TW200932274A - Interfering RNA delivery system and uses thereof - Google Patents

Description

200932274 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 發明領域

本發明係關於一種用來將干擾RNA分子輸送進入細胞 5 的輸送系統及使用該輸送系統的方法。該輸送系統包含TAT 胜肽或其它細胞穿透胜肽及聚精胺酸胜肽（諸如，9xArg胜 肽）。該輸送系統可於HA2胜肽(其可併入該系統或與該系統 同時給藥）存在下給藥至細胞。 ❹ 【先前技術】 10 發明背景 RNA干擾(RNAi)為—種使用雙股RNA(dsRNA)來沉默 ’ 基因表現的方法。RNAi藉由存在於細胞中的短（即，<30個 核苷酸）雙股RNA(“dsRNA”)分子來引發（飛雷(Fire)等人， 1998 ’自然，: 806-811)。這些短dsRNA分子稱為“短干 15 擾RNA”或“siRNA”，其會造成與該siRNA共享序列同源之 信息RNAs(“mRNAs”)破壞(愛爾巴薛(Elbashir)等人，20(Π， ® Genes Dev，U: 188-200)。咸信該siRNA的一股被併入已 知為RNA引發的沉默複體(RISC)之核醣核蛋白複體中。 RISC使用此siRNA股來鑑別與所併入的siRNA股至少部分 20 互補之mRNA分子，然後裂解這些標挺mRNAs或抑制其轉 譯。該siRNA更像多轉換酶可明顯地再循環，且丨個siRNA 分子能引發大約1000個mRNA分子裂解。因此， siRNA主導性RNAi降解比現在可獲得用來抑制標乾基因的 表現性之技術更有效。 200932274 RNAi提供一種非常令人興奮可治療及/或防止疾病的 方法。RNAi的一些主要利益（與多種傳統治療方法比較）包 括：RNAi之可將一與具有高特異性的疾病過程相關之非常 特別的基因作為標乾，因此減低或消除脫乾效應之能力； 5 RNAi為一導致高特定的rNA降解之正常細胞過程；及 RNAi不會如在許多以抗體為基礎的治療中般觸發宿主免 疫反應。 已試驗/發展出數種用於活體内用途的干擾尺1^八輸送 方法。例如，siRNAs可在鹽液溶液中”赤裸裸地，，輸送；可 10 與多陽離子、陽離子脂質/脂質轉移劑或陽離子胜肽複合； 可作為所限定的分子輛合物之組分(例如，經膽固酵改質的 siRNA、TAT-DRBD/siRNA複體）；可作為脂粒組分；及可 作為奈米粒子組分。這些方法已顯示出不同程度的成功。 因此，仍然需要一種新穎及經改良用於活體内輸送siRNA 15 分子以達成及提高RNAi的治療潛力之方法。 已描述出（賈弗（Jarver)及連爵（Langel)，2004，Drug Discov Today £: 395-402)數種細胞穿透胜肽(cpps)或薄膜 滲透胜肽(MPPs)可作為輛合物’以將胜肽輸送進入細胞 中。HIV-1 TAT蛋白質的蛋白質轉導區段(PTD)為一種顯露 20 出特別有效的CPP。已經使用TAT胜肽來試管内及活體内將 生物活性貨載（cargo)輸送至細胞（瓦狄亞（Wadia)及到地 (Dowdy)，2003，Curr Protein Pept Sci. ! : 97-104 ;巴爾拉 克(Bullok)等人，2006，Mol Imaging i : 1-15)。 數個群組已探索使用CPPs來輸送干擾RNA分子（參見 200932274 5 ❹ 10 15 20 米爹（Meade)及到地，2007，Adv Drug Deliv Rev.丛： 134-140)。此方法的主要挑戰包括將該干擾RNA連結至 CPPs，同時維持該複體與細胞内環境互相作用且進入其中 之能力。特別是，干擾RNA的負電荷會中和正電荷的CPPs， 此將提供該複體無法細胞輸送。因此，已需要鑑別出可讓 CPPs連結至干擾RNA分子而沒有阻礙CPP促進該干擾RNA 的細胞内輸送之能力的方法。 C 明内3 發明概要 本發明提供一種干擾RNA輸送系統，其包含一連結至 CPP-Arg胜肽（諸如，TAT-9xArg胜肽）的干擾RNA分子。本 發明亦提供一種用於試管内或活體内將干擾RNA分子輸迭 進入細胞中的方法，其包括：（a)將干擾RNA分子接附至 CPP-Arg胜肽，因此形成一干擾RNA輸送系統；及在合適於 該系統進入該細胞之條件下，將該系統給藥至該細胞。在 某些觀點中’於HA2胜肽（其輔助該系統從核内體釋放出） 存在下’將該輸送系統給藥至細胞。該HA2胜肽可併入該 輸送系統或先前、之後或隨著該輸送系統之給藥來給藥。 在一個觀點中，在本發明之輸送系統中的干擾RNA分 子可減弱標靶mRNA於標靶細胞中之表現性。因此，本發 明一種提供用來減弱在細胞中的表現性之方 法’其包括將本發明之輸送系統給藥至該細胞。 本發明進一步提供一種包含本發明之干擾1〇^八輸送系 統的醫藥組合物。該醫藥組合物可使用於治療多種想要抑 5 200932274 制標把基因的病症或疾病之治療應用中。 此外，本發明提供一種治療或防止患者的眼睛病症之 方法，其包括將如描述於本文的干擾RNA輸送系統給藥至 患者，其中該干擾RNA分子可減弱與眼睛病症相關的基因 5 之表現性。在某些觀點中，該眼睛病症與眼睛血管新生、 乾眼症、眼睛炎性症狀、眼壓過高或青光眼相關。