G261-IRES2-EGFP和兩個pShuttle2-CMV-G262-IRES2-EGFP樣品)均是陽性克隆。

2-3)將CMV-GFP-IRESGFP從pShuttleGFP-CMV-TrkC轉移到pAd腺病毒載體上，得到重組腺病毒pAd-GFP-G261或者重組腺病毒pAd-GFP-G262。以上所用到的空質粒均為clontech公司(http://www.clontech.com/)購買的商品化載體，所用的實驗條件和採用的試劑盒均為商品化的試劑盒。轉移所用的試劑盒與為clontech的Adeno-XExpressionSystem1(clontech 631513)，根據clontech所提供的實驗流程進行。

2-4)鑒定得到重組腺病毒pAd-GFP-G261和pAd-GFP-G262

用XhoI分別酶切所述重組腺病毒pAd-GFP-G261和pAd-GFP-G262，酶切所得產物在1.2%瓊脂糖凝膠電泳上得到鑒定：陽性克隆會出現以下分子量分別14kb、11.8kb、4.9kb、2.6kb、2.47kb、1.45kb和0.6kb的帶，而陰性克隆會出現以下分子量分別為14kb、11.8kb、4kb、2.47kb、1.45kb和0.6kb的帶。鑒定結果見圖七，圖中M是分子量標記(1kb的DNA梯形條帶，從上到下是：8kb、7kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1.6kb、1kb、517bp、396bp和230bp)，泳道1-5(兩個重組腺病毒pAd-GFP-G261和三個重組腺病毒pAd-GFP-G262樣品)均是陽性克隆。

2-5)重組腺病毒的包裝、擴增、收穫與純化

將步驟2-4)鑒定正確的重組腺病毒DNA轉染239細胞進行包裝，結束後保留毒種。將包裝好的病毒進行擴增，保留毒種(第二代毒種)。然後擴增所得第二代病毒經過兩次大規模擴增。擴增結束後收穫病毒並做CsCl密度梯度離心純化病毒，通過透析除去病毒液中殘留的CsCl。

具體操作如下：

a)293細胞(El-transformed human embryonic kidney cells)在轉染前24小時接種於1或2個60 mm培養盤中，使之在轉染時細胞匯合率為50-70%；

b)在轉染前，用Pac I酶切目的質粒(一個60 mm細胞盤需要6μg DNA)。酶切後質粒用乙醇沉澱並重懸於20 μl無菌水中；

c)用PEI或其他轉染試劑將6 μg Pac I處理過的質粒轉染細胞；

d)8個小時後移去混合液，加入4 ml DMEM完全培養液(10% CBS，1%Pen/Strep)；

e)在轉染後7到10天用細胞刮，將細胞從瓶中刮下並移入50ml錐形管。離心後將細胞重懸於2.0 ml PBS或全培液中。於液態氮中凍結細胞，37℃水浴中溶解，劇烈振盪。此步驟共進行4次。保存於-20℃；

f)將293細胞以50-70%的匯合率(confluency rate)鋪于60 mm培養盤中，以30-50%的體積比加入含病毒上清液。在感染後3天即可看到明顯的細胞裂解以及致細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)現象；

g)在有1/3到1/2的細胞脫離漂浮時，通常是感染後3-5天收集病毒。可進一步通過西方墨點法(Western blot)或PCR(5 μl病毒上清加上10 μl PCR-grade Protease K，55℃消化1小時，然後煮沸樣品5 min，離心後取1-2 μl進行PCR反應)證實重組腺病毒的存在；

h)按步驟f)的方法收集病毒上清。在這種情況下一般至少可收集到107病毒顆粒/毫升(infectious particles/ml)的病毒。每輪的擴增應能提高一個數量級的梯度；

i)為了進一步擴增，將步驟h)獲得的病毒上清進一步感染100 mm培養盤的細胞，按步驟f)的方法收集病毒，並進而將其感染150 mm細胞培養盤中的293細胞，以獲得足夠量的病毒；

