TW200948368A - Heparin binding motif of eosinophil cationic protein and use thereof - Google Patents
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Description
200948368 六、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種嗜酸性球毒素之肝素結合結構以及其用途。 【先前技術】 嗜酸性球陽離子蛋白質(Eosinophil cationic protein,簡稱ECP)是 核糖核酸水解酶A (RNase A)家族成員中的一員,其可在嗜酸性球的 特定顆粒中被發現,為單一多肽鏈,由於醣化程度不一,其分子量分 佈範圍為16到21.4 kDa不等。其胺基酸序列與嗜酸性球神經毒素 (Eosinophil-derived neurotoxin,另一種嗜酸性球核糖核酸水解 酶’簡稱EDN)具67%之相似度。雖然ECP與核糖核酸水解酶a (RNaseA)之立體結構類似,但其核糖核酸水解酵素活性卻較低(B〇ix, E.,et al., 1999,Journal of Biological Chemistry 274, 15605-15614)。由活化之嗜酸性球釋放出的ECP可毒殺螺蟲、細菌以 及單股核糖核酸病毒等(Lehrer, R., et al.,1989, Journal of
Immunology 142, 4428-4434; Domachowske, J. B., et al., 1998
Nucleic acids research 26,3358-3363)。ECP 與其他嗜酸性球釋放 的蛋白質包括:嗜酸性球神經毒素、嗜酸性球過氧化酶(e〇sin〇phil peroxidase ’簡稱EP0或EPX)、或主要鹼性蛋白質(腿j〇r basic protein ’簡稱MBP)會對上皮細胞造成傷害,這是氣喘時呼吸道發炎 节見的現象(Gleich,G· J·,2000, Journal of Allergy and Clinical Immunology 105,651-663)。 3 200948368 ECP細胞毒殺性的詳細分子機制目前尚不明確,但部份假說認為其與 破壞目標細胞之細胞膜穩定度有關(Young,J.,etal.,1986, Nature 321,613-616)’且毒殺細胞的程度與細胞内ECP濃度有關(Carreras, E., et al., 2005, Molecular and Cellular Biochemistry 272, 1-7) ° ECP與目標細胞的結合可能與其含高比例帶正電荷的精胺酸有關(估 計等電點為10.8),可促進ECP與細胞表面上帶負電的分子結合 (Carreras, E.,et al., 2005, Molecular and Cellular
Biochemistry 272, 1-7; Carreras, E., et al., 2003, Biochemistry 42,6636-6644)。最近我們發現ECP與氣管上皮細胞表面之結合及隨 後的細胞吞嗤與細胞表面的醣胺聚多聽,特別是與硫酸乙醯肝素蛋白 多糖(heparan sul fate proteoglycans,簡稱 HSPG)有高度相關(Fan, T. C·,etal.,2007,Traffic 8,1778-1795)。當細胞中缺少硫酸 乙酿肝素時,ECP的細胞毒殺性會大幅降低。 肝素以及硫酸乙醯肝素是由已醣醛酸以及葡萄糖胺組成的複雜多糖 ❹ 類’其中的尿幾基酸殘基通常由90%的左旋idopyranosyluronic acid 以及 10°/。的右旋 glucopyranosyluronicacid 組成(Capila,I and Linhardt, R. J. ( 2002 ) Angewandte Chemie International Edition 41,391-412)。葡萄糖胺的氮位置可被醋醯基硫酸基取代。 葡萄糖胺上第三以及第六位置的氧’以及已醣醛酸上第二位置的氧可 被硫化。與不同帶負電的官能基結合’使得肝素以及硫酸乙酿肝素可 與多種不同功能之蛋白質結合’例如生長激素、凝血纖維蛋白、化學 200948368 激素以及病毒蛋白。硫酸乙醯肝素包含許多高度硫化或表異構化的區 域(後者稱為S區域)、交錯乙醯化及硫化之區域(na/S區域)、 以及未修飾的區域(Tumova,s.,et al. (2000) The international journal of biochemistry & cell biology 32, 269-288)。因為硫 酸乙醯肝素含有由肝素組成的區域,肝素以及其模擬物可應用於蛋白 質以及多糖交互作用之研究。 