在其它 觀點中，該輛合物藉由眼内注射、眼睛局部塗佈、結膜下 注射、玻璃狀體内注射、前或後近鞏膜注射、靜脈内注射、 口服給藥、肌肉内注射、腹膜内注射、經皮塗敷、鼻内塗 10 敷或經黏膜塗敷來給藥。 本發明的特定較佳具體實例將從下列某些較佳具體實 例及申請專利範圍之更詳細說明變明瞭。 【實施方式】 較佳實施例之詳細說明 15 於此，以實施例顯示出詳細情況且其僅用於本發明的 較佳具體實例之闡明性討論的目的，及其顯現的原因為其 提供已咸信為最有用及容易了解本發明的多種具體實例之 原理說明及概念觀點。就這一點而言，未試圖顯示出比基 本了解本發明所需要更詳細之本發明的結構細節，該描述 20 一起採用圖形及/或實施例，使得由熟習該項技術者明瞭實 務上本發明可如何具體化出數種形式。 下列之定義及解釋指明且意欲在任何未來架構中有所 控制，除非在下列實施例中有明確及明白的修改，或當該 意義之應用提供任何無意義或基本上無意義的架構外。在 200932274 該名稱的架構將提供其無意義或基本上無意義的實例中， 該定義應該採自韋伯思特氏辭典(Webster’s Dictionary)第3 版，或由熟習該項技術者已知的辭典，諸如牛津生物化學 及分子生物學辭典(Oxford Dictionary of Biochemistry and 5 Molecular Biology))(恩松尼史密斯(Anthony Smith)編輯，牛 津大學出版社(Oxford University Press)，牛津，2004)。 如於本文中所使用，除非其它方面有描述，否則全部 的百分比皆為重量百分比。 如於本文中所使用且除非其它方面有指出，否則所採 10 用的名稱“一”意謂著“一種”、“至少一種”或“一或多種”。除 非其它方面由上下文所需求，否則於本文中所使用的單一 名稱應該包括複數，及複數名稱應該包括單一。 在某些具體實例中，本發明提供一種干擾RNA輸送系 統，其包含一經由Arg胜肽連結至細胞穿透胜肽(CPP)的干 15 擾RNA分子。 如於本文中所使用，措辭“干擾RNA輸送系統，，指為一 種包含CPP、Arg胜肽及干擾RNA分子的系統，其能將該干 擾RNA分子輸送進入細胞中。在某些具體實例中，該干擾 RNA輸送系統可給藥至需要其之患者。 20 如於本文中所使用，名稱“CPP-Arg胜肽”指為一種包含 連結至Arg胜肽的CPP之胜肽。例如，“TAT-Arg胜肽”意謂著 一種包含連結至Arg胜肽的TAT胜肽之胜肽。 “Arg胜肽”或“聚精胺酸”為一種全部由精胺酸所組成 的胜肽。該Arg胜肽包含7、8、9、10或11個精胺酸較佳。 200932274 在某些具體實例中，該Arg胜肽將經由1、2、3或4個甘胺酸 的甘胺酸間隔子連結至TAT之C-或N-終端。該甘胺酸間隔 子為2或3個甘胺酸較佳。 在一個具體實例中，該Arg胜肽為9xArg胜肽。如於本 5 文中所使用，名稱“9xArg胜肽”意謂著一種包含9個精胺酸 殘基的胜肽(RRRRRRRRR ; SEQ ID NO : 1)。在一個具體 實例中，9xArg胜肽包含或由D-異構物組成。負電荷的干擾 RNA分子可黏結至正電荷的9xArg胜肽，如由庫瑪(Kumar) 等人描述，其最近闡明出9xArg胜肽可使用來將干擾RNA分 10 子連結至用來輸送穿過血腦屏障之狂犬病病毒糖蛋白 (RVG)標靶胜肽的C終端末端（庫瑪等人，2007年6月17日， 自然，電子版本(epub ahead of print))。 如於本文中所使用，名稱“細胞穿透胜肽”及“CPP”指為 典型約9至約30個胺基酸殘基的胜肽，其能藉由哺乳動物細 15 胞内在化。在大部分例子中，CPP藉由細胞攝粒作用進入細 胞内環境中。在其它例子，CPP可餘留在細胞薄膜中，同時 促進其貨載進入細胞中。有用的CPP之實施例包括（但不限 於）TAT胜肽、及穿膜肽(penetratin)(pAntp)、細胞穿透肽 (Transportan)、MPG、MPGdeltaNLS及pHLIP的蛋白質轉導 20 區段。如於本文中所使用，名稱“TAT胜肽’，包括一包含HIV-1 TAT蛋白質的蛋白質轉導區段（PTD)之反向序列的逆反 (retro-inverso)TAT胜肽。在一個具體實例中，該TAT胜肽包 含或由D-異構物之胺基酸殘基組成。該TAT的PTD為： YGRKKRRQRRR; SEQ ID NO : 2(畢維斯(Vives)等人， 200932274 1997，J. Biol. Chem 272 : 16010)。 逆反TAT胜肽（即’由D-胺基酸構成的反向序列）為： rWqWkWg ; SEQ ID NO : 3 〇 5 ❹ 10 15 ❹ 20 D-異構物由一個右邊標有上標托劍號(t)之字母編碼符 5虎表不，因此’ D*代表D-天冬胺酸及L+代表D-白胺酸。 穿膜肽(pAntp)的PTD為： RQIKIWFQNRRMKWKK ; SEQ ID NO : 4(姆拉托夫斯 卡（Muratovska)及伊克雷斯（Eccles)，2004，FEBS Letters 558 : 63-68)。 細胞穿透肽的PTD為： LIKKALAALAKLNIKLLYGASNLTWG ； SEQ ID NO ： 5(姆拉托夫斯卡及伊克雷斯，2004，FEBS Letters 558 : 63-68)。 MPG 的 PTD 為： GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV ； SEQ ID NO : 6(西美歐尼（Simeoni)等人，2003，Nucl. Acids Res. 31 : 2717-2724)。 