j)將15% CsCl和40% CsCl加入貝克曼(Beckman)離心管中製備CsCl梯度溶液；

k)將最終富集病毒(enriched virions)顆粒的病毒上清滴加於CsCl梯度溶液上；

l)超速離心，30000 rpm，4℃離心16個小時；

m)離心後，應有兩條帶。位置較高，顏色較弱的條帶主要為腺病毒空殼，不具感染能力；位置較低，顏色較亮的條帶含有需要收集的活病毒顆粒。用16號針頭將這一條帶收集；

n)在TBS(10mM Tris,0.9% NaCl,pH8.1)中透析一小時，隨後在含有10%甘油的TBS中透析兩次，每次一小時，除去CsCl；

o)將純化的腺病毒分裝于EP管中；

p)在艾本德生物分光光度計(Eppendorf Biophotometer)中測量透析液中的總蛋白量，1μg病毒蛋白相當於4×10⁹病毒顆粒；

q)長期保存於-70度中，短期可保存於4度；毒種保留量為分裝以後不少於1E+11的VP單位/分裝容器；以上所述大規模擴增為達到1E+12VP單位/分裝容器以上的病毒量。

r)由於腺病毒對不同細胞株的感染效率存在差異，且考慮到病毒顆粒的細胞毒副作用，通常通過梯度感染的方法確定所需的病毒用量。以相對細胞數1：1，10：1，100：1，1000：1的病毒顆粒感染靶細胞；加入相對培養液體積1：1000的Polybrene(1,5-二甲基-1,5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物)。在37度下平板離心30分鐘；

s)感染8~12小時後換液，收集病毒。

2-6)重組腺病毒的包裝品質控制

有感染能力的病毒總量1.05×10¹²PFU/3ml

2-7)重組腺病毒的保存

保存液：4%蔗糖、2mM MgCl₂、10mM Tris，pH 8.0

保存溫度：-80℃

實施例三min-6細胞的轉染

1、min-6細胞基本培養基：

DMEM(Gibco 11995)　830ml

FBS(Gibco.US)　150ml

P/S　10ml

Hepes(1M)　10ml

β-巰基乙醇　10ul

培養皿表面未經細胞培養處理。均為菲科培養瓶(ficol flask)

培養環境：37℃；5% CO2；95%濕度

按Lipofectmine 2000(invitrogen)步驟將實施例二製備的攜帶有目的基因(實施例一或者對比例一)的pIRES2-EGFP質粒載體轉染至min6細胞系。具體步驟如下：

第一天：解凍液氮凍存細胞，培養於25cm²培養瓶中。

第二天：細胞換液。

第三天：待細胞密度長到90%時，用0.2%胰酶(Gibco)消化，按2×10⁵密度培養于6孔板內(此時將抗生素撤掉)

第四天：4ug線性化的載體Lipofectmine 10ul；Opti-M至100ul，混合室溫放置10分鐘。全部加入min6細胞的培養基內，輕輕混勻。在37℃；5% CO₂；95%濕度環境下放置24小時。同時加做陰性對照。

第五天：細胞換液。(可以改用含有抗生素培養基)

第六天：細胞換液，並加抗生素G418(400ug/ml)篩選穩定轉染細胞系(參見圖五，暗視野下可以觀察到綠色螢光蛋白得到表達)，連續8天。

在抗生素篩選獲得穩定表達外源GCK蛋白的細胞系以後，對其基因組進行了PCR水準上的鑒定，本發明的發明人設計了一對載體序列特異性的引子(上游引子5’-GCGGAGAAGCCTTGGATATT-3’；下游引子5’-TTTGATAGCGTCTCGCAGAA-3’)，該條引子經過實驗和序列比對證實在min-6細胞系的基因組上沒有擴增，而在轉入的載體上有653bp大小的產物擴增。同時設計了一對min-6基因組特異的引子(上游引子5’-CAAGCCCTGTAAGAAGCCACT-3’；下游引子5’-TGCTTCCAGCTACTTGAGGTC-3’)，該條引子同樣經過實驗和序列比對證實在載體中沒有產物擴增，在基因組上有956bp大小的產物，因此帶有外源DNA的min-6基因組擴增以後能看到兩條大小不同的擴增產物(參見圖四)。

min-6細胞基因組DNA的抽提

所需試劑的配製

蛋白K酶裂解緩衝液(Porteinase K buffer SNET)

