TW201204345A - Use of curcumin or its analogues in cancer therapy utilizing epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor - Google Patents

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201204345 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本申請案主張2010年2月11日申請之美國臨時專利申許 案第61/303,593號之優先權’該案之全文以引用的方式併入^ 本發明係有關於薑黃素或其類似物於使用上皮細胞生長 因子接受器酪胺酸激酶抑制劑（EGFR-TKI)之癌症醫療之^ 途’其減少治療導致之副作用，並減少需用於治療的 EGFR-TKI劑量’特別是對單獨EGFR-TKI治療具抗性之病人。 【先前技術】 ’ 癌症是世界上死亡的首要原因。近來’已發展了所謂的「標 靶治療」，而選擇性作用在上皮細胞生長因子接受器（egfr) 的樂物已被證實在臨床上具有療效（Cflwcer穴eyearc/z 2004 ; 64 (15 ) : 5355-62 )。EGFR的訊息傳遞路徑為調控細胞生長及分 化的主要因素之一，其經由調控内生性酪胺酸激酶的碟酸化而 作用（Ciwcw 2003 ; 63 ( 1) : 1-5 )。在不同的惡性細 胞中，發現到EGFR的過量表現發生’且伴隨著較差的預後 (0此〇/叹加2004 ; 9 ( 1) : 58-67)。然而，一些關鍵問題仍然 限制了這些藥物之使用。 艾瑞莎（Iressa®)，口服有效的EGFR-TKI，為第一個被 核准治療非小細胞肺癌（NSCLC)的選擇性小分子藥物 2003，41 Suppl 1 : S9-14 ;以及 CVmcer 772era/^2004 ; 4 ( 1 ) : 5-17)。先前涉及多機構的臨床 試驗之研究已證實，亞洲病人對艾瑞莎之反應比白種病人更 佳’且對未吸於之腺癌婦女療效最佳（认e National Academy of Sciences of the United States of America 2004 ; 101 (36) : 13306-11 ;以及 2005 ; 366 (9496): 1527-37)。近來研究已指出，NSCLC中五(?烈之外顯子19片 段缺失（ΔΕ746-Α750)和外顯子21之L858R取代，與艾瑞 201204345 莎敏感度高度相關（Iw五喂<?/她出c⑻2004; 350 (21) . 2129-39 ; iSWe/ice 2004 ; 304 (5676) . 1497-500，以及 0沉〇/%/对2008 ; 13 (12) : 1276-84)。然而，NSCLC 病人之 五GFi?基因突變率已被發現在白種人中從10 %至15 %以及在 亞洲人中從 30 % 至 40 %之範圍内（C//m‘ca/ Cimcer 2008 ; 14 (10) : 2895-9 ;以及 Jowrwa/ iVai/cwa/ Cam^r /似如^ 2005 ; 97 (5) : 339-46)。在全世界所有NSCLC案例 中’具野生型EGFR之病人仍占大多數，且這些人顯試了對 艾瑞莎治療相對較差的反應。此外，由第二位點取代，五GM 之外顯子20中的T790M，造成的後天性抵抗力，導致較差的 艾瑞莎活性（New England Journcd of Medicine 2005 ； 352 ( 8 ) · Ί%-92 ·，以反 PLoS Medicine / Public Library of Science 2005 ； 2 (3) : e73)。 副作用為使用EGFR_TKI之另一限制。已知艾瑞莎會導致 之副作用如腹瀉（《Towmfi；/ o/C/k/ca/ 2003 ; 21 ( 12 ): 2237-46 ;以及 C//«/ca/ 從arc/z 2004 ; 10 (4) : 1212-8) 和皮疹。臨床試驗中由艾瑞莎導致之腹瀉頻率，在5〇〇 mg/曰 劑量組為67%，而在250 mg/曰劑量組為48%。近期發表的案 例已指出EGFR-TKI和放射療法之組合使用會導致轉移性 NSCLC病人意外的毒性及致命的腹瀉2〇〇8 ; 61 (2) . 270-3)。這些副作用可能會造成身體和心理不適，其 會導致劑量減少或治療中斷。 〃 【發明内容】 本發明係基於發現薑黃素係一潛力藥劑，其能減少由 EGFR-TKI >台療所導致之副作用，並減少需用於egfr_tk 症治療的EGFR-ΤΟ難’特別是對單獨egfr_tki治療具^ #『生人。 據此’在一方面，本發明提供一種用於減少由 胞生長因子接受器酷胺酸激酶抑制，劑（EGFR_T g 的副作用之方法，包含施用能減少該等副侧之有效 201204345 至接受此治療之病人。在—具體實施例中，該等 i生R-TKI誘發之腸胃道副制，例如腸道細胞損傷 哭政方面’本發明提供—種制上皮細胞生長因子接受 馱激酶抑湖（祕TKI)至需要使用egfr_tki 人之方*，包含細減少劑量之咖R-™ 二併量頁錢其_物至該病人，_ EGFR_TKI在 面之功效’相較於在無施用薑黃素或其類似物而 ^準 巧量之EGFR-TKI所達之功效，係實質上予以維持㈣3 =施例中’該病人係被診斷為具EGFR_TKI抗性的 j m egfr-tki ；〇® 在一具體實施例中，待治療之病人東右 (NSCLC)。在另一具體實施例中，样u、A小細胞肺癌 EGFR-TKU^t性的。 待^療之病人係具 在一具體實施例中，該薑黃素類似物传！ ώ # 成之群組： 〜自於由下列所構 OH 〇 KjfX)

OCKj 001,3 LL-17 OH Ο H3C0.