MPGdeltaNLS 的 PTD 為： GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV ； SEQ ID NO : 7(西美歐尼等人，2003，Nucl. Acids Res. 31: 2717-2724)。 pHLIP 的 PTD 為： ACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT G ; SEQ ID NO : 8(安追夫(Andreev)等人，2007，Proc.Natl· Acad. Sci. USA 104 : 7893-7899)。 9 200932274 在某些具體實例中，於TAT-HA2胜肽、配體-HA2胜肽 或逆反TAT-HA2胜肽（其已經顯示出可提高TAT-胜肽/蛋白 質從核内體釋放出）存在下，將一干擾RNA輸送系統給藥至 患者或細胞（瓦狄亞等人，2004，Nat. Med. : 310)。名稱 5 “HA2胜肽”意謂著一包含流行性感冒病毒血球凝集素蛋白 質的N-終端20個胺基酸之胜肽。該天然HA2胜肽為： GLFGAIAGFIENGWEGMIDG ; SEQ ID NO : 9。 該天然HA2胜肽包含L·異構物較佳。 該逆反HA2胜肽為： ®

10 GD’lWGEtwtGN 卞 EYF 卞 GAtitAWLtG ; SEQ ID NO : 10。 HA2之存在可輔助該干擾RNA輸送系統從核内體釋放 - 進入胞質液中’以便該干擾RNA分子可減弱標靶mRNA在 患者或細胞中之表現性。在某些其它具體實例中，HA2胜 15 肽插入在CPP胜肽與9xArg之間，其中該HA2胜肽經由甘胺 酸間隔子連結至9xArg。若TAT為CPP時，該序列如下：

RtRtRtQ+RtRtKtKTRtGGGD+ItMtGEtWtGNtEtItFtGAt ® itAWLtGGGRWRtRWW ; SEQ ID NO : U。 在某些具體實例中，所產生的CPP-Arg胜肽在輛合至該 20 干擾RNA分子前如為單一胜肽。在其它具體實例中，該 CPP-Arg胜肽可藉由在二種胜肽將彼此連接之條件下結合 該CPP(或CPP-HA2)胜肽與該Arg胜肽而製造。此用來連結 二種胜肽的方法已在技藝中熟知。在更其它具體實例中， 該Arg胜肽可與該干擾RNA分子預混合，然後連結至CPP(或 10 200932274 CPP-HA2)胜肽，以有助於干擾RNA黏結至該胜肽之Arg末 端。因此，可在連結CPP(或cpp_H2)與Arg前或後達成該干 擾RNA分子的連結。 在某些具體實例中，可在一將干擾RNA分子輸送進入 5 細胞的方法中使用如於本文中所描述的干擾RNA輸送系 統。該細胞可為經分離的細胞(例如，在細胞培養中）或為與 想要抑制標靶基因的表現性之患者相關的細胞。亦可在體 外治療方法中使用該細胞，其中該細胞採自患者且在該干 擾RNA輸送系統已經引進該細胞中之後再引進相同或不同 1〇 的患者中。 如於本文中所使用，名稱“實驗對象，，或“患者，，指為人 類及非人類動物。名稱“非人類動物，，指為脊椎動物及非脊 椎動物，包括(但非為限制）靈長類動物、兔、豬、馬、狗、 猶、羊及牛。在一個具體實例中，該患者患有眼睛病症或 15在患有眼睛病症的風險下。與此病症相關之眼睛結構可例 如包括眼睛、視網膜、脈絡膜、水晶體、角膜、小樑網、 虹膜、視神經、視神經頭、鞏膜、前或後房、或睫狀體。 在某些具體實例中，該患者患有與小樑網(TM)細胞、睫狀 上皮細胞或另一種眼睛的細胞型式相關之眼睛病症。 2〇 #於本文中所使用，名稱“眼睛病症，，包括與眼睛歲管 新生、乾眼症、炎性症狀、眼墨過高相關的症狀及與提高 眼壓(IOP)相關之眼睛疾病（諸如，青光眼）。 如於本文中所使用，名稱“眼睛金管新生,，包㈣ A管生成症狀及眼睛血管生成症狀，及包_如眼睛灰管 11 200932274 新生、眼料▲管增生、視賴水腫、糖尿舰_膜病、 與視網膜缺血相關的後遺症、後段新血管增生(PSNV)及新 生血管性青光眼。使用於本發明之方法的干擾RNAS可例如 有用地用來治療患有眼睛血管新生、眼部新血管增生、視 5網膜水腫、糖尿病性視網膜病、與視網膜缺血相關的後遺 症、後段新血管增生（PSNV)及新生血管性青光眼之患者， 或在發展出此等症狀的風險下之患者。名稱“眼部新血管增 生”包括年齡相關的黃斑病變、白内障、急性缺血性視神經 病變(AION)、視網臈震盪、視網膜分離、視網膜撕裂或破 ❹ 10 孔、醫生引起的視網膜病及其它缺血性視網膜病或視神經 病變、近視、色素沉著性視網膜炎及/或其類似病症。 - 如於本文中所使用，名稱“炎性症狀，，包括諸如眼睛發 — 炎及過敏性結膜炎的症狀。 本發明之干擾RNA輸送系統可有用地用來減弱特別基 15 因在使用RNA干擾的患者（即，實驗對象）中之表現性。 RNA干擾(RNAi)為一種使用雙股rnA(dsRNA)來沉默 基因表現的過程。雖然不想要由理論所限制，RNAi藉由似 0 RNaselll的酵素（剪切子(dicer))將較長的dsRNAs裂解成小 干擾RNAs(siRNAs)而開始。siRNAs為長度通常約19至28個 20 核苷酸（或20至25個核苷酸，或21至22個核苷酸）之 dsRNAs’且經常包括2_核苷酸3,突出物及5’磷酸鹽及3,羥基 終端。