TW201031417A - Platelet-rich plasma (PRP) derived growth factor complex, method of producing the same, medical compound comprising the same, and method for enhancing growth of tissue of patient - Google Patents

Description

201031417 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明關於一種生長因子複合物、其製備方法及其用 途，並且特別地，該生長因子複合物係由富含血小板血漿 (Platelet-rich plasma，PRP)所衍生之生長因子複合物。 【先前技藝】 〇 企小板(Platelet)具有凝血、止血等功能，因此在人體 中扮演著重要的角色。當A管受創時，血小板特有的胞器 α顆粒(ct granule)，被活化釋放出内含物，如凝血因子 (von Willebrand factor)及纖維蛋白原（fibrin〇gen)。這些内 含物可促使血小板附著在血管壁上並且聚集，達成初&的 止血。 近幾年，研究人員還發現，血小板在組織修復和再生 過程中’也擔任了非常重要的角色。經實驗證實，α顆粒 被活化時’會釋放一些生長因子，例如血小板衍生生長因 攀子(platelet derived growth factor，PDGF)、轉型生長因子 β (transforming growth factors，TGF-β)、血管内皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)、表皮生長因子 (epithelial growth factor，EGF)、類胰島素生長因子(insulin_ like growth factor, IGF)等。這些生長因子在傷口癒合過程 中，可促進細胞的增生、移動、分化以及膠原蛋白合成、 血管新生等。因此，已經有醫師在病人手術後，以^含血 小板血漿注射至病人體内，以促進骨路再生。 學者Cannago等人於2000年發表了製備富含血小板 血漿的方法。該方法包含下列步驟：首先，抽取病人全血 201031417 10毫升’加入10%捧檬酸納抗凝血劑(trjs〇dium citrate)混 合。接著，將全血置於離心管中，以每分鐘5600轉的轉 速加以分層離心(gradient density centrifugation)，6 分鐘之 後可將離心管中的全血分成三部份：最底層為紅血球，最 上層為血小板含量很少的血漿，中間層就是血小板含量豐 富的血敷。