依據1· 75 A解析度之ECP結構,顯示其包含三個α-螺旋以及五個β_ © 薄板(Mallorqui-Fernandez,G.,etal. (2000) Journal 〇f Molecular Biology 300, 1297-1307)。其中含19個暴露於蛋白質表面的精胺 酸殘基’使蛋白質呈現鹼性。然而ECP與肝素結合之位置尚無資料報 導。蛋白質與肝素結合的位置常具備許多帶正電的殘基,會與肝素上 的酸性官能基透過靜電反應產生作用。雖然科學家曾假設硫酸乙醯肝 素之正確二度空間結構為與其他蛋白質結合之必要條件(Hiieman,r. Q E.,et al. (1998) BioEssays 20, 156-167),但目前並無硫酸乙醯 肝素二度空間的結構資訊。依據諸多與肝素鍵結之蛋白質結構,car(jin 與Weintraub提出胜肽序列XBBBXXBX或XBBXBX (其中X代表疏水 性或未帶電的胺基酸、B則代表驗性胺基酸)可與硫酸乙醯肝素結合 (Cardin, A. D. and Weintraub, H. J. ( 1989) Arteriosclerosis (Dallas, Tex 9’ 21-32))。除此之外,下列結構亦具有與肝素結 合之能力。 5 200948368 BBXXBBBXXBB(B為帶正電的胺基酸、X代表任何胺基酸)(Olenina, L. V., et al. (2005) J Viral Hepat 12,584-593)。 BXXBBXB (B為鹼性胺基酸、X代表任何胺基酸)(Wu,H. F. ,etal. (1995) Blood 85,421-428)。 XBBBXXBBBXXBBX(B為驗性胺基酸、X代表任何胺基酸)(Andersson, E., et al. (2004)) Eur J Biochem 271, 1219-1226; Sobel, M., et o al. (1992) The Journal of biological chemistry 267, 8857-8862)。 TXXBXXTBXXXTBB (B為鹼性胺基酸、X代表任何胺基酸、τ則為轉折) (Capila, I. and Linhardt, R. J. ( 2002 ) Angewandte Chemie International Edition 41, 391-412; Hileman, R. E., et al. (1998) BioEssays 20, 156-167)。 【發明内容】 0 「嗜酸性球毒素」在此發明中係指嗜酸性球產生之毒素,且當其進入 細胞時會傷害細胞。嗜酸性球毒素包括ECp、EDN、Ep〇以及MBp。 此發明中發現ECP中一段線性的肝素結合位置以及最短的Ecp結合 肝素寡糖單元。ECP的圈套L3結構可促進ECp與細胞表面HSpG之 結合,提馬ECP細胞毒性。 本發明提供-卿肝素結合胜肽序列,其包含ΒΖΒχΒχ,其中B為驗 6 200948368 |·生殘基、χ代表任何殘基、Z則為芳香族殘基。此發明也提供中 之肝素結合位置,包含上述序列。在此發明之一實施例中,此一結構 為 SEQ ID N0: 8 。 此發明更提供一組合物用於降低嗜酸性球毒素之細胞毒性,其包含 BZBXBX ' XBBBXXBX ' XBBXBX ' BBXXBBBXXBB ' BXBBXB, XBBBXXBBBXXBBX 或ΤΧΧΒΠΤΒΧΧΧΤΒΒ之多肽、肝素、硫酸乙醯肝素或有效的肝素分解 0 酶抑制劑。在此發明的一實施例中,此段多肽包含QRRCKN (SEQ ΙΜ〇: 7)或RWRCKN (SEQ ID NO: 8)。在此發明的另一實施例中,此段多肽 序列為 SEQ IDN0: 3 (NYRWRCKNQNK)或 SEQ IDN0: 4 (NYQRRCKNQNK)。 肝素包含:低分子量肝素(LMWH,Sigma-Aldrish,平均分子量3, 000
Da)、高分子量肝素(LMWH,Sigma-Aldrish,平均分子量3, 〇〇〇 Da)、 HSPG、合成肝素寡糖、及硫酸乙醯肝素,其聚合程度(dp)為3到15。 在此發明此實施例中,合成肝素寡糖之dp為3到9 (分子量926 _ ❹ 2, 694 Da’分子式P + nQ,其中P為2—曱氧基葡萄糖胺,Q代表由 已釀酿酸以及葡萄糖胺組成的雙糖单元,且η為整數)。p的分子量 為349 Da而Q之分子量從333到573 Da ’且ρ之葡萄糖胺可由其 他保護基取代。 本發明可抑制嗜酸性球毒素之胞飲作用,抑制嗜酸性球毒素,包括 ECP、EDN、EP0、及MBP的胞飲作用而降低其造成的細胞毒性。此組 合物可進一步抑制氣喘,其中氣喘包括ECP/EDN造成之氣喘、細胞毒 7 200948368 殺核糖核酸水解酶造成之氣喘以及高等電位毒素造成之氣喘。 