OH O

LL-68 LL-18 ; LL_68 ;和 201204345

JC-15 〇 > #在一具體^施例中，該EGFR-TKI係艾瑞莎（N_ (3_氣斗 氣本基）-7-曱乳基-6- (3-嗎琳-4-丙氧基）啥β坐琳_4•胺）。 在一具體實施例中，該薑黃素或其類似物係與 同時被施用。 本發明亦提供’一種用於治療具EGFR-TKI抗性之癌症病 人的方法’其包含對前述病人共同施用有效量之Egfr-TKI 和薑黃素或其類似物。 本發明之各種具體貫施例詳述如下。本發明之其他特徵將 由下列關於各種具體實施例及申請專利範圍的詳細敘述與圖 式而清楚地呈現。 相信本發明所屬技術領域具有通常知識者可基於此處說 明而利用本發明至其最廣範圍，而不需要進一步說明。因此°， 下列δ兒明應可被理解作為示範之目的，而無意於以任何方式限 制本發明之範圍。 【實施方式】 除非另有定義，此處所有使用之技術及科學名詞具有與本 f明所屬技術領域中熟習此藝者所一般性了解者相同的含 意。所有在此提到的公開文獻以引用的方式併入本文中，以揭 露及描述與該等所引用之公開文獻有關的方法和/或材料。 如在此所使用者，單數形「一」，「一種」，及「該」包括 了複數指涉物，除非内容另有清楚指明。因此，舉例而言，關 於 樣本」包括了複數個此樣本及為此技術領域中熟習此菽 者所知之相等物。 = 如前述’本發明發現，施用薑黃素或其類似物於進行 EGFR-TKI治療之病人可減少由該治療導致之副作用。 201204345 ，此，在一方面’本發明提供一種用於減少由使用上皮細 I生長因子接受器酪胺酸激酶抑制劑（EGFR-ΤΚΙ)治療導致 =作用之方法’包含施用能減少該等副作用之有效量的 素或其類似物至接受此治療之病人。 、 疋j皮細胞生長因子接受11 (EGFR)係17G心之膜結合 月八^ ’其表現於上皮細胞的表面，已知上皮細胞與細胞生長 之節有關’且係經由調節内在赂胺酸激*之鱗酸化。 祐％ 4大里表現已被報告係發生在各種惡性細胞中且與不良 ^後相關。如在此所使用者’所揭露之EGFR蛋白質 GenBank 登錄號 NM_〇〇5228 ( SEQ ID NO : 1)。 …、 政，*EGFR'TKI」乙詞在此處係指上皮細胞生長因子接受器 =邊酶抑制劑。某些EGFR_TKI之實例包括艾瑞莎，亦即 苯基）_7_甲氧基（3-嗎琳_4-丙氧基）十坐琳 d卿a®) ’以及埃羅替尼，亦即Ν_ (3·乙快苯基）_6,7_ :、魅I !^乳）啥唾琳冰胺（Tarceva®)，其為臨床上用於 冶療非小細胞肺癌之藥物。 ..,^作用」乙詞在此處係指由EGFR-TKI誘發之副作用， 丄影響(例如腹瀉、腸絨毛/細胞之損傷，或腸 乾焊)'在il,乍用不利的皮膚狀況（例如皮療或皮膚 咖細财崎之腸道 八頁素（二阿魏酰甲烷diferuloylmethane)係高度活性 ϋ Γΐ物川薑黃（6>謂猶/0哪）所萃取出，化學式（烯

薑黃素烯醇型 或趟素」^詞係亦包含其類似物、衍生物， ·-、衣自里汽素之產品，例如食品添加物或補充劑，亦包 201204345 含在内。在-具體實施例中，薑黃素類似 LL-18、LL-68和LC_15所構成之群組，化自由LL-17 千式如下所示：

JC-15 〇 h3co

技4τ領域所知的一般方法’例如^，oorgaw.e设

Che麻ry ，，u w，. 2m-3l 瓦 Joumal 〇f Medicinai C7^m·味y 2006 ; 49 (13) : 3963-72 所述者，而自 成或分離出。 …貝原口 此處所使用的「病人」、「個體」及「個人」用詞可互換使 用，具體而言係指一需要癌症醫療之人類個體。在一具體實施 例中，該個體患有非小細胞肺癌（NSCLC)。 八貝 曰根據本發明，EGFR-TKI和薑黃素或其類似物可以一治療 劑量形式、或分開治療劑量，如分開的膠囊、片劑、容器或注 射。可同時（併行）或依序施用EGFR_TKI及薑黃素或I類似 物。在一具體實施例_，EGFR_TKI及薑黃素或其類似&係被 併行施用。 為有助於輸送’根據本發明EGFR-TKI及薑黃素可被，各 別地或組合地，配製成具醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。 201204345 此處使用之「醫筚卜 典θ ,t ^ 中之活性成份相容的^地=定=^與含於該組合物 的個體無害。生成份’且對被處理 包，糖、葡萄糖'二

