TW201034676A - Pharmaceutical compositions - Google Patents

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201034676 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明關於用於原位腫瘤破壞療法之醫藥組成物，該 療法包含腫瘤破壞及投予免疫刺激量之免疫增強劑的步驟 ，及關於該醫藥組成物於製造藥物上之用途。 【先前技術】 0 癌症係用於描述贅瘤生長之總稱。贅瘤被視爲異常、 通常爲去分化型式之組織，並且經常以高於正常之速度增 生。在大部分情況中，贅瘤細胞侵入周圍組織而且會轉移 並在身體他處繼續生長。 贅瘤實體（腫瘤）之局部及區域性治療（諸如手術） 無法影響可能的轉移。因此，需要額外療法（諸如細胞毒 性藥物之治療）。該治療通常被稱爲化學療法。 局部治療當然是治療實質腫瘤的第一步。此通常由腫 Q 瘤切除之方式進行。另一方法係原位腫瘤破壞。原位腫瘤 破壞之特徵在於該腫瘤不是被移除而是使之壞死。原則上 ，放射線係原位腫瘤破壞之一種型式，但是許多其他腫瘤 破壞之方式已被發展。常用之方法爲例如使用光敏性化合 物與彼等經雷射後續活化之組合的光動力療法、藉由雷射 光、微波、電流、超音波、高強度聚焦超音波或藉由高頻 波所進行之原位加熱、或藉由冷凍使組織壞死之冷凍療法 〇 原位腫瘤破壞使經破壞之腫瘤實體留在體內。此導致 -5- 201034676 嘗試及建立對腫瘤特異性抗原之免疫反應的可能性（癌症 免疫療法）。成功誘導對腫瘤特異性抗原之免疫反應的優 點在於，該免疫反應將持續一段時間，最後清除位於體內 他處無法經局部腫瘤破壞之腫瘤。然而，與基於非自體抗 原之疫苗發展所知不同的是，誘導拮抗腫瘤抗原之免疫反 應並不容易。 基本上，腫瘤抗原主要是身體之正常成分，也就是自 體抗原。因此，免疫系統就此而論將下調自體導向之免疫 反應，導致耐受自體抗原之狀態。因此，基於腫瘤破壞之 癌症免疫療法的發展需要非常特別的方式。 事實上，非甲基化之胞苷鳥苷寡去氧核苷酸（CpG ODN )目前被認爲是能誘發拮抗腫瘤特異性自體抗原之免 疫反應的一群最佳之免疫增強化合物。這些胞苷鳥苷寡去 氧核苷酸係作爲類鐸受體9 (TLR9)之拮抗劑。CpG模體脫 穎而出，因爲彼等優先地誘導Thl反應及腫瘤特異性CD 8 + T淋巴細胞。T L 9主要係由B細胞及樹狀細胞（D C )表現， 樹狀細胞內化CpG模體且直接與CpG模體反應。當觸發 TLR9時，DC成熟且移動至弓[流淋巴結，在該處呈現抗原 予T及B淋巴細胞。重要的是，這些DC獲得在第I型MHC分 子上呈現捕捉抗原之獨特能力，此過程稱爲交叉呈現，係 有效促發（priming)腫瘤特異性CTL之關鍵。因此，CpG 之投予已被報告用於預防性情況以防止腫瘤過度生長且亦 可清除小鼠體內已建立之腫瘤。Nierkens, S. et al. (Cancer Res. 68: 5390-5396 (2008)) S. Roux, S. et al. 201034676 (Cancer Immunol. Immunoth. 5 7: 1 29 1 - 1 3 00 (2008)) ° 然而，CpG ODN之使用上有一些潛在的安全考量，除 其他外包括誘導抗DN A抗體及自體免疫性。另外’當以較 高之量及較長之時間期間給予時’彼等之毒性以及與彼等 之使用有關之費用値得注意。 