【實施方式】 第一實施例:材料 小鼠抗麥芽糖結合蛋白抗體自Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)購得,核糖核酸水解酶自promega (Ma(jison,wi)購得,化學藥 品自 Sigma-Aldrich (St. Louis,MO)購得。人類 ECP 多肽 NYRWRCKNQNK-生物素(Cl,SEQ ID NO: 3)、EDN 多肽 NYQRRCKNQNK-〇 生物素(D1,SEQ ID NO: 4)、核糖核酸水解酶多肽MTQGRCKPVNK-生 物素(Rl,SEQ ID NO: 5)以及 HIV-TAT 多肽 YGRKKRRQRRRK-生物素 (TAT,SEQ ID NO: 6)自 Genemed Synthesis (South San Francisco, CA)購得。 第二實施例:ECP-肝素交互作用對募糖長度的依賴性 將羧端具有組氨酸標籤的人類ECP利用BL21-CodonPlus (DE3)大腸 φ 桿菌(Novagen,Madison,WI)進行表現,再利用親合性層析法進行 純化及重新折疊(Boix,E·, et al. (1999) Journal of Biological Chemistry 274,15605-15614) 〇MBP-ECP則利用直鏈澱粉親和力層析 法純化。 先前技術顯示ECP的結合以及細胞吞噬與細胞表面HSPG相關(Fan, T. C·,et al. (2007) Traffic 8,1778-1795)。另一篇文章也顯示 肝素-瓊脂糖層析法純化(Gleich,G· J·,et al. (1986) Proc Natl 8 200948368
Acad Sci USA 83, 3146-3150)可分析蛋白質撕素之交互作用因 此,我們利用螢光輔助糖類電泳(Flu〇rescence_assisted carbohydrate electrophoresis ; FACE)探討了肝素與 ECP 交互作用 所需的最短之長度(或雙糖單位)。 參考文章技術(Calabro,A.,et al. (2〇〇〇) Glycobiology 10, 273-281 ),利用2-aminoacridone (AMAC)標定合成肝素募糖(圖一) (Lee, C. J., et al. (2004) J Am Chem Soc 126, 476-477) ' LMWH 以及PI-88 (由Progen Inc·,Australia提供)。AMAC-寡糖與蛋白質 於室溫反應15分鐘,再置入1%凝膠進行電泳分析(H〇lmes,〇 , et al· (2007) J Mol Biol 367,395-408)。 首先將ECP與LMWH以不同莫耳比例混合反應,反應產物則利用膠體 電泳分離。隨著ECP濃度增加’可偵測未結合之LMWH訊號的強弱變 化(圖二A)。以LMWH為控制組,可檢測ECP與dp值為3至9的肝 素募糖結合反應之變化。實驗結果明確顯示dp5之肝素募糖為具有 ECP結合能力的最短肝素片段(圖二b)。此外,亦測試強效之肝素分 解酶抑制劑(PI-88)之結果。PI-88為目前進行臨床試驗的藥物,測 驗其抗血管新生以及抗癌症轉移的功效(,Joyce,j. A.,etal. (2005) Oncogene 24, 4037-4051; Parish, C. R., et al. (1999) Cancer research 59,3433-3441),PI-88為含高度硫化的甘露糖雙糖至六糖 之混合物。(Yu, G.,et al. (2002) European journal of medicinal 9 200948368 chemistry 37,783-791; Ferro,V·,Li,C.,et al. (2002)
Carbohydrate research 337,139-146)。結果顯*pi_88 也能與 Ecp 結合(圖二B);此外,EDN的實驗亦獲得相似的結果(圖二c)。 第三實施例:利用合成寡糖競爭抑制ECP與細胞之結合 Beas_2B為人類支氣官上皮細胞株,培養於含1〇%胎牛血清蛋白 (Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA )的 RPMI 1640 培養液 (Sigma-Aldrich) 將寡糖或多肽樣品系列稀釋,以前述的方法測試MBP—ECP與細胞結合 的能力(Fan, T. C.,etal· (2007) Traffic 8,1778-1795)。在 96 孔細胞培養财,使BeaS-2B細胞於4 t先與相濃度轉糖或多肽 於不含血清的RPMM640培養液中反應3〇分鐘,再與5 #g/mL MBP-ECP反應1小時。