TW201106958A - Use of lanostane and poria extract in treating diabetic - Google Patents

Description

201106958 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種以茯荼萃取物治療糖尿病的用途， 尤其有關以萃取自茯苓的化合物治療因血中胰島素不足所 引起的糖尿病的用途發明。 【先前技術】 糖尿病為富裕國家之成人（尤指老年人）常見的慢性 籲病。糖尿病人主要可分為兩種，第一型糖尿病或稱胰島素 依賴型糖尿病，其病因是免疫反應造成胰臟之冷·細胞破壞 而無法生產胰島素’血中無胰島素因此此種型病人必需藉 助於注射胰島素補充才能治療糖尿病。第二型糖尿病或稱 非騰島素依賴型糖尿病，其病因不明，但是遠傳基因問題 為重要因素之一，另外生活方式影響（如肥胖）也是重要因 素之一。 • 大約西元5⑽年，唐朝之醫學書籍備急千金要方記載 著用於治療的糖尿病的多種複方，其中某些複方含有茯 令。2002年曰本研究人員μ. Sato發表茯苓皮部份的氫化 去氫松荼酸（Dehydrotrametenolic acid)能夠應用在第二型 糖尿病（Biol. Pharm· Bull. 2002, 25(1)，81-86)的治療，其作 用原理是經由增加胰島素敏感度（即減少人體對胰島素抗 藥性）而達到治療目的。但是從其體外脂肪細胞試驗知道氫 化去氫松苓酸的有效濃度為丨〇_5 Μ，及從體内小老鼠動物 實驗的結果得知氫化去氫松苓酸的有效劑量為丨J 〇 201106958 mg/kg ’顯然應用在人體其有效劑量至少高達大於700 mg 以上。700 mg之有效劑量相當於目前臨床使用之用藥劑量 的10倍以上，因此發展成臨床用藥會造成困難。 【發明内容】 本發明的一個目的在揭示一種使用具下列化學式⑴的 羊毛留烷或其醫藥上可接受的鹽作為有效成分在製備一種 用於治療哺乳類動物因血中胰島素不足所引起的糖尿病藥 物的用途，

(I) 於式中1^為Η或CH3 ; R2為OCOCH3, =0或OH ; R3為Η或OH ; R4 為-C(=CH2)-C(CH3)2Ra，其中R^H 或 OH，或 -CH=C(CH3)-Rb，其中 Rb為 CH3 或 CH2OH ; R5gH或 OH ;及 R6 為 CH3 或 CH2OH。 本發明亦揭示一種使用茯荼萃取物作為有效成分在製 備一種用於治療哺乳類動物因血中胰島素不足所引起的糖 尿病藥物的用途，其中該茯苓萃取物包含1-60重量％的具申 201106958 請專利範圍第1項所述的羊毛甾烷（i)且實質上不含開環羊 毛甾烷。較佳的，該茯苓萃取物包含包含5-3 5重量％的羊毛 甾烷⑴。 較佳的，該羊毛甾烷（I)具有下列化學式：

5 201106958

更佳的，該羊毛崔烧（i)具有下列化學式：

較佳的，該藥物為注射劑型。 較佳的，該藥物為口服劑型。 棱佳的’該糖尿病為第一型糖尿病。 較佳的’該糖尿病為第二型糖尿病。 較佳的，該哺乳類動物為人類。 本發明證明’從茯苓分離出來的有效成分能夠發揮同 胰島素一樣功能：（1)增加葡萄糖轉運蛋白（GLUT4)之基因 表達（mRNA) ’（2)葡萄糖轉運蛋白（GLUT4)製造，（3)能夠將 轉運蛋白（GLUT4)從細胞内轉位（transl〇catin)到脂肪（或肌 肉）細胞膜上，（4)葡萄糖轉運蛋白能夠將細胞外葡萄糖運送 至細胞内，及（5)同胰島素功能一様能夠製造三酸甘油脂儲 201106958