隨後，先將最上層血小板含量很少的血漿(約2毫升） 取出丟棄，再收集中間層血漿，即為富含血小板血漿，並 儲。存，。此外，使用此富含血小板血漿時，可加入含有 lj)%氯^化約(calcium chloride)的生理食鹽水及同體積的1〇〇 單位/毫升牛萃取的凝血晦(b〇vine thrombin)促進其中的血 小板釋出生長因子，再將此富含血小板血漿注射到欲治療 的部位。經臨床實驗證實，前述方法可有效地促進傷口癒 &，也可有效促進組織(例如，骨組織)的生長速率。 然而，由於富含血小板血漿中含有血漿或血液中的苴 匆質，因此可能會活化病患體内的巨噬細胞 (macrophage)前來吞噬血漿等物質，引發二度發炎。 【發明内容】 因，，本發明之—料在於提供—種富含*小板血 二ίa長因子複t物之製備方法’用以自全血中分離純化 術板血漿何生之生長因子複合物，以解決先前技 獲得-全將;含下列步驟:⑻ 驟⑷離心後之-ϋ將樣本離心；（b)收集經步 步驟(b)離心後之―二二並將該上層液離心；⑷收集經 俊之中層液，將一活化劑與該中層液混合 5 201031417 上並離心；以及⑼收集經步驟 富含血小板血有該 之生在於提供一種富含血小板血衆衍生 如前所述之製備方法H自一全缚本，並且其係經由 ❸ 卜種繼合物，用以促 忿2 i小板血漿衍生之生長因子複合物，以及 骨路組織’該組織可以是如雜組織等 之又—射在於提供—種促進—病患之一組織 於—具體實施例中，該方法包含下列步驟：⑻ =經步驟⑷離讀之—上魏，並將該上層n t一、/tb液，並將該混合液離心；（d)收集經步 該清液，並職該上清液，以獲得含有 1Ί、板漿衍生之生長因子複合物之—標的溶液； 人物製成一醫藥組合物；以及②將該醫藥組 ίίϊ 實際應用中’前述投藥可藉由注射 式進订，或疋由其他適當的方式進行。 屮〜ί合上ΐ，本發明之方法可自病患本身的全血中分離 血，血漿衍生之生長因子複合物，並且將其製 y樂^合物’以投藥給病患’促進病患的組織生長。特= ’根據本發明之富含血小板血騎生之生長因子複合物 6 201031417 先球之殘骸’物質組成單純，因 所附神可以藉由以下的發明詳述及 【實施方式】 的舍’圖—係1會示根攄本發明之—具體實施例 ❿ t2 Ϊ血漿衍生之生長因子複合物之製備方法流程 圖。如圖一所示，該方法包含下列步驟： 酸鈉ΐί凝=步:：丄U口本’並加入摔檬 mL，_二月'轉血七、溫下，以每分鐘 迷離心1〜5分鐘。請注音，於眘潞 :實:r条件可視情況進行適當地調整“ 經過步驟阳後，前述全血樣本會成為主要包含上下 ，的層狀樣態，其中上層主要為血漿，2 3 : 血球、白血球等。 叩r赝王I馮、.工 接著’執行步驟S14 ’收集步驟Sl2齙、、始沾 (即血漿），並將該上層液於室溫下 ^後的上層液 轉的轉速離心5〜1G分鐘。分鐘2，麵〜5,000 件可視情況進行適當地調整，^限於實=了條 間層;狀樣態，其中 所取狀+間層所包含^小板濃度可達 7 201031417 接著’執行步驟S16，收集此中層液，並且將活化劑 (例如，但不受限於，凝血酶(thrombin))與該中層液混合形 成混合液。此活化劑可造成中層液裡的血小板破裂，並釋 出（X顆粒。如前所述，這些α顆粒内含多樣的生長因子， 例如，但不限於 PDGF、TGF-β、VEGF、EGF、IGF-I、II 等以及多樣的細胞貼附性因子，例如，但不限於纖維蛋 白（fibrin)、纖維結合素卬br〇nec㈣、玻連蛋白⑽舰沉如) 等。