該siRNA的一股被併入已知為RNA引發的沉默複體 (RISC)之核醣核蛋白複體中。RISC使用此siRNA股來鑑別 與所併入的siRNA股至少部分互補之mRNA分子，然後裂解 12 200932274 5 ❿ 10 15 ❹ 20 這些標靶mRNAs或抑制其轉譯。因此，該已併入RISC的 siRNA股已知為引導股或反義股。從該siRNA消除其它 siRNA股（其已知為旅客股或正義股且與該標靶mRNA至少 部分同源）。熟習該項技術者將了解，原則上，siRNA的任 一股皆可被併入RISC中且作用為引導股。但是，siRNA設 計（例如，減少siRNA在想要的引導股之5’末端處的雙重穩 定性)可有助於將想要的引導股併入rISC中。 siRNA的反義股為該siRNA之活性引導劑，其中該反義 股已併入RISC中，因此讓RISC可鏗別出具有與該反義 siRNA股至少部分互補的標乾mRNAs，以用於裂解或轉移 抑制。具有與該引導股至少部分互補的序列imRNAs的 RISC主導性裂解將導致mRNA及由此mRNA所譯碼出的相 應蛋白質之穩定狀態程度減低。再者，rISC亦可經由轉移 抑制（而沒有裂解標乾mRNA)來減低相應蛋白質的表現性。 干擾RNAs似乎以催化方式作用於標靶mRNa的裂 解，即，干擾RNA能夠以亞化學計量的量達成標靶mRNA 之抑制。當與反義治療比較時，明顯需要較少的干擾rNA 來在此裂解條件下提供治療效應。 在某些具體實例中，本發明提供一種輸送干擾RNA來 抑制標靶mRNA之表現性，因此減少在患有與標靶mRNA 相關的病症之患者中的標乾mRNA程度之方法。 如於本文中所使用，措辭“減弱表現性，，(參照至基因或 恤NA)意謂著給藥或表現出一干擾RNA(例如，仙购的 量’以便㈣mRNA裂解或經由直接抑㈣譯來減低標把 13 200932274 mRNA轉譯成蛋白質。如於本文中所使用，名稱“抑制”、“沉 默”及“減弱’’指為標靶mRNA或相應蛋白質的表現性具有可 偵測的減低（如與在缺乏本發明之干擾RNA下，該標乾 mRNA或相應蛋白質的表現性比較）。標靶mRNA或相應蛋 5 白質的表現性減低通常指為“敲除(knock-down)”，且以在非 標靶對照RNA(例如，非標靶對照siRNA)之給藥或表現後所 呈現的相對程度來報導。由在本文的具體實例所預計之表 現性的敲除量包括且在50%至100%間。但是，對本發明之 目的來說，並不必需達成此敲除程度。 10 通常使用定量性聚合酶連鎖反應（qPCR)放大來測量 mRNA程度，或藉由西方墨點法（Western blot)或酶標記免疫 吸附測定法(E LIS A)來測量蛋白質程度來評估敲除。分析該 蛋白質程度可提供mRNA裂解和轉譯抑制二者之評估。測 量敲除的進一步技術包括RNA溶液雜交、核酸酶保護、北 15 方雜交、以微陣列監視的基因表現、抗體黏結、放射免疫 測定法及螢光活化的細胞分析。 可藉由觀察人類或其它哺乳動物之病症症狀改善來推 論出標靶基因的表現性已由本發明之干擾rNA分子減弱。 在一個具體實例中，輸送單一干擾RNA來減低標靶 20 mRNA的程度。在其它具體實例中，給藥二或更多種把該 mRNA做為標靶之干擾rnAs來減少該標靶mRNA的程度。 該干擾RNAs可透過連結至相同cPP-Arg胜肽或透過連結至 各別的CPP-Arg胜肽來輸送(例如，可預混合每種干擾RNA 及將其加入至CPP-Arg ;或每種干擾RNA可各自獨立地與 200932274 CPP-Arg混合，接著結合該各別的干擾RNA/CPP-Arg複體）。 如於本文中所使用，名稱“干擾RNA”及“干擾RNA分 子”指為全部的RNA或似RNA分子，其可與RISC互相作用 且參與RISC主導的基因表現改變。可與RISC互相作用的其 5 它干擾RNA分子之實施例包括短髮夾RNAs(shRNAs)、單股 siRNAs ' 微RNAs(miRNAs)、picoRNAs(piRNAs)及剪切子-基質27-mer雙鏈體。可與RISC互相作用之“似RNA”分子之 實施例包括siRNA、單股siRNA、miRNA、piRNA及shRNA 分子，其包含一或多種經化學改質的核苷酸、一或多種非 10 核苷酸、一或多種去氧核醣核苷酸、及/或一或多種非磷酸 二酯連結。因此，siRNAs、單股siRNAs、shRNAs、miRNAs、 piRNA及剪切子-基質27-mer雙鏈體為“干擾RNAs”或“干擾 RNA分子”的子群組。 如於本文中所使用，除非其它方面有提到，否則名稱 15 “siRNA”指為雙股干擾RNA。典型來說，在本發明之方法中 所使用的siRNA為包含二條核苷酸股之雙股核酸分子，每股 具有約19至約28個核苷酸（即，約19、20、21、22、23、24、 25、26、27或28個核苷酸）。典型來說，在本發明之方法中 所使用的干擾RNA具有長度約19至49個核苷酸。措辭“長度 20 19至49個核苷酸”當指為雙股干擾RNA時，其意謂著該反義 及正義股各自獨立地具有長度約19至約49個核普酸，包括 该正義及反義股藉由連結子分子連接的干擾RNA分子。 在本發明之輸送系統及方法中所使用的干擾尺\人可未 經改質或可經化學穩定化，以防止在内吞途徑中於溶酶體 15 200932274 或其它腔中降解。 已經發現單股干擾RNA可達成mRNA沉默，雖然其比 雙IRNA較無效率。因此，本發明的具體實例亦提供給藥 單股干擾RNA。如上述所引用的雙股干擾rna般，該單股 5 具有長度約19至約49個核苷酸。