療。另外最重要的是從脂肪體外試驗說明在〇〇l _濃度 下就能產生葡萄糖吸收作用， 需要10_5 Μ才能產生作用，. ’相較於上述日學者Sat〇研究 二者之間劑量差1 〇 〇 〇倍。 【實施方式】 本發明所揭示之從茯苓製備具有治療因血中胰島素不 足所引起的糖尿病的有效成分的一合適方法例如為 15356〗9Α1所揭示的方法，包括利用傳統萃取法萃取茯苓得到一 粗萃取物，再經由層析法，分成極性小之羊毛甾烷 (lanostane)類部位（以二氯甲烷：曱醇（96:4)為沖提液）和極 性大之開環羊毛甾院（secolanostane)類部位（以二氯甲院： 甲醇（90:1 0或〇: 1 〇〇)為沖提液），其中，利用矽膠薄層層析 法，顯示出羊毛甾烷（lanostane)類部位之所在位置，即展開 溶媒為二氯曱烷一甲醇（96:4)時，層析值（Rf)為之〇1 ;至於 開環羊毛甾烷（secolanostane)類成分，則層析值小於〇」。 用矽膠管柱層析法可進一步分離該羊毛留烷類部位，其中 沖it液使用一氯甲院·甲醇（97:3至95:5)，分離出數種羊 毛甾烧（lanostane)類化合物。 下面結合實施例對本發明做進一步詳細的描述，但不 以此限制本發明。 201106958 實施例一 雲南產茯苓26公斤，以260升含75°/。酒精，加熱萃取 三次’合併酒精萃取液，經減壓濃縮後可得225 2克萃取 物。举取物經定量分析知道每一克萃取物可得76.27毫克 之羊毛甾烧’其中K1 (茯荟酸(pachymic acid)) 33,4亳克， K1-1 (去氫获荟酸(dehydropachymic acid)) 9.59 亳克，K2-1 (块 苓酸(tumulosic acid)) 19.01亳克，K2-2 (去氫块荼酸 (dehydrotumulosic acid)) 6.75 亳克，K3 (多孔覃酸 C (poylporenic acid C)) 5·06 mg，K4 (3-表氫块荼酸 (3-epidehydrotumulosic acid)) 2,46 亳克。 實施例二 實施例一酒精萃取物125克以1.3升二氣甲烷萃取6 次，合併二氯甲烷萃取液，經濃縮後可得22.26克之萃取 物。以95%熱酒精溶解二氯甲烧萃取物，放冷後過濾不溶 物，濾液以水少量加入直到酒精含量為45%為止，此時會 有沉澱產生’用離心方式取沉澱物’可得17 · 4克沉澱物。 經定量分析可得知每克沉澱物含有264.78毫克羊毛甾烷， 其中 K1-1 159.7 毫克 ’ K1-2 56.96 毫克，K2-1 24.43 毫克， K2-2 8.8毫克，K3 9.84毫克’ K4 5.05毫克。該沉殿物經 矽膠薄層層析法檢測證明其不含有開環羊毛留烷。 實施例三 获芬藥材1 0 0公斤以8 0 0公斤水煮沸3小時後，靜置 201106958 :冷卻至5〇°C，以調節溶液至pHU，再授摔溶液 3小時。接著以離心機分離液體和固體，固體再以綱公 斤水加入’同上述方法，以Na〇H|^pHU、㈣和離心 機分離’去掉固體。合併兩次液體，在5〇<t將液體真空濃 縮至100公斤溶液，再加入^^(::丨至pH6 5，產生沈澱物。 分離出該沈澱物，再以40 LH2〇清洗，接著以離心機分離 出沈澱物’加入8 L水噴霧乾燥（spray dry)，得到約38〇 g φ粉末。再以4匕之酒精萃取該粉末三次，合併萃取液並濃 縮可得238.9克酒精萃取物。該萃取物經矽膠薄層層析法 (TLC)檢測證明其不含有開環羊毛甾烷。該萃取物再經過 HPLC分離’每克該萃取物可得主成分為K2 214 mg，K3 23 mg，K4 24 mg及少量成分κΐ 4.52 mg，即萃取物每克約含 205 mg羊毛甾烷。 或以4 L之50%酒精水溶液萃取該粉末，去除5〇%酒 精水溶液部份收取不溶之粉末，重覆三次可得245 7克之 籲50%酒精水溶液不溶物，經TLC法檢測顯示該不溶物不含 開環羊毛留烷，再經過HPLC純化分離該不溶物，每克可 得主成分為K2 214 mg，K3 23 mg，K4 24 mg及少量成分 ΚΙ 4·52 mg’即萃取物每克約含261 mg羊毛甾院。 實施例四 以雲南產茯苓30公斤，磨成粉後，利用120 L酒精（濃 度95%)萃取24小時，及過濾分離。再重復前述萃取及固 液分離三次。合併濾液，並將之濃縮後得乾燥萃取物265.2 201106958 】用兩相萃取劑（己烧：95%甲醇=1 : 1)對該乾燥 萃取物進行分配萃取。取出甲醇層並加予漢縮後得到乾燥 固體246.9克。利用矽膠管柱層析對該乾燥固體進行分離， 該矽膠管柱填充有該乾燥固體重量10-40倍的矽膠，係購 自.心灿公司，Silica gel 60, 70-230 mesh。以二氣甲燒/ 甲醇混合液作為沖提劑（eluent)，依序以96:4、9〇:1〇、 比例的混合液進行沖提，溶離液（eluate)以矽膠薄層層析法 (ThmLayerChromatographyH紫外光燈及碘作檢測，展開 液為二氯甲燒：甲醇=96:4)檢測成分，將相同成分合併。 以一氯甲烷一曱醇（96:4)混合液進行矽膠管柱層析，可 得到屬本發明的茯荟萃取物之PCM部份78克。pCM部份 依上述矽膠薄層層析法可明顯看到6個跡點。以二氣甲 烷.甲醇（90:10)及（0:100)沖提液層析合併可得到pcw部份 168 克。 PCM部份進一步以二氣甲烷：甲醇（96 5:3·5)作為沖提 劑進行矽膠管柱層析（同上述矽膠管柱），進一步分離可得 純化之羊毛甾烷（lanostane)類成分Κ1 (Κ1-1及Κ1_2)，Κ2 (K2_l 及 Κ2-2)，Κ3, Κ4, K4a，K4b，Κ5, K6a 及 K6b。詳細分 離步驟及鑑疋分析數據請參見ep 1535619a1。 上述之K1至K6b化合物’其結構如下： 10 201106958