因此，有對其他免疫增強化合物之需求。 0 【發明內容】 本發明提供降低或克服上述考慮之方法。 由於TLR9及彼之拮抗劑在原位腫瘤破壞後誘導拮抗腫 瘤特異性抗原之免疫反應上至爲重要’技藝人士會將該其 他免疫增強化合物亦具有TLR9拮抗劑之作用視爲前提。 令人意外的是，現在發現與TLR9機制完全無關之皂素 卻非常適用於在腫瘤破壞後誘導拮抗腫瘤特異性自體抗原 之免疫反應。甚至更超出預期的是，皂素雖然經由未知機 Q 制作用，但是彼等之有效性似乎與CpG相等或甚至優於 CpG。發現在腫瘤破壞時或靠近腫瘤破壞時投予皂素至腫 瘤內或腫瘤周圍，在原位腫瘤破壞後誘發非常顯著之拮抗 腫瘤特異性抗原之免疫反應。此免疫反應係長期的，因此 非常適合清除轉移細胞，即使該等細胞已經潛伏存在體內 。另外，即使在治療後數週故意投予大量相同類型之腫瘤 細胞，此強烈之免疫反應似乎足以預防該等細胞之增殖。 皂素到目前爲止僅被描述作爲拮抗非自體抗原之佐劑 :例如在細菌性或病毒性疫苗中。使用皂素作爲細胞毒素 201034676 以殺滅腫瘤細胞已由Bachran, C. et al. (Medicinal Chemistry 8: 5 7 5 - 5 8 4 (2 0 0 8 ))描述。P C T 申請案 W O 2008/063 1 29描述在含脂顆粒中使用皂素以作爲殺滅腫瘤 細胞之細胞毒素。 然而在本發明中，彼等之細胞毒性作用並不重要，因 爲皂素係與已經在腫瘤破壞過程中被殺滅之細胞組合使用 。由於彼等之細胞毒性作用並不重要，因此不預期對該破 壞腫瘤產生任何作用。另外，皂素於化學療法中之細胞毒 性作用僅在投予時有效。它們不產生免疫反應，因此不會 對暫時具有低代謝活性之轉移細胞（潛伏細胞）發揮作用 〇 在原位腫瘤破壞後，皂素在誘發拮抗腫瘤特異性自體 抗原之免疫反應上的角色到目前爲止是未知的，且因爲上 述原因而無法被預期。 因此，本發明之第一實施態樣關於用於原位腫瘤破壞 療法之醫藥組成物，該療法包含腫瘤破壞及投予免疫刺激 量之免疫增強劑的步驟，其中該免疫增強劑係皂素。 皂素原則上係一群植物糖苷之統稱，其中皂皮樹（ Quillaja saponaria)皂素最古老且最常被使用。粗皂素實 際上係具有相同基礎結構但有不同側鏈之皂素的混合物。 不同皂素成份之主要差異在於彼等親水性/疏水性之程度 ° HP LC係從粗皂素混合物中偵測及分離各種皂素成份之 較佳方法。一些經純化之萃取物諸如Q S _ 7、Q S - 1 7、Q S -1 8 、QS-21、GPI-0100、QuilA、Qvac及 BioQ可自許多來源購 201034676 得。較佳的是，皂素包含下列成分中至少一者：QS-7、 QS-17、QS-18或QS-21。亦佳的是，皂素爲QuilA及彼之成 份、Vax Sap、SuperSap、GPI-0100、QP UF 1 000 或該類 似物。 因此，此實施態樣之較佳型式關於本發明之醫藥組成 物，其中該皂素包含下列成分中至少一者：QS-7、QS-17 ' QS-18、QS-21、QuilA、Vax Sap、SuperS ap ' GP1-0100 0 或 QP UF 1 000。 另一引人注意之皂素免疫刺激型式係所謂的空白免疫 刺激複合物（空白I s C Ο M S )。空白免疫刺激複合物製劑 與皂素之不同之處在於，彼等係從皂素、脂肪及膽固醇之 混合物製備。在彼等之製備期間形成小型微胞樣（ micelle-like )顆粒，這些顆粒的免疫增強性就此而言甚至 高於皂素。 