TW201140052A - Methods of identifying & using anti-viral compounds - Google Patents

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201140052 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本文中揭示之方法適用於識別用以治療脊椎動物之病毒 感染（包括RNA病毒感染）之化合物。所識別化合物可調節 RIG-I路徑。 【先前技術】 總體而言，RNA病毒代表美國及全球範圍内之巨大公共 衛生問題。熟知RNA病毒包括流感病毒（包括禽及豬分離 株）、C型肝炎病毒（HCV)、西尼羅河病毒（West Nile virus)、SARS冠狀病毒、呼吸道融合性病毒（RSV)及人類 免疫缺乏病毒（HIV)。 全球超過1億7千萬人受到HCV感染且其中1億3千萬為具 有發展慢性肝臟疾病（肝硬化、癌瘤及肝衰竭）之風險的熳 性攜帶者。因此，HCV為造成已開發世界中所有肝臟移楂 中之三分之二的原因。最近研究表明HCV感染之死亡率由 於慢性感染患者之年齡增加而上升。類似地，季節性流感 感染5-20%人口，每年引起200,000例住院治療及36,000例 死亡。 與流感及HCV相比，西尼羅河病毒引起之感染數目最 低，2010年在美國引起981例。20%的感染患者發展重型 疾病，引起4.5%死亡率。與流感及HCV不同，沒有核准之 療法可以治療西尼羅河病毒感染，且西尼羅河病毒由於其 作為生物恐怖戰劑（bioterrorist agent)之潛力而成為藥物研 發之優先考慮病原體。 155861.doc 201140052 在所列RNA病毒中，僅存在用於流感病毒之疫苗。因 此，需要藥物療法以降低與該等病毒相關之顯著發病率及 死亡率。不幸的是，抗病毒藥物數目有限，許多抗病毒藥 物有效性較弱且幾乎所有抗病毒藥物受病毒抗性快速進化 及有限作用範圍困擾。此外，用於急性流感及HCV感染之 治療僅中度有效。HCV感染之護理標準（聚乙二醇化干擾 素及病毒唑（ribavirin))僅在5〇%患者中有效且存在許多與 組合療法相關之劑量限制副作用。兩種類別急性流感抗病 毒劑（金剛烷及神經胺糖酸酶抑制劑）僅在感染後的前48小 時内有效，由此限制；台療時機窗。對金剛院之高抗性已限 制金剛烷之使用且神經胺糖酸酶抑制劑之大量累積將最終 導致過度使用及出現流感之抗性病毒株。 大部分針對該等病毒之藥物研發計劃以病毒蛋白質為目 標。此為當前藥物之適用範圍狹窄且受到出現病毒抗性影 響之主要原因。大部分RNA病毒具有小型基因組且許多編 碼少於12種蛋白質。因此病毒目標有限。基於前述内容， 存在對針對病#感染之有效治療的巨大且未滿足之需要。 【發明内容】 本發明藉由提供識別刺激先天免疫信號傳導之化合物之 結構類別的方法來幫助滿足對有效病毒治療方法之需要。 所識別之化合物結構類別使病毒藥物研發之重點自乾向病 毒蛋白質轉移至研發乾向且增強宿主先天抗病毒反應之藥 物。該等化合物及方法可能更有效、不易“病毒抗性、 引起較少副作用且有效針對一系列不同病毒⑴。 155861.doc 201140052 RIG-Ι路徑與調節對RNA病毒感染之先天免疫反應緊密 相關。預期RIG-I促效劑適用於治療及/或預防由許多病毒 (包括（但不限於）HCV、流感及西尼羅河病毒）引起之感 染。因此，本發明係關於識別用於治療及/或預防病毒感 染（包括RNA病毒感染）之化合物的方法，其中該等化合物 調節RIG-Ι路徑。 一個實施例包括識別調節先天免疫之化合物的方法，其 包含以下步驟：使至少一個包含報導基因（其係受到對先 天免疫活化具有反應性之基因啟動子控制）之細胞與至少 一種推定的先天免疫反應調節化合物接觸；及量測報導基 因活化》 在另一貫施例中，方法進一步包含選擇活化報導基因表 現高於所選臨限值的化合物以供進一步表徵。在另一實施 例中’所選臨限值比對照值高四倍標準偏差。 在另一實施例中，進一步表徵包括量測對先天免疫活化 具有反應性之轉錄因子之核移位。在另一實施例中，藉由 免疫化學檢定量測核移位。 在另一實施例中，在接觸前，根據預測的與之配 位體結合域之結合而在結構上選擇化合物。 在另一實施例中，細胞為真核細胞。在另—實施例中， 真核細胞為Huh7細胞》 在另一實施例中，報導基因為螢光素酶。 另實施例包括一種方法，其包含提供至少一個包含報 導基因（其係、文到對先天免疫活化具有反應性之基因啟動 155861.doc 201140052 子控制）之真核細胞以供識別調節先天免疫反應之化合 物0 在另一貫施例中，細胞為真核細胞。在另一實施例中， 真核細胞為Huh7細胞。 在另一實施例中，報導基因為螢光素酶。 另一實施例包括藉由投與脊椎動物化合物來預防或治療 脊椎動物之病毒感染之方法，該化合物係藉由使至少一個 包含報導基因（其係受到對先天免疫活化具有反應性之基 因啟動子控制）之細胞與至少一種推定的先天免疫反應調 節化合物接觸而識別；其中該病毒感染得到治療、減輕或 預防。 在另一實施例中，化合物活化報導基因表現高於所選臨 限值以供進一步表徵。在另一實施例中，所選臨限值比對 照值高四倍標準偏差。 在另一實施例中’化合物誘導對先天免疫活化具有反應 性之轉錄因子之核移位。 在另一貫施例中，病毒感染由一種以下病毒科中之病毒 引起：星狀病毒科（Astroviridae)、雙RNA病毒科 (Bimaviridae)、雀麥花葉病毒科（Br〇m〇viridae)、杯狀病 毒科（Caliciviridae)、長線形病毒科（ci〇steroviridae)、紅 豆花葉病毒科（Comoviridae)、囊狀嗤菌體科 (Cystoviridae)、黃病毒科（Flaviviridae)、彎曲病毒科 (Flexiviridae) '肝炎病毒（Hepevirus)、光滑病毒科 (Leviviridae)、貫症病毒科（Luteoviridae)、單股負鏈病毒 155861.doc 201140052 (Mononegavirales)、嵌紋病毒（Mosaic Viruses)、套病毒 (Nidovirales)、野田病毒科（Nodaviridae)、正黏病毒科 (Orthomyxoviridae)、小雙節 RNA病毒（Picobirnavirus)、小 核糖核酸病毒科（Picornaviridae)、馬鈴薯Y病毒科 (Potyviridae)、呼腸孤病毒科（Reoviridae)、逆轉錄病毒科 (Retroviridae)、伴生病毒科（Sequiviridae)、纖細病毒 (Tenuivirus)、彼膜病毒科（Togaviridae)、蕃茄叢矮病毒科 (Tombusviridae)、整體病毒科（Totiviridae)、蕪菁變黃鑲嵌 病毒科（Tymoviridae)、肝 DNA病毒科（Hepadnaviridae)、范 療病毒科（Herpesviridae)、副黏病毒科（Paramyxoviridae)或 乳頭狀瘤病毒科（Papillomaviridae)。 在另一實施例中，病毒感染為流感病毒、C型肝炎病 毒、西尼羅河病毒、SARS冠狀病毒（SARS-coronavirus)、 脊髓灰質炎病毒（poliovirus)、麻療病毒（measles virus)、 登革熱病毒（Dengue virus)、黃熱病病毒（yellow fever virus)、碑傳播腦炎病毒（tick-borne encephalitis virus)、曰 本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus)、聖路易腦炎病毒 (St. Louis encephalitis virus)、墨累谷病毒（Murray Valley virus)、布氏病毒（Powassan virus)、羅西奥病毒（Rocio virus)、跳躍病病毒（louping-ill virus)、班奇病毒（Banzi virus)、伊利烏斯病毒（Ilheus virus)、科科貝拉病毒 (Kokobera virus)、庫寧病毒（Kunjin virus)、阿 _ 弗病毒 (Alfuy virus)、牛腹濕病毒（bovine diarrhea virus)、科薩努 爾森林病病毒（Kyasanur forest disease virus)或人類免疫缺 155861.doc 201140052 乏病毒（HIV)。 【實施方式】 本發明提供識別使病毒處理重點自乾向病毒蛋白質轉移 至研發乾向且增強宿主（患者）先天抗病毒反應之藥物的化 合物之方法。該等化合物及方法可能更有效、不易出現病 毒抗性、引起較少副作用且有效針對一系列不同病毒（1)。 RIG-I路徑與調節對尺^^八病毒感染之先天免疫反應緊密 相關。RIG-I為觸發對廣泛範圍之RNA病毒之免疫性所必 需的細胞溶質病原體識別受體（5_8)。尺犯^為結合於rna 病毒基因組内特徵在於尿苷或聚合U/A基元之均聚段之基 疋的雙股RNA解螺旋酶（9)。與rNA之結合誘導構形變化， 此解除自體抑制域對RIG_nt號傳導之抑制，由此允許 RIG-I經由其_聯卡斯蛋白酶活化及募集域（c ARD)向下游 傳導信號（4)。RIG-I信號傳導依賴於其NTPase活性，但不 需要解螺旋酶域（10，11) ^ RWd信號傳導在休眠細胞中靜 止’且抑制域用作回應於病毒感染來管理信號傳導之開閉 開關（8)。 RIG-Ik 號傳導經由 IPS-1(亦稱為 Cardif、MAVs 及 VISA) 轉導’ ips-i為駐留於外粒線體膜中之必要接附蛋白質（12_ 15)。IPS-1募集刺激irF_3之下游活化的大分子信號傳導複 合物’其為誘導I型干擾素（IFN)及控制感染之病毒反應性 基因之表現的轉錄因子（16)。直接或經由調節iug-j路徑組 分（包括IRF-3)觸發RIG-I信號傳導之化合物提供作為抗病 毒劑或免疫調節劑之引人的治療應用。 155861.doc 201140052 使用高產量篩選方法來識別調節^(^“路徑之化合物， 為對RNA病毒感染之細胞先天免疫反應之關鍵調節劑。 在特定實施例中，證明經驗證ΚΙ(Κ[促效劑先導化合物特 異性活化干擾素調節因子_3(irf_3)。在其他實施例中，其 展現一或多種以下性質：其誘導干擾素刺激之基因（ISG) 之表現、在基於細胞之檢定中具有低細胞毒性、適於類似 物研發及QSAR研究、具有類藥物生理化學性質且具有針 對A型流感病毒及/或c型肝炎病毒（Hcv)之抗病毒活性。 在某些實施例中，化合物展現所有該等特徵。如下文所論 述，該等化合物代表潛在抗病毒治療劑之新穎類別。儘營 本發明不受化合物在活體内之特定作用機制約束，但針對 化合物對RIG-I路徑之調節選擇化合物。在某些實施例 中’調節為活化RIG-I路徑。 使用先導化合物之抗病毒及機制作用來識別一系列適於 著重於HCV、流感病毒及西尼羅河病毒之最佳化及醫藥研 發實驗的經驗證化合物。本文中揭示之先導化合物在hcv 及/或流感病毒之細胞培養模型中起一或多種以下作用： 減少病毒蛋白質、病毒RNA及感染性病毒。 許多RNA病毒共享生化、調節及信號傳導路徑。該等病 毒包括（但不限於）流感病毒（包括禽及豬分離株）' c型肝炎 病毒、西尼羅河病毒、SARS冠狀病毒、脊髓灰質炎病 毒、麻疹病毒、登革熱病毒、黃熱病病毒、蜱傳播腦炎病 毒、日本腦炎病毒、聖路易腦炎病毒、墨累谷病毒、布氏 病毋、羅西奥病毒、跳躍病病毒、班奇病毒、伊利烏斯疾 155861.doc 201140052 毒、科科貝拉病毒、庙窗 及科薩努^ 阿爾弗病毒、牛腹填病毒 可用…本文_所描述之方法可用於識別 康β專病毒之化合物。

JlH毒之相關分類科包括（但不限於）星狀病毒科、雙 抖、：雀麥花葉病毒科、杯狀病毒科、長線形病毒 、肛丑花葉病毒科、囊狀嗟菌體科、黃病毒科、脊曲病 :科炎病毒、光滑病毒科、黃症病毒科、單股負鍵病 μ、欲紋病毒、套病毒、野田病毒科、正黏病毒科、小雙 即RNA病毒、小核糖核酸病毒科、馬鈴薯γ病毒科、呼腸 孤病毒科、逆轉錄病毒科、伴生病毒科、纖細病毒、披膜 病毒科、㈣叢矮病毒科、整體病毒科及蕪寄變黃鎮嵌病 毒科本文中揭示之化合物及方法可用於作為醫藥學上可 接受之藥物調配物之部分治療該等病毒科内之病毒。其他 相關病毒科包括（但*限於）肝職病毒科、録病毒科、 副黏病毒科及乳頭狀瘤病毒科。 本發明提供包含化合物與抗原組合之疫苗，以用於預防 或治療動物(包括脊椎動物)之疾病之㈣。如本文中所 用’疫苗包括起預防或治療作用以產生及/或增強宿主對 抗疾病及/或感染之免疫性的組合物。 本發明提供化合物作為佐劑之用途。如本文中所用，佐 劑增強、加強、延長及/或加速另一種所投與之預防劑及/ 或治療劑（包括（但不限於）疫苗）之作用。 本發明亦提供識別用於預防或抑制病毒感染之治療性化 合物的方法’其中治療性化合物具有如下結構式 155861.doc 201140052 ΚΙΝ100(異黃綱（isoflavone)):