Kl-l: R2 = OCOCH3 (茯苓酸 (pachymic acid, PA))

Kl-2: R2 = OCOCH3 (微量）（去氫茯苓 酸(dehydropachymic acid，DHPA)) K2-1: R2 = OH (块苓酸(tumulosic acid，K2-2: R2 = OH (微量）（去氫块苓酸

ΤΑ)) (dehydrotumulosic acid, DHTA))

K3: &=013 R5 = H(多孔覃酸 K4:R2= α_0Η R5 = H(3-表脫 虱坱荟酸(3-epidehydrotumulosic acid,

C (polyporenic acid C, PPA)) K4a ： R6=CH2OH R5 = H K6a : = CH3 R5 = OH edhta))

K4b：R2= y5-〇COCH3 R5 = OH

HOOC

K5 11 201106958 從PCM部份分離出來羊毛甾烷化合物K1至K6b的產 量如下表所示。PCM部份含有約15重量％的羊毛留烷化合 物K1至K6b。 K1 K2 K3 K4 K4a K4b K5 K6a K6b 3.0 g 6.2 g 1.93 g 0.55 g 66 mg 86.8 mg 47.6 mg 21.4 mg 90.7 mg 實施例五：膠囊製備 依下列組成製備含有實施例四所製得的茯苓萃取物 PCM成份的膠囊： 成份 每膠囊 每30,000膠囊 以實施例四方法製備的茯苓萃取物 PCM (含約15 wt%的K1-K6化合物） 11.2 mg 336.0 g 碎銘酸納(Sodium silicoaluminate) 5.0 mg 150.0 g 馬龄薯澱粉（Starch Potato) 378.8 mg 11,364.0 g 硬脂酸鎂(Mangensium Sterate) 5.0 mg 150.0 g 小計 400 mg 12,000.0 g 將茯苓萃取物PCM與矽鋁酸鈉分別以#80目（mesh) 篩網過篩，馬鈴薯澱粉以# 60目篩網過篩，硬脂酸鎂以# 40目篩網過篩後，置入混合機攪拌均勻，接著填充入壹號 空膠囊，每顆膠囊含有約1.68 mg (0.42 wt%)的有效成份 K1-K6。 12 201106958 實施例六 获苓三萜類化合物預防及治療第一型糖尿病試驗 進行下列細胞實驗之茯苓萃取物為由實施例二所製得 者或示於圖1的純化合物。它們被溶在酒精：DMS〇 (9:1)溶 媒’所得溶液加入在培養盤上’其中每一個孔（well)僅加入 最後體積之千分之一。 一、脂肪細胞培養 鲁 3T3_L 1為一種老鼠前脂肪細胞，型態為紡綞.狀，當加 入誘導劑培養2-3天後’可以觀察到細胞型態轉為圓型， 而且細胞内有油滴累積’隨著分化天數增加，會分化的越 完全。分化前的細胞’主要的葡萄糖轉運蛋白為GLUT 1， 而分化後的細胞，則主要作用的葡萄糖轉運蛋白為 GLUT4，如細胞膜上的GLUT4蛋白數目愈多，血液中葡萄 糖穿越細胞膜被細胞吸收的速度與量也愈大，血糖下降速 度越快。此3T3-L1脂肪細胞内具有完整的胰島素活化葡萄 • 糖吸收的系統，可以進行糖類代謝與胰島素信息路徑的研 究’另外也可以觀察完整的脂質新生調節過程，因此分化 的3T3 -L1脂肪細胞為一具代表性且應用廣泛的模式細胞 株’.由於人體組織内真正的脂肪細胞難以繼代培養，故學 術界一般使用此模式進行各項試驗及評估。 (a)脂肪細胞培養： 3T3-L1 細胞於 DMEM (Dulbecco，s minimal essentiai medium)及37°C培養箱（5%二氧化碳，95%空氣）中進行 培養’該〇]^1^被添加1〇%成牛血清的（(^1£“1>11111)、1〇〇 13 201106958 IU/mL青黴素、100 gg/mL鏈黴素及1%非必需性胺基酸。 