該單股干擾尺1^八 具有5’磷酸鹽或就地或活體内於5,位置處經磷酸化。使用名 稱“5,經磷酸化”來描述出例如在多核苷酸或募核苷酸之5， 末端處具有一經由醋連結至該糖(例如，核糖、去氧核糖或 其類似物）的C5經基而接附之填酸鹽基團的多核芽酸或寡 ❹ 10 核苷酸。 單股干擾RNAs可化學地合成或藉由試管内轉錄或從 媒傳者或表現匣（Expression cassettes)内生性表現，如描述 於本文參照雙股干擾RNAs。5,磷酸鹽基團可經由激酶加 入，或5’磷酸鹽可為RNA的核酸酶裂解之結果。髮夾干擾 15 RNA為單一分子(例如，單寡核苷酸鏈），其包含呈莖環或髮 夾結構的干擾RNA(例如，shRNA)之正義及反義股二者。例 如’ shRNAs可從DNA媒傳者表現出，其中該編碼出正義干 〇 擾RNA股的DNA寡核苷酸藉由一短間隔子來連結至該編碼 出反向互補的反義干擾RNA股之DNA寡核苷酸。若需要所 20 選擇的表現載體時，可加入3’終端T，s及核苷酸形成限制位 置。所產生的RNA轉錄摺回到其自身上以形成一莖環結構。 干擾RNAs可藉由加入、消除、取代或改質一或多個核 苷酸而與天然發生的RNA不同。非核苷酸物質可在5,末 端、3’末端處或内部地鍵結至干擾^^八。此改質通常設計 16 200932274 5 Ο 10 15 ❹ 2〇 成增加該干擾RNAs之抗核酸酶性，以改良細胞吸收性、提 高細胞標靶性、幫助干擾RNA追蹤、進一步改良穩定性、 減低脫把效應或減低用於干擾素途徑活化的位能。例如’ 干擾RNAs可在突出物的末端處包含一嗓吟核苷酸。例如， 膽固醇藉由吡咯啶連結子軛合至siRNA分子的正義股之3’ 末端亦可對siRNA提供穩定性。 進一步改質包括例如生物素分子、擬胜肽、螢光性染 料或樹狀分子(dendrimer)。 在本發明的具體實例中，核苷酸可在其鹼基部分上、 在其糖部分上或在該分子的磷酸鹽部分及功能上改質。該 改質包括例如以烷基、烷氧基、胺基、脫氮、函基、羥基、 琉醇基團或其組合取代。核_酸可例如以具有較大穩定性 的類似物取代(諸如，以去氧核糖核苷酸置換核糖核苷酸）， 或具有糖改質（諸如2, OH基團藉由2’胺基、2, 0-甲基、2’ 甲氧基乙基或2，-〇,4，-C亞甲基架橋置換）。核苷酸的嘌呤或 嘧啶類似物之實施例包括黃嘌呤、次黃嘌呤、吖嘌呤、甲 基硫腺嘌呤、7-脫氮-腺苷酸及0-及N-經改質的核苷酸。該 核苷酸的磷酸鹽基團可藉由以氮或以硫取代該磷酸鹽基團 的一或多個氧而改質(硫代磷酸酯類）。該改質例如對提高功 能、改良穩定性或滲透性、減低脫靶效應、或直接局部化 或標靶化有用。 在某些具體實例中，本發明的干擾分子包括如上戶斤述 的改質之至少一種。 如於本文中所使用，措辭“標靶序列”及“標 17 200932274 指為mRNA或該mRNA序列的部分，其可由在本發明之方法 中所使用的干擾RNA鑑別，藉此該干擾RNA可如於本文中 所討論般來沉默基因表現。選擇siRNAs用的標靶序列之技 術可由例如下列提供：吐奇(Tuschl)T.等人，“siRNA使用者 5 指南”，2004年5月6曰修訂，可在洛克菲勒大學(Rockefeller University)網址上獲得；工藝公報（Technical Bulletin)#506，“siRNA設計指導方針”，安畢翁有限公司 (Ambion Inc.)，在安畢翁網址上；及其它以網路為基礎的 設計工具’例如，在因維錯俊（InVitrogen)、狄哈馬空 10 (Dharmacon)、整合的 DNA 技術（Integrated DNA Technologies)或基因史酷力普特(Genscript)的網址處。起始 搜尋參數可包括G/C含量在35%至55%間且siRNA長度在19 至27個核普酸間。該標無序列可位於該mRNA的編碼區域 中或在5’或3’未轉化區域中。該標靶序列可使用來取得干擾 15 RNA分子’諸如描述於本文中的那些。 使用如上述討論之可獲得的設計工具來選擇在標靶 mRNA序列内的干擾RNA標乾序列（例如，siRNA標乾序 列）。然後，藉由轉移表現出標靶mRNA的細胞，接著為如 於本文描述之敲除評估來試管内測試與標靶序列相應的干 20擾RNAs。該干擾RNAs可使用如描述於本文的動物模型進 一步活體内評估。 可如下試管内評估干擾RNA敲除内生性雜基因在例 如HeLa細胞中的表現程度之能力。在標準生長媒質（例如， 以！0%胎牛血清補充的謝腹）中轉移前，板置HeL__ 200932274 5 ❹ 10 15 ❹ 20 小時。使用例如狄哈馬費克特(拉斐葉(Lafayette))l(狄哈馬 空，拉斐葉’ CO)，根據製造者的用法說明，在範圍從〇. j nM-100 nM的干擾RNA濃度下進行轉移。各別使用西空錯 (SiCONTROL)TM非標粗siRNA#l及西空錯tm親環素 (Cyclophilin)B siRNA(狄哈馬空）作為負及正對照。藉由 qPCR24小時轉移後，使用例如塔克門（TAqman)®基因表 現試驗(Gene Expression Assay)(其重疊標靶位置較佳（應用 生物系統(Applied Biosystems)，福斯特市(Foster city)，CA)) 來評估標靶mRNA程度及親環素b mRNA(PPIB， NM—000942)程度。當轉移功效為loo%時，正對照siRNA提 供基本上親環素B mRNA的完全敲除。