S劑：乞_、及甲基纖維素。醫藥組合物可另外包S 浮劑；保^如物Ϊ;濕潤劑；乳化劑和懸 調味劑。 日和财曱酸丙s旨；甜味劑；及 小袋根醫藥組合物可為片劑、丸劑、粉末、錠劑、 栓劑、=、、主=、^浮液、乳液、溶液、概、軟及硬膠囊' d ,，、、囷/主射各易、以及包裝粉末形式。 於穿本组合物可經由任何生理上可接受的路徑而 ，吉彳細'非腸道（例如肌肉、靜脈'皮下、腹腔），二 .i合及其類似途徑。在-具體實施例中，本發明之 在本發明中’亦發現，當施用EGFR_TKI結合蕃普 有…需要之病人時，可減少EGFR-TKI之有交文量，而其^療有 效性’相較於單獨施用EGFR-TKI，係實質上予以維持。，、 ^此。’在另一方面，本發明提供一種施用上皮細胞生長因 子接受器酪胺酸激酶抑制劑（EGFR_TKi )至需要使用 EGFR-TKI之癌症醫療之病人之方法，包含施用減少劑量之 EGFR-Ώα讀黯錢其細輕賴人，喊egfr_tki 在癌症醫療方面之功效，相較於在無施用薑黃素或其類似物而 僅％用標準劑量之EGFR-TKI所達至之功效’係實質上被维接 的。 、 + τ 有關於施用一藥劑之一「有效量」或一「有效劑量」，係 才曰‘致所欲藥學結果之量或劑量，例如改善症狀、減少副作 用、延長生命或改善生命品質；就一具惡性腫瘤之個體而言， 201204345 舉例而言’腫瘤生奴速率被降低、此義_積被減少 ，腫瘤被完整消除。-藥劑之有效量或劑量可依據所使用之特 疋活性成份、施用的模式、被治療之個體之年齡、體重及狀況， 而不同。施用所需藥劑之精確量依照醫療從業人員之判 每個個人所特有。 巧 此處所，用的「標準劑量」乙詞係指治療劑之一有效劑 量，其為製藥界中權威人士，包括食品和藥物管理局，所建^義 者，且常用於例行實作。此處所使用的「減少之劑量」乙詞係 指低於，準劑量但仍實質上㈣了相同治療劑之相同治療效 果的劑量。特定而言，根據本發明，EGFR-TKI之減少之劑量 係EGFR-TKI標準治療劑量的約9〇%或更少、8〇%或更少、 70%或更少、60%或更少、50%或更少。在本發明一具<實 施例中，該減少之劑量係EGFR-TKI標準治療劑量的約' 或更少。 已知，某些病人對EGFR-TKI治療具反應不良，而可能需 要高劑量以達到所欲的治療效果，然而其會造成病人無法接受 的毒性反應並最後導致治療中斷。出人意外的，本發明之方法 在治療具EGFR-TKI抗性之病人特別有效。當施用於對 EGFR-TKI具抵抗力之病人時，本發明之方法允許施用減少之 士1丨里之EGFR-TKI至4病人’而其醫療有效性，相較於單獨施 用EGFR-TKI，係實質上予以維持。在一具體實施例中，病人 具有對EGFR-TKI具抵抗力之突變，例如，在egfr(SEQH) NO : 1)中之T790M取代。 本發明亦提供一種用於治療具EGFR-TKI抗性之癌症病 人的方法，其包含對前述病人共同施用有效量之egfr_tki 和薑黃素或其類似物。 此處所使用的「治療」乙詞係指對一個體應用或施用一含 有一或多個活性劑的組合物’具體而言該個體具有一將以 EGFR-TKI治療之疾病’包括但不限於，腫瘤或癌、疾病的症 狀、或對疾病的易患傾向’具有治癒、愈合、減輕、緩解、改 201204345 變、補救、舒緩、改善、或影響該疾病、疾病的症狀、或 病的易患傾向之目的。 ' 參知、下列具體貫施例，現在本發明將被更特定地描述，該 等具體實施例係供用於實證之目的，而無非限制。 材料與方法 1. 試劑 用於活體外研究之薑黃素（以HPLC純化：98.0%)係購 自Calbiochem (Darmstadt市，德國）。活體内，薑黃素（純度 〜70%)係來自Sigma (St Louis市，MO州，美國）。艾瑞莎 (Iressa® )，ZD1839，係由 Astra-Zeneca Ph麵aceuticals (Macclesfield市，英國）善意提供。薑黃素及艾瑞莎之存料 溶液係在二甲亞砜（DMSO)中製備並貯存在_2〇°C。於每個 貫驗’在新鮮的媒質中稀釋該等化合物，且DMSO之最終濃 度係低於0.1%。用於動物之薑黃素及艾瑞莎係以在丙二醇 (J/T.Baker’Phmipsburg美國）中徹底懸浮該藥物製備而成。 2. 細胞系及培養條件 已建立具高度侵襲性之人類肺腺癌細胞系（CL1_5 ) {American Journal of Respiratory Cell & Molecular Biology 1997 ; 17( 3 ): 353-60 )。人類肺癌細胞系 A549、H1299、H1650， 及 HI 975 係得自 American Type Culture Collection ( Manassas， VA) ° PC-9係得自Dr. Chih-Hsin Yang (台大醫院，台灣）的 善思贈與。這些細胞在RPMI 1640培養基（Life Technologies R〇ckvil]e ’ md)中生長。正c_i8大鼠腸道上皮細胞系（BCRC 60230)係於補充有 10%胎牛血清（FBS) (LifeTechn〇1〇gies) 之 DMEM 培養基（Life Technologies Rockville，MD )中生長。 上述培養基各含青徽素及鏈黴素（各100 mg/ml)且細胞系係 在37 °C、具5% C02之濕潤環境下培養。 3·增生試驗 進行MTT [3- (4,5-二甲基噻唑基-2) -2,5-溴化二苯四唑] 201204345 (Sigma，St Louis，MO)試驗以測定測定細胞增生。簡言之， CL1-5、A549、PC-9、H1650、H1975 及 IEC-18 細胞被鋪在 96-孔盤’密度為5xl03細胞/孔。在培養24小時後，以不同濃 度之量黃素及/或艾瑞莎處理細胞72小時。此外，以薑黃素、 BIRB 796及/或艾瑞莎處理IEC-18細胞培養24小時。MTT溶 液在培養基中的最終濃度為0.5 mg/ml，並被加入孔中。在又 1.5小時培養後，該培養基被移除，並加aDMS〇至盤中。使 用多標示盤讀取器（multi-label plate reader )( Vector3 ; Perkin-Elmer ’ USA)於 570 nm 計量溶解之甲臢（formazan) 的顯色強度。 4.菌落形成試驗 CL1-5、A549及H1975細胞被鋪於具培養基之6-孔盤中 (每孔100細胞）。在培養24小時後，艾瑞莎或薑黃素單獨處 理細胞，或以所示的合併處理。以該等試劑培養細胞5天，接 著完全更換培養基；接著再培養細胞9天。使用0.001〇/◦結晶 紫染菌落，並計算每孔的菌落數。 5.西方墨點法分析 使用西方墨點法以測定EGFR、pEGFR、Akt、pAkt、細 胞週期素D1、PCNA、iNOS及多種細胞凋亡相關蛋白質（半 胱天冬原酶-3、8、9及PARP)之蛋白質表現量。細胞被鋪在 10-cm碟’密度ΐχ106。在培養整夜後，在無FBS之培養基中 以血清凱餓法處理細胞24小時。接著在無血清條件下以不同 濃度薑黃素及/或艾瑞莎處理細胞1小時，接著以2〇 ng/mL EGF刺激30分鐘。IEC_18細胞被鋪在i〇_crn碟中，密度 1X1 〇6。在培養整夜後，以不同濃度薑黃素及/或艾瑞莎或birb 796處理細胞又24小時。以冰冷的PBS清洗這些細胞三次， 並卒取其蛋白質。此外，從各組中獲取CL1-5腫瘤組織（1〇〇 mg)並接著在裂解緩衝液中絞碎。使用哺乳類蛋白質萃取試 劑（Pierce ’ Rockford)獲得蛋白質萃取物，該試劑含有蛋白 酶抑制劑及碌酸酶抑制劑（sigma，US A )。使用1 〇%解析膠進 201204345 行SDS/PAGE，以分離蛋白質（25 mg/膠道）。抗磷酸-EGFR (Tyrl〇68)、磷酸-Akt (Ser473 )、Akt、c-MET、半胱天冬酶 -3、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶_9、parp、活性-p38及p38之 抗體係購自於 Cell Signaling Technology (Beverly ’ MA)。抗 EGFR、細胞週期素D1、PCNA，及iNOS之兩種形式之抗體 係購自於 Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz，CA )。該等抗 體係根據製造商之建議而使用。使用增強的化學冷光系統 (Santa Cruz，CA)偵測聯結的抗體。使用 Fujifilm LAS 3000 系統（Fujifilm，Tokyo ’ Japan)捕捉化學冷光信號。所有實驗 皆重複進行三次。 6·流動細胞計數法 種晶細胞於6-mm培養盤中，密度每碟1〇5細胞。在培養 24小時後’以血清飢餓法處理細胞整夜。接著以薑黃素及/或 艾瑞莎處理細胞又7 2小時。分別蒐集附著的與漂浮的細胞， 並再懸浮於冷1 X PBS中以進一步分析。以膜聯蛋白ν-FITC 細胞凋亡套組（BD Pharmingen，USA)染細胞，以監試凋亡 細胞，並以碘化丙錠（PI)染細胞，以偵測死亡細胞。在一 FC 500流動細胞計數系統（BecJcman Coulter)分析樣本。未 染色的細胞被分類為「活著」，只染上膜聯蛋白V之細胞被分 類為「早期凋亡」，染上膜聯蛋白V及PI兩者的細胞被分類為 「晚期凋亡」，而只染上PI的細胞被分類為「死亡」。