因此，此實施態樣之另一較佳型式關於本發明之醫藥 〇 組成物，其中該皂素係呈空白免疫刺激複合物之型式。 不用多加說明的是，本發明同樣適用於人及獸醫醫學 之領域。 由於皂素在一方面與CpG ODN在另一方面具有不同之 作用模式，因此無法預期組合投予二者可達任何增強效應 。然而，意外發現皂素與CpG ODN之組合使用具有強烈之 協同效應。此非預期之協同效應係有利的，因爲這使CpG ODN在與皂素組合投予時可能可以使用次標準量。此因而 明顯地減少如上所述之使用CpG ODN之缺點。就此而言’ -9 - 201034676

CpG ODN之使用再次變得令人注意，前提是它們與皂素組 合投予。 皂素與CpG之組合使用已在美國專利US 7(M9302中被 描述爲誘導拮抗非自體抗原之免疫反應的佐劑，由於上述 之原因可預期拮抗自體抗原之組合效應但遑論協同效應。 因此，此實施態樣之更佳型式關於本發明之醫藥組成 物，其中該醫藥組成物額外包含CpG ODN。 用於免疫刺激之CpG ODN自1 994年起已被描述（美國 專利US 6429 1 99 ) 。CpG模體基本上具有S’-Xi-C-pG-Xz-〗’ 之結構。CpG模體5’-Pu-Pu-CpG-Pyr-Pyr已知係免疫增強性 最強者之一（Scheule, R.K·，Advanced Drug Delivery Reviews 44:1 1 9- 1 34 (2000))。基本上，彼等之長度係介 於8至80個鹼基，且包含至少一個非甲基化之CpG模體。 在不同動物物種間之微小效率差異經常可見。僅供舉 例而言，人TLR9係理想地由CpG模體G-T-CpG-T-T觸發， 然而小鼠TLR9係更理想地由G-A-CpG-T-T觸發（Krieg, A.M.，Nature Medicine 9: 8 3 1 -8 3 5 (2 003 ))。 7個獸醫物種及3個實驗室物種之理想CpG模體已由 Rankin, R., et al., in Antisense and Nucleic Acid Drug Development 1 1: 3 3 3 -3 40 (200 1 )描述。有效刺激犬及貓免 疫細胞增生之CpG模體係由Wernette, C.M., et al.，in Veterinary Immunol. And Immunop ath. 84: 2 2 3 -23 6 (2002) 描述。CpG模體於禽類之應用已由除其他外Ameiss, K.A., et al., in Veterinary Immunol. And Immunopath. 1 1 0: 257- -10- 201034676 267 (2006)描述。 具有不同CpG模體之CpG ODN可輕易地購得，且若有 需要可被輕易地合成。CpG ODN之適當量可見於上述除其 他外之出版物及實施例之部分。 同樣的如上所述，不用多加說明的是，本發明同樣適 用於人及獸醫醫學之領域，但是建議（雖不強制）符合本 發明所使用於該動物物種之CpG模體。此可輕易地根據上 0 述摘列之出版物進行。 原則上，腫瘤破壞及投予免疫增強劑的步驟可在不同 的時間點或相同時間點進行。然而理論上，預期在進行腫 瘤破壞之數天前或較佳一週前或甚至二週前或超過二週前 利用免疫增強劑調理腫瘤，連同「促發」免疫系統之協助 ，將爲較佳之途徑。