其中Ri、R2及R3(獨立地）為H、低碳烷基、芳基、烯基、 炔基、烷基芳基、芳基烷基、烷氧基、芳氧基、芳基烷氧 基、烷氧基烷基芳基、烷基胺基、芳基胺基、雜烷基、雜 芳基、環狀雜烷基、醯基、NH2、OH、CN、Ν02 ' 〇CF3、CF3、Br、a、F、卜脒基、2-脒基、烷基羰基、嗎 啉基、哌啶基、二噁烷基、哌喃基、雜芳基、呋喃基、噻 吩基、四唾基、。塞唾、異嘆。坐基、咪β坐基、嗟二唾、嗟二 唑S-氧化物、噻二唑s,S-二氧化物、吡唑基、噁唑、異噁 唑、吡啶基、嘧啶基、喹啉、異喹啉、SR5、SOR6、 so2R7、co2R8、c〇R9、CONR1QRu、CSNR12R13、 SOnNR14R15， R·4(獨立地）為H、低碳院基、芳基、烯基、炔基、烧基芳 基、芳基烷基、烷氧基烷基芳基、烷基胺基、芳基胺基、 雜烷基、雜芳基、環狀雜烷基、醯基、烷基磺醯基、芳基 酿基及雜環烧基烧基， W為Ο或ΝΗ， X為 C=0、S=0或 S〇2，且 Z為烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基、雜烷基、雜 芳基、經取代雜芳基、芳基烷基、雜芳基烷基。 155861.doc -11- 201140052 例示性化合物包括：

本發明亦提供識別驗預防或抑制病毒感染之治療性化合 物的方法’其中治療性化合物具有如下㈣式讀2〇〇(二 氫查耳酮（dihydrochalcone)):

為Η、低碳烷基、芳基、烯基、炔基、烷基芳基芳基烷 基、烷氧基、芳氧基、芳基烷氧基、烷氧基烷基芳基、烷 基胺基、芳基胺基、雜烷基、雜芳基、環狀雜烷基、醯 基、ΝΗ2、OH、CN、N〇2、OCF3、CF3、Br、ci、F、1-脉 基、2-脒基、烧基幾基、嗎琳基、味„定基、二嗯院基、哌 喃基、雜芳基、°夫喃基、嗟吩基、四唾基、嗟β坐基、異售 唑基、咪唑基、噻二唑、噻二唑S-氧化物、售二吐s，s_二 氧化物、吡唑基、噁唑、異噁唑、吡啶基、响咬基、啥 咐、異喧琳、SR"、SORu、SO2R13、C02R14、CORi5、 CONR16R17、CSNR18RI9、SOnNR20R21， w為 c=o、c=〇(nh2)、s=o、so2、so2nh2， 155861.doc -12- 201140052 X為 S、Ο、NH、CR22R23、CR24R25、CR26R27， Υ為低碳烷基、芳基、烯基、炔基、烷基芳基、芳基烷 基、雜烷基、雜芳基或環狀雜烷基， Ζ 為 ΟΗ、NR28 R29、NR30CO2R31 ' NR32(C=0)NR33R34、 C02H、C02R35、CONH2、CONR36R37、c=o(R38)、1·脒、 2-脒、胍、N-氰基脒、N_氰基胍及四唑，且

Rn至R38(獨立地）為Η、低碳烷基、芳基、烯基、炔基、烷 基芳基、芳基院基、雜烷基、雜芳基及環狀雜烷基。 例示性化合物包括： ΟΗ η

本發明亦提供識別用於預防或抑制病毒感染之治療性化 合物的方法，其中治療性化合物具有如下結構式KIN 300A(°塞唾咬_4-酮_2-硫酮）：

其中Wl ' W2、W3(獨立地）為0、S、NH、NRi ;且 心、R2(獨立地，經取代或未經取代ah、低碳院基、劳 基烯基、块基、燒基芳基、芳基烧基、烧氧基、芳氧 基方基烷氧基、烷氧基烷基芳基、烷基胺基、芳基胺 基雜院基、雜芳基、環狀雜烧基、雜烧基芳基或酿基。 I55861.doc -13· 201140052 本發明亦提供識別用於預防或抑制病毒感染之治療性化 合物的方法，其中治療性化合物具有如下結構式 ΚΙΝ300Β(»塞唾咬-4-酮-2-硫酮）：

其中 W!、W2、W3(獨立地）為 〇、S、ΝΗ、NR,; X!、Xz(獨立地）為H、低碳烷基、芳基、烯基、炔基、院 基芳基、芳基院基、烧氧基、芳氧基、芳基烧氧基、院氧 基烧基^'基、烧基胺基、芳基胺基、雜院基、雜芳基、環 狀雜烷基、雜烷基芳基或醯基； Υι、Y2(獨立地）為Η、低碳烷基、芳基、烯基、炔基、燒 基芳基、芳基烷基、烷氧基、芳氧基、芳基烷氧基、烷氧 基烷基芳基、烷基胺基、芳基胺基、雜烷基、雜芳基、環 狀雜烷基'雜烷基芳基或醯基； Ζ!、Ζ2(獨立地）為Η、低碳烷基、芳基、烯基、炔基、垸 基芳基、芳基烷基、烷氧基、芳氧基、芳基烷氧基、烷氧 基烷基芳基、烷基胺基、芳基胺基、雜烷基、雜芳基、環 狀雜烷基、雜烷基芳基、醯基，Z=OH、OR】、NR2R3、 NR4CO2R5 、NR6(C=0)NR7R8 、C02H 、CO2R9 、 l/c〇NR丨。R" '也炎、2-脒、胍、N-氰基脒、N-氰基胍、四 嗤、CS(OR12) 、S02R13 、c〇R14、CONR15R16、 so2nr17r18、〇(c=o)nr19 ;

Ri、R·2(獨立地’經取代或未經取代）為H、低碳烷基、芳 155861.doc •14· 201140052 基、烯基、炔基、烷基芳基、芳基烷基、烷氧基、芳氧 基、芳基烷氧基、烷氧基烷基芳基、烷基胺基、芳基胺 基、雜烷基、雜芳基、環狀雜烷基、雜烷基芳基或醯基。 例示性化合物包括：

本發明/亦提供冑別用於預防或抑制病#感染《治療性化 合物的方法，其中治療性化合物具有如下結構式K【N 400(二芳基吡啶）：

其中 Rl、R2、R3、R4、R5、、R7、R8、R9、R10(獨立地） 為H、院基、環烧基、芳基、烷基芳基、Br、Cn、F* OH、OR5、NH2、NRnR12、N〇2、机3、s〇R 4、s〇2r 5 cor16 ' co nr17r18 > s〇2nr19r20^nr21^so2 R22 ； w,、w2、w3(獨立地）為 N、CH、CR23 ; X為 S、NH、NR24 ' 0、（CR25R26)ni ; 〜為0至8 ; 155861.doc -15· 201140052 Y為 S、NH、NR27、Ο、（CR28R29)n2 ; n2為0至8 ; Z 為 CH2OH、CH2NH2、CH2NR30R31、C02H、CO2R32、 CONH2、CONR33R34、C = 0(R35)及四 口坐；且 R10至R35(獨立地）為Η、低碳烷基、芳基、烯基、炔基、燒 基芳基、芳基烷基、烷氧基、芳氧基、芳基烷氧基、烷氧 基烧基方基、烧基胺基、芳基胺基、雜烧基、雜芳基、環 狀雜烷基、醯基，或 當共同形成環時，包括（但不限於）哌啶、哌嗪、氧雜環 丁烷、吡咯啶、哌喃、二噁烷或亞曱基二噁烷。 例示性化合物包括：

本發明亦提供識別用於預防或抑制病毒感染之治療性化 合物的方法，其中治療性化合物具有如下結構式 KIN500(N，Ni-聚烷基化尿嘧啶）：

155861.doc -16- 201140052 其中心為Η、烷基、環烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷 基、雜烷基、雜環芳基、環狀雜烷基、S02R,或 so2nr2r3 ； R2、R3(獨立地）為Η、低碳烷基、芳基、烯基、炔基、烷 基务基、方基烧基、烧氧基、芳氧基、芳基烧氧基、烧氧 基烷基芳基、烷基胺基、芳基胺基、雜烷基、雜芳基、環 狀雜烷基、醯基、NH2、OH、CN、Ν〇2、OCF3、CF3、 Br、CM、F、1-脒基、2-脒基、烷基羰基、嗎啉基、哌啶 基、二噁烷基、哌喃基、雜芳基、呋喃基、噻吩基、四 唑、噻唑、異噻唑基、咪唑基、噻二唑、噻二唑s氧化 物、〇塞二唾S，S -二氧化物、β比D坐基、嗯。坐、異^惡唾、。比〇定 基、嘧啶基、喹啉、異喹啉、SR4、sor5、S02R6、 C02R7、COR8、CONR9R1G、CSNRhRi2、SOnNR13R14 ; 或R2、R3共同形成芳族環，諸如苯基、噻吩、呋嚼、咪 。坐、嘆唾、異嚷嗤、嗔唾、異β惡唾、。比洛或二唾、苯并碟 唑、笨并呋喃、苯并噁唑、苯并異噁唑、苯并噻吩、苯并 咪唑、苯并咪唑、苯并吡喃、苯并二噁烷； η為1或2 ; 以至尺…獨立地）為Η、低碳烷基 '芳基、烯基、炔基、烷 基芳基、芳基烷基、烷氧基、芳氧基、芳基烷氧基、烷氧 基烷基芳基、雜烷基、雜芳基、環狀雜烷基； W為Η、低碳烷基、芳基、烯基、炔基、烷基芳基、芳基 烷基、烷氧基、芳氧基、芳基烷氧基、烷氧基烷基芳基、 烷基胺基、芳基胺基、雜烷基、雜芳基、環狀雜烷基、 155861.doc -17- 201140052 C=0、Ο、s、NH、NR15、（CR16R17)n、（C = 0)R18 ;且 Z 為 OH、〇R19、NR20R21、NR22C02R23、NR24(C=0) NR25R26、C02H、C02R27、CONH2、CONR28R29、1-脒、2-脒、胍、N-氰基脒、N-氰基胍及四唑、C02H、 cs(or30)、so2r31、COR32、CONR33R34、S02NR35R36及 nr37或so2 R38。例示性化合物包括：

本發明亦提供識別用於預防或抑制病毒感染之治療性化 合物的方法，其中治療性化合物具有如下結構式 ΚΙΝ600(二芳基磺醯胺）：

其中Ri、R2、R3、R4、R5、R6、R7(獨立地）為Η、低碳烧 基、芳基、稀基、块基、烧基芳基、芳基烧基、烧氧基、 芳氧基、芳基烷氧基、烷氧基烷基芳基、烷基胺基、芳基 胺基、雜烷基、雜芳基、環狀雜烷基、醯基、ΝΗ2、ΟΗ、 CN、Ν〇2、OCF3、CF3、Br、Cl、F、1-脒基、2-脒基、烧 基羰基、嗎啉基、哌啶基、二噁烷基、哌喃基、雜芳基、 155S61.doc ，18 201140052 咬σ南基、d塞吩基、四。坐、。塞〇坐、異°塞β坐基、°米β坐基、°塞二 唑、噻二唑S-氧化物、噻二唑S，S-二氧化物、吡唑基、嗎 °坐、異°惡°坐、°比咬基、喊咬基、啥·#·、異啥淋、SR5、 SOR6、S02R7、C02R8、COR9、CONR10RU、CSNR12R13、 SO„NR14Ri5 ； W為 O、（CRgR，)!！； R8R9(獨立地）為H、低碳烷基、芳基、烯基及炔基； π 為 0 - 7， X 為 NH、NR10 ; Y為 Ο、NH、NRh、S、CH=CH、CR12=CR13 ; Z 為 CH2OH、CH2NH2、CH2NRI4R15、co2h ' C02R16、 CONH2、CONR17R18及四 〇坐；且

Rio、R" ' R12、R13、R14、R15、R16、r17、r18(獨立地）為 H、低碳烷基、芳基、烯基、炔基、烷基芳基、芳基烷 基、烷氧基、芳氧基、芳基烷氧基、烷氧基烷基芳基、烷 基胺基、芳基胺基、雜烷基、雜芳基、環狀雜烷基、醯 基、雜烧基、雜芳基或環狀雜院基。 例示性化合物包括：

ΚΙΝ700(醯亞胺酸硫代醯胺）： 155861.doc -19- 201140052

其中Ri、R2、R3及R4(獨立地）為Η、低碳烷基、芳基、烯 基、炔基、烷基芳基、芳基烷基、烷氧基、芳氧基、芳基 烷氧基、烷氧基烷基芳基、烷基胺基、芳基胺基、ΝΗ2、 OH、CN、NO〗、〇CF3、CF3、Br、Cl、F、1-脒基、2-脒 基、烧基緩基、嗎琳基、派咬基、二°惡烧基、娘喃基、雜 芳基、吱喃基、〇塞吩基、四唾基、〇塞。坐、異。塞σ坐基、咪。坐 基、噻二唑、噻二唑氧化物、噻二唑S，S-二氧化物、吡 唑基、噁唑、異噁唑、吡啶基、嘧啶基、喹啉、異喹啉、 SR5、SOR6、S02R7、C02R8、COR9、CONR10Rn χ CSNR12R13、SOnNR14R15 ; 其中 R5、R6、R7、R8、R9、R10、Rn、R12、R13、R14及 R1S(獨立地）為H、低碳烷基、芳基、烯基、炔基、烷基芳 基、芳基烷基、雜烷基、雜烷基芳基、雜烷基芳基烷基、 雜芳基、雜芳基烷基、環烷基、環烷基芳基 '雜環烷基、 雜環烷基烷基；且 其中R丨6、Ru(獨立地）為H、低碳院基、芳基、烯基、炔 基、烷基芳基、芳基烷基、環烷基、芳基環烷基、雜環烷 基、雜環烷基烷基、雜烷基、雜烷基芳基、芳基雜烷基或 雜烷基芳基烷基；或 當結合在一起時為烷基亞胺、芳基亞胺、NR18、CR18、螺 155861.doc •20· 201140052 烧基螺雜烧基、NH2、OH、CN、N02、OCF3、CF3、 Br ' Cl ' F ; w】、w2(獨立地）為 CH、CRi9r2〇、n、NH、Nr2i、〇、 SO、S02 ;