接著移至室溫環境中,加人冰冷的哪沖洗細 ❹ 胞、並用2% PFA固定細胞15分鐘、再與2% BSA/PBS反應90分 鐘。再利用ELISA分析定量與細胞結合的MBp_Ecp ;卿先利用小鼠 抗MBP單株抗體、再以具酵素⑽)標記之次級抗體顯示被抗 體偵測之MBP-ECP含量。未經過寡糖或多肽處理之細胞結合❸MBp_ECp 量定為lOO%。 本研究發現募糖抑制ECP與細胞結合的程度隨寡糖Μ的增長而增高 (圖二> 5〇 Ag/mL的肝素dp5可抑制5〇% ECp與細胞的結合,而 200948368 «的dP7與dp9則可分別抑制通以及卿與細胞的結合。 —數據,,、貞不五糖為能抑制Ecp與細胞的結合的最短長度單元。此 卜Π 88抑制ECP與細胞的結合情形與邮類似。 第四實施例:鑣定卿中的肝素結合序列 在許多GAG的蛋自質或多肽巾’共通的肝素結合位置曾被報導 (例如 ΧΒΒΧΒΧ 或 χΒΒΒΠΒΧ) ( Hileman,R. Ε.,et al. (1998)
BioEssays 20, 156-167; Cardin, A. D. and Weintraub, H. J. (1989)
Arteriosclerosis Dallas,Tex 9,21-32)。檢視 RNase A 家族成員 的序列’發現翻中表面圈套L3區域,MqRRCKN (卿ID N〇: 7), 符合XBMM結構特徵。但在ECp中並未發現任何共通的肝素結合結 構或序列。因此’推測ECP中與EDN對應之第34-39胺基酸 (RWRCKN,SEQ ID N0: 8)序列可能與肝素結合。為確認此段區域與 細胞結合之相關性,利用MBP-ECP及含R34A/W35A/R36A/K38A突變 的MBP-ECP mtl進行細胞ELISA分析。 利用 QuickChange (Stratagene,La Jolla,CA)定點突變 ECP 的胺 基酸殘基R34、W35、R36與K38成為丙胺酸(34AAACAN ),將產生的 突變株命名為ECP mtl。使用的.引子為:mtl forward, 5’ -TATGCAGCGGCTTGCGCAAACCAAAAT-3, ( SEQ ID NO: 1 )以及 mtl reverse , 5’ -TTTGCGCAAGCCGCTGCATAATTGTTA-3, (SEQ ID NO: 2)。 以BL21-CodonPlus (DE3)大腸桿菌及各式質體進行轉殖。ECPmtl突 變種僅餘50%的細胞結合能力’顯示34RWRCKN在ECP與細胞硫酸乙 200948368 醯肝素結合的重要性(圖四B)。 第五實施例:ECP與肝素寡糖結合的特性 利用内在色胺酸螢光滴定(Lau,E. L,et al. (2004) The J0urnai of biological chemistry 279,22294-22305)偵測野生型以及變種 ECP與肝素寡糖的結合強度。 ❹
ECP與肝素的結合係以内在色胺酸螢光放光(IFTE)偵測。於25 t將 溶於PBS的ECP (200 nM)以少量高濃度(最少稀釋,< 2%)的五糖 滴定。每次於Hitachi 8000螢光光譜儀加完試劑2分鐘後,利用280 nm波長的激發光’量測340 nm波長的放射光。AF為相對的螢光變 化量’等於F0 - Fobs ’其中F0與Fobs各代表初使螢光值及測得 螢光值。利用非線性最小平方電腦分析將滴定資料套入1 : 1結合化 學劑量之方程式’計算結合常數(Venge, P. andBystrom,J. (1998) The international journal of biochemistry & cell biology 30, 433-437)。 AF=AFm8xx([P]+[H]+Kd-(([P]+[H]+Kd)2 - 4x[P]x[H])l/2)/(2x[P]) (公式一)其中AFm代表最大的相對螢光變化量,p是ECP的總濃 度,Η是肝素的濃度,Kd是ECP-肝素結合的解離常數。 色胺酸螢光之改變顯示野生種ECP與dp5有高度結合能力,相對的Kd為 12 200948368 139. 6 nM (圖五)。如預期地,ECP mtl ( R34A/W35A/R36A/K38A)的