然而意外發現的是，若投予免疫增強 劑係於腫瘤破壞後進行，即腫瘤破壞後數天內，較佳爲一 天內，更佳爲1 2小時內，甚至更佳爲6小時內，仍更佳地 0 是腫瘤破壞後之2小時內，免疫刺激之量相較於該等步驟 之順序相反時爲佳。 當投予免疫增強劑係於腫瘤破壞前約2小時至破壞當 時之間進行時，亦能獲得非常好的結果。此係因爲贅瘤實 質在經破壞後可能因爲破壞誘發之彼之結構改變而更難以 接近或進入。在腫瘤破壞前2小時及腫瘤破壞後2小時之間 的間隔投予免疫增強劑係所謂的圍手術期投予。 因此，此實施態樣之一較佳型式關於一種用於原位腫 瘤破壞療法之醫藥組成物，該療法包含腫瘤破壞及投予本 -11 - 201034676 發明之免疫增強劑的步驟，其中該等步驟係呈下列順序： a.破壞腫瘤， b .投予免疫增強劑。 此實施態樣之更佳型式關於如上述順序之步驟，其中 免疫增強劑之投予按優先順序排列係在腫瘤破壞後之24小 時內、1 2小時內或甚至6小時內進行。 同樣的，此實施態樣之另一較佳型式關於一種用於原 位腫瘤破壞療法之醫藥組成物，該療法包含腫瘤破壞及投 予本發明之免疫增強劑的步驟，其中該等步驟係： a. 圍手術期投予免疫增強劑， b. 破壞腫瘤。 關於投予免疫增強劑之部位或多個部位，應進行下列 考慮·’較佳的是，該免疫增強劑係直接投予至贅瘤實質內 。雖然稍微不那麼優先，亦可能在贅瘤實質周圍的一或多 個位置投予免疫增強劑以進行圍腫瘤投予。再者，雖然較 不優先的投予係在贅瘤實體引流區之皮下投予。最後，較 佳地接近贅瘤實質位置之靜脈內投予亦爲可能。 因此，該免疫增強劑之投予按漸增之優先順序係藉由 靜脈內投予、贅瘤實體引流區之皮下投予、腫瘤周圍投予 或腫瘤內部投予發生。 本發明之另一實施態樣關於本發明之醫藥組成物於製 造用於治療罹患癌症之哺乳動物的藥物上之用途，其中該 哺乳動物已接受腫瘤破壞。 本發明之另一實施態樣關於本發明之醫藥組成物於製 -12- 201034676 造供圍手術期投予以治療罹患癌症之哺乳動物的藥物上之 用途，其中該哺乳動物將接受或已接受腫瘤破壞。 【實施方式】 實施例1 小鼠及腫瘤細胞 C57BL/6n小鼠（6至8週齡）係購自查爾斯河維加（ Charles River Wiga )公司（德國敘爾次費爾德市（ Sulzfeld ))，並飼養於無特定病原屏障條件之中央動物 實驗室（荷蘭奈梅亨市（Nijmegen ))。飲水及標準實驗 室顆粒飼料隨時充分供給（ad libitum ) ’在隨機分配至 特定治療組之前允許小鼠適應至少1週。該實驗係根據奈 梅亨動物實驗委員會之動物照顧指南進行。 小鼠黑色素瘤細胞系B 1 6F 1 0 ( ATCC )係培養於完整 培養基（MEM，5 %胎牛血清（格瑞納（Greiner Bio-one) Q ) 、100 U/ml青黴素 G鈉及 100 # g/ml鏈黴素（Pen/Strep ) 、MEM 丙酮酸鈉（lmM) 、NaHC03、MEM 維生素、MEM 非必要胺基酸（所有均購自吉布可（Gib co ) > 20 μ Μ β 乙醇（召-ΜΕ))。 腫瘤模型及冷凍手術 腫瘤細胞係懸浮於PBS及Matrigel (2:1)之混合液中， 將總體積5 0微升之0.5 * 1 06細胞經皮下注射至右側股骨部位 。當所測量之腫瘤直徑達6-8毫米（通常爲第9-10天），將 -13- 201034676 小鼠隨機分配至治療組。在異氣院（isoflurane ) /O2/N2O 之麻醉下，使用液態氮冷凍消融系統（CS76，康乃迪克州 雪頓市費吉多尼克公司（Frigitronics))進行冷凍消融（ Cryo )，該系統之尖端係由連續流動之循環液態氮冷卻。 