待細胞完全長滿後，加入含脂肪細胞分化促進劑[含〇·5 mM 異丁基甲基黃嘌呤（3-isobutyM-methylxanthane， IBMX )，1 μΜ 皮質類固醇激素（dexamethasone)，10 pg/mL 胰島素]之10%FBS/DMEM培養液培養二天，更換成含有 10 pg/mL胰島素之10%FBS/DMEM培養液中二天後，再以 每二天更換無胰島素培養液乙次進行培養4-6天。此時 3T3-L1細胞將近90%形成月旨肪細胞（adipocyte phenotype) 之型態後即可進行試驗。試驗進行前先以PSS溶液清洗 3T3-L1細胞，再以無血清及無胰島素之0.2% BSA/DMEM 培養液培養過夜，以去除血清及胰I»素之干擾。 (b) 抑制葡萄糖轉運體4基因表達（mRNA)實驗之脂肪細胞 培養· 利用攜帶抑制葡萄糖轉運體4核醣核酸之病毒載體 (TRCN0000043630 shRNA,中央研究院基因體研究中心， 台灣）感染3T3-L1前脂肪細胞（shG4-30)，以建立長期性抑 制葡萄糖轉運體4基因表達，並以此株細胞分化後之脂肪 細胞進行試驗。 (c) 檢測葡萄糖轉運體4轉運蛋白質轉位實驗之脂肪細胞 培養： 將帶有流行感冒病毒蛋白HA標幟之葡萄糖轉運體4 (HA-GLUT4-GFP, Timothy E. McGraw 贈送，美國紐約 Well Gornell 醫學院）載體以 Lipofectamine 2000 (Invitrogen，CA, USA)轉染到3T3-L1前脂肪細胞，並利用 201106958 G418筛檢出持續表達帶有流行感冒病毒蛋白HA標幡之葡 萄糖轉運體4轉運蛋白之脂肪細胞株，分化成脂肪細胞後 進行葡萄糖轉運體4轉運蛋白轉位試驗評估。 二、2-去氧葡萄糖吸收評估 茯苓三結類化合物促進3T3-L1脂肪細胞對於葡萄糖 吸收的測試中，3T3_L1前脂肪細胞被培養於6_孔培養盤 上，待細胞長滿以脂肪細胞分化促進劑進行分化刺激，待 參 7-12天3T3-L1細胞成熟分化成脂肪細胞後，可用以進行葡 萄糖吸收的測試。將前述脂肪細胞先置於無血清培養液（含 0_2% BSA/DMEM)過夜後，以含不同濃度的茯苓三萜類化 合物的無血清細胞培養液，培養2·6小時後，用pBS溶液

洗務一次’改換以KRP緩衝液（20 mM HEPES，137 mM NaCl， 4.7 mM KC1, 1.2 mM MgS04, 1.2 mM KH2P〇4, 2.5 mM CaCl2, and 2 mM 丙酮酸鹽（pyruvate), pH 7_4 及 0.2% BSA)於 37°C 培養3小時後，再使用加入0.2 pCi/mL之[14C] 2-去氧葡萄 鲁糖[2-deoxy-D-[ C]-glucose (2_DG ’ Amersham Biosciences, Little Chalfont，Bucks，U.K.)]和無放射性 O.lmM 2DG 之 0.2 ml葡萄糖緩衝液來取代KRP緩衝液以開始葡萄糖的吸收 實驗。5分鐘後移出細胞並以PBS清洗來終止葡萄糖攝取。 以0.2 mL之0.2 %SDS中溶解細胞並將10 μί之細胞溶離 液轉置至含有過滤底盤之UniFilter盤中（Perkim-Elmer， Wellesley, MA，USA)於37°C真空烘箱中乾燥，並將在每孔 中加入30 gL之計數溶液，利用微盤液體閃爍計數器 (TopCount, Packard NXT, Packard BioScience Company, 15 201106958

Menden，CT，USA)分析。計算出累積在細胞内之葡萄糖含 量’並除以蛋白質濃度，所得攝取速率係以每分鐘每毫克 細胞蛋白質之奈莫耳葡萄糖（nln〇i/min/mg)來表示。蛋白質 /辰度可利用標準二辛可寧酸（Bicinch〇ninic acid ; BCA)試劑 (Pierce，Rockf〇rd，IL，USA)分析來測定。加入 0.2 μ(：ί 之 L-[14C]-葡萄糖以測量非特定葡萄糖的攝取，並與每個測定 值中相減’而得到特定葡萄糖攝取量。觀察3T3_L1脂肪細 胞在不同濃度的茯苓三萜類化合物的作用下對葡萄糖的吸 收是否有所影響。 三、對葡萄糖轉運體1及4(GLUT1&4)轉運蛋白之評估