Vi為C或N ; z 為 C02R22、c〇R22、c〇NR22R23、c=S(NR22R23)、 SOnR22、1-脒基、2_脒基、四唑、異羥肟酸、脲基、硫脲 基、胺甲酿基、N-氰基脒、N-磺醯胺基脒、NH2、OH、 CN、N〇2、〇CF3、CF3、Br、Cl、F、1-脒、2-脒、烧基羰 基、嗎啉、哌啶、二噁烷、哌喃、雜芳基、呋喃基、噻吩 基、四唑、噻唑、異噻唑、咪唑、噻二唑、噻二唑s_氧化 物、°塞一 °坐S，S -二氧化物、α比β坐、U惡B坐、異D惡唾、吨〇定 基、嘧啶基、喹唑啉、喹啉、異喹啉、sr22、SOR22、 S02R22 ' C02R22 ' COR22 ' CONR22R23 ' CSNR22R23 ' SOnNR22R23 ; 其中 R18、R19、R20、R21、R22、R23、R24、R25(獨立地）為 H、低碳烷基、芳基、烯基、炔基、烷基芳基、芳基貌 基、雜烧基、雜烧基芳基、雜烧基芳基烧基、雜芳基、雜 芳基烷基、環烷基、環烷基芳基、雜環烷基、雜環烷基烷 _ 基。 例示性化合物包括： 155861.doc •21 · 201140052