在2個冷凍及解凍之治療週期期間，腫瘤被巨觀地冷凍， 同時使周圍健康組織維持完整。爲了監測長期腫瘤保護之 誘導，在冷凍消融後40天再次以15*103 B160VA或B16F10 細胞挑戰小鼠。再次挑戰係於1 00微升之PBS經皮下注射於 右脅腹。當腫瘤體積超過1000立方毫米或當腫瘤突破皮膚 屏障時，將小鼠犧牲。 佐劑注射 具有全部經硫代磷酸酯修飾之骨架的C p G 1 6 6 8 ( 5 ’ -TCCATGACGTTCCTGATGCT-3’）係購自西格瑪公司（ Sigma Genosys )(英國黑弗里爾（Haverhill) ) 。CpG 係 以PBS注射於圍腫瘤區（30微克分成2次圍腫瘤注射10微升 至消融腫瘤）。使用下列佐劑（所有均由博克斯梅爾（ Boxmeer)之英特威公司（Intervet BV)供應）：以礦物 油（Mar col 52 )爲基底之油包水乳液（1 )及以非礦物油 (Miglyol 840 )爲基底之油包水乳液（1 ):使用礦物油 之水包油乳液、使用鯊烯之水包油乳液（2 ):及使用乙 酸維生素E之水包油乳液（3 ) ; Matrix C 75 0 g/ml (伊 思科諾華公司（Isconova) ) ;Quil A皂素500/zg/ml (步 朗德公司（Brenntag ));氫氧化鋁0.75% (重量/體積 -14- .201034676 )(步朗德公司）：或磷酸鋁0.75% (重量/體積）（步朗 德公司）。在此物品中，該二種油包水乳液係以1 : 1比例 混合，該三種水包油乳液係以1 : 1 : 1比例混合。以鋁爲基底 之佐劑係以1 : 1比例混合使用，但也可分開使用。所有非 微生物性佐劑（或彼等之混合物）係以圍腫瘤方式注射（ 40微升分成2次20微升之注射，空間上與CpG-ODN注射分 開）。所有注射係於消融後3 0分鐘內進行。（1 : J a n s e n e t al, Vaccine, 23, 1053-1060, 2005, 2: O’Hagan Expert Re. Vaccines, 6，6 69-7 1 0, 2007, 3: Rijke et al, in A d v. Avian Immunol. Res. Eds. T. F. Davison, N. Bumstead and P. Kaiser 265 -2 7 1, 1 995 ) 統計分析 卡普蘭-邁耶（Kaplan Meier)存活曲線係利用對數秩 檢定分析。 〇 結果 由圖1之曲線可清楚得知，腫瘤破壞及投予CpG ODN 作爲免疫增強劑之組合導致80天後低於50%之存活率。另 外，存活曲線並未顯著變平（圖1 a )。腫瘤破壞及投予水 包油、油包水或A10 Η佐劑作爲免疫增強劑之組合均導致 較低之保護（圖lb及lc)。然而，腫瘤破壞及投予皂素（ 該皂素係呈Quil A或空白免疫刺激複合物之型式）作爲免 疫增強劑之組合導致80天後令人印象深刻之存活率> 75% -15- 201034676 。另外在此例中，該存活曲線顯著變平（圖1 c )。 腫瘤破壞及組合投予CpG與皂素（該皂素係呈QuU a 或空白免疫刺激複合物之型式）以作爲免疫增強劑之組合· 導致80天後甚至更高之存活率> 90%，及該存活曲線非常 強烈的變平（圖1 d )。 【圖式簡單說明】 圖1 :消融與CpG-ODN及皂素基底佐劑組合後之有效 抗腫瘤免疫性。