茯苓三萜類化合物促進3T3_Li脂肪細胞之葡萄糖轉 運體表達之測試中’同上述說明分化成熟之3T3_L1脂肪細 胞以無血清細胞培養液培養過夜後，以含不同濃度之茯苓 三萜類化合物之無血清細胞培養液培養24小時，再以PBS 溶液清洗，接著以0.2 ml溶解細胞液[1% NP-40，150 mM NaCl, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 10 mM EDTA, 0.5% 去氧膽酸鹽（deoxycholate)，1 mM PMSF，1 mM Na3V04, l〇 mM NaF, 10 mM β-磷酸甘油酯 (glycerophosphate)，l〇 pg/mL蛋白酵素抑制劑和磷酸酯酶 (phosphatase)抑制劑]作用30分（4°C溫度下）。每一樣品經 SDS-10%聚丙烯酿胺（p〇iyacryiamide)電泳分離，轉潰至 PVDF 膜（Millipore，Bedford, MA，USA)。利用西方點墨法 以專一性抗體，葡萄糖轉運體1抗體（GLUT1，Abeam， Cambridge, ΜΑ),葡萄糖轉運體 4 抗體（GLUT4，R&D 16 201106958 systems, Minneapolis，MN)，及 β-肌動蛋白抗體（β-Actin， Chemicon，Temecula, CA，USA)，來觀察 3T3-L1 脂肪細胞 在不同濃度的茯苓三萜類化合物的作用下對葡萄糖轉運體 蛋白質表達是否有影響。每一個樣品（蛋白）以化學冷光處 理，再暴露在X光片，再以軟體分析含量。 四、 葡萄糖轉運體1及4 (GLUT1 & 4)轉運蛋白之基因表達評估 利用即時定量聚合酵素鏈鎖反應（Q-PCR)對3T3-L1脂 肪細胞在不同濃度的茯苓三萜類化合物的作用下對葡萄糖 ^ 轉運體訊息核醣核酸（mRNA)之表達進行評估。將分化完全 之3T3-L1脂肪細胞，給予不同濃度的茯苓三萜類化合物24 小時後，去除細胞培養液後，用Trizol試劑（Invitrogen, Irvine, CA，USA)提取總RNA，並取1 RNA利用反轉錄試 #J (High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits, Applied Biosystems, Darmstadt, Germany)將 mRNA反轉錄 成cDNA。分別針對葡萄糖轉運體1、葡萄糖轉運體4及β-肌 鲁 動蛋白，設計出專一引子（primer)，及利用SYBR Green Q-PCR分析（Applied Biosystems, Foster City，CA，USA)擴 增待測基因（GLUT1及GLUT4)及内參基因（β-actin)，並以 StepOne v2.0 software (Applied Biosystems)軟體以△△Ct方 法計算相對因表達值。 五、 對葡萄糖轉運體4轉運蛋白轉位之評估 (1)對葡萄糖轉運體4轉運蛋白轉位分析(一） 因胰島素促進脂肪細胞或肌肉細胞之葡萄糖吸收之機 轉中，葡萄糖轉運體4 (GLUT4)轉運蛋白從細胞内胞器轉 17 201106958 位（translocation)到質膜（piasma membrane (PM))扮演重要 角色，故進行以茯苓三萜類化合物促進3T3-L1脂肪細胞之 葡萄糖轉運體4轉運蛋白轉位到質膜之測試。分化成熟之 3T3-L1脂肪細胞以無血清細胞培養液培養過夜後，再以含 不同濃度之茯苓三箱類化合物之無血清細胞培養液培養2 小時，接著以不同轉速高速離心（16,000幺〜200,000 g) ’將 細胞之質膜部份（plasma membrane (PM) fraction)及低密度 微粒體（low density microsome (LDM))分離出（Liu, L. Z. 等；Mo/ 价〇/· CW/ 17，（5)，2322-2330，2006)。利用西方點 墨法以葡萄糖轉運體4的專一性抗體來觀察3T3-L1脂肪細 胞在不同濃度的茯苓三薛類化合物的作用下對葡萄糖轉運 體4轉運蛋白從細胞之LDM轉位到質膜（PM)是否有影響。 (2)對葡萄糖轉運體4轉運蛋白轉位分析(二） 將穩定表達HA-GLUT4-GFP蛋白之3T3-L1前脂肪細 胞種於96孔培養盤，待長滿後以分化促進劑進行分化 (Govers，R.等；Mo/ Ce// 5z‘o/· 24 (14)，6456-6466, 2004)。 將分化完全之3T3-L1脂肪細胞，給予不同濃度的茯苓三萜 類化合物2小時，去除細胞培養液’用冰PB S清洗細胞。 再以4%三聚甲路（paraformaldehyde)於室溫下固定細胞15 分鐘，接著以冰PB S清洗2-3次，再加入針對HA之一級 抗體（12CA5 )培育2小時。以冰PBS清洗2-3次，加入 共輕架接螢光染料鹽基桃紅精之二級抗體 (rhodamine-conjugated secondary antibody)(Leinco, Ballwin, MO)培育細胞1小時。以冰PBS清洗2-3次，再以螢光免 18 201106958 疫分析儀（POLARstar Galaxy; BMG Labtechnologies, Offenburg，Germany)分別偵測鹽基桃紅精（rhodamine)及綠 色勞光蛋白（GFP)之激發波長強度（Ειη. 480/Ex. 425 nm及 Em· 5 76 nm/Ex. 550 nm) ’並以鹽基桃紅精對綠色螢光蛋白 之比值評估HA-GLUT4-GFP轉位之質膜之相對量。因為僅 有在HA-tagged GLUT4移位到質膜上時，才會被鹽基桃紅