因此，藉由參照至在 以親環素B siRNA轉移的細胞中之親環素B mRNA程度來 對轉移功效進行標靶mRNA敲除校正。標靶蛋白質程度可 例如藉由西方墨點法在轉移後大約72小時來評估（實際時 間依蛋白質循環速率而定）。用來從培養細胞中分離RNA及 /或蛋白質的標準技術已由熟習該項技術者熟知。為了減低 非特定的脫靶效應之機會，使用可在標靶基因表現中產生 想要的敲除程度之最低可能濃度的干擾RNA。亦可使用人 類角膜的上皮細胞或其它人類眼睛細胞株來評估干擾RNA 敲除内生性標靶基因的程度之能力。 在某些具體實例中，干擾RNA輸送系統包含一把與眼 晴病症相關的基因作為標靶之干擾RNA分子。由本發明的 干擾RNAs所設計作為標靶之mRNA標靶基因的實施例包 括與铋襲視網膜的病症相關之基因、與青光眼相關的基因 19 200932274 及與眼睛發炎相關之基因。 與視網膜病症相關的mRNA標把基因之實施例包括 TEK酪胺酸激酶，内皮(TEK);補體因子B(CFB);缺氧誘發 因子1，α亞單位(HIF1A) ; HtrA絲胺酸胜肽酶l(HTRAl); 5 衍生性血小板生長因子受體P(PDGFRB);化學激素，CXC 保守基序(motif) ’受體4(CXCR4);類胰島素生長因子I受體 (IGF1R);血管生長素2(ANGPT2) ; v-fos FBJ鼠科骨肉瘤病 毒致癌基因同系物（FOS);組織蛋白酶L1，轉錄變體 l(CTSLl);組織蛋白酶U，轉錄變體2(CTSL2);細胞内黏 10 連分子l(ICAMl);類胰島素生長因子i(iGFl);整合素 (integrin)a5(ITGA5);整合素βΙ(ΠΌΒΙ);核因子γ·Β，亞單 位l(NFKBl);核因子γ-Β，亞單位2(NFKB2);化學激素， CXC保守基序，配體12(CXCL12);腫瘤壞死因子受體 l(TNFRl);血管内皮生長因子(VEGF);血管内皮生長因子 15 受體UVEGFR1);腫瘤壞死因子-α-轉換酵素(TACE);及激 酶插入區受體(KDR)。 與青光眼相關的標靶基因之實施例包括碳酸脫水酶 II(CA2);碳酸脫水酶iV(CA4);碳酸脫水酶XII(Ca12) ; β1 腎上腺素受體(ADBR1) ; β2腎上腺素受體(ADBR2);乙醯 20 膽驗醋酶(ACHE) ; Na+/K+-ATP酶；溶質載體家族12(納/卸 /氣化物轉運蛋白），成員1(SLC12A1);溶質載體家族12(鈉/ 鉀/氣化物轉運蛋白），成員2(SLC12A2);結締組織生長因 子（CTGF);血清類澱粉a(SAA);分泌捲曲相關性蛋白質 l(sFRPl);說姆林蛋白（gremiin)(GREMl);離胺基氧化酵素 200932274 5 ❹ 10 15 ❹ 20 (LOX)，c_Maf; rho相關的含纒繞結構(c〇iie(j-c〇il)蛋白質激 酶l(ROCKl) ; rho相關的含纒繞結構蛋白質激酶 2(ROCK2);纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑i(PAI-l);内皮 分化，神經鞘脂質G-蛋白質耦合的受體，3(Edg3R);肌纖 蛋白（myocilin)(MYOC) ; NADPH 氧化酵素 4(NOX4);蛋白 質激酶€5(卩1^&);水通道蛋白（391^〇1*丨11)1(八(^>1);水通道 蛋白 4(AQP4);補體串接（complement cascade)成員；ATP 酶，H+傳輸，溶酶體VI亞單位A(ATP6V1A);間隙連接蛋 白a-l(GJAl);甲醯基胜肽受體l(FPRl);似甲醯基胜肽受 體l(FPRLl);白血球間質8(IL8);核因子γ-Β，亞單位 l(NFKBl);核因子γ-Β，亞單位2(NFKB2);早老蛋白 (presenilin)l(PSENl);腫瘤壞死因子-a-轉換酵素(TACE); 轉化生長因子P2(TGFB2);瞬時性受體電位陽離子通道，亞 科V，成員l(TRPVl);氣化物通道3(CLCN3);間隙連接蛋 白a5(GJA5);腫瘤壞死因子受體l(TNFRl);及似幾丁質酶3 2(CHI3L2)。 與眼睛發炎相關的mRNA標靶基因之實施例包括腫瘤 壞死因子受體總科，成員lA(TNFRSFlA);磷酸二酯酶4D， cAMP特定(PDE4D);組織胺受體Hl(HRHl);脾酪胺酸激酶 (SYK);白細胞介素(interkeukin)ip(ILlB);核因子γ-Β ’ 亞 單位l(NFKBl);核因子γ-Β，亞單位2(NFKB2);及腫瘤壞 死因子-a-轉換酵素(TACE)。 此等標靶基因已描述例如在具有公告案號 20060166919 > 20060172961'20060172963'20060172965 ' 21 200932274 20060223773、20070149473及20070155690的美國專利申請 案中’該等揭示其全文以參考方式併入本文。 在某些具體實例中，本發明提供一種包含本發明之干 擾RNA輸送系統的醫藥組合物。在某些具體實例中，該組 5 成物以一治療有效量存在於一醫藥可接受的載體中。 醫藥組合物為一包含本發明之干擾尺]^八8或其鹽（最高 99重量％)與一生理可接受的載體媒質（包括以下描述的那

些及諸如水、緩衝液、鹽液、甘胺酸、玻尿酸、甘露醇及 其類似物）混合的調配物。 〇 本發明之組成物以溶液、懸浮液或乳液給藥。下列為 可使用在本發明之方法中的醫藥組合物調配物之實施例。

