TW200846361A - Expression and bioactivity of bovine follicle stimulating hormone - Google Patents
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Description
200846361 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 胚胎移植領域正在期望多個後代之各動物業界中不斷發 展。在2006年，在世界範圍内有超過13〇,〇〇〇頭經超數排 印處理的供體牛且移植胚胎的數量增加了〗〇%達到超過 670,000 頭（IETS Newsletter，2007 年 12 月）。在美國，在 2006年據估計有52,〇〇〇頭經超數排卵處理的供體牛（aeta Annual Report 2006)。目前所有超數排卵方案均需要在至 少4天期間每天兩次進行多次促濾泡激素（FSH)注射。目前 應用之FSH來源於動物、含有雜質且具有感染性傾向。本 文所述之發明係一種單次注射即可有效導致超數排卵之長 效FSH類似物。而且，該FSH類似物純度較高且不含感染 性载體及其他污染物。 本申凊案主張2007年2月8日申請之美國臨時專利申請案 第60/888,807號之權利，該案之全文以引用的方式併入範 圍不會與本文揭示内容產生不一致。 【先前技術】 在吳國有超過900萬頭奶牛，在加拿大超過1〇〇萬頭且在 世界範圍内超過5千萬頭。乳品業極具競爭性且牛奶公司 具有提高繁殖效率及在授精後保持受孕之能力對生產者之 盈利能力至關重要。據估言十，未受孕奶牛之花費約為每天 5吴兀。又據估計目前之授精可在第45天獲得大約2〇铺 :又孕奶牛且其中9〇_95%的奶牛會在283天妊娠期結束時 为娩小牛。然而，長期以來奶牛生殖效率卻在不斷下降。 128957.doc 200846361 該趨勢之幅度及持續性對乳品業具有極為重要的影響且在 近ίο年内使初次配種受孕率每年持續下降大約1%。吾人 尚不明了該生產率變化之影響，乃因為在同一時期内個體 奶牛奶產量增加20%。從長遠來看，乳品業無法承受生殖 效能以目前速率持續下降。
已在全美國及世界上奶產量不斷增加的其他地區觀察到 奶牛生殖效率下降（Lucy，M.C. (2001) "Reproductive loss in high-producing dairy cattle: Where will it end?/1 J. Dairy Sci.y 84:1277-1293 ; Roche等人，（2000) ’’Reproductive management of postpartum cows,n Anim. Reprod. Sci.f 60-61:703-712 ； Royal 等人，（2000) "Declining fertility in dairy cattle: changes in traditional and endocrine parameters of fertility/* Anim. 70:487-502 ;及 Macmillan等人，（1996) "The effects of lactation on the fertility of dairy cows” Aust· Vet. J·， 73-/141-147)。衆多特徵可負面影響奶牛生育力，包括負能 量平衡及疾病事件，如滯留胎盤、酮症、囊性卵巢、及乳 腺炎（Lucy 2001，上述文獻；及Staples等人，(1990) "Relationship between ovarian activity and energy status during the early postpartum period of high producing dairy eows，” J· Dairy 73:938-947)。而且，美國乳品業之主 要趨勢係奶牛場數量減少、畜群規模不斷增大、及向西部 各州運送乳製品（USDA National Agricultural Statistics Service， http//www.usda.gov/nass)。更大的畜群規模可能使生殖效能 降低，乃因奶牛場勞動力及奶牛管理之相關變化會導致識 128957.doc 200846361 別動情行為、實施人工授精、進行動情同步化程序、及識 別與處理生病奶牛的工人培訓不足或任務過重（Lucy 2001，見上文所述文獻在全年大部分時期發生於美國 西部及西南部乳畜群中的熱應激對牛生育力具有顯著的負 面影響（Wolfenson 等人，（2000) "Impaired reproduction in heat-stressed cattle: basic and applied aspects,1* Anim. Reprod. Sci., 60-61:535-547)。 