精標識’故此比值可用來評估葡萄糖轉運體4轉運蛋白轉 位到質膜之情形。 六、三酸甘油酯堆積及甘油釋放之影響 在获令二％類化合物對3 T3 _L 1脂肪細胞内的三酸甘

油酯堆積和甘油之釋出的測試中，已分化成熟之3T3_L1脂 肪細胞以無血清細胞培養液培養過夜，再以含不同濃度之 茯苓二萜類化合物之無血清細胞培養液培養24小時。收集 培養液以甘油檢測試劑（glycerol assay kit (Rand〇X

Laboratories, Antrim，UK))進行甘油釋出檢測，觀察 3T3_L1 月曰肪細胞在不同濃度的茯苓三箱類化合物的作用下對脂肪 刀解的甘/由釋出疋否有所影響。脂肪細胞内三酸甘油酯檢 測利用油紅染色法（〇il Red 〇 staining)進行 (Ramirez-Zacarias，j· L 等；勤__心 97, (6), 493-497,1992)。將細胞内脂質堆積形成的脂肪油滴染色， 紅60〇/〇異丙醇洗務二次，再以刚％異丙醇萃取後，檢測 柳⑽吸光值。以未給予衫三㉝類化合物之脂肪細胞之 °光值進行比較’來怦估不同濃度的茯苓三萜類化合物作 用下對脂肪細胞的三酸甘油0旨堆積之影響。 19 201106958 實驗結果說明茯苓三結類化合物如同胰島素一樣具備 下列四種性質，因此具有治療第一型糖尿病患的能力： (一）茯苓成分或萃取物於脂肪細胞模式下具促進葡萄 糖從細胞外吸收進入細胞内之能力： 茯苓萃取物（實施例二）在成熟脂肪細胞之評估，如圖 2A結果顯示援荟萃取物具有顯著增加葡萄糖吸收之作 用，其促進吸收效果隨給與劑量增加而增加。如給予1 〇〇 nM 胰島素則一樣看到葡萄糖吸收。進一步以實施例二之純化 合物作試驗。如圖2B所示’純化合物給予脂肪細胞二小時 後，其中三個化合物茯苓酸（PA)、块苓酸（TA)及多孔覃酸C (PPA)於〇.〇1 μΜ顯著增加糖吸收分別增加至165.89 %， 142.5 %及147.9 %。其中以ΡΑ增加程度最為顯著，故後續 試驗之評估均以ΡΑ進行試驗。 圖3 Α顯示’ ΡΑ隨投予時間之增加而促使糖吸收隨之 增加’而以投予2小時之增加最為顯著（增加165 89%)另 外’ PA隨投予濃度之增加，糖吸收之促進程度亦隨之增 加，1 μΜ PA時，增加至209.84%，如圖3B所示。 如圖4結果所示，ΡΑ促進糖吸收效果僅對已分化之脂 肪細胞’對於前脂肪細胞ΡΑ無促進葡萄糖吸收之效果。如 對則脂肪細胞及成熟脂肪細胞二者給予葡萄糖轉運體轉運 蛋白抑制劑（PT，phloretin)後觀察到二種細胞之促進吸收能 力大幅被抑制。跟據文獻前脂肪細胞僅有葡萄糖轉運體 (GLUT 1)轉運蛋白，而成熟脂肪細胞則為葡萄糖轉運體_4 20 201106958 (GLUT4)轉運蛋白，故PA之作用應為增加GLUT4而增加 糖吸收。 (二） 茯苓三萜類化合物PA對成熟脂肪細胞有顯著誘 導葡萄糖轉運體4轉運蛋白質（GLUT4)及信息核醣核酸 (mRNA)之表達 圖5結果顯示，對成熟脂肪細胞給予不同劑量之PA， 作用24小時後，以西方點墨法分析葡萄糖轉運體1及4轉 運蛋白（GLUT1，4)，進行評估PA對GLUT1及GLUT4轉運 ^ 蛋白表達的影響，結果PA具促進GLUT4轉運蛋白表達之 效果（圖5A)，而其不具有促進GLUT1轉運蛋白之表達效果 (圖 5B)。 以定量聚合酵素鏈鎖反應（Q-PCR)及以專一之探針來 觀察PA對成熟之3T3-L1脂肪細胞在不同濃度作用下對葡 萄糖轉運體訊息核醣核酸（mRNA )之表達進行評估，圖6 結果顯示，1 μΜ PA促進GLUT4基因表達至228%。顯示 φ ΡΑ具調節增加GLUT4基因及蛋白質表達之能力。另外利 用干擾訊息核醣核酸技術建立持續性降低GLUT4轉運蛋 白之3T3-L1脂肪細胞（圖7Α)，並以此脂肪細胞進行糖吸收 評估，如圖7Β所示，所有ΡΑ之不同劑量均無法促進該脂 肪細胞之糖吸收，進一步證實ΡΑ之促進糖吸收與GLUT4 轉運蛋白有直接關係。 (三） ΡΑ對成熟脂肪細胞具有促進GLUT4轉運蛋白從細 胞内轉位移至質膜之功效 胰島素促進糖吸收之機轉之一為促使大量GLUT4由 21 201106958 細胞内胞器轉位到質膜（PM)上進行糖吸收。