干擾RNA 羥丙基甲基纖維素 氣化納 氣化节烷銨 EDTA NaOH/HCl 純水（無核糖核酸酶) 最高99 ; 0.1—99 ; 0.1-50 ; 0.5-10 〇 0.5 0.8 0.01 0.01 適量pH 7.4 適量100毫并

最高99 ; 〇.ι_99 1.0 0.01 0.5 適量至100% 0.1-50 ； 0.5-： 干擾RNA 磷酸鹽緩衝的鹽液 氣化节院鍵 聚山梨酸酯80 純水（無核糖核酸酶） 22 15 200932274 Ο 干擾RNA 元鹼磷酸鈉 二元鹼磷酸鈉（無水） 氣化鈉 二鈉 EDTA 聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor)EL 氣化节烷銨 HC1 及/或 NaOH 純水（無核糖核酸酶)_ > 0.1-99 最高99 0.05 0.15 0.75 0.05 0.1 0.01 ΡΗ 7.3·7.4Jiijaoo〇/〇 0.1-50 ； 0.5-10.0 干擾RNA 磷酸鹽緩衝鹽液 羥丙基-β-環糊精 純水（無核糖核酸酶） f丄以重量％計 f 南 99 ; 0.1-99 4.0 -«^100% 0.1-50 ； 0.5-10.0 如於本文中所制，名稱，，治療有效量，，指為干擾RNA 5或包含干擾RNA的醫藥組合物其經測量可在哺乳動物中產 生治療反應之量。此治療有效量容易地由一般技藝人士使 用如於本文中所描述的方法查明。 通常來說，在本發明的組成物中所使用之干擾RNAs的 治療有效量可在標靶細胞表面處產生從1〇〇 ?]^至1 μΜ、或 10 從1 ηΜ至100 ηΜ、或從5 ηΜ至約50 ηΜ、或至約25 ηΜ的細 胞外濃度。達成此局部濃度所需要的劑量將依一些因素而 變化’包括輸送方法、輸送位置、在輸送位置與標靶細胞 或組織間之細胞層數目，不論該輸送為局部或全身性等 等。在輸送位置處的濃度可非常高於其在標靶細胞或組織 15表面處者。局部組成物可根據熟練的臨床醫生之例行判斷 每天輸送至k乾器官表面一至四次，或使用延長的輸送計 23 200932274 劃表:諸如每曰、每週、每二週、每月或較長。該調配物 的阳為約阳4.0至約PH 9.0，或約pH 4.5至約pH 7.4。 5 10 15 20 調配物的治療有效量可依下列因素而定：諸如例如患 者的年齡、種族及性別、病症的嚴重性、標減因轉錄^ 白質轉換的料、干擾RNA效力及干擾rna穩定性。在— 個=體實例中，該干擾RNA在治療劑量下局部輸送至標乾 器官及到達該含雜mRNA的組織’因此改善與標免基因 相關的疾病過程。

以針對標靶mRNAs的干擾RNAs來治療性治療串者可 藉由增加作用週期而預期獲益超過小分子治療，因此允許 較少的給_率及較大的患者容量彈性；及II由增 ^ 特異性’因此減少副作用。 * 如於本文中所使用，“醫藥上可接受的載劑，，指為可、2 成至多、些微至無刺激、可提供合適的預防（若需 ^ 及可以均勻的劑量來輸送一或多種本發明之干擾 那些載劑。

本發明之組成物可以溶液、懸浮液或生物侵蝕性。 生物侵蝕性輸送裝置來輸送。 3 4 本發明之組成物可例如經由吸收、吸附、备 乳蔡、賴 真皮、吸入、心室内（intracentricular)、顱内、皮膚内 肉内、鼻内、眼内、肺内、靜脈内、腹膜内、胸骨内 内、室内、鼻、眼睛、口服'耳、非經腸式、貼片、直腸$ 全身性、皮下、舌下、局部或經皮、或陰道給藥來輪送 干擾RNA輸送系統可藉由眼睛組織注射直接輪送至 24 200932274 月諸如眼周圍 '結膜、眼球筋膜腔下（subtenon)、眼房内、 玻璃狀體内、眼内、前或後近輩膜、視網膜下、結膜下、 眼球後、或管内注射；藉由使用導管或其它放置裝置直接 施加至眼晴，諸如視網膜小粒、眼内嵌入物、包含多孔、 ^孔或膠狀物質的栓劑或植人物；藉由局部眼睛滴劑或 :’或藉由呈盲囊或錢至鞏膜(經輩膜)植人或在輩膜 膜内）中或在眼睛内的慢釋放裝置。眼房内注射 膜進入前虑由、^ η ，U讓藥劑到達小樑網。管内注射可進入靜 10 15 ❹ 20

Ml集器管道排出鞏膜靜脈竇或進人鞏膜靜脈寶中。 ^睛給藥來說’本發明之組成物可例如藉由每2-6週 的玻璃狀體内4 存、妹 射，或經由局部眼睛、前或後近鞏膜的積 膜下眼周圍、眼球後、眼球筋膜腔下、眼房内、 以視_下、或脈絡膜上給藥來輸送。 ^ ，輪送來說，本發明之組成物可與醫藥上可接受 的防腐劑、妓、货*丨 又 劑、_/、 界面活性劑、黏度增_、滲透增強 或冰该_彳、氯化鈉或水結合，以形成一水性無菌懸浮液 由在生理可接受的等滲壓水性緩衝液中溶解 ^界 製備溶液調配物。再者，該溶液可包括可接受 f汰1面活性劑以幫助該干擾RNA溶解。可將黏度建立試劑 土纖維素、羥乙基纖維素、甲基纖維素、聚乙 备11咬_或其類似物)加入至本發明之組成物以 化合物的滯留性。 民忒 為了製備—無菌軟膏調配物，在適當的媒劑 ， 物油、液體呈 ^ 手毛脂或白軟石蠟）中結合該組成物與防腐劑。 25 200932274 可根據在此項技藝中已知之方法，藉由將本發明之組成物 懸浮在從例如卡波剖（Carb〇p〇1)⑧_94〇(BF古得里趣 (Goodrich)，夏洛特市(Charl〇Ue)，NC)或其類似物之組合所 製備的親水性基礎物中來製備一無菌凝膠調配物。可例如 5使用維斯扣特（Visc〇at)®(愛爾康實驗室公司（Alcon Laboratories ’ Inc.)，沃斯堡（F〇rtW〇rth)，τχ)來眼内注射。 本發明之其它組成物可包括滲透提高劑，諸如聚氧乙烯蓖 麻油（cremephor)及屯（Tween)⑧8〇(聚氧乙烯脫水山梨糖醇 單月桂酸醋’西格瑪亞得富（sigma Aldrich)，聖路易斯(St. ® 10 Louis)，MO)。 在某些具體實例中，本發明亦提供一種成套配方，其 * 包括用來減弱如於本文中所引用之mRNA在細胞中的表現 - 性之藥劑。該成套配方包括軛合至CPP-Arg或CPP-HA2-Arg 胜肽的干擾RNA分子，及/或用來製造軛合至cpp-Arg或 15 CPp-HA2-Arg胜肽的干擾RNA分子所需要之組分(例如，干