7.實時定量RT-PCR 藉由實時PCR於ABI prism 7900序列偵測系統（Applied Biosystems)上偵測EGFR之表現量。使用的EGFR引子如下： 前置引子 EGFR-F，5’- GTGACCGTTTGGGACTTOATOA -3’ ；反置引子 EGFR-R，5，- GGCTGAGGGAGGCGTTCTC -3’。使用TATA-盒結合蛋白質（TBP)作為内部控制（GenBank X54993 )。用於TBP mRNA之定量RT-PCR的引子與探針如前 所述（24，25)。EGFR相較於TBP的相對表現量係定義為 一ΔΟΤ= —[CTEGFR—CTTBP] ° EGFR mRNA/TBP mRNA 比係計算 201204345

-ACT 為2 χΚ ,其中K係一常數。所有實驗皆重複進行三次 8.活艘内研究實驗方案 我們根據國立陽明大學動物照護及使用委員會許可的實 進行小鼠活體内研究。按照細胞存活及細胞數使用台盼 監計异011-5細胞’接著在1〇〇4册％中1)<1〇6活(：^1_5細 胞被皮下注射至6週大SCID小鼠（由台灣大學醫學院動物中 心，台北，台灣，所提供）。為了試驗是否薑黃素可增強艾瑞 莎之抗瘤效果，小鼠在細胞注射一週後被任意分成五組（n = 9) ’這些疋.（1)空載體控制組；（2)薑黃素單獨組（1妨@); (3 ) 乂沙早獨組（120 mg/kg) ; ( 4) 60 mg/kg 艾瑞莎加 1 g/kg薑黃素組；以及（5) UOmg/kg艾瑞莎加！ g/kg薑普素 ，。每日以口服將所示處理計量之薑黃素及艾瑞莎餵給動物二 母四天監以電子游標卡尺視腫瘤尺寸並使用公式V = 0.4 χ沾2 計异腫瘤體積，其中a及b分別為腫瘤的最長及最短直徑。3 週後，犧牲小鼠，切除皮下腫瘤；接著凍於液態氮中，最後貯 存於-80X。使用布恩液（Bouin，s fluid)固定來自每組小鼠的 腸道樣本並石蠟包埋，用於常規的蘇木精與曙紅染色。 9. PCNA免疫组織化學染色，及細胞的細胞凋亡偵測試驗 使用PCNA染色在石纖包埋腫瘤組織樣本上進行細胞增 生分析。簡言之，在一次反應中使用一兔抗·人類PCNA多株 抗體（Santa Cruz，CA)。以3,3’-二胺聯苯胺使用DAK〇