故利用具備完 整的胰島素活化葡萄糖吸收的系統的3T3_L1成熟脂肪細 胞進行GLUT4轉運蛋白轉位效能評估。由圖8八結果觀察 利用超高速離心方法所分離之質膜（PM)之西方點墨法觀察 到0.01 μΜΡΑ顯著增加GLUT4於質膜量達到141%，隨劑 量增加到1 μΜ則增加至328%。而利用持續表達 HA-GLUT4-GFP蛋白之3T3-L1脂肪細胞方式及螢光檢 測，再次確認ΡΑ促進糖吸收為增加GLUT4轉運蛋白轉位 移到質膜所導致。圖8B結果觀察到於PA劑量丨〇μΜ時 GLUT4轉運蛋白轉位到質膜顯著增加達2 71倍。上述結果 證實ΡΑ確實具有促進GLUT4轉運蛋白轉位到質膜之能力。 (四）P A具促進脂肪細胞三酸甘油酯累積及減少脂肪細 胞釋放甘油至細胞培養液之能力 除了觀察PA促進糖吸收，也觀察脂肪細胞之影響，我 們評估脂肪細胞三酸甘油酯合成（儲存）及脂肪分解（甘油釋 出）情形。圖9結果所示，給予不同劑量之pA 24小時候，以 /由紅染色方法s平估二酸甘油酯累積情形，觀察到三酸甘油 酯累積超過137%，PA給予也觀察到甘油釋出降至原本7〇% 以下。顯示PA具有促進脂肪新生及抑制脂肪分解之能力。 【圖式簡單說明】 圖1示出由茯苓分離純化所得之羊毛留烷型三結類化 合物的結構。 22 201106958 圖2A顯示茯苓萃取物促進3Τ3_μ脂肪細胞糖吸收。 圖2B顯示胰島素（〇」_作肖3〇分鐘及純化之三箱類化 合物於0.(Η μΜ劑量二小時反加糖測試下促進糖吸收。數 據以平均值土標準誤差（η=6)表示。*p<〇 〇5，H 與對 照組（不給藥）比較❶ ’ 圖3Α顯示茯荟酸（ΡΑ)於〇 〇1 μΜ劑量下給予二小時吸 收速率最高。圖3Β顯示給予不同劑量之pachymic心（ρΑ) 籲隨劑量增加，糖吸收有增加趨勢。ρΑ作用2小時後，再加 入糖測驗，數據以平均值±標準誤差（η=6)表達，*ρ<〇 〇5， **ρ<0.01與對照組（不給藥）比較 圖4顯不ΡΑ促進糖吸收僅作用於分化成熟之脂肪細 胞。如將未成熟與成熟脂肪細胞除加入ρΑ處理2小時外， 另外加入或不加入葡萄糖轉運蛋白抑制劑（ΡΤ)則顯著抑制 二種細胞之糖吸收作用也抑制ΡΑ之糖吸收促進作用。數據 以平均值土標準誤差（η=6)表示。*ρ<〇.〇5，**ρ<〇.〇1與對照 _ 組比較。 圖5Α顯示ΡΑ不具有促進葡萄糖轉運體1 (GLUT1)轉 運蛋白表達之能力。而圖5Β顯示pa具有促進葡萄糖轉運 體4 (GLUT4)轉運蛋白表達之能力。分化成熟細胞以不同 濃度ΡΑ處理24小時，然後分析gLUT1及GLUT4轉運蛋 白’數據以平均值士標準誤差（n=3)表示。*ρ<〇,〇5，**ρ<〇.〇ι 與對照組（不給藥）作比較。 圖6顯示PA具有促進GLUT4 mRNA表達的能力，其 中分化成熟細胞分別以胰島素（01 μΜ)及0.01 μΜ PA處理 23 201106958 24小時’然後分析GLUT1及GLUT4 mRNA之表達，數據 以平均值±標準誤差（n=3)表示。*ρ<〇.〇5’ **ρ<〇.〇ι與對照 組作比較》 圖7顯示對抑制GLUt4 mRNA的表達的脂肪細胞PA 不具促進糖吸收之能力。成熟脂肪細胞與抑制GLUT4 mRNA表達的脂肪細胞（shG4-30)二者以不同濃度pa及膜 島素處理’然後分析GLUT4轉運蛋白（圖7A)及其糖吸收能 力（圖7B)，數據以平均值士標準誤差（n=6)表示。*ρ<〇 〇5， **ρ<0·01與對照組作比較。 圖8Α、通過分析由離心方法分離的不同細胞膜層之 GLUT4轉運蛋白，顯示ΡΑ具有促進葡萄糖轉運體4轉運 蛋白從細胞内胞器轉運到細胞膜之能力。圖8Β、以螢光分 析完整細胞之細胞膜層之GLUT4轉運蛋白，顯示ΡΑ具有 促進GLUT4從細胞内胞器轉運到細胞膜之能力。數據以平 均值±標準誤差（η=3)(圖8Α)，（η=6)(圖8Β)表示。汁<〇〇5, **ρ<0.01與對照組（不給藥）作比較。 圖9顯不ΡΑ具有促進脂肪細胞三酸甘油酯合成及抑制 脂肪分解（產物甘油）產生之能力。成熟之脂肪細胞以胰島 素（0.1 μΜ)及不同濃度ΡΑ處理24小時，數據以平均值土標 準誤差（η=6)表示。*ρ<0.05 ’ **ρ<〇 〇1與對照組作比較。 24