20mmol/L Tris-CL(pH8.0)

5mmol/L EDTA(pH8.0)

400mmol/L NaCl

1%(m/v) SDS

400μg/ml蛋白K酶(proteinase K)

將細胞用胰蛋白酶消化以後按照以下步驟抽提基因組DNA

A　加入蛋白酶，56度過夜

B　加入2倍體積無水乙醇，震盪混勻

C　-80度冰箱過夜

D　12000g離心15min

E　棄上清

F　75%乙醇洗滌

G　12000g離心10min

H　75%乙醇洗滌

I　12000g離心10min

J　乾燥

K　加純水溶解

用紫外分光光度計將DNA定量，並根據DNA濃度用純水進行稀釋，使DNA工作液終濃度為50ng/μl。原液置於-20℃冰箱保存備用，稀釋液置於4℃冰箱作為PCR反應的範本，供PCR反應使用。

PCR 10 μl反應體系

10×PCR緩衝液(不含Mg₂+)　1.0 μl

dNTP(25 mM)　0.2 μl

MgCl₂(25 mM)　1.0 μl

引子1(正向/反向)　1.0 pmol

引子2(正向/反向)　1.0 pmol

DMSO(二甲基亞碸)　0.5 μl

AmpliTaq Gold DNA聚合酶　0.05 μl(5 U/μl)

範本基因組DNA(50 ng/μl)　2.0 μl

H2O　加水補足總體系至10.0 μl

PCR TouchDown反應程式

1=95℃　持續　8分鐘

2=94℃　持續　30秒

3=68℃　持續　1分鐘

-1.0℃　每迴圈

4=72℃　持續　45秒

5=轉到　2,　12次

6=95℃　持續　30秒

7=54℃　持續　15秒

+1　秒　每迴圈

8=72℃　持續　45秒

9=轉到　6,　30次

10=72℃　持續　60分鐘

11=4℃　持續　維持(ever)

PCR擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。鑒定結果見圖四，其中泳道依次為0：G262質粒、1：G261min-6基因組、2：G261min-6基因組、3：G262min-6基因組、4：G262min-6基因組、5：G261質粒、6：G261質粒、7：野生型min-6基因組、8：陰性水對照、9：陰性水對照、10：G262質粒、11野生型min-6基因組、12：G261min-6基因組、13：G262min-6基因組、M：分子量標記DNA。

2、min-6細胞均勻鋪板細胞，12孔板，每個樣品重複四個孔。細胞饑餓同步化，吸去上清，無糖克-林二氏重碳酸鹽緩衝液(KRBB)洗滌2遍，以無糖KRBB+0.1% BSA預處理2h。無糖KRBB+0.1% BSA的培養基配方如下：

KRBB　1L

NaCl　6.9496 g

KCl　354 mg

NaHCO3　420 mg

MgSO4　144.4 mg

KH2PO4　160.6 mg

HEPES　4.766 g

CaCl2無水　281.915 mg

PH7.4

BSA 0.1%　(終濃度)

3、吸去上清，KRBB G2.8+0.1%BSA或KRBB G25+001% BSA處理細胞1h，其中所述G2.8指葡萄糖濃度504.448mg/L；G25指葡萄糖濃度4.504g/L。