EnVision系統，其含一個二次辣根過氧化酶_接合抗_鼠抗體複 合物，以偵測PCNA。 用於凋亡細胞死亡的比色免疫組織化學染色（丁UNEL) 係在石蠟包埋腫瘤及腸道組織切片上進行，使用原位細胞死亡 偵測套組，POD (Roche Diagnostics，德國）；亦以Gill之蘇木 精對比染色該等切片。在來自每處理組的三個腸道的1〇隨機 視野中試驗TUNEL_陽性細胞，接著陳述每高倍視野（χ4〇〇倍 率）TUNEL-陽性細胞平均數土 SE。 ° 10·半耽天冬酶活性之測量 201204345 藉由使用半耽天冬酶-Gl〇® 3/7試驗套組（Promega Corporation，澳洲）偵測半胱天冬酶活性。簡言之，種晶ffic_ i 8 細胞在96-孔白色光度計試驗盤中，密度為每孔1χ1〇4細胞， 並培養於37°C。在培養24小時後，以不同濃度之艾瑞莎及/ 或薑黃素處理細胞又24小時。每孔添加丨00 μι半胱天冬酶3/7 試劑，於室溫在旋轉搖動器上培養1小時。使用多標示盤讀取 器（Vector3 ; Perldn-Elmer ’ USA)來測量每孔的發光強度。 11.統計分析 所有的實驗皆重複三次並由ANOVA (Excel，Microsoft ; 台北’台灣）分析。使用雙尾司徒頓t檢定做比較，且顯著差 異定義為Ρ<〇·〇5。在適當情況下，數據以平均數±標準差（mean 土 SD)表示。 結果 1.薑黃素可抑制肺腺癌細胞增生，EGFR及AKT蛋白質表現 及磷酸化 為了發展能增強抗癌效果、降低劑量，或克服NSCLC病 人對艾瑞莎之抵抗力的新藥劑或化合物，應用具不同的對艾瑞 莎具抵抗力之細胞系的高通量藥物篩選系統，以從本實驗室之 藥草中篩選數以百計之化合物。表1顯示此處使用之EGFR 狀態及NSCLC細胞系之種族。 細胞系 EGFR狀態 種族 CL1-5 野±型EGFR 亞洲人 A549 野生型 高加索人 H1299 野生型但p53-缺失 高加索人 H1650 五GFi?外顯子19片段缺失 (ΔΕ746-Α750)，但無 PTEN 蛋白質 高加索人 H1975 外顯子21 L858R取代及外顯子 20第二T790M取代 高加索人 PC-9 五外顯子19片段缺失 亞洲人 201204345 __( ΔΕ746-Α750 ) 選擇薑黃素做為潛在候選。我們確認，在對艾瑞莎具抵抗 力之 NSCLC 細胞系中，包括 CLl-5 (wt-EGFR)、A549 (wt-EGFR)、H1299 (wt-EGFR)、H1650 (五GF及外顯子 19 片段缺失(^7464750^但無pten蛋白質）、及H1975(EGFR 之L858R及T790M突變），薑黃素對細胞增生展現顯著地抑 制效果。如圖1A所示，當以艾瑞莎培養72小時後，相較於 對艾瑞莎敏感之細胞系PC-9(IC50<0.1 jhM)，CL1-5、A549、 H1299、H1650、及H1975顯示了增加的抗性的總體佈局 (Κ：50>10μΜ)(圖1A組）；不過，這些艾瑞莎抗性細胞的 增生受到薑黃素以濃度依賴性方式之抑制（圖1右）。 已知EGFR訊息傳遞路徑與腫瘤發展高度相關，因此試 驗了在CLl-5、Α549及Η1975細胞中薑黃素對EGFR及ΑΚΤ 的表現量及活性（磷酸化）的影響（圖1Β)。結果指出，在 CL1-5及Α549細胞中薑黃素皆可濃度依賴性地減少EGFR、 pEGFR、ΑΚΤ ’及ρΑΚΤ蛋白質表現（圖1Β)。雖然在Η1975 細胞中薑黃素並無改變ΑΚΤ磷酸化，薑黃素仍顯著地減少了 一個EGFR下游訊息傳遞因子，即細胞週期素01之量（圖ιΒ， 右）。再者，RT Q-PCR結果顯示，量黃素可濃度依賴性地減 少EGFRmRNA表現（圖1C)。這些結果指出，薑黃素劑量藉 由在艾瑞?少抗性NSCLC細胞中減弱EGFR訊息傳遞，展現了 一潛在抗癌效果。 2.薑黃素對EGFR之結合活性 我們研究了薑黃素對EGFR之結合活性，並將之與艾瑞莎 比較。結果顯示，根據LIBDOCK，薑黃素之預測3-D構形結 合至開形野生型E GFR蛋白質具有相對較高的分數（薑黃素分 數=89.5 ;艾瑞莎分數=80.3)。此外，圖2顯示薑黃素結合至 具T790M抗性突變之EGFR酪胺酸墙酸化處。綜言之，這些 結果顯示，相較於艾瑞莎，薑黃素展現了對EGFR較高的結合 活性’且T790M抗性突變不影響薑黃素對EGFR之結合活性。 201204345 3. 薑黃素促進EGFR降解並下調EGFR蛋白質量 我們測試了是否薑黃素可促進EGFR在轉譯階段之降 解二以^1^32前處理3小時或無前處理肺腺癌細胞，接著以 所示之里㈤素處理。我們的數據顯示，薑黃素可劑量依賴性地 抑制EGFR蛋白質表現;.然而，當細胞以mgi32前處理，其 ，蛋白酶體抑制劑，則EGFR蛋白質濃度可被回復（圖3八)二 這些結果可指出，薑黃素可經由促進泛蛋白_蛋白酶體能力而 降低EGFR蛋白質表現量。 我們亦發現，在艾瑞莎合併薑黃素組中之EGFR蛋白質濃 度，低於薑黃素單獨組。因此，我們進行了免疫沉澱試驗以檢 驗該觀察。結果顯示，艾瑞莎（1〇 μΜ)不改變EGFR泛蛋白 量，然而，相較於其他單獨處理組，在合併處理組，艾瑞莎（1 μΜ)及量黃素（1〇 μΜ)可增加EGFR蛋白質泛素化（圖3B)。 此數據指出，薑黃素可藉由下調EGFR蛋白質濃度而增強艾瑞 莎抗腫瘤性質。 4. 合併薑黃素及艾瑞莎可改善NSCLC細胞中艾瑞莎之抗腫 瘤效果，具野生型或突變五GFi?者皆然 使用具野生型或突變EGfT?之CL1-5、A549、H1299、 H1650及H1975細胞系，以評估薑黃素能否增加多種具不同 狀恕五之艾瑞莎-抗性NSCLC細胞中之艾瑞莎抗瘤效果。 細胞增生試驗顯示，艾瑞莎（$1〇μΜ)或薑黃素（$ΐ5μΜ) 單獨處理僅產生輕微的細胞增生抑制作用（圖4Α)。然而，當 合併薑黃素（15 μΜ)與艾瑞莎（1 μΜ)時，在五個對艾瑞莎 具抵抗力之NSCLC細胞系中，細胞增生皆有顯著減少，且抗 增生效果係等同於高劑量艾瑞莎（20 μΜ)(圖4Α)。當檢驗 CL1-5、Α549 及 Η1299 細胞中 EGFR、pEGFR、ΑΚΤ 及 ρΑΚΤ 表現量時’亦發現薑黃素與艾瑞莎合併處理顯著抑制了 EGFR 訊息傳遞。這些結果指出，艾瑞莎（1 μΜ)或薑黃素（1〇和 15 μΜ )單獨組僅具有對pEGFR及ρΑΚΤ最小的抑制效果（圖 4Β ) ’反之’合併艾瑞f少（1 μΜ)與薑黃素（15 μΜ)產生了 201204345 對EGFR及AKT磷酸化顯著的屏障（圖4B)。這些結果建 當使用艾瑞莎處理艾瑞莎-抗性癌細胞時，薑黃素7可°增強艾$ 莎之抗癌效果。 此外，我們研究了是否薑黃素可增加在CL1_5、Α549 Η1975細胞系中由艾瑞莎導致之細胞凋亡量。使用蛐化丙 膜聯蛋白-V染色的動細胞計數法試驗指出，在clm與α549 細胞，合併父知沙（1 μΜ)及薑黃素（μ μΜ)誘發了比起言 /辰度、單獨組（20 μΜ)較南量的細胞〉周亡（圖5α，^ 及中）。在Η1975細胞中，相較於艾瑞莎單獨組，薑黃素及= 巧沙亦共服尚了麟蛋自V陽性細胞數，但此量係相似於 4黃素（15μΜ)單獨組；15μΜ薑黃素不論是否有艾瑞莎， 皆可誘發約90〇/〇之Η1975細胞的細胞〉壯（圖5Α，右）: 事實可解釋兩藥劑並未一起誘發。綜上，這些結果似乎指出， 薑黃素可增強艾瑞莎-抗性細胞中由艾瑞莎誘發之細胞调亡。 下步，我們使用菌落形成試驗，檢驗了是否薑黃素可辦 ，⑶-5、A549及H1975細胞中艾瑞莎之抗致瘤性。、結果^ ’ ί，’相較於無藥劑控制組及各藥劑單 H汽素與艾瑞莎之結合顯著地抑制了 CL1-5、A549 圖5B)。上述活體外研究支持了，當使用 C广沙_抗性肺腺癌細胞時薑黃素可增強艾瑞莎之 果似乎不受膽突變型之突變或任 β ί u增強人類肺腺癌細胞中艾瑞莎抗瘤 可察覺到腫瘤時=mcmL -5細f至SCID小鼠。一週後，當 桩荽估4 X 4 )，小鼠被隨機分成五組（圖6A)。 理體系，其為:做為控制組的空載 一 乂而沙（60mg/kg)組，及薑黃素（]g/Jcg) 201204345 合併高劑量艾瑞莎〇2〇 mg/kg)組。這些處理每日一次以口 服給予，且在四週後犧牲小鼠。在此期間，每四天監視每組的 腫瘤體積（圖，6B)。在此研究末，控制組動物之腫瘤尺寸平均 為638.55 明顯地’薑黃素加上高劑量艾瑞莎合併處理組 的腫瘤尺寸顯示了最大的縮減，至僅64.15 mm3 (p == 0 0〇〇1 對照控制組）’而薑黃素加上低劑量艾瑞莎組僅顯示縮減至平 ί ΐ·!6!·59 mm3 (/? = 0.0006對照控制組）。薑黃素單獨組及 艾瑞莎單獨組之平均腫瘤尺寸分別為354.91(/7 = 0.015對照控 制組^38.32 mnv> (户=0·0003對照控制組）。因此薑黃素 合併艾瑞莎之抗瘤活性，相較於薑黃素及艾瑞莎單獨組，顯示 1強了的效果（p < 0.01對照薑黃素組，及户二〇 〇15對照艾瑞 了，）此外，以低劑量薑黃素（6〇 mg/kg)處理之組顯示了 ，20 mg/kg艾瑞莎單獨組相似程度的抗瘤活性（户=〇483) 6·薑黃素藉由減少