於實務中，將活化劑與t層液混合後可藉由每分鐘 100〜500轉的速度持續振盪1〜5小時，以使前述之生長因 子以及細胞貼附性因子充分釋放至混合液中。於實務中， ^振蘯條件可婦職㈣當地，並不祕本具 絲.你f 〇 _ ϋ 行步驟S18 ’將該混合液以每分鐘 钋雜，祕轉的轉速離心1〜5分鐘。同樣地’於實務中， :讀件可視情況進行適當地調整，並不限於=實 液，:獲以，18離心後之上清 可藉由孔徑為（U〜0.5 娘ϋ用中，此處的過濾' 務中，可是情況伟爾m過/慮早兀來進行。當然，於實 過濾、方式來進行顯、。5孔㈣顧單元，或者使用其他 複合物之標的溶液冷；東乾心血聚衍生之生長因子 冷滚保存標的粉_如:於_^/^步驟S24, 80 C等低溫冷凍保 201031417 存） 的溶液。請參見下表可直接冷凍保存It標 時間對富含血小板血漿衍度以及保存 子可使富含▲小板血漿衍生之生長下的冷 更有效地轉富含血丨血j驗證實，崎體形式保存可 性。％ ^小板錢魅之生㈣子複合物=

❹ 於實際應帛t，吾人可藉由tgf 的含量來靖所製備的富含血錢„他生長因子 合物的品質。於實際應用中，以前述方、I之生長因子複 小板血漿衍生之生長目子複合物㈣備的富含血 養，觀察細胞之活性反應，以證實:用於體外細胞培 之生長因子複合物的活性。經實驗以含，板血製衍生 血漿衍生之生長因子複合物存在t:該•含血小板 椎間盤軟骨細胞、中胚層間葉幹細胞纖維母細胞、 有顯著增加。科，吾人也已證實，胞增生速率皆 血浆衍生之生長因子複合物可有d二= 9 201031417 tH。ί外，在培養若干時間後，抽取椎間盤髓核細 、，、田胞的再*化，_可避免f細胞分化的可能性。 不ιίΓΤ應用中’以前述方法所製備的富含血小板血漿 Siiff子複合物可被應用於频動物試驗，以證實 二田1血小板血漿衍生之生長因子複合物的活性。舉例而 ;創：”或其他方式於活體動物的體表造成皮 ϋ傷，再以本發明的富含血小板錢衍生之生長因子複 ^ ，並持續觀察傷口復原情形。經實驗證 Ϊ本察Η&Ε染色的皮膚傷口病理切片發現經 衍生之‘長ίΐ=具;;玆==:_ 參 來驗3二由體外組織培養以及活體動物實驗 製備，含血小板血衆衍生之生長因子 口 w丨，並可與虽含血小板血漿進行活性比較。 所贺實施例中，本發明還提供了包含以前述方法 合物小板血㈣生之生長因子複合物的醫藥組 i，二實/、應財’此醫藥組合物還包含醫藥可接受之載 Ϊ的ϋ二Ϊ受ΐ於’無_生理食鹽水。該醫藥組合物 況厅生之生長因子複合物的含量可視情 β ，並不受限於任何特定的劑量。於實際库用 中’該醫藥組合物還可包含辅劑，用以增加該富含 201031417 漿衍生之生長因子複合物的活性。 於一具體實施例中，前述醫藥組合物可被用來促 患之組織生長。特別地，此醫藥組合物可被直接注 的患部，例如’但不受限於，退化的椎間盤處、骨 Ί 等。在實際應用中，吾人可藉由x光機定位病串L 療，置(例如，椎間盤位置)，以辅助直接注射的“ 又。此外，於投藥治療椎間盤退化病患後，吾人可藉由X S核磁共振儀器等器材來協助追縱病患的椎間盤組織‘ 實驗剌’此醫藥組合物可促進錄細胞及顿， 缝核細胞及組織，的增生與分化。請注意，於I 療病患時’製備富含血小板血聚街生之! “ΐί 2所ΐ的全血樣本可直接取自病患本身。此外， 菌。=述純化分離以及投藥之倾可視情況在益 衍子用無菌器具，以避免富含血小板^ 感染。長禝5物制㈣’或病患在治療過程中受到 注射Ϊ實;r L本;組合物可被製成口服液、 以藥2可應地選，、塗敷、； 患者限於，止痛藥、胃藥等-起投藥給 猫、免子之醫藥組合物可用於治療如豬、狗、 兔子或其它哺乳類動物，甚至非哺乳類動物。 出富含血小=血法可自病患本身的全血中分離 成醫藥組合物，生/因子複合物’並且將其製備 m权樂給病患，促進病患的組織生長。特別 11 201031417 地 _很艨不赞明之富含血小板血漿衍生之 不含，、血小板或其他血球之殘骸，物質 避免病患體内的巨嗟細胞被活化，而引發二度發 藉由以上較佳具體實施例之詳述，係希望能更加 描述本發明之特徵與精神，而並非以上述所揭露的較佳具 體實施例來對本發明之範疇加以限制。相反地，i目的& 希望能涵蓋各種改變及具相等性的安排於本發明^欲申 參 之專利範圍的範轉内。

12 201031417 【圖式簡單說明】 圖一係繪示根據本發明之一具體實施例的富含血小板 血漿衍生之生長因子複合物之製備方法流程圖。 【主要元件符號說明】 S10〜S24 :流程步驟

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Claims (1)

1. 201031417 七、申請專利範圍： 1、二種，含血小板血漿衍生之生長因子複合物之製 法’包含下列步驟： (a) 獲得一全血樣本，並且將該全血樣本離心； (b) 收集經步驟⑻離心、後之—上層液，並將該 離心； a〜 中層液，將一活化劑與 ’並將該混合液離心；