如本文中單獨或組合使用，術語「烷基氧基」或「烷氧 基」係指包含烷基醚基之官能基。烷氧基之實例包括（但 不限於）甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧 基、異丁氧基、第二丁氧基、第三丁氧基及其類似基團。 術語「烷基」、「烯基」及「炔基」係指經取代及未經取 代之烷基、烯基及炔基。術語「烷基」係指包含含有僅由 單鍵連接之1至20個碳原子且無任何環狀結構之直鏈或分 支鏈烴的官能基。烷基可如本文中定義視情況經取代。烷 基之實例包括（但不限於）曱基、乙基、正丙基、異丙基、 正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、戊基、異戊基、 己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、 十二烧基、十四烧基、十五烧基、十六院基、十七烧基、 十八烷基、十九烷基、二十烷基及其類似基團。 經取代之烧基、烯基及炔基係指經1至5個來自包括以下 基團之群的取代基取代的貌基、稀基及块基：H、低碳烧 基、芳基、烯基、炔基、芳基烷基、烷氧基、芳氧基、芳 基烷氧基、烷氧基烷基芳基 '烷基胺基、芳基胺基、 NH2、OH、CN、N02、OCF3、CF3、F、1-脒、2_脒、烷基 135861.doc -22· 201140052 羰基、嗎啉基、哌啶基、二噁烷基、哌喃基、雜芳基、呋 喃基、噻吩基、四唑基、噻唑基、異噻唑基、咪唑基、噻 二11坐基、嗟二吐S-氧化物、嗔二嗤s，S-二氧化物、〇比唾 基、噁唑基、異噁唑基、吡啶基、嘧啶基、喹啉基、異嗤 琳基、SR、SOR、S02R、C02R、COR、CONR'R"、 CSNR'R"、SOnNR'R·'。 如本文中單獨或組合使用，術語「炔基」係指包含含有 2至20個碳原子且具有一或多個碳-碳參鍵且無任何環狀結 構之直鏈或分支鏈煙的官能基。炔基可如本文中定義視情 況經取代。炔基之實例包括（但不限於）乙炔基、丙炔基' 羥基丙炔基、丁炔基、丁炔_丨·基、丁炔_2_基、3_甲基丁 炔-1-基、戊炔基、戊炔-1-基、己炔基、己炔_2_基、庚炔 基、辛炔基、壬炔基、癸炔基、十一炔基、十二炔基、十 三炔基、十四炔基、十五炔基、十六炔基、十七炔基'十 八炔基、十九炔基、二十炔基及其類似基團。 如本文中單獨或組合使用之術語「伸烷基」係指自在兩 個或兩個以上位置處連接之直鏈或分支鏈飽和烴獲得之飽 和脂族基，諸如亞甲基（_C2_)。除非另有說明，否則術語 「烷基」可包括「伸烷基」。 如本文中單獨或組合使用之術語「烷基羰基」或「烷醯 基」係指包含烷基經由羰基連接至母分子部分的官能基。 烷基羰基之實例包括（但不限於）甲基羰基、乙基羰基及其 類似基團。 術語「伸炔基」係指在兩個位置處連接之碳_碳參鍵， I55861.doc •23· 201140052 諸如伸乙絲（m々）。除非 「炔基」可包括「伸炔基」。 有說明’否則術語 如本文中單獨或組合使用 弋Γ 2t 方基」、「烴基芳基」 ρ 土！」係指包含具有3至12個碳原子之共軛環狀分 子：狀結構之經取代或未經取代之芳族 :為：環、雙環或多環且可視情況包括⑴個其他= 2 ’ _如㈣基、環稀基、雜環絲、雜料基或雜芳 土。術浯「芳基」包括(但不限於)苯基(笨次甲基)、噻吩 基、。引絲、萘基、甲苯基、二甲苯基、葱基、菲基、奠 基、聯苯、萘基、！·甲基蔡基、二氫危基、危基、蒽基、 :基、丙烯合萘基、菲基、苯并[a]蒽基、苯并⑷菲基、 筷基、第蒽基、芘基、并四苯基(稠四苯基）、聯伸三苯 基、蒽嵌蒽基、苯并芘基、苯并㈤芘基、苯并㈤苐蒽 基、苯并[ghi]茈基、笨并⑴苐蒽基、苯并[k]第蒽基、碗 烯基（corannulenyl)、蔻基、聯二蔻基（dic〇r〇nylenyi)、螺 烯基（helicenyl)、稠七苯基、稠六苯基、莪基、稠五苯 基、茜基、茈基及聯四苯基。經取代之芳基係指經1至5個 來自包括以下基團之群的取代基取代之芳基：H、低碳烷 基、芳基、烯基、炔基、芳基烷基、烷氧基、芳氧基、芳 基院氧基、烷氧基烷基芳基、烷基胺基、芳基胺基、 NH2、OH、CN、no2、0CF3、CF3、Br、a、F、卜脒基、 2 -脉基、貌基幾基、嗎琳基、派咬基、二^惡院基、略喃 基、雜芳基、呋喃基、噻吩基、四唑基、噻唑、異噻唑 基、咪嗤基、售二唑、塞二唑S-氧化物、噻二唑S，S-二氧 155861.doc -24· 201140052 化物、°比》坐基、噁唑、異噁嗤、。比咬基、喊咬基、唾咐、 異喹啉、SR、SOR、S02R、C02R ' COR、CONRR、 CSNRR、SOnNRR。 如本文中單獨或組合使用之術語「低碳芳基」係指包含 具有3至6個碳原子之共軛環狀分子環狀結構之經取代或未 經取代之芳族烴的官能基。低碳芳基之實例包括（但不限 於）苯基及萘基。 如本文中單獨或組合使用之術語「羧基」係指官能基 -C(=0)〇H或相應「羧酸根」陰離子_c(=〇)〇…實例包括 (但不限於）甲酸、乙酸、草酸、苯曱酸。「〇_羧基」係指 具有通式RCOO之羧基，其中R為有機部分或基團。「匕羧 基」係指具有通式C00R之羧基，其中汉為有機部分或美 團。 …土 如本文中單獨或組合使用之術語「環烷基」、「碳環狀烷 基」或「碳環烷基」係指包含碳環結構十具有僅由碳-碳 單鍵連接之3至12個碳原子之非共軛環狀分子環結構之: 取代或未經取代之非㈣㈣官能基ϋ基可 、、 雙環或多環且可視情況包括1至3個其他環結構，諸^ 基、雜芳基、環烯基、雜環烷基或雜環烯基。 如本文中單獨或組合使用之術語「低碳環 含碳環結構令具有僅由碳 土 J係指包 ，僵由奴-奴早鍵連接之3至6個 非共輛環狀分切結構之經取代絲絲 非> 烴的官能基。低磁护* & 干嗜非方族 h低石反％烷基之實例包括（但 環丁基、環戊基及環己基。 於)％丙基、 I5586I.doc -25- 201140052 如本文中所用，術語「官能基」係指分子内負責該等分 子之特徵性化學反應的特定原子團。 如本文中單獨或組合使用之術語「雜烷基」係指包含含 有1至20個僅由單鍵連接之原子之直鏈或分支鏈烴的官能 基，其令鏈令至少一個原子為碳且鏈申至少一個原子為 〇、S、N或其任何組合。雜烷基可完全飽和或含有丨至^個 不飽和度。非碳原子可位於雜烷基之任何内部位置且至多 兩個非碳原子可毗連，諸如_CH2_nh_〇ch^此外，非碳 原子可視情況經氧化且氮可視情況經四級銨化。 如本文中單獨或組合使用之術語「雜芳基」係指包含具 有3至12個原子之共軏環狀分子環結構之經取代或未經取 代之芳族烴的官能基，其十環結構中至少一個原子為碳且 環結構中至少-個科為〇、S、N或其任何組合。雜芳基 可為單環、雙環或多環且可視情況包括1至3個其他環結 構’+諸如芳基、環烧基、環烯基、雜環烧基或雜環稀基。 雜芳基之實例包括（但不限於）。丫<基、苯引嗓基、笨并 咪。坐基、苯并異°惡唾基、苯并二氧雜環己稀基、二氫苯并 二氧雜環己縣、苯相：氧雜環戊絲、i，3_苯并間二 氧雜環戊烯基、苯并咬喃基、苯并異㈣基、笨并㈣ 基、苯并售吩基、苯并[C]B塞吩基、苯并三唾基、苯并過二 。坐基、笨并嗯唾基、笨并嗟二。坐基、苯并嘆嗤基 '苯㈣ 吩基、咔唑基、色’基、啐啉基、二氫畤啉基、香豆素 基、二苯并咬喃基"夫喃并"比咬基、吱口南基、t朵嗪基了 吲絲、二氫十朵基、咪唾基、十坐基、異苯并咬喃基、 155861.doc -26 - 201140052 異吲哚基、異吲哚啉基、二氫異吲哚基、異喹啉基、二氫 異喹啉基、異噁唑基、異噻唑基、噁唑基、噁二唑基、啡 琳基、啡η定基、嗓吟基、。底喃基、n比嗓基、η比。坐基、D比咬 基、嘧咬基、達嗓基、°比嘻淋基、η比嘻基、η比嘻并π比咬 基、啥琳基、啥"若琳基、啥〇坐琳基、四氫啥琳基、四。坐并 健嗪基、四氫異喹琳基、嗟吩基、嘆唑基、噻二唑基、售 吩并°比°定基、嗟吩基（1；1^1171)、°塞吩基（111丨〇01^1171)、三<1坐 基、11山基及其類似基團。 如本文中單獨或組合使用之術語「低碳雜芳基」係指包 含具有3至6個原子之共軛環狀分子環結構之經取代或未經 取代之單環或雙環芳族烴的官能基，其中環結構中至少一 個原子為碳且環結構中至少一個原子為〇、S、；^或其任何 組合。 如本文中單獨或組合使用之術語「羥基」係指官能基羥 基（-ΟΗ” 如本文中單獨或組合使用之術語「側氧基（οχο)」係指 官能基=0。 “曰 如本文中所用，術語「脊椎動物」包括所有活脊椎動 物，諸如（但不限於）哺乳動物、人類、鳥類、犬類1 類、家畜、農畜、放養畜群等。 一 士本文中所用，醫藥組合物」包含至少—種本文中揭 示之化合物連同適於所選投藥模式的一或多種醫藥: 接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。 醫藥組合物可製成（但不限於）固體形式（包括顆粒劑 155861.doc •27- 201140052 劑或栓劑）或液體形式（例如溶液、懸浮液或乳液）。醫藥組 合物可經受習知醫藥操作(諸如滅菌)及/或可含有習知佐 劑，諸如防腐劑、穩定劑、濕潤劑、乳化劑、緩衝劑等。 用於經口投與之固體劑型可包括膠囊、鍵劑、丸劑、散 劑及顆粒劑。在該等固體劑型中，活性化合物可血至少一 種惰性稀釋劑(諸如蔬糖、乳糖或殿粉)混合。如同在正常 實踐中’該等劑型亦可包含除惰性稀釋劑以外的其他物 質：例如潤滑劑，諸如硬脂酸鎮。在膠囊、鍵劑及丸劑之 情況下，劑型亦可包含緩衝劑。鍵劑及丸劑可另外製備成 具有腸溶衣》 用於經口投與之液體劑型可包括醫藥學上可接受之乳 液★液、懸汁液、糖漿及驰劑，其含有此項技術中常用 之惰性稀釋劑，諸如水。該等組合物亦可包含佐劑，諸如 濕潤劑、甜味劑、調味劑及芳香劑。醫藥組合物可含有一 種以上本發明之實施例。用於經口投與之製劑可經適當調 配以提供活性化合物之控制釋放。 對於頰内投與’組合物可呈以習知方式調配之錠劑或口 含錠形式》 化合物可經調配以供藉由注射(例如藉由快速注射或輪 注）非經腸投與。用於注射之調配物可以單位劑型提供， 例如於玻璃安瓿或多劑量容器（例如玻璃小瓶）中。用於注 射之組合物可呈諸如於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液 或礼液形式，且可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑、保 藏劑及/或分散劑。或者，活性成分可呈粉末形式以供使 155861.doc -28- 201140052 用前用適合媒劑（例如無菌無熱原質水）復原。 除上述調配物外’化合物亦可調配為儲積式製劑。該等 長效調配物可藉由植入或肌肉内注射來投與。 對於經鼻或經肺投與或任何其他吸入投與，根據本發明 使用之化合物適宜藉由使用適合推進劑（例如二氯二氣甲 燒、三氣氟曱烧、二氣四氟乙烷、二氧化碳或其他適合氣 體或氣體混合物）以加壓包裝或噴霧器呈遞之氣霧劑噴霧 形式傳遞。 本文中揭示之化合物及方法可與當前研發或使用之其他 療法相加或協同。舉例而言，病毒唾及干擾素_a(IFN_a)當 組合使用時提供HCV感染之有效治療。其組合功效可超過 任一藥物產品單獨使用時之功效。本發明組合物可單獨投 與或與IFN-a、病毒唑及/或正在研發之針對病毒目標（病毒 蛋白酶、病毒聚合酶、病毒複製複合物之組裝）及宿主3 標（病毒加工所需之宿主蛋白酶、病毒目標（諸如NS5A)磷 酸化所需之宿主激酶及有效利用病毒内部核糖體進入位點 所需之宿主因子的抑制劑或IRES)之多種小分子組合或結 合投與。 本文中揭示之化合物及方法可與以下（但不限於）組合或 結合使用：金剛烷抑制劑、神經胺糖酸酶抑制劑、a干擾 素、非核苷或核苷聚合酶抑制劑、NS5A抑制劑、抗組織 胺、蛋白酶抑制劑、解螺旋酶抑制劑、P7抑制劑、進入抑 制劑、IRES抑制劑、免疫刺激劑、HCV複製抑制劑、親環 素A抑制劑（cycl〇phiHrl a inhibitor)、A3腺苷促效劑及 155861.doc • 29· 201140052 microRNA抑制劑。 可與本文中揭示之化合物及方法組合或結合投與之細胞 激素包括（但不限於）IL-2、IL-12、IL-23、IL-27或 IFN-γ。 可獲得或將可獲得之可能與本文中揭示之化合物及方法組 合或結合投與之新穎HCV藥物包括（但不限於）ACH-1625(Achillion) » 糖基化干擾素（Alios Biopharma); ANA598、ANA773(Anadys Pharm) ； ATI-0810(Arisyn Therapeutics) ; AVL-18l(Avila Therapeutics) ； LOCTERON® (Biolex) ; CTS-1027(Conatus) ; SD-101(Dynavax Technologies); 氣味 0坐(Clemizole)(Eiger Biopharmaceuticals) ; GS-9190(Gilead Sciences) ; GI-5005(GlobalImmune BioPharma); 雷西莫特（Resiquimod)/R-848(Graceway Pharmaceuticals); 阿特費羅 a-2b(Albinterferon alpha-2b)(Human Genome Sciences) ； IDX-184 ' IDX-320 ' IDX-375(Idenix) ； IMO-2125(Idera Pharmaceuticals) ； INX-189(Inhibitex) ； ITCA-638(Intarcia Therapeutics) ； ITMN-191/RG7227(Intermune)； ITX-5061 ' ITX-4520(iTherx Pharmaceuticals) ί MB11362 (Metabasis Therapeutics);巴韋西布（Bavituximab) (Peregrine Pharmaceuticals) ; PSI-7977、RG7128、PSI-938(Pharmasset) ; PHX1766(Phenomix)；石肖。坐尼特 (Nitazoxanide)/ALINIA®(Romark Laboratories) ; SP-30(Samaritan Pharmaceuticals) ； SCV-07(SciClone) ； SCY-635(Scynexis) ; TT-033(Tacere Therapeutics);偉拉 米定 (Viramidine)/ 他瑞韋林（taribavirin)(Valeant Pharmaceuticals); 155861.doc •30· 201140052 特拉瑞韋（Telaprevir)、VCH-759、VCH-916、VCH-222、 VX-500、VX-813(Vertex Pharmaceuticals);及 PEG-INF X(Zymogenetics) o 可獲得或將可獲得之可能與本文中揭示之化合物及方法 組合或結合投與之新穎流感及西尼羅河病毒藥物包括（但 不限於）神經胺糖酸酶抑制劑（帕拉米韋（Peramivir)、蘭那 米韋（Laninamivir));三合一療法-神經胺糖酸酶抑制劑病 毒0坐、金剛胺（amantadine)(ADS-8902);聚合酶抑制劑（法 匹拉韋（Favipiravir));反轉錄酶抑制劑（ANX-201);吸入 聚葡萄胺糖（ANX-211);進入/結合抑制劑（結合位點模擬 劑，複希得（Flucide));進入抑制劑（流感酶（Fludase));融 合抑制劑（用於西尼羅河病毒之MGAWN1);宿主細胞抑制 劑（羊毛硫抗生素（丨antibiotics));裂解RNA基因組（RNAi、 RNAse L);免疫刺激劑（干擾素，阿爾芬龍-LDO(Alferon-LD0);神經激肽1促效劑、霍爾佩拉（Homspera)、干擾素 阿爾芬龍N，用於西尼羅河病毒）；及TG21。 可獲得之可能與本文中揭示之化合物及方法組合或結合 投與的其他用於治療流感及/或肝炎之藥物包括（但不限 於）： 表1·肝炎及流感藥物 商標名 屬名 批准適應症 Pegasys 佩格費羅 a-2a(PEGinterferon alfa-2a) C型肝炎、叶'省 Peg-Intron 佩格費羅a-2b C型肝炎 Copegus 病毒唑 C型肝炎 Rebetol 病毒唾 C型肝炎 I55861.doc -31- 201140052 病毒唾 c型肝炎 Tamiflu 奥斯他偉(Oseltamivir) A型流感、B型流感、c 型流感 Relenza 紫那米偉(Zanamivir) A型流感、B型流感、C 型流感 金剛胺 A型流感 金剛乙胺(Rimantadine) A型流感 該等藥劑可併入作為同一醫藥組合物之部分或可與本發 明化合物分開投與（同時或根據另一治療方案投與）。此 外，本發明之化合物或組合物可用作其他療法之佐劑。 本文中揭示之化合物及方法可與其他化合物及方法相加 或協同以允許疫苗研發。由於其抗病毒及免疫增強性質， 該等化合物可用於影響預防性或治療性疫苗接種。化合物 無需與其他疫苗組分同時或組合投與便可有效。化合物之 疫苗應用不限於預防或治療病毒感染，而且歸因於化合物 引起之免疫反應之一般性質亦可涵蓋所有治療性及預防性 疫苗應用。 如一般技術者應理解，疫苗可針對病毒、細菌感染、癌 症等且可包括（但不限於）活減毒疫苗（LAIV)、不活化疫苗 (IIV ;死病毒疫苗）、次單位（裂解疫苗）；次病毒粒子疫 苗；經純化蛋白質疫苗；或DNA疫苗中之一或多者。適當 佐劑包括（但不限於）以下中之一或多者：水/油乳液、非離 子型共聚物佐劑（例如CRL 1〇〇5(〇ptivax; Vaxcel Inc， N〇rcross，Ga.)、磷酸鋁、氫氧化鋁、氫氧化鋁及氫氧化鎂 之水性懸浮液）、細菌内毒素、聚核苷酸、聚電解質、親 知性佐劑及合成胞壁醯二肽（n〇rMDp)類似物（諸如N-乙醯 155861.doc -32- 201140052 基-去甲基-胞壁醯-L-丙胺醯基_D_異麩醯胺酸、N_乙醯基_ 胞壁醯_(6-0-硬脂醯）-L-丙胺醯基異麩醢胺酸或N-乙二 醇-胞壁醯-LaAbu-D-異麩醯胺酸（Ciba_Geigy Ltd.))。 包含本發明化合物之醫藥組合物可調配為多種形式，例 如液體、凝膠、凍乾形式或壓縮固體。較佳形式將視所治 療之特定適應症而定且一般技術者將顯而易知。在一實施 例中，所揭示之RIG-I促效劑包括用於經口傳遞之調配 物，其可為採用簡單藥物化學過程之小分子藥物。 投與本發明調配物可以多種方式進行，包括（但不限於） 經口、皮下、靜脈内、腦内、鼻内、經皮、腹膜内、肌肉 内、肺内、勒内、經陰道、經直腸、眼内或以任何其他可 接受之方式。可使用此項技術令熟知的技術（諸如泵（例如 皮下滲透泵）或植入）藉由輸注（但亦可接受快速注射）連續 才又與調配物。在一此情況下，七用 一11况下凋配物可以溶液或噴霧形式 直接施用。 醫藥組合物之實例為設計用於非經腸投藥之溶液。儘管 在許多情況下醫藥溶液調配物以適於直接使用之液體形式 提供，但㈣非經腸靠物亦可以冷;東或;東乾形式提供， 在前-種情況下’組合物在使用前必須解;東。後一種形式 通常用於在多種儲存條件下增強組合物中所含活性化合物 之穩定性，如-般技術者認識到束乾製劑通常比其液體對 應物更穩定。在使用前藉由添加一或多種醫藥學上可接受 之適合稀釋劑（諸如（但不限於）無菌 町用水或無菌生理食 |水溶液）來復原該等凍乾製劑。 155861.doc -33· 201140052 非經腸製劑可藉由適當時將具有所需純度之化合物與一 或多種此項技術中常用之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑 或穩定劑（其統稱為「賦形劑」，例如緩衝劑、穩定劑、防 腐劑' 等張劑、非離子型清潔劑、抗氧化劑及/或其他混 雜添加劑）混合製備為凍乾調配物或水溶液以供儲存。 緩衝劑有助於維持pH值處於接近生理條件之範圍内。其 通常以約2 mM至約50 mM範圍内之濃度存在。用於本發明 之適合緩衝劑包括有機酸及無機酸及其鹽，諸如檸檬酸鹽 緩衝劑（例如擰檬酸單鈉_檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸稽 酸三鈉混合物、檸檬酸·檸檬酸單鈉混合物等）、丁二酸鹽 緩衝劑（例如丁二酸-丁二酸單鈉混合物、丁二酸-氫氧化叙 混口物、丁—酸-丁二酸二鈉混合物等）、酒石酸鹽緩衝齊 (例如酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸_酒石酸鉀混合物、 酒石酸-氫氧化納混合物等）、反丁稀二酸鹽緩衝劑（例如反 丁烯二酸-反丁烯二酸單鈉混合物、反丁烯二酸·反丁烯二 酸二鈉混合物、反丁烯二酸單鈉_反丁烯二酸二鈉混合物 等）、葡糖酸鹽緩衝劑（例如葡萄糖酸-葡萄糖酸鈉混合物' 葡萄糖酸-氫氧化鈉混合物、葡萄糖酸_葡萄糖酸鉀混合物 等）、草酸鹽緩衝劑（例如草酸_草酸鈉混合物、草酸-氫氧 化納混。、草I _草酸钟混合物等）、乳酸鹽緩衝劑（例如 乳酸·乳酸納混合物、乳酸·氫氧化納混合物、乳酸-乳酸斜 混合物等）及乙酸鹽緩衝劑（例如乙酸_乙酸鈉混合物、乙 鲛-氫氧化鈉混合物等）。亦可使用磷酸鹽緩衝劑、組胺酸 緩衝劑及三曱基胺鹽，諸如Tds。 155861.doc -34- 201140052 可添加防腐劑以阻止微生物生長且通常以約0.2。/。-1〇/〇 里、:』、、加。用於本發明之適合防腐劑包括（但不限於） 苯齡苯甲醇、間甲苯紛、對經基苯甲酸甲S旨、對經基苯 甲酸丙S旨' 氯化十八烧基二甲基苯p基敍、自化苯甲煙敍 (例如氣化苯甲烴銨、溴化苯曱烴銨或碘化苯甲烴銨)、氣 化六烴季銨、對羥基苯甲酸烷基酯（諸如對羥基苯甲酸甲 醋或對羥基苯f酸丙酯）、兒茶齡、間苯二齡、環己醇及3_ 戊醇。 可添加等張劑以韻液體組合物之等張性1包括（但不 限於)多元糖醇’較佳為三元或更高級糖醇，諸如甘油、 赤/11糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露糖醇。 考慮八他成刀之相對1，多元醇可以〇丨重量％與h重量％ 之間，通常1重量％至5重量％的量存在。 穩定劑仙功能範圍為增積劑至使治㈣溶解或有助於 防止！ !·生或與谷器壁黏著之添加劑的廣泛類別之賦形劑。 典型穩；t’為多元糖醇（上文中列舉）；胺基酸，諸如精 胺酸、離胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、 丙胺酸 '烏胺酸、L-白胺酸、2_笨丙胺酸、麩胺酸、蘇胺 酸等；有機糖或輯，諸如乳糖、㈣糖、水蘇糖、甘露 糖醇、山梨糖㈣糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘 油及其類似物’包括環醇，諸如環己六醇；聚乙二醇；胺 基酸聚合物；含硫還原劑，諸如尿素、麩耽甘肽'硫辛 酸 '氫硫乙酸納、硫甘油、α_單硫甘油及硫代硫酸納；低 分子量多肽（亦即<1〇個殘基）；蛋白質，諸如人類血清白 155861.doc -35· 201140052 蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物， 諸如聚乙烯吼洛啶酮；單醣，諸如木糖、甘露糠、果糖及 葡萄糖；雙醣’諸如乳糖、麥芽糖及蔗糖；三醣，諸如棉 籽糖’及多醣’諸如聚葡萄糖。以活性化合物重量計，穩 定劑之含量範圍通常為0丨至10 000重量份。 其他混雜賦形劑包括增積劑或填充劑（例如澱粉）、螯合 劑（例如EDTA)、抗氧化劑（例如抗壞血酸、甲硫胺酸、維 生素E)及共溶劑。 活性成分亦可截留於例如藉由凝聚技術或界面聚合製備 之微囊（例如羥甲基纖維素、明膠或聚（甲基丙烯酸甲酯）微 囊）中、膠態藥物傳遞系統（例如脂質體、白蛋白微球體、 微乳液、奈米粒子及奈米膠囊）中或巨乳液中。該等技術 揭示於Remington, The Science and Practice of Pharmacy， 第 21 版，LipPinc〇tt Williams & Wilkins出版，A Wolters Kluwer Company，2005 中 ° 用於活體内投與之非經腸調配物通常為無菌的。此可例 如藉由經由無菌過濾膜過濾容易地實現。 持續釋放製劑之適合實例包括含有化合物或組合物之固 體疏水性聚合物之半滲透基質’該等基質具有適合形式， 諸如膜或微囊。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠 (例如聚（甲基丙烯酸2-羥基乙酯）或聚（乙烯醇））、聚乳酸交 醋、L-麩胺酸與L-麩胺酸乙酯之共聚物、不可降解乙稀_ 乙酸乙烯酯、可降解乳酸_乙醇酸共聚物（諸如 PROLEASE®技術或LUPRON DEPOT®(由乳酸_乙醇酸共聚 155861.doc -36 - 201140052 物及乙酸哀丙山 挪、n 儿 ^林以叩⑺丨丨心acetate)構成之可注射微球 體）及聚g·； w < -么基丁酸。儘管諸如乙烯-乙酸乙烯酯及