’右）。這些結果指出， 薑黃素似乎會藉由減少EGFR訊息 ’特別是薑黃素加上艾瑞莎組（圖 j 6C)，此’合黃素與低縫之艾瑞莎可節省半量艾 U、二且獲得相同的腫瘤進展之抑制作用。這些結果清楚地 不，畺黃素增強了艾瑞莎之抗瘤活性。 ‘ 201204345 傳遞、c-MET、PCNA及iNOS，及藉由上調細胞凋亡路經， 而強化活體内具抗性之細胞中艾瑞莎之抗癌活性。 我們接著使用免疫組織化學染色檢驗了增生標記 PCNA，及藉由TUNEL試驗檢驗細胞死亡；於石蠟包埋組織 樣本中完成。圖7B結果顯示，在薑黃素處理組樣本及薑黃素 合併艾瑞莎組樣本中，PCNA標記（圖7A，左）減少了，其 係相似於PCNA蛋白質表現。此外’原位細胞死亡價測試驗 指出，相較於控制組及艾瑞莎單獨組，薑黃素合併艾瑞莎處理 組顯著地增加了細胞的細胞凋亡活性（圖7B)。這些結果亦顯 不，相較於控制組，薑黃素單獨組誘發了細胞的細胞凋亡（圖 7A，右）。這些結果確認了薑黃素活體内抗增生及細胞凋亡 發能力。 7·薹黃素減輕艾瑞莎之不良腸胃道影審 在研究活體内異體移植綱，艾瑞莎處理組小鼠顯示了 , 人的體重減輕（數據未顯示）且亦有明顯的腹篤副作用丨此^