擾RNA分子和用來連結的胜肽及需要物質）。該成套配方亦 可包括正及負對照siRNAs或shRNA表現載體(例如，非標無 Q 對照siRNA或把不相關的mRNA作為標把之siRNA)。該成套 配方亦可包括用來評估想要的標靶基因之敲除的試劑（例 20 如，用於定量性PCR以偵測標靶mRNA的引子及探針，及/ 或用於西方墨點來對抗相應蛋白質之抗體）。再者，該成套 配方可包含siRNA序列或shRNA序列’及藉由試管内轉錄產 生siRNA或構成shRNA表現載體所需的用法說明及物質。 進一步提供一呈成套配方形式的醫藥組合，其在包裝 26 200932274 ::中包括-採用來容納一與之緊密侷限的容器工具之攜 工具，及一包含干擾RNA組成物與胜肽的第一容器工 t若必要時’此成套配方可進—步包括多種f知二成 套配方組分之-或多種，諸如例如，含有1多種醫藥上 ==的載劑之容器、額外容器等等，如將容易地由熟習 技術者明瞭。在該成套配方中亦可包括“出欲给藥 的組分之量、給藥㈣方針及/或混合組麵㈣ 印 ❹ 10 刷的用法朗（如為夾人物或如為貼紙）。 於本文中所引㈣參考（至它們可對於本文所提出的 那些提供典型程序或其它詳細補充之程度)特^參考方 式併入本文。 按照本公告，熟習該項技術者將察知，可對於本文所 揭不的具體實例製得明顯改質而沒有離開本發明之精神及 範圍。可按照本公告在沒有過度實驗下製得且執行於本文 15 所揭不的全部具體實例。在本揭示及其相等具體實例中闡 φ 述出本發明的最大範圍。本專利說明書應該不過度地推斷 而窄化本發明授以保護權利的最大範圍。 應該了解的是’前述揭示強調本發明的某些特定具體 實例’及向那裏的全部改質或代用同等物皆在如於所附加 20 的申請專利範圍中所提出之本發明的精神及範圍内。 【圖式簡單說明】 (無） 【主要元件符號說明】 (無） 27

Claims (1)

1. 200932274 七、申請專利範圍： 1. 一種干擾RNA輸送系統，其包含一連結至細胞穿透胜肽 (CPP)-Arg胜肽的干擾RNA分子。 2. 如申請專利範圍第1項之輸送系統，其中該CPP_Arg胜肽 5 更包含一HA2胜肽。 3·如申請專利範圍第1項之輸送系統，其中該干擾RNA分 子經由共價鍵連結至該CPP-Arg胜肽。 4.如申請專利範圍第1項之輸送系統，其中該干擾RNA分 子為 siRNA、miRNA 或 shRNA。 10 5. 一種醫藥組合物’其包含如申請專利範圍第1項之輸送 系統及一醫藥上可接受的載劑。 6.如申請專利範圍第1項之輸送系統’其中該cpp為TAT胜 肽、或穿膜肽的蛋白質轉導區段(pAntp)、細胞穿透肽、 MPG、MPGdeltaNLS 或pHLIP。 15 7. —種將干擾RNA分子輸送進入細胞中的方法，其包括： ⑷將一干擾RNA分子接附至CPP-Arg胜肽，因此形 成一干擾RNA輸送系統；及 (b)在合適於該系統進入細胞中之條件下，將該系統 給藥至該細胞； 20 其中於HA2胜肽存在下可提高該系統在細胞内從 核内體釋放出。 8.如申請專利範圍第7項之方法，其中該HA2胜肽藉由給 藥CPP-HA2胜肽引進該細胞中。 9_如申請專利範圍第7項之方法，其中該cpp-Arg胜肽更包 200932274 含該HA2胜肽。 10·如申請專利範圍第7項之方法，其中該干擾RNA分子經 由共價鍵連結至該CPP-Arg胜肽。 5 ❹ 10 15 20 11. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該干擾RNA分子為 siRNA、miRNA 或 shRNA。 12. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該CPP為TAT胜肽、 或穿膜肽的蛋白質轉導區段(pAntp)、細胞穿透肽、 MPG、MPGdeltaNLS 或 pHLIP。 13. 一種如申請專利範圍第1項之干擾RNA輸送系統的用 途’其使用來製造用於治療或防止患者的眼睛病症之藥 劑，其中該干擾RNA分子可減弱與該眼睛病症相關的基 因之表現性。 14. 如申請專利範圍第13項之用途，其中該眼睛病症與眼睛 血&新生、乾眼症、眼睛炎性症狀、眼壓過高或青光眼 相關。 15. 如帽專利範，13項之用途，其中該线藉由下列方 式、·。藥·眼内注射、眼睛局部塗佈、結膜下注射、玻璃 ㈣内注射、前或後近鞏膜注射、靜脈内注射、口服給 藥肌肉内主射、腹膜内注射、經皮塗敷、鼻内塗敷或 經黏膜塗敷。 29 200932274 四、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（ ）圖。（無) (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：