Kd升高至568· 1 nM (表一);此結果顯示突變種ECp缺少L3區域中關 鍵的肝素結合序列,其肝素結合能力則出現顯著降低現象。 表一:野生種與mtl ECP與肝素寡糖結合的解離常數(Kd)的決定。 ECP wt ECP mtl Oligosaccharide Kd (nM) Kd (nM) dp9 62.6 400.3 dp5 139.6 568.1 圓二色光譜(CD spectroscopy)可應用於比較野生種以及mti ECP之 二級結構。將蛋白質溶於PBS中固定濃度為1〇 “Μ,並利用圓二色光 譜儀(Aviv model 202 CD Spectrometer)於 25°C 分析 200 nm 至 250 nm的遠紫外線光譜。每一光譜為三次連續測量值的平均,且扣除緩衝 液的光譜吸收而得之校正值。結果顯示ECP mtl與野生種ECP之二級 結構十分相似(圖六),表示ECP mtl之肝素結合能力的下降係與缺乏 特定的肝素結合區域相關,而與結構改變無關。 第六實施例:利用合成多肽競爭抑制ECP與細胞結合 為探討RWRCK結構(SEQ ID NO: 8)是否直接與肝素結合,利用合成 多肽Cl (SEQ ID NO: 3)以及控制組的合成多肽TAT (SEQ ID NO: 6) (Vives, E., et al. (1997) The Journal of biological chemistry 272,16010-16017; Ziegler, A. and Seelig,J. (2004) Biophysical 200948368 j_al 86, 254-263)進行細胞Elisa實驗。圖七A顯示多狀的劑 量與競爭現象相關。MBP-ECP與細胞表面HS的結合可顯著地受到合 成多肽Cl (SEQ ID N0: 3)與合成多肽TAT (SEQ ID N〇: 6)的抑制, 推論具肝素結合能力的合成多肽可與ECP競爭其與細胞結合的位置。 此外’以ELISA測量多肽與細胞表面的結合能力,發現合成多肽撕 (SEQ ID NO: 6),Cl ⑽Q ID NO: 3)與 D1 (¾ Π) N0: 4)會與細胞 表面結合,而合成多肽R1 (SEQ ID NO: 5)則無此功能(圖七B)。 ❹ 第七實施例:合成肝素結合多肽與細胞表面的作用 為探时相對於ECP的RWRCK結構(SEQ ID N0: 8)之EDN的肝素_合 結構QRRCK疋否會與細胞表面的硫酸乙酿肝素結合,我們利用^__入成 多肽D1 (SEQ ID N0: 4)及一合成多肽TAT (SEQ ID N0: 6)為控制組 測量Beas-2B細胞與合成多肽的結合。此資料顯示合成多肽’di (部卩id NO: 4)可在低溫下與Beas-2B細胞表面上的硫酸乙醯肝素結合(圖八 ©B) ’此結果與圖七中的細胞-ELISA競爭抑制實驗一致、 第八實施例:合成多肽與LMWH的作用 利用FACE分析探討合成多肽Cl (SEQ ID N0: 3)與ECP作用的關係。 結果顯示依合成多肽Cl (SEQ ID N0: 3)或TAT (SEQ ID N0: 6)濃 度逐渐上升,AMAC-LMWH的號隨之減弱(圖九)。此外,由於edn含 有一傳統的肝素結合序列,其對應的多肽D1 (SEQ ID N〇: 4)也進行 測試。如圖九所示:D1 (SEQ ID NO: 4)與Cl (SEQ ID NO·· 3)對肝 14 200948368 素具很高的結合能力。雖然在人類RNase 1中相對位置的多肽(ri sgg ID NO: 5)亦含帶正電的胺基酸,其卻不會與肝素結合。綜合上述,確 認ECP位於圈套L3内的多肽RTOCK (SEQ ID N0: 8)是一個新賴的肝 素結合位置。 第九實施例:C1與肝素寡糖結合能力之定性分析 利用ITFE分析多肽C1(SEQ ID N0: 3)與肝素的結合能力,結果顯示 α對於肝素具很強結合能力(圖十)。LMWH、dp9、dp5與C1 (SEQ瓜⑽· 3)的L值分別為192Λ 229.1,以及m.8nM (表二),顯示C1(SEQ ID NO: 3)與較長的肝素寡糖具較高的結合力。 表二:多肽ci與肝素寡糖結合的解離常數(Kd) 募糖 Kd (nM) LMWH --—1——-- 192.0 dp9 229.1 dp5 274.8 第十實施例:合撕储合條與匪結合能力的定性分析 多肽分子若與_有分子作用時會產生放熱反應。多肽m⑽ι〇 NO. 6)為控制組’itc結果顯不其為放熱反應模式,多肽μ (卿_〇: 5)則為對照組,ITC結果則未顯示放熱現象(圖十—b),表示其與刪 1、、’未產生刀子作用。合成多肽C1 (SEQ IDN〇: 3)與趴(卿則〇: 200948368 4)之ITC結果顯示均為放熱模式(圖十一 c至D),表示人類嗜酸性球 核糖核酸水解酶中的多肽結構Cl (SEQ ID N0: 3)與D1 (SEQ ID N0: 4)具有與HMWH結合的能力。 第十一實施例:ECP抑制細胞生長之能力探討 ECP抑制淋巴球以及哺乳類細胞生長之能力於先前已被報導(Fan, T. C., et al. (2007) Traffic 8, 1778-1795; Maeda, T., et al. (2002) European Journal of Biochemistry 269, 307-316)。本實驗利用 MTT 試驗分析ECP mtl之細胞毒性。