4、收集三個孔細胞的上清，-20℃保存待測。

5、消化第四個孔的細胞，血球板計數，統計每個樣品中的細胞個數。

6、放射免疫法測定min-6細胞在高濃度葡萄糖環境下胰島素分泌的強度。

在放射免疫方法中，樣品中的胰島素含量和樣品¹²⁵I cpm計數有函數關係，因此每次實驗都要製作標準曲線，計算胰島素含量和¹²⁵I cpm計數的函數關係。

標準曲線的製作和樣品的測量

如圖二所示，根據標準品的中胰島素的含量以及¹²⁵I計數，得到胰島素單位(μunit/ml)x和¹²⁵I計數Y之間的函數關係為：

y=-1649.8Ln(x)+10590　式1

因此x=exp[(10590-y)/1649.8]　式2

實測wt、G261min-6和G262min-6上清中的¹²⁵I cpm計數，通過式2計算分別得到胰島素分泌量。

從表2可以看出，G262具有顯著促進胰島素分泌的作用，說明其葡萄糖激酶的活性顯著高於野生型。

實施例四重組腺病毒動物體內實驗

1、實驗動物GK大鼠飼養

實驗動物GK大鼠購自國家齧齒類實驗動物種子中心上海分中心。實驗動物GK大鼠即Ⅱ型糖尿病大鼠SLAC/GK，1975年由日本東北大學(Tohoku University)培養。在遠交系WISTAR大鼠中篩選高血糖個體而成。雌性性成熟8─10周齡，雄性10─12周齡。懷孕期21─23天，窩仔數7─9個，懷孕率60%，哺乳期28天。GK大鼠被廣泛應用於非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM，Ⅱ型糖尿病)研究。在糖尿病症發作後，快速出現高血糖、胰島素分泌減弱等，後期併發視網膜病、微血管病、神經病、腎病。和其它齧齒類Ⅱ型糖尿病動物型相反，GK大鼠是非肥胖的。本實施例選擇20只10周齡GK大鼠，自由食水一周。

2、給藥實施例2的重組腺病毒

(1)注射液的配製

將按照表三所示的劑量分別配製一組磷酸鹽緩衝液，121℃下滅菌60分鐘。在無菌條件下，以0.45微米的微孔濾膜過濾實施例二的步驟(2-6)的重組腺病毒原液，去除細胞碎片，收集濾液至無菌離心管中，8000轉/分離心1小時，棄去上清，按照表三所示的病毒滴度，將所得病毒沉澱分散在上述高溫滅菌後的磷酸緩衝液中，即得本發明注射液。

實施例二的重組腺病毒pAd-GFP-G261或者重組腺病毒pAd-GFP-G262通過尾靜脈分別連續注射三天，每天1次，每次注射劑量為1010pfu/Kg體重。每個配方注射兩隻大鼠。

(2)血糖測定方法

從大鼠眼角靜脈採集血樣0.5ml，使用歐姆龍血糖儀HEA-214，按照說明書進行血糖的測定。

(3)大鼠血糖檢測結果

注射野生型葡萄糖激酶(G261)病毒表達載體的動物編號為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。注射突變型葡萄糖激酶(G262)病毒表達載體的動物編號為11、12、13、14、15、16、17、18、19、20。所有大鼠注射前採集空白血樣，測定血糖值。注射後分期采血8次，測定血糖值，採集時間及結果見表四和表五。

從表四和表五所記載的資料可以看出，本發明的人葡萄糖激酶突變體的體內降血糖活性及穩定性遠遠好於野生型人葡萄糖激酶，通過將含有本發明的人葡萄糖激酶突變體編碼基因的重組腺病毒注射到動物體內，能有效控制II型糖尿病模型大鼠的血糖，從而能夠有效增加胰島素分泌來治療糖尿病。

<110>　黃海東

<120>　人葡萄糖激酶突變體編碼基因、其編碼的酶、重組載體及宿主，其醫藥組合物及其應用

<130>　PCT090008

<150>　200910000087.1

<151>　2009-01-07

<160>　2

<210>　1

<211>　2749

<212>　DNA

<213>　人屬人種(Homo sapiens)