乳酉夂-乙醇g參夕耳χ A 、 久义^合物使得能夠長期（諸如多達100天或100 天以上）釋放八了 77于’但某些水凝膠在較短時段内釋放化合 物。 7<彳又與化合物及組合物為本發明之一種預期實踐。對 ;丄口投與’醫藥組合物可呈固體或液體形式，例如呈膠 囊錢劑、散劑、顆粒、懸浮液、乳液或溶液形式。醫藥 物較佳製備成含有指定量活性成分之劑量單位形式。 ;類或其他脊椎動物之適合日劑量可根據患者狀況及 "他因素廣泛變化’但可由__般技術者使用常規方法確 定。 :在固體劑型令’活性化合物可與至少一種惰性稀釋劑 (諸如蔗糖、乳糖或澱粉）混合。如同正常實踐，該等劑型 亦可包含其他物質，例如潤滑劑，諸如硬脂酸鎂。在膠 囊、錠劑及丸劑之情況下，劑型亦可包含緩衝劑。鍵劑及 丸劑可另外製備成具有腸溶衣。 化合物或組合物可與佐劑（諸如乳糖、蔗糖、澱粉粉 末、烷酸之纖維素酯、硬脂酸、滑石、硬脂酸鎂、氧化 鎂、磷酸及硫酸之鈉鹽及鈣鹽、阿拉伯膠'明膠、褐藻酸 鈉、聚乙烯-吡咯啶及/或聚乙烯醇）混合且進行製錠或封裝 以供習知投藥。或者，其可溶解於生理食鹽水、水、聚乙 二醇、丙二醇、乙醇、油（諸如玉米油、花生油、棉籽油 或芝麻油）、黃蓍膠及/或各種緩衝液中。其他佐劑及投藥 15586l.doc -37- 201140052 模式為醫藥技術中所熟知。載劑或稀釋劑可包括時間、 物質，諸如單獨或與蠟組合之單硬脂酸甘油酯或二二 甘油酯，或此項技術中熟知的其他物質。 曰 以下實例描述本文中揭示之方法之最佳化。包括以下實 例以說明本發明之特定實施例…般技術者應瞭解，實例 中揭示之技術代表本發明者發現之在實施本發料發揮良 好作用之技術及組合物，且因此可視為構成本發明實踐之 較佳模式。然而，根據本發明，一般技術者應瞭解，在不 偏離本發明之精神及範疇下，可在所揭示之特定實施例中 進行多種變化且仍然獲得類似或相似結果。 實例提供本發明之測試用於RJGJ促效劑之化合物及/或 其抗病毒活性之活體外方法。其他可使用之活體外病毒感 染模型包括（但不限於）黃病毒，諸如牛腹瀉病毒、西尼羅 河病毒及GBV-C病毒，其他RNA病毒，諸如呼吸道融合性 病毒，及HCV複製子系統（32)。任何勝任病毒複製之適當 培養細胞均可用作抗病毒檢定。 實例 在實例及本發明中’ TSA-A與KIN200為相同化合物， TSA-B與尺11^100為相同化合物且丁从_〇與1<^600為相同化 合物。 實例1. 發展報導Huh7細胞株以利用自基因組DNA選殖之ISG54 啟動子穩定表現螢火蟲螢光素酶。該等細胞株可對RIG-I 介導之刺激（包括仙台病毒感染）以及IFN處理具有反應性 155861.doc -38· 201140052 且用於經由小分子文庫之高產量篩選（HTS)識別RIG-Ι促效 劑。關於用於HTS中之細胞生長及檢定條件最佳化報導細 胞株之誘導以獲得最敏感及可再現之結果。此外，研發使 用肌動蛋白啟動子表現海腎（Renilla)螢光素酶之對照細胞 株作為陰性對照。複篩（counter screen)中利用肌動蛋白細 胞株以識別引起整體基因表現中之非特異性變化之化合 物。 選殖ISG54及β-肌動蛋白啟動子構築體：使用以下引子 自儲備基因組DNA擴增肌動蛋白、ISG54及ISG56啟動子序 列： ISG54 For_Sacl ： GGGAGCTCCTCCGGAGGAAAAAGAGTCC(SEQ [D NO： 1) ISG54 Rev_EcoRV ： GGGATATCGCAGCTGCACTCTTGAGAAA(SEQ ID NO： 2) ISG56 For_Sacl ： GGGAGCTCATGGTTGCAGGTCTGCAGTT(SEQ ID NO: 3) ISG56 Rev_EcoRV ： GGGATATCTCTGGCTATTCTGTCTTGTGGA(SEQ ID NO： 4) 肌動蛋白 5, SacI : GGGAGCTCCCCAAGGCGGCCAAC(SEQIDNO: 5) 肌動蛋白 3'Ηΐη(1ΙΙΙ : GGAAGCTTGGTCTCGGCGGTGGT(SEQIDNO:6) 使用鉑PCR反應擴增序列片段。純化PCR片段，用SacI 及EcoRV或Hindlll消化且連接至Promega螢光素酶載體 中。將肌動蛋白啟動子序列連接至含有潮黴素 (hygromycin)可選擇標記之pGL4.76載體中。將ISG54及 155861.doc 39· 201140052 ISG56啟動子序列連接至含有嘌吟黴素（puromyCin)可選擇 標記之pGL4.17載體中。藉由定序及質體圖確認構築體。 產生穩定細胞株：在6孔板中以2,5 X 105個細胞/孔之密度 接種Huh7細胞且在正常生長條件下生長隔夜，隨後轉染。 使用來自Invitrogen之脂質體（Lipofectin)及Plus試劑用2 pg 適當載體DNA轉染細胞。使用invitrogen方案中提供之建 議試劑體積及比率進行轉染。轉染後，使細胞生長至匯合 (24-48小時）且接著將各孔分至兩個cm培養jni中。細胞 生長24小時且接著用含有適當抗生素之選擇性培養基置換 培養基。測定用於Huh7細胞之抗生素之最佳濃度為400 pg/mL G418(嘌呤黴素）及250 Mg/mL潮黴素。細胞在抗生 素存在下生長直至80°/。細胞在選擇壓力下死亡且出現個別 群落。自板用胰蛋白酶處理含有超過5〇個細胞之群落，轉 移至96孔板且在抗生素存在下生長（此階段僅2〇_4〇%之純 系存活）。使存活純系生長且在其達到8〇%匯合時，在正常 條件下但利用含有抗生素之培養基進行繼代。所有穩定細 胞株純系在液氮中冷凍且納入細胞庫中。 螢光素酶檢定：Huh7細胞在正常生長條件下生長且在96 孔板中以1 X 1 〇4個細胞/孔之密度接種並生長至8〇%匯合（通 吊2 0小時）。％性對照孔用仙台病毒感染或用指定濃度之 IFN處理且在37度下再培育18-24小時。移除培養基且細胞 用PBS洗務一次》添加被動溶解緩衝液（passive iysis bnffer)(promega)至孔中（1〇〇 μΙ〇且在室溫下培育細胞1〇分 鐘。溶解產物轉移至不透明白色光學96孔板中（1〇 pL)且用 155861.doc -40- 201140052