ECP對於細胞生長之影響係利用 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) (US Biological,MA,USA)的顏色定量進行檢驗。先將細胞固 定於96孔盤中(5000顆細胞/孔),於37 °C —天後再將各個樣品與 ECP (濃度範圍為moo "M)進行反應。經過48小時後,加入MTT試 劑並分析570 rnn波長的吸收值,最後換算成細胞存活的百分比。 相對於野生種的 ECP,ECP mtl (R34A/W35A/R36A/K38A)對 Beas-2B 細胞造成的細胞毒性較低,其ICm的值為野生種ECP的二至三倍(圖 十二、表三)。推測係因為其無法有效地與細胞表面結合,以致較難進 入細胞内,故顯現之細胞毒性亦較低。 表三:細胞毒性分析中ECP之半數致死量(ICso) 200948368 蛋白質 ια〇 (Ui〇 ECP wta 16. 05 ECP mtl 38. 52 第十二實施例:ECP的免疫組織化學染色結果 為更了解ECP可能作用之細胞標的位置,將重組蛋白ECP由尾巴靜 脈注射至大鼠血液循環系統中。 實驗使用的大鼠為體重200-300克的成年sprague-Dawley品系大鼠 (購自於台灣國家動物中心)。實驗鼠分成三組;第一組ECP的注射量 為5 nmol ;第二組中除注射5 nmol的MBP-ECP外,還注射固定量的 肝素(FRAGMIN®,平均分子量6000, 5000 IU/0.2ml);第三組注射5 nmol的MBP作為對照組。於注射一小時後,將實驗鼠以二氧化碳犧牲 之並取出其氣管及肺臟利用10%中性緩衝forraaldehyde固定。細胞 樣品以石蠟包埋方式處理。將固定之蠟塊分割為6 #m的薄片,再利用 Super Sensitive Non-Biotin HRP Detection System (BioGenex
Laboratories,San Ramon, CA)進行檢測(Liang, C. T.,et al (2007) Journal of comparative pathology 136,57-64)。小鼠抗 ECP
或抗ECP單株抗體為初級抗體;抗原顯露係將切片浸在溶於Miui_Q 水的 5% Trilogy antigenUnmasking solution (Cell Marque,Rocklin CA)中’再於121 t:煮沸❶内生性的過氧化酵素能力係利用溶於甲醇 17 200948368 的3%過氧化氫抑制之。將切片浸泡於power Block solution中,再 將一級抗體以二百分之一稀釋後加入反應24小時,隨後與Super
Enhancer reagent 反應、再與 Polymer-HRP reagent 及 3-amino,9 ethy 1 -carbazo 1 e chromogen so 1 ut i on 反應、以 Mayer’ s hematoxy 1 i η 染色’利用 Super Mount permanent aqueous mounting media 進行封 片並以光學顯微鏡(Zeiss - Axioplan,Germany)觀測之。 免疫組織化學染色結果顯示注射1小時後大量的ECP被氣管及支氣管 上皮細胞吞噬(圖十三A及B)。若同時注射肝素,被細胞吞噬的ECP 含量大幅度降低(圖十三C)。對照組則無法於氣管及支氣管上皮細胞 中偵測到MBP (圖十三D)。 【圖式簡單說明】 圖一:用於此發明中的合成肝素寡糖之結構。η = 1 - 4 (n = 1,dp3 ; η = 2,dp5 ; η = 3 ’ dp7 ; η = 4,dp9) ❹ 圖二:以FACE分析法評估ECP與各式含糖基質之結合能力。a,將 AMAC標定的LMWH與含有或不含ECP的pbs於25 °C作用1〇分 鐘,反應後的結合物以1%瓊脂糖凝膠進行分離。凝膠上方的數字代表 ECP對LMffH的莫耳比。b,多糖與ECP結合之樣式代表圖。將amc 標定的肝素 dp3 (0. 8 nmol)、dp5 (3. 3 nmol)、dp7 (1. 4 nmol)、 dp9 (l.l nm〇i)、LMWH (0.03 nmol)、及 PI_88 (〇 〇3 nm〇1)與 200948368 含有或不含10倍莫耳濃度的ECP作用10分鐘,反應後的結合物再 以瓊脂糖凝膠進行分離。C,多糖與_結合之樣式代表圖。將AMAC 標定的肝素dp3 (0.8 nmol)、dp5 (3.3 nmol)、dp7 (1.4 nmol)、 dp9 (1.1 nmol)、LMWH (0· 03 nmol)、及 pi-88 (0. 03 nmol)與含 有或不含10倍莫耳濃度的ECP作用i〇分鐘,反應後的結合物以瓊脂 糖凝膠進行分離。 圖三:肝素募糖能抑制ECP與細胞之結合。將Beas-2B細胞於4 °C與 不同長度的肝素反應30分鐘’再加入MBP-ECP反應1小時。