   (c)收集經步驟(b)離心後之一 該中層液混合形成一混合液 以及 上清液，並過濾該上清 板血漿衍生之生長因子 (d)收集經步驟(c)離心後之一 液’以獲得含有該富含血小 複合物之一標的溶液。 2、如申請專利範圍第1項所述之製傷 心1〜5分鐘 離心條件係於室溫下，以每分鐘丨㈨、中，乂驟(&)的 …l000〜3,000轉的轉速離 3、如申請專利範圍第1項所述之製借 _ _心條件係於室溫下，以每分其中，步驟⑼ ⑩ 離心5〜1〇分鐘。 里2,00〇〜5,000轉的轉速 4、 5、 6、 u利範圍扪項所述之製備方 一步包含下列步驟： 吳干，步驟(c)進 (cl)將該活化劑與該中層液混合， 速度持續振盪1〜5小時，以形成該100〜500轉的 如申凊專利範圍第1項所述之製備方 離心條件係以每分鐘 如申請專利範圍第1項所述之製備以，其中，步_ 201031417 的過;慮係將該上清液通過孔徑為〇. 1〜〇.5pm之一過漁單 元。 7、 一種富含血小板血漿衍生之生長因子複合物，其係分離自 一全血樣本，其製備方法包含下列步驟： (a) 獲得該全血樣本，並且將該全血樣本離心； (b) 收集經步驟(a)離心後之一上層液，並將該上層液 離心； (c) 收集經步驟(b)離心後之一中層液，將一活化劑與 ❹ 該中層液混合形成一混合液，並將該混合液離心； 以及 ^ (Φ收集經步驟(c)離心後之一上清液’並過濾該上清 液’以獲付含有該畐含血小板血裝衍生之生長因子 複合物之一標的溶液。 8、 如申請專利範圍第7項所述之富含血小板血漿衍生之生長 ，子複合物，其中，步驟(a)的離心條件係於室溫下，以 每分鐘1,000〜3,000轉的轉速離心1〜5分鐘。 鲁 9、如申請專利範圍第7項所述之富含血小板血漿衍生之生長 因子複合物，其中，步驟(b)的離心條件係於室溫下，以 每分鐘2,0〇〇〜5,〇〇〇轉的轉速離心5〜1〇分鐘。 10、如申凊專利範圍第7項所述之富含血小板血漿衍生之生長 因子複合物，其中，步驟(c)進一步包含下列步驟： 又 (Cl)將該活化劑與該中層液混合，以每分鐘〜轉的 速度持續振盛1〜5小時’以形成該混合液。 U、如申請專利範圍第7項所述之富含血小板血漿衍生之生長 因子複合物，其中，步驟⑻的離心條件係以每分鐘 3〇〇〜1，000轉的轉速離心卜5分鐘。 里 15 201031417 12、 如申請專利範圍第7項所述之富含血小板血漿衍生之生長 因子複合物，其中，步驟(d)的過濾係將該上清液通過孔 徑為0.1〜〇.5μιη之一過濾單元。 13、 一種醫藥組合物，用以促進一組織的生長，該醫藥組合物包 含有效量之如申請專利範圍第7項所述之富含血小'板血漿衍 生之生長因子複合物，以及醫藥可接受之載劑。 14、 如申請專利範圍第13項所述之醫藥組合物’進一步包含一辅 劑’用以增加該富含金小板血衆衍生之生長因子複合物的 • 活性。 15、 如申請專利範圍第13項所述之醫藥組合物，進一步包含一間 葉幹細胞或一胚胎幹細胞。 16、 如申請專利範圍第13項所述之醫藥組合物，其中該組織係一 骨骼組織。 17、 如申請專利範圍第16項所述之醫藥組合物，其中該骨骼組織 係一椎間盤組織。 • 18、一種促進一組織生長之方法，包含下列步驟： (a) 獲得一全血樣本，並且將該全血樣本離心； (b) 收集經步驟(a)離心後之一上層液，並將該上層液 離心， (c) 收集經步驟(b)離心後之一中層液，將一活化劑與 該中層液混合形成一混合液，並將該混合液離心； (d) 收集經步驟(c)離心後之一上清液，並過遽該上清 液’以獲得含有該富含血小板血衆衍生之生長因子 複合物之一標的溶液； (e) 將該標的溶液製成一處理劑；以及 (f) 以該處理劑處理該組織。 16 201031417 19、 如申請專利範圍第18項所述之方法，其中該組織位於一動物 體内。 20、 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中步驟(f)係將該處理 劑直接注射至該動物體内之該組織處。 〇 17