Claims (1)

1. 201106958 七、申請專利範圍： 1. 一種使用具下列化學式（I)的羊毛甾烷或其醫藥上可接 受的鹽作為有效成分在製備一種用於治療哺乳類動物因 血中胰島素不足所引起的糖尿病藥物的用途，

   (I) 於式中1^為11或 CH3; R2 為OCOCH3, =0 或 OH; R3 為 Η或 OH ; R4 為-C(=CH2)-C(CH3)2Ra，其中Ra為 Η或 OH，或 -CH=C(CH3)-Rb，其中 Rb為 CH3 或 CH2OH ; R5 為 Η或 OH ;及 Φ R6 為 CH3 或 CH2OH。 2.如申請專利範圍第1項的用途，其中該羊毛甾烷（I)具有 下列化學式：

   25 201106958

   3.如申請專利範圍第2項的用途，其中該羊毛甾烷（I)具有 下列化學式： 26 201106958

   4. 如申請專利範圍第1項的用途’其中該藥物為注射劑型。 5. 如申請專利範圍第i項的用途’其中該藥物為α服劑型。 6. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該糖尿病為第一型 糖尿病。 7. 如申請專利範圍第1項的用途’其中該糖尿病為第二型 糖尿病。 8. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該哺乳類動物為人 類。 9. 一種使用茯苓萃取物作為有效成分在製備一種用於治 療哺乳類動物因血中胰島素不足所引起的糖尿病藥物的 用途’其中該茯苓萃取物包含1-60重量％的具申請專利範 圍第1項所述的羊毛甾烷（I)且實質上不含開環羊毛甾烷。 27 201106958 ίο 11 .如申請專利範圍第9項的用途，其中該茯苓萃取物包含 包含5-35重量％的羊毛留烷（I)。 .如申請專利範圍第9項的用途，其中該羊毛甾烷（I)具有 下列化學式：

   28 201106958

   12. 如申請專利範圍第9項的用途，其中該藥物為口服劑型。 13. 如申請專利範圍第9項的用途，其中該糖尿病為第一型 糖尿病。 14. 如申請專利範圍第9項的用途，其中該糖尿病為第二型 糖尿病。 15. 如申請專利範圍第9項的用途，其令該哺乳類動物為人 類0 29