Berthold光度計對板進行讀取。光度計自動向各孔注射確 定體積（50-100 pL)之螢火蟲受質或雙重螢光素酶試劑（均 來自Promega)且讀取螢光素酶活性持續丨_丨〇秒。原始資料 以矩陣格式輸出至待儲存於伺服器上之excel試算表。或 者，使用單步驟試劑（Promega Steady-Glo或Bright-Glo)。 對於該方案’細胞直接接種於白色不透明組織培養板（BD Bioscience)上且如上所述進行刺激。各孔含有1〇〇 含細 胞之培養基。再向各孔中直接添加25_1〇〇 Pr〇mega試劑 且培育該板5-30分鐘，隨後如上所述用光度計進行螢光素 酶定量β 報導細胞株合成。用含有驅動螢火蟲螢光素酶表現的 ISG54或ISG56啟動子之報導構築體短暫轉染Huh7細胞且 在仙台病毒感染或IFN處理後測試螢光素酶誘導。仙台病 毒感染引起IRF-3之活化及ISRE序列之結合/活化，而ifn 僅引起ISRE序列活化。ISG54顯示低基本表現量（無誘導） 而利用仙台病毒或IFN處理顯示表現增加》相反，ISG56顯 示較高基本表現量而利用仙台感染或IFN處理僅顯示中度 誘導（圖1)。 為解決短暫表現研究中之高變化性（最可能歸因於轉染 效率之差異），使用肌動蛋白對照構築體校正表現量（， Huh7細胞用肌動蛋白及ISG 54構築體共轉染且接著使用 Dual-Glo螢光素酶試劑（Promega)分析螢火蟲螢光素酶及海 腎螢光素酶產生。當使用Fluc:Rluc比率計算經校正之榮光 素酶表現時’誘導程度可再現（由圖2中展示之較小誤差條 155861.doc -41· 201140052 證明）。穩定細胞株之產生消除由轉染效率差異造成之變 化性。為分析螢光素酶報導體之誘導性，在不同IFN濃度 下測s式細胞株。顯示表現ISG54啟動子（而非isg56啟動子） 之細胞對遞增量之IFN展現劑量反應且對低濃度IFN(〇 5 IU/mL)具有反應性，使其成為用於篩選目的之有吸引力的 細胞株（圖2)。 以選殖方式分離含有ISG54報導構築體之整合複本之 Huh7細胞株且測試受仙台病毒感染時之螢光素酶表現，如 圖3中所示。在兩個於三重複孔中進行之獨立實驗中測試 螢光素S#誘導以產生標準偏差。細胞株2、4由於其低基本 表現量及可再現誘導（高出背景15倍）而選用於進一步表 徵。對所有IS G 5 4穩定細胞株進行繼代且冷;東於細胞庫 中。細胞株2B6及2B7為在海腎螢光素酶基因上游具有肌 動蛋白啟動子之整合複本的Huh7細胞（應注意該等細胞株 為僅有的兩個分離之穩定肌動蛋白細胞株）。兩個肌動蛋 白細胞株均展現相對較低程度之非誘導性表現且進一步繼 代以用於表徵。 對ISG5啟動子進行定點突變誘發以產生最佳IRF3結合位 點及ISRE(干擾素刺激調節元件）。預測最佳化該等序列可 在用IFN或仙台病毒感染刺激時引起較佳誘導。表1展示 ISG54中進行之序列變化及當短暫轉染至Huh7細胞中時獲 付的營光素表現。結果表明内源IS G 5 4序列提供最高程 度之誘導，所以突變型構築體未進行進一步表徵。 實例1-表1.對ISG54-Luc進行定點突變誘發以最佳化活 155861.doc •42- 201140052 性0 純系名稱 序列變化 用仙台病毒感染誘導 pKINOll 内源ISG54 14倍 PKIN016 ISG54A88G 11倍 ΡΚΙΝ017 ISG54 3ΧISRE 7倍 ΡΚΙΝ018 A88G 加 3ΧISRE 7倍 最佳化檢定條件：測試生長及檢定參數以識別在ISG54 細胞株中進行高產量篩選之最佳條件（2,4)。表2展示所測 試之檢定參數及經由偵測螢光素酶表現確定之最佳條件。 使用仙台病毒感染後之誘導程度分析各參數且選擇提供最 高程度誘導之條件作為用於篩選目的之最佳條件。亦使用 MTS檢定在遞增DMSO存在下測試細胞活力且表明在含有 >2% DMSO之培養基中生長的Huh7細胞展現增加之毒性以 及降低之誘導。 實例1-表2. Huh7-ISG54_Luc高產量篩選最佳化研究 檢定參數 評估範圍 最佳化檢定條件 DMSO耐受性 0.5 - 5% 0.5% 血清濃度 0-10% 10% 細胞塗鋪密度(96孔板） 5,000-20,000個細胞/孔 10,000 陽性對照 0.1-1,000 U/mLIFN lOOU/mLIFN-β 及 0.5-200 HA/mL仙台病毒 50 HA/mL仙台病毒 終點試劑濃度 25-200% 50% 終點讀取時岸 8、16、24及48 處理後24小時 螢光素酶讀取條件 培育及讀取時間 10分鐘，1秒 可再現性 3天中每一天，n=3個複 製板 3天中每一天，n=3個 複製板 討論：選擇使用内源ISG54啟動子表現營火蟲螢光素酶 155861.doc -43· 201140052 之穩定細胞株用於在HTS中識別RIG-Ι促效劑。該細胞株在 仙台病毒感染後展現低程度之内源性表現（基於細胞之篩 選中的背景）及高程度之誘導（14倍）。選擇具有低基本表現 量且對仙台病毒或IFN暴露無反應的在肌動蛋白啟動子控 制下表現海腎螢光素酶之兩個穩定細胞株。關於對全面增 加轉錄量之試劑的反應進一步表徵兩個肌動蛋白細胞株。 為最佳化用於進行HTS之檢定參數，測試影響細胞生長及 ISG54誘導之各種條件。確定細胞、血清、DMSO、陽性 對照（仙台病毒及IFN)及螢光素酶受質之最佳濃度。利用 該等條件篩選用於RIG-Ι促效劑之小分子文庫。 實例2.在ISG54細胞株中篩選RIG-Ι目標文庫 引言：使用電腦模型化程式形成目標文庫以預測與βίοι抑制 域相互 作用之 化合物 。藉 由初始 篩選， 7種化 合物識 別為活化ISG54表現顯著高於背景。使用MTS檢定及消除 任何非特異性活化肌動蛋白啟動子之表現的啟動子特異性 在3次檢定中驗證初始標的以測定劑量反應、細胞毒性。 分析化合物標的之IRF-3核移位以確認其活化RIG-Ι路徑。 此外，確認分子在RNA及蛋白質層面上誘導内源ISG表 現。 接者分析經驗證標的針對細胞培養物中之RN Α病毒（包 括C型肝炎病毒（HCV)及A型流感病毒）之抗病毒性質。篩 選該小型化合物子集證實所揭示基於細胞之篩選平台能夠 識別經由IRF-3起作用且產生抗病毒活性之經驗證ISG54促 效劑。 155861.doc •44- 201140052 化合物文庫稀釋及子板（daughter plate):在96孔密封板 中以含10 mM化合物之100% DMSO接收NCI小分子文庫且 在-20度下儲存直至使用。在室溫下解凍化合物板隔夜， 在96孔聚苯乙烯板中製備2 mM稀釋化合物之等分試樣（2個 板）且用箔蓋密封板並在-20度下儲存。如下以1:5(1〇 mM 至2 mM)稀釋儲備化合物：5 pL各儲備化合物添加至2〇 μι 100% DMSO中。所有板貼上條碼且用原始NCI識別系統進 行標記；第一列僅含DMSO。 在ISG54報導細胞株中篩選化合物。Huh7-ISG54-Luc細 胞株在選擇條件下生長。細胞之等分試樣以1 x丨〇6個細胞/ 小瓶或3 X 1 〇6個細胞/小瓶在液氮下冷凍以供實驗使用。自 液氮移除細胞小瓶且在T25燒瓶中生長直至80%匯合（約3 天）且接著於T75燒瓶中擴增直至匯合（3天）。在白色不透明 96孔板中以1 x丨〇4個細胞/孔之密度接種細胞且在無抗生素 選擇下生長24小時。各檢定板具有經含有0.5% DMSO之培 養基處理之孔Α1·Α4及經1〇血球凝集素（HA)仙台病毒感染 之孔A5 A8。板之其餘部分用含化合物之培養基（含 有 〇_5% DMSO)處理。 為使最終濃度達到1〇 μΜ，在室溫下解凍2 mM化合物之 板執行以下稀釋方案：取10 pL化合物自子板轉移至 3有90吣培養基之聚苯乙烯％孔板中且充分混合。取1〇 μΕ化。物自該稀釋板轉移至含有細胞及9〇 卜。養基之白色不透明96孔板中且藉由抽吸進行混合。細 胞板返回;官兹α 1 生長24小時。解;東steady-Glo螢光素酶 155861.doc -45- 201140052 試劑（Iomega)，士。製造商指示進行製備且添加5〇卟試劑 至細胞板上之各孔中（不移除培養基）。在室溫下培育細胞 板20分鐘且接著如實例丨所述，用光度計（β_。⑷進行讀 取。 在肌動蛋白對照細胞株中篩選化合物：取在18(}54報導 體篩選中識別為標的之化合物，以其2福原始濃度塗鋪 於標的分析板上。使肌動蛋白細胞株生長且以上述方式添 加化合物《如製造商指示製備DuaKG1〇螢光素酶試劑 (Promega)且添加5(M 00 劑至細胞板上之各孔中（不移 除培養基）。在室溫下培育細胞板1〇分鐘且接著如實例以斤 述用光度計（Berthold)進行讀取。 ISG54-Luc報導體檢定法與劑量之相關性。如上所述進 行螢光素酶檢定。為測試與濃度之相關性，在含有最終濃 度為0.5〇/〇之DMSO的培養基中製備1、5、1〇、20及50 μΜ 之化合物稀釋液。培養基中之稀釋液僅在臨使用前製備且 化合物不以該狀態儲存。僅取含於1 〇〇% DMSO中之化合 物進行冷凍且用於後續實驗。 測定細胞毒性之MTS檢定。採用於培養基中稀釋的遞增 量之化合物或等量DMSO處理培養之人類Huh7細胞24小 時，以觀測其對細胞活力之影響。使用量測活細胞將四唑 鑌化合物[3-(4,5-二曱基-2-基）-5-(3-羧基曱氧基苯基）-2-(4-磺酸基苯基）-2H-四唑鏽’内鹽；MTS]轉化成有色曱賸化 合物之轉化率的細胞活力檢定法計算活細胞比例。在96孔 微量滴定板讀取器中偵測MTS轉化成曱賸之轉化率，且可 155861.doc • 46 - 201140052 直接繪示所得光學密度以估計細胞活力。Cell Titer One(Promega)為如製造商方案建議使用之單步驟試劑，且 在試劑存在下培育細胞3小時，隨後進行O.D.讀取。在含 有0.5% DMSO之培養基中稀釋化合物至最終濃度〇、5、 1 0、20及50 μΜ。陰性對照孔不含化合物且使用引起1 〇〇〇/0 細胞病變效應之EMCV感染’以檢驗陽性對照之細胞毒 性。各化合物濃度及對照組在三重複孔中進行以產生誤差 條形圖。 EMCV抗病毒檢定。培養人類Huh7細胞，以1.5χΙΟ4個細 胞/孔接種’且用化合物或等量含有DMSO之培養基（陰性 對照）預處理24小時。接著用250 pfu EMCV感染各孔且在 正常生長條件下培育1 8小時。用50 IU/mL内含子A處理陽 性對照孔。使用量測活細胞將四唑鑌化合物[3_(4,5-二甲 基-2-基）-5-(3-羧基甲氧基苯基）·2-(4-磺基苯基）_2H-四唑 鑌’内鹽，MTS]轉化成有色甲腾化合物之轉化率的細胞活 力檢定法計算活細胞含量。在96孔微量滴定板讀取器中偵 測MTS轉化成甲臜之轉化率且可直接繪示所得光學畲度.， 以估計細胞活力。如上所述使用Cell Titer One。 IRF-3核移位檢定^ Huh7細胞以5 χ 103個細胞/孔接種於 常規96孔細胞培養板中《細胞在正常條件下生長24小時。 在至溫下解凉化合物分析板（2 ηιΜ含於100% DMSO中）1-2 小時且接著在培養基中稀釋。在常規培養基中以1:1〇及 1:20稀釋化合物且接著添加1〇叫至各孔含有9〇叫培養基 之細胞板中（此結果係進一步稀釋1:1〇)。該等稀釋液之最 155861.doc •47- 201140052 終濃度分別為20 μΜ及10 μΜ且DMSO之最終量為1%及 0.5%。陰性對照細胞於培養基中含有0.5% DMSO且陽性對 照細胞用100 HA仙台病毒感染24小時。 細胞在化合物存在下培育20-24小時且接著固定單層， 滲透且針對IRF-3蛋白質進行染色。根據Cellomics移位套 組（Thermo Fisher)方案執行染色方案，且使用來自該套組 之所有緩衝液。使用自商業來源獲得之IRF-3特異性血清 (Cell signaling #4962 及 Zymed #39-2700)或多株兔血清。 使用IRF-3兔血清進行如下描述之實例：在洗滌緩衝液 中，以1:400稀釋兔血清IRF-3且取100 pL置於各孔中待染 色。在洗滌緩衝液中稀釋與Dylight 488及Hoescht染料（核 染色）結合之二級兔抗體，且如Cellomics方案中所說明進 行培育。二級抗體培育後，洗滌單層且留置於100 μί洗滌 緩衝液中，用於成像。用倒裝顯微鏡檢視IRF-3 FITC及核 染色（DAPI)。使用MetaMorph軟體獲得影像，且在 Powerpoint中儲存為tif影像。在相同曝光時間下獲得所有 影像。此外，用 ArrayScan 儀器（Thermo Fisher)執行 IRF-3 核移位之高產量檢定。掃描96孔板且對整個板使用相同參 數執行IRF-3核移位評估。