<400>　1

<210>　2

<211>　2748

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成的人葡萄糖激酶突變體編碼基因

<400>　2

圖一、連接線性化pIRES2-EGFP質粒和目的基因(實施例一)後所得的電泳照片；

圖二、胰島素單位(μunit/ml)x和¹²⁵I計數Y之間的函數關係曲線；

圖三、為pIRES2-EGFP質粒載體的結構示意圖；

圖四、重組質粒載體轉染成功的min6細胞鑒定電泳照片；

圖五、重組質粒載體轉染成功的min6細胞顯微鏡照片；

圖六、重組環狀穿梭質粒pShuttle2-CMV-G262-IRES2-EGFP或重組環狀穿梭質粒pShuttle2-CMV-G261-IRES2-EGFP鑒定電泳照片；

圖七、重組腺病毒pAd-GFP-G261或重組腺病毒pAd-GFP-G262鑒定電泳照片。

Claims

一種人葡萄糖激酶突變體編碼基因，其特徵在於，所述基因具有：(1)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或者(2)除SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的第487位至第1884位的開放閱讀框外，其餘部分與SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列相同的核苷酸序列，並且該核苷酸序列的開放閱讀框與SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的開放閱讀框編碼相同的胺基酸序列。
根據權利要求1所述的人葡萄糖激酶突變體編碼基因，其特徵在於，所述基因具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
一種人葡萄糖激酶突變體，其特徵在於，所述人葡萄糖激酶突變體的編碼基因是權利要求1或2所述的人葡萄糖激酶突變體編碼基因。
一種重組載體，所述重組載體包括載體及其攜帶的目的基因，其特徵在於，所述目的基因是權利要求1或2所述的人葡萄糖激酶突變體編碼基因。
根據權利要求4所述的重組載體，其特徵在於，所述載體選自由克隆載體、真核表達載體、原核表達載體和穿梭載體所組成的組中。
根據權利要求4所述的重組載體，其特徵在於，所述載體選自由pIRES2-EGFP、pCMVp-NEO.BAN、pEGFT-Actin和腺病毒載體所組成的群組。
一種宿主，其特徵在於，所述宿主含有權利要求4-6中任意一項所述的重組載體。
根據權利要求7所述的宿主，其特徵在於，所述宿主選自大腸桿菌、239細胞、min-6細胞和人胰島β細胞中的一種或幾種。
一種醫藥組合物，其特徵在於，所述醫藥組合物含有藥學上可接受的賦形劑以及選自權利要求1和2所述的人葡萄糖激酶突變體編碼基因、權利要求3所述的人葡萄糖激酶突變體、權利要求4-6所述的重組載體和權利要求7-8所述的宿主中的一種或幾種。
根據權利要求9所述的醫藥組合物，其中，所述醫藥組合物為注射液，所述注射液包括藥學上可接受的賦形劑以及選自權利要求1和2所述的人葡萄糖激酶突變體編碼基因和權利要求4-6所述的重組載體中的一種或幾種。
根據權利要求10所述的醫藥組合物，其中，所述藥學上可接受的賦形劑為pH值為4.0-9.0的磷酸緩衝液；每毫升注射液中含有10²-10¹⁰拷貝的所述人葡萄糖激酶突變體編碼基因或含有10²-10¹⁰拷貝的所述重組載體。
根據權利要求11所述的醫藥組合物，其中，所述注射液還含有保護劑和/或滲透壓調節劑；以所述注射液為基準，所述保護劑的含量為0.01-30重量%，所述保護劑選自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一種或幾種；所述滲透壓調節劑的含量使所述注射液的滲透壓為200-700毫滲摩爾/千克，所述滲透壓調節劑為氯化鈉和/或氯化鉀。
權利要求1和2所述的人葡萄糖激酶突變體編碼基因、權利要求3所述的人葡萄糖激酶突變體、權利要求4-6所述的重組載體、權利要求7--8所述的宿主和權利要求9-12的醫藥組合物在製備控制血糖的藥物或預防和治療糖代謝紊亂的藥物中的應用。
權利要求1和2所述的人葡萄糖激酶突變體編碼基因、權利要求3所述的人葡萄糖激酶突變體、權利要求4-6所述的重組載體、權利要求7-8所述的宿主和權利要求9-12的醫藥組合物在製備預防和治療糖尿病的藥物中的應用。