反應後後 加入PBS沖洗細胞並以PFA固定。結合的MBP-ECP量係利用ELISA測 量。未加入醣胺聚多醣處理組的MBP-ECP量定為1〇〇%。(:指控制組(僅 以MBP處理細胞)。 圖四:鑑定ECP與肝素結合之位置。A,對照人類以及牛胰臟的核糖核 φ 酸水解酶序列,框線内顯示的區域為出現於其他核糖核酸水解酶中, 相似於預測的ECP肝素結合位置。β,Beas—2β細胞於4 °c與MBP-ECP 反應1小時’並分析其結合於細胞表面之蛋白質含量。 圖五:野生型ECP及ECP mtl與dp5之ITFE量表。測量〇. 2碰野生 型ECP及ECPmtl分別與dP5結合之色胺酸滴定放射光譜,記錄34〇挪 之放射波長。利用KaleidaGraph Synergy軟體進行結果分析。AF, 相對螢光強度之差值,等於F。一 F(>bs,其中F。與^各代表起始與 19 200948368 觀測到的螢光強度。 圖六:野生型ECP與ECP mtl之200 ran至260 nm CD光譜。 圖七:合成多肽可抑制ECP與細胞結合。A,將Beas_2B細胞於4艺 先與合成多肽反應30分鐘後,再與勝—财反應丄小時。隨後利用 PBS沖洗並以pFA固定。結合的MBp_ECp量係利用eusa測量。未以 _ 乡肽處理的MBP-ECP量定為麵。將Beas_2B、細胞於4 t與生物素 化的合成彡肽反應1 *時,結合於細虹的合成乡肽似與圖三相同 的方式定量。 圖八:肝素結合合成紐。將人類Beas_2B細胞先於4 t與合成多狀 (A、TAT ; B、D1)反應30分鐘’再沖洗並固定。合成多肽係利用抗 生物素的單株抗體進行辨識,再利用帶螢光標記之次級抗體顯示多狀 Q 抗原之位置及含量,其分佈係_共滅顯微鏡觀測。圖巾顯示的刻 度尺長度為10 刪。 圖九:合成多肽之FACE分析。將AMAC標定的刪與含有或不含遞 增漠度的a、tat、di、與R1多狀於室溫作用15分鐘,反應後的樣本 再以瓊脂糖凝膠進行分離(圖二)。 圖十.合成肝素寡糖滴定至多肽溶液之量化表。將多肽溶液(1讀) 20 200948368 滴定至合撕«糖溶财’根據色職螢絲譜的讀計算多狀與 多糖作用之動力學參數Kd。 圖十-:肝素-多肽等溫滴定量熱分析。獅分子暇互作时產生能 量變化的特性,以等溫敝微量熱法來細多肽溶液與_之間^ 用力。怪溫過程:多肽溶液’包括TAT (控制組)、B、R1 (對照組)、c、 α、D以及D1分別滴定至H_H容液中並檢測其熱量變化。每次滴定 量為6"L ’緩衝溶液為PBS ’於25°c中進行。上圖為滴定熱能變化實 際圖,下圖為滴定熱能變化之數據。 圖十 野生型ECP與ECP mtl之細胞毒性。將Beas_2g細胞於37 與遞增濃度的野生型ECP與ECP mtl反應48小時,再進行MTT試驗。 圖十三:利用 Super Sensitive Non-Biotin HRP Detection System 進 行ECP免疫化學定位。(a、B)箭號標示的部份代表氣管上皮細胞及軟 骨細胞中測得之ECP。( C)先將ECP與肝素混合後,再注入實驗動物中 測得之細胞内ECP分佈。(D)以MBP注射後取得之肺組織區段為對照 組。放大倍率:A ’ 200倍;B與C,400倍。圖中顯示的刻度尺長度 為 20 //in。 21 200948368 序列表 <11 〇>國立清華大學 <120>嗜酸性陽離子蛋白之肝素結合位及其用途 <130> 0803-NTHU-TW <160> 8 <170> PATENT IN VERSION 3.4 ❿
<210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220>
<223> PRIMER ❿ <220> <221> M1SC_FEATURE <222> (1)..(27) <400> 1 TATGCAGCGG CTTGCGCAAA CCAAAAT 27 <210> 2 22 200948368
<211> 27 <212> DNA <213> ARTIFICIAL
<220> <223> PRIMER <220> <221 > MISC.FEATURE 〇 <222> (1)..(27) <400> 2 TTTGCGCAAG CCGCTGCATA ATTGTTA 27
<210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> DERIVED FROM EOSINOPHIL CATIONIC PROTEIN (ECP) PEPTIDE WITH BIOTIN-LABELED AT 3' END <220> <221 > BENDING <222> (1)..(11) 23 200948368 <400> 3 ASN TYR ARG TRP ARG CYS LYS ASN GLN ASN LYS 1 5 10