ΐ於巧，且組内嚴重者甚至死亡。有趣0 了 J 2 瓦素，可避免體重減輕且亦顯著地減J 療法ί 33%)(圖81开f f的f f率係78 % ’相較於艾瑞ί 研究蔓黃素=艾“^接#著=腸道的形態與組織，^ =11 ΐ長較合併療法組者短且細（圖认，右）。Η 同。再者，當以_染色艾曰瑞，間，職明顯㈣ 的腸絨毛之長度，相較於付自*黃素及艾瑞莎合併细 性G = 0.0001)(圖8B)，=工處理組，較長且具較大的完f 估，相較於艾瑞莎單獨组，堇主，當以TUNEL試驗活體内_ 毛内細胞;壯合併艾瑞莎亦可顯著減少誠 艾瑞莎處理之小鼠的存活/圖8C)。因此，薑黃素可改善以 用。 鮮，且亦可減少Ϊ瑞莎之Gi副作 我幻研九了领外薑黃素對艾瑞莎誘發之腸道上皮 20 201204345 細胞之細胞凋亡的保護效果，使用未轉形上皮細胞系 IEC-18。半胱天冬酶_G_3/7試驗顯示，艾瑞莎（就 細胞分別為1¾5於30 μΜ及ICso於40 μΜ之艾瑞莎）可誘 發IEC-18細胞中半胱天冬酶3/7活性，然而，5 μΜ薑黃素（無 毒性劑量）可顯著地抑制艾瑞莎誘發之半胱天冬酶3/7活性（^' 9Α)。結果顯示，薑黃素可避免腸道上皮細胞不被艾瑞莎誘發 細胞凋亡；此效果明顯相似於在活體内的先前觀察。我們接^ 測定，種可能的機制牽涉到此薑黃素對艾瑞莎誘發細胞凋亡 之保護效果。先前的報導已指出，艾瑞莎可經由依賴ρ38有絲 分裂劑活化蛋白質激腾（ΜΑΡΚ)的活化作用，而誘發腸道上 皮細胞之細胞凋亡（Gcistrointestind& Liver Physiobgy 2007 ; 293 (3 ): G599-606) ’此為艾瑞莎相關GI副作用之可能機制。 在此，我們發現IEC-18細胞中，活性_p38顯著地隨艾瑞莎處 理劑量依雛地（㈣μΜ)增加了，但在同樣培養條件下 CL1-5細胞並不提高ρ38活化作用（圖9Β)。此外，iec_i8細 月包中艾瑞莎誘發之P38 MAPK活化作用係被薑黃素顯著地抑 制了 .結果指出，薑黃素（5 μΜ)及選擇性p38 抑制 BIRB 796 ( 10 nM)可顯著地降低艾瑞莎_處理IEC_18細胞 中之活性-p38表現（圖9C ’左）。再者，Μττ試驗顯示，艾 ，J巧及4。μΜ)可顯著地減少ffic_18細胞存活率，然而， μΜ)，以及BIRB 7% (1〇 nM)，可顯著地將細胞 t又知沙之毋性效果中解救出來（圖9C，右）。亦測試了薑黃 素類似物’ LL-17、LL-18、LL68及JC-15，發現其等具有減 艾瑞莎誘發之腸道細胞死亡的保護效果（圖1())。續古之； 這些ΐίΐ示4黃素可減輕腸道中艾瑞莎誘發之併發i。 = 們的結果顯示，墓黃素做為艾瑞莎之抗腫瘤能 ϋΐΛΐΊ^广&活性°此藥劑亦減輕艾瑞莎之腹S副作用， 人而言可為—良好的佐劑。臨床上，肺癌標靶 _南’且在治療期間’副翻往往是酸問題。 里贯料1及且較便宜之_ ’且其卿能增強艾瑞莎之效 201204345 果並，此減少醫療相關花費及病人經濟負擔。為了減少艾瑞莎 之劑巧，削減費用，並避免副作用，我們建議，對在艾瑞莎治 療期間的NSCLC癌病人而言，薑黃素應為—良好的佐劑。 【圖式簡單說明】 以說明本發明為目的，目前較佳的具體實施例顯示於圖式 中。然而應理解的是，本發明並未被所示之較佳具體實施例所 限制。 圖式中： 圖1顯示薑黃素在具艾瑞莎抗性之NSCLC細胞中潛在地 抑制細胞增生並減少配體誘發之EGER訊息傳遞活化。a部 分，左’ MTT試驗結果顯示，六個肺腺癌細胞系中都對艾瑞 沙具易感性，右，MTT試驗顯示，在五個對艾瑞莎具抵抗力 之NSCLC細胞系中’薑黃素皆造成劑量依賴性之細胞增生的 抑制。柱’=均數（n = 6);條，標準差（SD)。數據係代表 兩侧立的實驗。B部分，西方墨點法顯示，薑黃素劑量依賴 性地（1-20 μΜ)減少了 CL1_5、A549和H1975細胞系中egf (20 ng^nl)-誘發之Egfr表現、pEGRR濃度、AKT表現、 pKT濃度以及細胞週期素D1表現。數據係代表兩個獨立的 貫知’使用β_肌動蛋白作為内部控制。C部分，實時定量RT—PCR 顯示’在CL1-5細胞中，EGFRmRNA表現係被薑黃素濃度依 賴性地（1-20 μΜ)在培養24小時後減少。柱，平均數（n = 3 )，條，SD。* ’ p < 〇.〇5，與空載體處理控制組（咖μ control)相較具統計上顯著性。數據係代表三個獨立的實驗。 圖2顯示薑黃素結合至具T790M抗性突變之EGFR的酉欠 胺酸磷酸化部位。 ° 圖3顯示薑黃素加速EGFR之降解並下調EGFR之蛋白質 濃度。A =，西方墨點法顯示，薑黃素可劑量依賴性地抑制 EGFR蛋白質表現，而當細胞係以MG132前處理，則EGFR 蛋白質濃度恢復。B部分，免疫沉澱試驗顯示，相較於其他單 22 201204345 一處理組，艾瑞沙（1 μΜ)及薑黃素（ι〇 μΜ)可增加£GFR 蛋白質泛素化。 圖4顯示活體外使用薑黃素增強由艾瑞莎造成之抗細胞 增生並阻擋由艾瑞莎造成之EGFR訊息傳遞活化。A部分， MTT試驗顯示，在五個對艾瑞莎具抵抗力之肺腺癌細胞系 中，薑黃素增強了艾瑞莎的抗增生效果。柱，平均數（n = 6); 條’ SD。’ρ<〇.〇1。數據係代表兩個獨立的實驗。β部分， 西方墨點法顯示，在以乂瑞沙處理CL1-5、Α549及Η1299 NSCLC細胞系後，薑黃素增加阻擋EGF (20 ng/ml)誘發之 EGFR並進-步減少pEGFR、AKT和pAKT蛋白f表現濃x度。 數據係代表兩個獨立的實驗，使用β_肌動蛋白作為内部控制。 圖5顯示在活體外NSCLC細胞中，薑黃素增強了艾瑞莎 之細胞凋亡效果及菌落幵>成之抑制作用。Α部分，膜聯蛋白 (Annexin)V-FITC細胞凋亡試驗顯示，薑黃素增強了'艾瑞莎 之細胞;壯效果；上部分，以所指示的藥劑處理cu_5細胞。 所有呈現的圖表中，X軸係膜聯蛋白_V_FITC，少軸係ρι (碰化 丙錠，Pr〇PidiUm iodide);下部分’計算正在進行細胞洞;之 CL1-5、A549及H1975細胞；總細胞之膜聯蛋白—v+和 ρϊ_(早 期細胞社）以及膜聯蛋白_V+和ρι+ (晚期細胞壯）濃度 被發現在右下和右上方象限。柱，平均數（η = 3);條，犯。 *」=ο.〇5’**’ρ<0.01& = 0.331(15μΜ#Β^μΜ 乂ί而沙加上11_ 4黃素）。數據係代表各做過三次的獨立實 驗。5部分，菌落形成試驗顯示，在cu_5、Α549及Ha乃 ，薑黃素增強了艾瑞莎之菌落抑制能力。指示以 樂劑作細胞處理；v :空載體控制組，G1、G5、Gi〇、 23 1 C5nC1I、C15、G1+C1、G1+C5、G1+C10 及 G1+C15: r tn ΐ艾瑞莎和甚黃素’以及數字顯示藥劑之濃度 (μΜ)。在兩週後計算菌落。柱，平均數（η = 3)，·條，沁。 數據係代表兩個獨立的實驗。 ” 圖6顯示薑黃素增強了活體内艾瑞莎之抗瘤活性。八部 201204345 分’活體内實驗方案以一計劃表呈現。B部分，1〇6 cu_5肺 腺癌細胞被皮下植入於SCID小鼠中，並隨時間監視五組的腫 瘤體積。點，為母組至少六隻小鼠的平均；條，SD。c部分， 上圖，自小鼠切下的皮下腫瘤攝影，其指出，相較於單獨處理 的組，薑黃素增強了艾瑞莎抗腫瘤生長的活性；下表，實驗最 後一天的腫瘤體積。担，平均數（n = 6);條，SD。厂=〇 〇〇〇3 (控制組對照120 mg/kg艾瑞莎單獨組），夕=〇 〇〇〇6 (控制 組對照60mg/kg艾瑞莎及1§/岐結合組），及p = 〇484 (^2〇 mg/kg艾瑞莎單獨組對照60 mg/kg艾瑞莎及}結合組）。 ^圖7顯示抗瘤增生活性的增強作用及使用異體移植腫瘤 模型藉由複合艾瑞莎/薑黃素處理誘發之細胞〉周亡。A部分， ί巾示，墓黃素結核艾瑞莎抑制了肺腺癌腫瘤組 Λ 中 EGFR、AKT、c-MET、細胞週期素 m、pcNA，及 iN〇s 之表現；右，西方墨點法顯示’薑咅辛έ士人 =酶-8、钱天冬齡3及半胱 :!=i=I,PARP片段全長的量。數據係以使用p:動 ίί?:1員示。從每組十三隻動物匯集樣本並分 ί使f結果°Β部分’ _染色，增生標記 此，使驗之細胞，周亡酬之免疫組織化學染色。為 此使用母組的皮下腫瘤切片，其結果指出，薑普 制腫增強由艾瑞莎誘發之社性細胞死亡。乂 分，；二'素減輕活體内艾瑞莎之腸胃道副作用。Α部 刀’左，母組的動物存活率指出，薑黃素 ^ 用造成之小鼠死亡；右，每έ㈡ ^ 又而炒田1Η乍 普辛減少了-炉一七田 鈿返之攝影，呈現以顯示薑 切片之Η&Ε染色顯示，薑*辛 =的知逗 之主要副作狀—化’其為艾瑞f少 平均數（n = 3W欠π 戈長度（條=2〇〇，）。柱， ^ 3 )，條 ’ SE。p = 0.00(^ ⑴〇 /k 獨組對照mmg/kg艾瑞莎加_ 使用各組的腸道切片由測EL試驗偵測細心壯°;刀這|指 24 201204345 由辦造叙細歧t右，如材 i ㈣罐“皰之量化。柱，平Ϊ 分之^道副作用。a部 yI ^ ϊ瑞莎誘發之半耽天冬酶活性。才主，平ί數k Γ) 條，SD。數據係代表兩個獨立的實驗 ：H-3)， 顯示，艾瑞莎劑量依賴性地（〇_2〇 《二西方墨點法 驗，使用β_肌動蛋白作為内部控“】du立的實 顯不，IEC-18 +，薑普辛盘mRB 7 /丄西方墨點法 iU 6 ° ^，平均 二，及 丨_，胞增生抑 ^fiNM_0〇5"28 } 5P GenBank^^ 【主要元件符號說明】 Μ »\

S 25 201204345 序列表 <110>國立台灣大學 <120>噩黃素或其類似物於使用上皮細胞生長因子接受器酪胺酸激酶抑制劑之癌症醫療之用途 <130> IN0071/NTU0013US <150> US61/303,593 <151> 2010-02-11 ' <160> 1 <170> Patentin version 3.5 <210> 1 <211> 1210 <212> PRT <213>人類 <400> 1

Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Lea Leu Ala 15 10 15

Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gin 20 25 30

Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gin Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe 35 40 45

Leu Ser Leu Gin Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn 50 55 60

Leu Glu lie Thr Tyr Val Gin Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys 65 70 75 80

Thr Me Gin Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu lie Ala Leu Asn Thr Val 85 90 95