HCV免疫螢光抗病毒檢定：Huh7細胞以5χ103個細胞/孔 之密度接種於96孔板上且生長24小時。在培養基中稀釋至 10 μΜ且含有最終濃度為0.5%之DMSO的化合物添加至各 孔中且再生長24小時。自板移除化合物培養基溶液且儲存 於潔淨組織培養皿中。用PBS洗滌細胞單層且以所述MOI 155861.doc • 48- 201140052 添加HCV2a病毒。培育病毒2_4小時且接著移除，用pBS洗 滌單層且化合物溶液置換至各孔令。 使細胞生長隔夜且接著固定細胞並針對蛋白質進行 染色。所有所用緩衝液及試劑均來自上述Ce丨i〇mics染色套 組。來自商業來源或原生患者血清之Hcv特異性抗體可用 於偵測培養物中之HCV感染細胞。以下提供之實例使用原 生患者血清：在洗滌緩衝液中以1:3,〇00稀釋血清且在室溫 下培育1小時《如上所述稀釋二級抗人類Dylight 488或 FITC Alexa 488及Hoescht核染劑。洗滌細胞且各孔中保留 100 μί洗滌緩衝液。用倒裝顯微鏡觀測細胞染色且如上所 述獲得影像。對受感染細胞之數目進行計數且保存代表性 影像。 Α型流感病毒ELISA檢定：Α549、MRC-5或其他允許流 感病毒感染之細胞以1 X 1 〇4個細胞/孔之密度接種於96孔板 中。使細胞生長16小時且在含有0.5% DMS0之培養基中稀 釋至5、10、20、50 μΜ之化合物添加至各孔中。培育細胞 6小時且接著用250 pfu流感WSN病毒株感染。經稀釋之病 毋·直接添加至孔中且不移除化合物。化合物處理後使受咸 染細胞生長總共24小時且接著固定β如下執行wsn流成 ELISΑ方案.用PBS洗務細胞，用曱醇：丙酮固定1 〇分鐘且 再用PBS洗滌。用馬血清及BSA在Triton X-ioo存在下阻斷 細胞。一級抗體為小鼠單株抗A型流感核蛋白（chemic〇n) 且以1:3 000稀釋液使用。二級抗體為山羊抗小鼠 HRP(Pierce) ’ 亦以 1:3000 稀釋液使用。使用 TMBK Bi〇Fx 155861.doc ·49· 201140052 試劑如所建議進行顯色反應。添加試劑後，在室溫下培育 細胞2-5分鐘且使用2 n HCI終止反應。在450 nM下對板進 行讀取。 下文中討論上述實驗之結果。 在Huh7-ISG54-Luc報導細胞株中識別先導化合物：針對 在Huh7-ISG54_Luc細胞中之活性篩選RIG-I目標集合（168 個分子）中之化合物以識別幻匕〗路徑促效劑。圖4展示所 筛選之所有化合物之散佈圖且線描繪設定用於識別顯著活 化螢光素酶表現之分子之臨限值。根據目標文庫子集，7 種化合物活化ISG54表現超過800種相對螢光素酶單位且選 用於進一步研究（文庫之4.2%)。各板含有陰性對照（含有於 培養基中之0.5% DMSO但無化合物的4個孔）及陽性對照 (受仙台病毒感染且產生ISG54誘導之4個孔）。分析各板上 之對照且必妻時重複該板；然而，未重複第一次文庫筛選 中之板。圖4展示來自目標文庫之初始標的之散佈圖。各 板上包括陰性對照（未處理-灰色）及陽性對照（仙台病毒感 染-未圖示）》所篩選之所有化合物之螢光素酶值以紅色展 示。線表示用於識別初始標的之臨限值。 為確定誘導特異性’在使用肌動蛋白啟動子表現螢光素 酶之對照細胞中篩選7個初始標的。肌動蛋白複篩（圖5)僅 展示一種化合物與背景表現量相比使肌動蛋白啟動子之活 性增加。其餘化合物在肌動蛋白對照細胞株中未顯示任何 活化且進一步驗證所有化合物。自原始化合物子板選擇先 導化合物（2 mM)，轉移至新聚丙烯板且製備連續稀釋液。 155861.doc -50. 201140052 在含有0.5% DMSO之培養基中製備50 μΜ、20 μΜ、10 μΜ 及5 μΜ之最終化合物濃度且添加至Huh7-ISG54-Luc細胞中 以偵測ISG54表現之活化是否具劑量依賴性。陰性對照孔 含有在含有DMSO之培養基中生長之Huh7-ISG54-Luc細胞 且陽性對照細胞經100 HA仙台病毒感染。 此外，在MTS檢定中添加相同化合物稀釋液至Huh7細胞 中以檢驗細胞毒性。用不同濃度化合物處理細胞24小時且 與未經化合物處理但在含有DMSO之培養基中生長之陰性 對照樣品相比較來分析細胞活力。圖6展示在ISG54報導體 檢定中來自目標集合之化合物之劑量依賴性活性。圖7展 示在MTS檢定中針對初始細胞毒性對化合物標的進行之分 析。有趣的是，證實所有選自目標集合之初始標的誘導 ISG54啟動子之劑量依賴性活化且不具有顯著毒性，表明 該等目標RIG-I化合物之100%驗證率。 先導化合物之作用機制及抗病毒性質。檢驗在MTS檢定 中經驗證以劑量依賴性方式特異性活化ISG54啟動子且不 引起細胞毒性之目標集合化合物之IRF-3活化。已充分描 述在RIG-I路徑活化後，IRF-3變為活化型且移位至細胞 核，其在細胞核中起作用上調若干種免疫調節基因之轉 錄。 用化合物處理Huh7或用仙台病毒感染Huh7細胞（作為陽 性對照）24小時且接著針對IRF-3進行染色。針對重組型 IRF-3蛋白質產生兔血清且在免疫螢光檢定中用於針對 IRF-3進行染色。 I55861.doc -51 · 201140052 圖8展示所有經驗證RIG-Ι目標化合物在Huh7細胞中顯示 IRF-3核移位。用類似濃度之DMSO處理陰性對照細胞且受 仙台病毒感染之細胞為IRF-3移位之陽性對照。此外，使 用不活化ISG54表現之化合物作為陰性對照且兩種陰性化 合物不引起IRF-3細胞定位之非特異性變化。細胞核内 IRF-3之強度在各化合物下不同且表明一些化合物比其他 化合物具有更高活性。 若干種化合物在較低濃度（5 μΜ)下不引起IRF-3活化且 表明該活性指標依賴於化合物濃度。藉由分析肝細胞中 IRF-3之活化，證實由該等化合物引起之ISG54誘導係經由 所意圖靶向之路徑。總體而言，如自結合且活化RIG-Ι受 體之分子所預期，所有來自化合物之RIG-Ι目標集合之ISG 活化化合物均顯示高度IRF-3移位。 圖8展示經化合物處理之Huh7細胞中之IRF-3移位。用10 μΜ化合物預處理細胞24小時且接著針對IRF-3進行染色。 模擬處理之細胞顯示大多數IRF-3在細胞質中，仙台病毒 感染之細胞在細胞核中具有聚積之IRF-3且化合物亦顯示 IRF-3在細胞核中。 經驗證化合物之抗病毒表徵。使用ELISA方法偵測感染 程度，初始檢驗化合物針對A型流感病毒- WSN病毒株 (IFA)之抗病毒活性。在允許A型流感病毒感染之A549細胞 及MRC5細胞中，來自目標集合之RIG-Ι促效劑化合物均不 具有任何顯著活性。細胞用化合物預處理8小時或24小時 且接著用IFA病毒感染。針對病毒蛋白質對細胞進行染色 155861.doc -52- 201140052 以量測感染程度。 與經模擬處理之細胞相比，經誘導IRF_3移位之化合物 處理之細胞不具有流感病毒感染之任何顯著降低。使用該 檢定，在其他化合物集合（諸如多樣性文庫）中識別之irf_3 促效劑顯示針對流感病毒之良好活性。該資料表明目標為 直接結合及活化RIG-I受體之化合物可能不具有針對流感 病毒之良好功效，此可能歸因於IFA感染後之高度先天免 疫反應下調。 亦檢驗化合物針對C型肝炎病毒之抗病毒活性。為分析 抗病毒活性，細胞用10 μΜ(用於識別初始18(}54活化之濃 度）之化合物預處理且接著用HCV2a純化病毒感染。 HCV2a係自於Huh7細胞中擴增之所構築純系合成且經濃縮 以獲得高病毒效價。該等實驗中所用之病毒為約5xl〇5 pfu/mL且抗病毒實驗使用（U-o」之河〇1。 為量測存在或不存在藥物處理時之HCV感染程度，使用 血清及FITC結合螢光二級抗體針對HCV特異性染色對細胞 進行染色。HCV蛋白質染色為特異性的，在模擬感染細炮 t顯示低背景且僅染色發生HCV複製之細胞之細胞質（圆 9 ’上圖）。使用倒裝螢光顯微鏡對受感染細胞之數目進行 定量（展示於圖9中，下圖）。干擾素處理用作陽性對照且究 全阻斷HCV感染。使用不引起IRF_3移位之陰性對照化合 物顯示抗病毒活性不歸因於用任何小分子進行之處理。該 實驗提供經由IRF-3起作用之所識別rig-I促效劑可抑制 HCV感染之證據。 155861.doc -53· 201140052 圖9展示IF檢定中之HCV抗病毒活性。Huh7細胞用化合 物預處理24小時，用HCV以低MOI感染48小時且接著針對 HCV蛋白質進行染色。模擬感染細胞未顯示背景染色，且 干擾素完全阻斷感染並用作陽性對照。用倒裝顯微鏡對受 感染細胞（由於HCV蛋白質而染為綠色）進行計數。各化合 物之處理後HCV感染細胞之數目展示於圖表中。 若干種來自目標文庫之化合物顯示與經IFN處理之細胞 類似之高度HCV抑制且在HCV模型中進一步檢驗。為確認 抗病毒活性之特異性，在用遞增濃度之藥物處理後檢驗 HCV感染。 圖10，用遞增濃度0-10 μΜ之化合物預處理Huh7細胞24 小時。接著如上所述感染細胞且分析HCV病灶。圖10展示 確認一種抗病毒化合物具有針對HCV感染之劑量依賴性活 性。此外，在遞增MOI之所添加病毒下分析化合物針對 HCV之抗病毒活性。 圖11屐示一種分子可在高感染倍率條件下抑制HCV感 染。用1 0 μΜ化合物處理Huh7細胞24小時且隨後如上所述 進行HCV感染。 總體而言，小分子之RIG-I受體目標集合之篩選表明預 測結合RIG-I受體之分子識別為經驗證RIG-I促效劑且子集 具有抗病毒性質。約4%之初始標的率高於自多樣性子集 (diversity set)所預期，如自目標分子文庫預期。此外，複 篩及驗證檢定證明極小百分比之初始標的為假陽性分子且 經驗證標的率較高。該實例中描述之所用驗證檢定成功識 155861.doc -54- 201140052 別RIG-Ι促效劑。 使用一系列抗病毒系統確定RIG-I促效劑化合物之抗病 毒性質’使用基於細胞之系統研究HCV及A型流感病毒， 證明化合物子集針對HCV感染具有劑量依賴性活性。如所 預期，由於在病毒蛋白質存在時可停止路徑活化之病毒應 對措施，並非所有RIG-Ι促效劑均具有抗病毒性質。由於 成功識別經驗證促效劑分子，利用RIG-Ι目標文庫進行其 他篩選，且基於其針對HCV之活性而進一步發展標的。 實例3. 實例3A.識別RIG-Ι促效劑 為識別RIG-Ι促效劑’使用由具有受ISG54啟動子控制之 螢光素酶報導基因之Huh7細胞組成之篩選平台。該啟動子 編碼結合活化型IRF-3(RIG-I效應分子）之串聯irf元件及經 由IFN-α/β提供啟動子誘導之干擾素（iFN)刺激反應元件。 最佳化檢定條件以在無刺激條件下產生低背景及在陽性對 照處理（諸如仙台病毒感染）下產生可再現高度劑量依賴性 誘導。選擇含有最大互異性及類藥物化合物之小分子多樣 性文庫以用於促效劑識別。 用於識別誘導ISG啟動子活性之分子之初次篩選的結果 展示於圖12中。在10 μΜ下篩選20,000個成員之小分子多 樣性文庫以識別誘導ISG54螢光素酶報導體活性之化合物 (灰色直方圖，1 ° Υ軸）。陰性對照（僅細胞）及陽性對照（似 台病毒感染細胞）表示為累積頻率直方圖（2。γ轴）。黃線指 示用於識別陽性標的之4 SD臨限值（插圖）。RLU係指海腎 155861.doc -55- 201140052 螢光素酶。 僅選擇活化螢光素酶活性至高於整個多樣性文庫之平均 值四倍標準偏差（黃線）的分子以用於進一步驗證。在該等 條件下’初始標的率為0 49%，產生約100個標的用於進一 步驗證。 除篩選多樣性文庫外，亦使用計算對接研究 (computational docking study)來識別預測結合RIG-I之配位 體結合域之小分子。接著使用ISG54螢光素酶篩選細胞株 評估該「目標集合」’產生4〇/0標的率且在多樣性篩選中顯 示顯著富集。若干種該等化合物經充分驗證且顯示抗病毒 活性，如下文所描述。 實例3B.細胞毒性及抗病毒作用 所有選用於進一步研發之先導分子均介導IRF_3核移位 且具有針對HCV之抗病毒活性。所有分子均在不存在非特 異性啟動子（β-肌動蛋白）誘導下誘導ISG表現之劑量依賴性 活化。為分析先導促效劑分子之活體外細胞毒性，使用多 種細胞類型（Huh7，人類肝細胞；MRC5，肺纖維母細胞； 及293 ’纖維母細胞）進行MTS檢定。如檢定在5〇 μΜ下所量測’無化合物對細胞代謝或代謝具有顯著影 響。 圖13展示自多樣性篩選分離之例示性化合物ΚΙΝ3〇〇之 表徵。如圖13Α中所示，藉由證明iSG54螢光素酶報導體 之劑量依賴性誘導（左側）、不存在非特異性啟動子誘導（β_ 肌動蛋白-LUC，中間）及多種細胞類型中不存在細胞毒性 155861.doc •56· 201140052 (MTS檢定，右侧）來驗證初始標的。 圖13B展示抗病毒表徵，藉由以合成HCV 2A病毒感染反 進行感染前或感染後藥物處理之Huh7細胞之HCV病灶形成 (左側）及上清液中之病毒RNA產生（右側）的抑制所量測° 如圖13C中所示，流感研究藉由ELISA(左側）或西方墨點法 (右側）表徵與對照濃度之IFN a-2a(内含子A ’中間）相比以 A/WSN/33病毒感染之經藥物處理MRC5細胞中的病毒核蛋 白產生。 病灶形成檢定中化合物對HCV感染之抑制具劑量依賴 性，且使用該檢定計算HCV感染之50%抑制濃度（IC5〇)(表1 及圖13B)。為檢驗化合物對HCV複製及病毒傳播之抑制， 藥物預處理後藉由qPCR量測受感染Huh7細胞之上清液中 的病毒RNA(圖13B)。與使用100 IU/mL醫藥IFN-a (IntronA®，圖13B)處理類似，先導化合物引起HCV RNA 含量降低> 1 log。當感染後添加時，化合物引起類似的 HCV RNA含量降低，證明在已建立感染中具有抗病毒活 性。 為檢驗化合物對流感病毒感染之作用，在受感染細胞之 藥物處理後藉由ELISA及西方墨點法檢定病毒核蛋白（NP) 含量，如圖13B中所示。然而，所有自多樣性文庫識別之 分子（KIN300、KIN400及KIN500)均展現有效的劑量依賴 性抗流感活性（表1及圖14)。 實例3C. IRF-3核移位 由RIG-I介導之ISG表現之誘導係由IRF-3轉錄因子之磷 155861.doc •57· 201140052 酸化、二聚化及核移位產生。因為Huh7細胞缺乏其他病原 體相關分子模式（PAMP)受體來誘導irf-3，所以轉錄因子 之核積聚為該等細胞中RIG-I路徑活化之特異性指標（1〇)。 在正常未刺激Huh7細胞中’ IRF-3在細胞質與細胞核之間 穿梭’引起彌漫性細胞染色。在藉由仙台病毒活化路徑 後’ IRF-3移位且在細胞核中聚積。 在用KIN300、仙台病毒（陽性對照）或不誘導ISG表現之 陰性對照化合物（1〇 μΜ)處理後24小時在Huh7細胞中檢驗 IRF-3(圖14’左圖）。用兔多株血清及DyLight 488二級抗 體偵測IRF-3(綠色）且藉由Hoescht染色偵測細胞核（藍色）。 使用單株抗體及Dylight 488檢驗聚（A)結合蛋白質（圖14， 右圖）作為陰性對照。 先導促效劑分子均以與仙台病毒類似之程度刺激劑量依 賴性IRF-3移位（圖14) ’但不改變對照因子（聚八結合蛋白 質）之分佈。來自多樣性篩選之陰性對照化合物不改變 IRF-3疋位，表明先導分子之特異性作用。所有先導化合 物亦在293種細胞中上調内源ISG mRNA表現及蛋白質產 生’證實其他細胞類型中對天然啟冑子的路徑活化及化合 物活性。 總體而言’已表明小型類藥物分子可活化RIG-I路徑且 促進IRF-3核移位，從而引起抗病毒作用。該等研究亦顯 不RIG-I抑制域之電腦模型之驗證及其用於識別具有抗病 毒活性之相互作用小分子化合物的應用。 除非另有說明’否則說明書及中請專利範圍中所使用之 155861.doc •58- 201140052 表不成分量、諸如分子量之性質、反應條件等之數字應理 解為在所有情況下經術語「約」修飾。因此，除非相反指 出，否則說明書及隨附申請專利範圍中闡述之數值參數為 近似值，其可視本發明設法獲得之所需性質而變化。最低 限度且並不嘗試限制應用申請專利範圍範疇之等效物之準 則，應至少根據所報導有效數字之數值且藉由應用一般捨 入技術來解釋各數值參數。 儘官闡述本發明之寬廣範疇之數值範圍及參數為近似 值，但儘可能精確地報導特定實例中闡述之數值。然而， 任何數值均固有料有某些由其各制試量射發現之標 準差所必然引起的誤差。 除非本文中另有說明或與上下文明顯矛纟，否則描述本 發明之上下(尤其以下申請專利㈣之上下《中）使用 之術m 」、「該」及類似指示物應解釋為涵蓋單數及複 數兩者《本文中引述值之範圍僅欲用作個別提及各個別值 屬於該範圍㈣略方法1非本文中另有說明，否則各個 值仿佛其是在本文中個別引述__般併人說明書卜除非本 文中另有說明或另外與上下文明顯矛盾，否則可以任㈣ 合次序執行本文中所描述之所有方法。本文中提供之任何 及所有實例或例示性語言（例如「諸如」）之使用僅欲更好 地說明本發明且不對另外 卜所主張本發明之範疇造成限制。 不應將說明書中之任何語士齷摆A丄 〇解釋為扣不貫施本發明所必需 之任何未主張要素， ' 本文中揭示之本發明之替代性要素或實施例之分組不應. 155861.doc •59· 201140052 解釋為限制^各群,组成員可個別地提及及主張或與群組之 其他成員或本文中存在之其他要素形成任何組合。預期出 於便利性及/或專利性理由，一或多個群組成員可納入群 、-中或自群組刪除。當存在任何該納入或刪除時，認為說 明書包含修改之群組，因此滿足隨附申請專利範圍中使用 之所有馬庫西群組（Markush group)之書面描述。 本文中描述本發明之某些實施例，包括本發明者已知用 於執行本發明之最佳方式1然，在閱讀前述描述時，該 等所描述實施例之變化將對—般技術者將變得顯而易知。 本發明者預期熟習此項技術者適當時可使用該等變化且本 發明者預期可以肖|X中明確描述不同的方式實施本發 明。因此，如適用法律所允許，本發明包括隨附申請專利 範圍中所述標的物之所有修改及等效物。此外，除非本文 中另有說明或以其他方式與上下文明顯矛盾，否則本發明 涵蓋上述要素之所有可能變化之任何組合。 申請專利範圍中可使用語言由…組成或基本上由組成 進步限制本文中揭示之特定實施例《當用於申請專利範 圍中時（無淪申請或根據修正添加），過渡術語「由…組 成」排除申請專利範圍中未說明的任何要素 '步驟或成 分。過渡術語「基本上由…組成」使申請專利範圍之範齊 限於指定物質或步驟及本質上不影響基本及新穎特徵之物 質或步驟。本文中固有地或明確地描述及允許所主張本發 明之實施例。 最後，應理解本文中揭示之本發明實施例為本發明之原 155861.doc •60· 201140052 理的說明。其他可使用之修改屬於本發明之範疇。因此， 作為實例但不加限制，可根據本文中之教示内容利用本發 明之替代性組態。因此，本發明不限於明確展示及描述之 内容。 參考文獻 1. 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Jr. (2010) IPS-1 is essential for the control of West Nile virus infection and immunity, PLoS Pathog 6, el000757。 30. Barnard, D. L. (2009) Animal models for the study of influenza pathogenesis and therapy, Antiviral Res 82, A110-122。 31. Daffis, S., Samuel, M. A., Suthar, M. S., Gale, M., Jr. 及 Diamond，M. S. (2008) Toll-like receptor 3 hai： a protective role against West Nile virus infection, J Fko/ 队 10349-10358 。 32. Blight, J.J.等人，（2002) J. Virology 76:13001-13014 〇 【圖式簡單說明】 圖1展示利用仙台病毒（Sendai virus)及IFN時ISG54及 ISG56報導構築體之短暫表現及誘導； 圖2展示在遞增IFN濃度下經校正之螢光素酶表現； 圖3展示穩定螢光素酶細胞株在利用仙台病毒時顯示各 種誘導； 圖4展示初始篩選後之目標文庫散佈圖。各板上包括陰 性對照（未處理-灰色）及陽性對照（仙台病毒感染（Sendai infection))。所篩選之所有化合物之螢光素酶值以紅色展 155861.doc •67· 201140052 示。線表示用於識別初始標的之臨限值； 圖5展示大多數目標集合標的不引起肌動蛋白啟動子活 化； 圖6展示ISG54報導體檢定中來自目標集合之化合物之劑 量依賴性活性； 圖7展示使用MTS檢定測得之Huh7細胞中之化合物細胞 毒性； 圖8展示經化合物處理之Huh7細胞中之IRF-3移位。用 (10或20 μΜ)化合物預處理細胞24小時且接著針對IRF-3進 行染色。模擬處理之細胞顯示大多數IRF-3在細胞質中， 仙台病毒感染之細胞在細胞核中具有聚積之IRF-3且化合 物亦顯示IRF-3在細胞核中； 圖9展示IF檢定中之HCV抗病毒活性。用化合物預處理 Huh7細胞24小時，用HCV以低MOI感染48小時且接著針對 HCV蛋白質進行染色。模擬感染之細胞未顯示背景染色， 且干擾素完全阻斷感染並用作陽性對照。用倒裝顯微鏡對 受感染細胞（由於HCV蛋白質而染為綠色）進行計數。各化 合物處理後HCV感染細胞之數目展示於圖表中； 圖10展示用遞增濃度0-10 μΜ之化合物預處理Huh7細胞 24小時之實驗的結果。接著如所描述感染細胞且分析HCV 病灶； 圖11展示用10 μΜ化合物處理Huh7細胞24小時且接著如 實例2所描述進行HCV感染之實驗的結果； 圖12為來自ISG誘導之初次篩選之螢光資料的直方圖。 155861.doc -68 - 201140052 在10 μΜ下篩選20K多樣性文庫以識別誘導ISG54螢光素酶 報導體活性之化合物（灰色直方圖，1。γ軸）。陰性對照（僅 細胞）及陽性對照（仙台病毒感染細胞）表示為累積頻率直方 圖（2° Υ軸）。黃線表示用於識別陽性標的（插入物）、RLrj、 海腎螢光素酶（1^11丨11&-111(^[6^3 6)之4 80臨限值； 圖13展示自多樣性篩選分離之化合物KIN300之表微。 (A)藉由證明ISG54螢光素酶報導體之劑量依賴性誘導（左 側）、不存在非特異性啟動子誘導（β-肌動蛋白_LUC ,中間） 及多種細胞類型中不存在細胞毒性（MTS檢定，右側）來驗 證初始標的。（Β)抗病毒表徵量測以合成jfh-1 HCV 2Α病 毒感染且進行感染前或感染後藥物處理之Huh7細胞的HCV 病灶形成（左側）及上清液中之病毒RNA產生（右側）的抑 制。（C)流感研究藉由ELISA(左側）或西方墨點法（右側）表 徵與對照濃度之IFN a-2a(内含子A，中間）相比受 A/WSN/33病毒感染之藥物處理MRC5細胞中的病毒核蛋白 產生；及 圖14展示IRF-3核移位。在用KIN300、仙台病毒（陽性對 照）或不誘導ISG表現之陰性對照化合物（1 〇 μΜ)處理後24 小時在Huh7細胞中檢驗IRF-3(左圖）。用兔多株血清及 DyLight 488二級抗體偵測IRF-3(綠色）且藉由H〇escht染色 偵測細胞核（藍色）。使用單株抗體及Dylight 488檢驗作為 陰性對照之聚（A)結合蛋白質（右圖）。 155861.doc •69-