<210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220>
<223> DERIVED FROM EOSINOPHIL-DERIVED NEUROTOXiN(EDN) PEPTIDE WITH BIOTIN LABELED AT 3' END <220> <221> BINDING <222> (1)..(11) 〇 <400> 4 ASN TYR GLN ARG ARG CYS LYS ASN GLN ASN LYS 1 5 10 <210> 5 <211> 11 24 200948368
<212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> DERIVED FROM RNASE1 PEPTIDE WITH BIOTIN-LABELED AT 3' END <220> <221> BINDING <222> (1)..(11) <400> 5 MET THR GLN GLY ARG CYS LYS PRO VAL ASN LYS 15 10 <210> 6 <211> 12
<212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> DERIVED FROM HIV-TAT PEPTIDE WITH BIOTIN-LABELED AT 3' END <220> <221> BINDING <222> (1)..(12) 25 200948368 <400> 6 TYR GLY ARG LYS LYS ARG ARG GLN ARG ARG ARG LYS 1 5 10 <210> 7 <211> 5
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS <220> <221> BINDING <222> (1)..(5) <400> 7 GLN ARG ARG CYS LYS <210> 8 <211> 5
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS 26 200948368 <220> <221> BINDING <222> (1)..(5) <400> 8 ARG TRP AR6 CYS LYS 1 5
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Claims (1)
- 200948368 七、申請專利範圍: 1. -肝素結合結構,包含序列贿βχ,其中X躲何胺基酸、z為芳香族 胺基酸、Β為—鹼性胺基酸。 、 2. 根據申請翻麵1項的肝素結合結構,其取自於嗜酸性球毒素且含 有申請專利範圍第1項之序列。 3. 根據申請專利範圍第2項的結構,其中序列為和請:卜 4· -種降财難球毒权岭物,其包饼素、雜断素分解酵素抑 ❹ 制劑、或是含有以下序列之多肽:ΒΖ_ί、ΜΜ、 BBXXBBBXXBB ' BXBBXB ' XBBBXXBBBXXBBX ^ TXXBXXTBXXXTBB 5 1 X 任何胺基酸、z為芳香族胺基酸、B為一驗性胺基酸、T則為轉折。 5. 根據中請專利範圍第4項的組合物,其中多肽包含高比例的帶正電胺基 酸。 6. 根據申凊專利範圍第4項的組合物,其中多肽包含卿CKN⑽刪⑺ 或 RWRCKN (SEQ ID N0:8)。 Ο 7.根據申凊專利範圍第4項的組合物,其中多肽是SEQ ID NO: 3 (NYRWRCKNQNK) ^ SEQ ID NO: 4 (NYQRRCKNQNK) ° 8. 根據申請專利範圍第4項的組合物,其中肝素包含低分子量肝素(LMWH)、 高分子量肝素(HMWH)、硫酸乙醯肝素蛋白多糖(HSpG)或合成肝素寡 糖、及硫酸乙醯肝素。 9. 根據申請專利範圍第8項的組合物,其中合成肝素募糖的聚合程度(dp) 為3至15。 28 200948368 ι〇.根據申請專利範圍第8項的組合物,其中合成肝素募糖的聚合程度⑽ 為5至9。 11.根據申請專利範圍第4項的組合物’其中嗜酸性球毒素的細胞毒性透過 減少嗜酸性球毒素的細胞吞嗤而降低。 2.根據申叫專利範圍第u項的組合物,其中嗜酸性球毒素係嗜酸性球陽 離子蛋白⑽)、嗜酸性球神經毒素⑽N)、嗜酸性球過氧化酶⑽ 或EPX) ’或主要鹼性蛋白質(簡稱JJBP)。 Ο 13.根據申請專利範圍第4項的組合物,其亦用於治療氣喘。 H.根據申請專利範圍帛13魏组合物,其中氣喘為Ecp/EDN㈣魏 喘、細胞毒性讎核酸酵素造成之氣喘或其他高等電點毒素造成之氣喘。 29
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