在右側股骨所建立之B 1 6F 1 0腫瘤係經單獨 冷凍消融、與C p G組合、或與所示之非微生物性佐劑組合 治療。經過40天後，未經處理及無腫瘤之小鼠於腹脅部接 受腫瘤細胞（1 5000個B16F 10細胞）之皮下再次攻擊。每2 至4天監測腫瘤體積。（A )卡普蘭-邁耶存活曲線證實經 單獨消融或與CpG-ODN組合治療後，對腫瘤過度生長僅具 有限之保護。（B )存活曲線證實經單獨消融、或與經混 合之水包油、油包水或鋁佐劑組合治療後，對腫瘤過度生 長僅具有限或無保護作用。（C )存活曲線證實經單獨消 融、或與該所示（經混合）佐劑之組合治療後，對腫瘤過 度生長具相對保護作用。該皂素基底之佐劑顯示最有效之 保護作用。（D )當消融與皂素基底佐劑之組合治療係與 CpG-ODN共同投予組合時，存活曲線證實額外之保護作用 。*=p<0.05相較於冷凍消融，** = ρ<〇.〇〇1相較於冷凍消融 /CpG。供比較之資料係得自3個獨立實驗。 201034676 序列表 <ιιο> 英特威國際B.V. <120> 醫藥組成物 <130> 2008.021 <160> X <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> ΛΧ <220> <223> 此爲人XDNA <400> 1 tccatgacgt tcctgatgct

Ο

Claims (1)

1. 201034676 七、申請專利範圍： 1. 一種用於原位腫瘤破壞療法之醫藥組成物，該療法 包含腫瘤破壞及投予免疫刺激量之免疫增強劑的步驟，其 特徵爲該免疫增強劑係巷素（saponin)。 2. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中該皂素 包含下列成分中至少一者：QS-7、QS-17' QS-18、QS-21 、QuilA、Vax Sap、SuperSap、GPI-0100 或 QP UF 1000。 0 3 ·如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中該皂素 係呈空白免疫刺激複合物之型式。 4 ·如申請專利範圍第1至3項中任一項之醫藥組成物， 其中該醫藥組成物額外包含CpG ODN。 5 .如申請專利範圍第1至3項中任一項之醫藥組成物， 其中該等步驟係呈下列順序： a. 破壞腫瘤， b. 投予免疫增強劑。 〇 6 ·如申請專利範圍第5項之醫藥組成物，其中該投予 免疫增強劑之步驟係在腫瘤破壞後之2 4小時內進行。 7.如申請專利範圍第5項之醫藥組成物，其中該投予 免疫增強劑之步驟係在腫瘤破壞後之1 2小時內進行。 8 ·如申請專利範圍第5項之醫藥組成物，其中該投予 免疫增強劑之步驟係在腫瘤破壞後之6小時內進行。 9 ·如申請專利範圍第1至3項中任一項之醫藥組成物， 其中該等步驟係： a.圍手術期投予免疫增強劑， 201034676 b ·破壞腫瘤。 1 0·如申請專利範圍第1至3項中任一項之醫藥組成物 ’其中投予免疫增強劑之部位按漸增之優先順序係靜脈內 、贅瘤實體引流區之皮下部位、腫瘤周圍或腫瘤內部。 1 1 · 一種如申請專利範圍第1至1 0項中任一項之醫藥組 成物於製造用於治療罹患癌症之哺乳動物的藥物上之用途 ，其中該哺乳動物已接受腫瘤破壞。 12.—種如申請專利範圍第1至10項中任一項之醫藥組 成物於製造供圍手術期投予以治療罹患癌症之哺乳動物的 藥物上之用途，其中該哺乳動物將接受或已接受腫瘤破壞 -2-