Claims (1)

1. 201140052 七、申請專利範圍： 1. 一種識別調節先天免疫之化合物的方法，其包含以下步 驟： 使至少一個包含報導基因（其係受到對先天免疫活化具 有反應性之基因啟動子控制）的細胞與至少一種推定的先 天免疫反應調節化合物接觸；及 量測報導基因之活化作用。 2 ·如凊求項1之方法，進一步包含 選擇活化報導基因表現高於所選臨限值之化合物，以 供進一步表徵。 3.如#求項2之方法，其中該進一步表徵包括量測對先天 免疫活化作用具有反應性之轉錄因子之核移位。 4 · 士 ”月求項3之方法，其中核移位之該量測係藉由免疫化 學檢定進行》 5. 如请求項2之方法，其中該所選臨限值比對照值高四倍 標準偏差。 6. 如請求項1之方法，其中在接觸前，根據與尺…〗之配位 體結合域之預測結合性，在結構上選擇該化合物。 7. 如請求項丨之方法，其中該等細胞為真核細胞。 ' 8·如請求項7之方法’其中該等真核細胞為Huh7細胞。 9_如請求項1之方法，其中該報導基因為螢光素酶。 10. —種方法，其包括提供包含報導基因（其係受到對先天免 疫活化具有反應性之基因啟動子控制）之真核細胞，以識 別可以調節先天免疫反應之化合物。 155861.doc 201140052 11. 如請求項10之方法，其中該等細胞為真核細胞。 12. 如請求項11之方法，其中該等真核細胞為Huh7細胞。 13. 如請求項10之方法，其中該報導基因為螢光素酶。 14. 如請求項12之方法，其中該報導基因為螢光素酶。 15 · —種化合物之用途’其係用於製造用以預防、治療或滅 輕脊椎動物之病毒感染之藥劑，其中該化合物係藉由使 至少一個包含報導基因（其係受到對先天免疫活化具有反 應性之基因啟動子控制）的細胞與該脊椎動物之至少一種 推定的先天免疫反應調節化合物接觸來識別。 16. 如睛求項15之用途，其中該化合物之進一步特徵在於活 化報導基因表現高於所選臨限值。 17. 如請求項15之用途’其中該化合物誘導對先天免疫活化 具有反應性之轉錄因子之核移位。 18. 如請求項16之用途’其中該所選臨限值比對照值高四倍 標準偏差。 19. 如請求項15之用途，其中該病毒感染係由一種以下病毒 科中之病毒引起.星狀病毒科（Astroviridae)、雙RNA病 毒科（Birnaviridae)、雀麥花葉病毒科（Bromoviridae)、杯 狀病毒科（Caliciviridae)、長線形病毒科（ciosteroviridae)、 紅豆花葉病毒科（Comoviridae)、囊狀噬菌體科 (Cystoviridae)、黃病毒科（Flaviviridae)、彎曲病毒科 (Flexiviridae)、肝炎病毒（Hepevirus)、光滑病毒科 (Leviviridae)、黃症病毒科（Luteoviridae)、單股負鏈病 毒（Mononegavirales)、嵌紋病毒（Mosaic Viruses)、套病 15586 丨.doc 201140052 毒（Nidovirales)、野田病毒科（Nodaviridae)、正黏病毒科 (Orthomyxoviridae)、小雙節 RNA病毒（Picobirnavirus) ' 小核糖核酸病毒科（Picornaviridae)、馬鈐薯Y病毒科 (Potyviridae)、呼腸孤病毒科（Reoviridae)、逆轉錄病毒 科（Retroviridae)、伴生病毒科（Sequiviridae)、纖細病毒 (Tenuivirus)、彼膜病毒科（Togaviridae)、蕃茄叢矮病毒 科（Tombusviridae)、整體病毒科（Totiviridae)、蒸菁變黃 鑲嵌病毒科（Tymoviridae)、肝DNA病毒科（Hepadnaviridae)、 癌療病毒科（Herpesviridae)、副黏病毒科（Paramyxoviridae) 或乳頭狀瘤病毒科（Papillomaviridae)。 20.如請求項15之用途，其中該病毒感染為流感病毒 (influenza virus)、C型肝炎病毒（Hepatitis C virus)、西 尼羅河病毒（West Nile virus)、SARS冠狀病毒（SARS-coronavirus)、脊髓灰質炎病毒（poliovirus)、麻療病毒 (measles virus)、登革熱病毒（Dengue virus)、黃熱病病 毒（yellow fever virus)、蜱傳播腦炎病毒（tick-borne encephalitis virus)、日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus)、聖路易腦炎病毒（St. Louis encephalitis virus)、 墨累谷病毒（Murray Valley virus) ' 布氏病毒（Powassan virus)、羅西奥病毒（Rocio virus)、跳躍病病毒（louping-ill virus)、班奇病毒（Banzi virus)、伊利烏斯病毒（Ilheus virus)、科科貝拉病毒（Kokobera virus)、庫寧病毒 (Kunjin virus)、阿爾弗病毒（Alfuy virus)、牛腹瀉病毒 (bovine diarrhea virus)、科薩努爾森林病病毒（Kyasanur forest disease virus)或人類免疫缺乏病毒（HIV)。 155861.doc