Glu Arg lie Pro Leu Glu Asn Leu Gin lie lie Arg Gly Asn Met Tyr 100 105 110

Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn 115 120 125

Lys Thr G!y Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gin Glu ile Leu 130 135 140

His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu 145 150 155 160

Ser Ile Gin Trp Arg Asp lie Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met 165 170 175

Ser Met Asp Phe Gin Asn His Leu Gly Ser Cys Gin Lys Cys Asp Pro 180 185 190

Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gin 195 200 205

Lys Leu Thr Lys lie lie Cys Ala Gin Gin Cys Ser Gly Arg Cys Arg 210 215 220 201204345

Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gin Cys Ala Ala Gly Cys 225 230 235 240

Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp 245 250 255

Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro 260 265 270

Thr Thr Tyr Gin Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly 275 280 285

Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His 290 295 300

Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Scr Tyr Glu iMet Giu Glu 305 310 315 320

Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Ar^ Lys Val 325 330 335

Cys Asn Gly lie Gly lie Gly Glu Phe Lys Asp Scr Leu Ser lie Asn 340 345 350

Ala Thr Asn lie Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser lie Ser Gly Asp 355 360 365

Leu His lie Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr 370 375 380

Pro Pro Leu Asp Pro Gin Glu Leu Asp lie Leu Lys Thr Val Lys Glu 385 390 395 400 lie Thr Gly Phe Leu Leu He Gin Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp 405 410 415

Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu 丨le lie Arg Gly Arg Thr Lys Gin 420 425 430

His Gly Gin Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn lie Thr Scr Leu 435 440 445

Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu lie Ser Asp Gly Asp Val lie lie Ser 450 455 460

Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr lie Asn Trp Lys Lys Leu 465 470 475 480

Phe Gly Thr Ser Gly Gin Lys Thr Lys lie lie Ser Asn Arg Gly Glu 485 490 495

Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gin Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro 500 505 510

Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn 515 520 525 2 201204345

Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly 530 535 540

Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys He Gin Cys His Pro 545 550 555 560

Giu Cys Leu Pro Gin Ala Met Asn ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro 565 570 575

Asp Asn Cys Ile Gin Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val 580 585 590

Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp 595 600 605

Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys 610 615 620

Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly 625 630 635 640

Pro Lys Ile Pro Ser I)e Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu 645 650 655

Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His 660 665 670

Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gin Glu Arg Glu Leu 675 680 685

Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gin Ala Leu Leu 690 695 700

Arg lie Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys lie Lys Val Leu Gly Ser 705 710 715 720

Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp lie Pro Glu Gly Glu 725 730 735

Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Ar» Glu Ala Thr Ser 740 745 750

Pro Lys Ala Asn Lys Glu lie Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser 755 760 765

Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly lie Cys Leu Thr Ser 770 775 780

Thr Val Gin Lea Ile Thr Gin Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp 785 790 795 S00

Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gin Tyr Leu Leu Asn 805 810 815

Trp Cys Val Gin Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg 820 825 830 3 201204345

Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro 835 840 845

Gin His Val Lys lie Thr Asp Phe Gly. Leu AJa Lys Leu Leu Gly Ala 850 855 860 GIu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro lie Lys Trp 865 870 875 880

Met Ala Leu Glu Ser lie Leu His Arg lie Tyr Thr His Gin Ser Asp 885 890 895

Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser 900 905 910

Lys Pro Tyr Asp Gly He Pro Ala Ser Glu lie Ser Ser Me Lea Giu 915 920 925

Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gin Pro Pro lie Cys Thr He Asp Val Tyr 930 935 940

Met He Met Val Lys Cys Trp Met lie Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys 945 950 955 960

Phe Arg Glu Leu lie ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gin 965 970 975

Arg Tyr Leu Val lie Gin Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro 980 985 990

Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp 995 1000 1005

Asp Val Val Asp Ala Asp Giu Tyr Leu Ile Pro Gin Gin Gly Phe 1010 1015 1020

Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu 1025 1030 1035

Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys lie Asp Arg Asn 1040 1045 1050

Gly Leu Gin Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gin Arg 1055 1060 1065

Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp 1070 1075 1080

Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gin Ser Val Pro 1085 1090 1095

Lys Arg Pro Ala Gly Ser Val Gin Asn Pro Val Tyr His Asn Gin 1100 1105 1110

Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro His Tyr Gin Asp Pro 1115 1120 1125 201204345

His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Va! Gin 1130 1135 1140

Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala His Trp Ala 1145 1150 1155

Gin Lys Gly Ser His Gin fie Ser Leu Asp Asn Pro Asp Tyr Gin 1160 1165 1170

Gin Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly lie Phe Lys 1175 1180 1185

Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gin 1190 1195 1200

Ser Ser Gtu Phe lie Gly Ala 1205 1210

Claims (1)

1. 201204345 七、申請專利範圍： 1. -種用於減少纟使用上皮細胞生長因子接受器路胺酸 治療__之方法，包含施用 之纽㈣薑黃核其軸物域受此治療 2·如申請專利範圍第〗項之 EGFR-TKI誘發之腸胃道副作用。 八中5玄專副作用係 3.如申請專利範圍第2項 咖係 瑞莎（队（3-氯冰氟苯基）_ $ ’其中該EGFR-TKI係艾 由下^^^圍第1項之方法，其中該類似物係選自於 唑啉_4-胺）。 乳基-6_ (3'嗎啉-4-丙氧基）喹

   h3c〇' HO" 〇 LL] 7 LL]8 ; 和 Ί<χη3 ΌΗ JC-15 如申請專利範圍第1項之方法， 其中該病人， S、有非小細 s 201204345 胞肺癌（NSCLC)。 7. 如申請專利範圍帛1項之方法，其中該薑黃素或 物係與EGFR-TKI同時被施用。 ” 8. —種施用上皮細胞生長因子接受器酪胺酸激酶 (EGFR-TKI)至需要使用EGFR-TKI之癌症醫療之病人之方 法，包含施用減少劑量之EGFR_TKI合併薑黃素或其類似物至 該病人，其中該EGFR-TKI在癌症醫療方面之功效，相較於在 無施用薑黃素或其類似物而僅施用標準劑量之EGFR 张 之功效，係實質上予以維持。 斤這 翻第8項之方法’其中該減少劑量係 tR-TKI之標準治療劑量的約5 〇%或更少。 贼Tc。如申請專利範圍第8項之方法，其中該病人患有 U.如申請專利範圍第8項之方法，其中該 egfr-勒轉桃㈣。 J如人域早獨以 艾瑞專利範圍第8項之方法，其中該egfr_™係 啥俱氣苯基）_7_甲氧基4 (3、嗎琳-4-丙氧基） 於由8 其巾該類似物係選自

   LL-18 ; LL-68 ;和 201204345

   似物===;項之方法’其中該薑黃素或其類 抗性之癌症病人的方法， EGFR-TK〗和薑黃素或其 15. —種用於治療具EGFR-TKI 其包含對前述病人共同施用有效量之 類似物。