乳品業中的主要收益來源係奶產量。在最近幾十年中， 在奶牛遺傳學及管理方面的進步已使奶產量顯著增加，僅 在最近十年裏每頭奶牛產量就增加了 20%(USDA National Agricultural Statistics Service，http//www.usda.gov/nass)。然而， 為保持高畜群生產率，奶牛必須受孕並分娩小牛以更新泌 乳週期。而且，必須繁殖足夠數量的小奶牛來取代老奶 牛。因此，將來乳品業之生產率極大地取決於生育力及繁 殖力之保持。 若能提高馬、牛或其他有蹄類動物之生殖效能將對飼養 者具有顯著經濟效益。此可藉由提高生育力及在妊娠期間 改良妊娠保持以防止流產來達成。超音波妊娠檢查之近期 研究表明牛中至少20%的胚胎死亡發生於妊娠28至60天之 間（Pursley 等人，（1998) ’’Effect of time of artificial insemination on pregnancy rates, calving rates, pregnancy loss, and gender ratio after synchronization of ovulation in lactating dairy cows,H J. Dairy 5W·，81:2139-2144;及 Vasconcelos 等人，（1997) ’’Pregnancy rate, pregnancy loss, and response to heat stress after A1 at 128957.doc 200846361 2 different times from ovulation in dairy cows" Biol· ，56(附錄1) : 140)。在28天之前很可能有超音波檢 查檢測不到的更高的死亡率（Lucy 2001，見上文所述文 獻）。數據表明現代奶牛由於子宮環境未達最佳而無法受 孕（Gustafsson，H·及 K. Larsson (1985) ’’Embryonic mortality in heifers after artificial insemination and embryo transfer: differences between virgin and repeat breeder heifers/* Res. Vet. Sci., 39:271-274)。雖然有衆多可能因素可造成胚胎死亡，但一個潛在 原因係血液孕留酮濃度低。 目前若干激素療法被用於提高生育力或保持妊娠。 Thatcher 等人（2001 Theriogenology 55:75-89)闡述了 激素治 療對牛生殖效能之效果。激素治療包括投與牛生長激素 (bST)及人絨毛膜促性腺激素（hCG) 〇 DOcchio等人（2000 Anim. Reprod. Sci. 60-61:433-442)闡述使用促性腺激素釋 放激素（GnRH)拮抗劑植入劑進行肉用牛管理之多種策略。 De Rensis等人（2002 Theriogenology 58(9):1675-1687)闡述 在人工授精之前投與GnRH或hCG對奶牛之影響。Martinez 等人（1999 57:23-33)闡述豬黃體生成激 素（LH)及GnRH能在排卵後（第0天）未授精肉用小奶牛中在 動情週期之第3、第6、及第9天誘導卵泡波出現。Santos等 人（2001 JL Animal Science 79:2881-2894)闡述在人工授精 後第5天向高產奶牛肌内投與3,300 IU之hCG對生殖效能之 影響。Lee 等人（1983 Am· J· Vet· Res. 44(1 1):2160-2163)闡 述在人工授精時投與GnRH對奶牛之影響。美國專利第 128957.doc 200846361 5,792,785號（公佈於1998年8月11曰）及美國專利第 6,403,631(公佈於2002年6月11日）闡述在授精之前及之後 才又與槐黑素以在動物中提南姓娘成功率之方法及組合物。
Chagas e Silva等人（2002 ⑽/agy 58(1):51-59)闡述 胚胎移植後奶牛中的血漿孕甾酮特性。Weems等人（1998
Prostaglandins and other Lipid Mediators)闡述來自未孕及 受孕奶牛黃體（CL)之激素對孕甾酮分泌的影響。美國專利 第4,780,451號（公佈於1988年10月25日）闡述使用LH及促濾 泡激素（FSH)在牛中產生超數排卵之組合物及方法。；parin 等人（1988出〇/· 38:413-421)闡述在未授精時動情 週期的第5天及第7.5天靜脈投與300 IU之hCG對綿羊黃體 重量之影響。Hoyer 及 Niswender (1985 C⑽· ·/· Pharmacol 63(3):240-248)闡述綿羊黃體細胞中類固醇生 成之調節作用。juengel 及 Niswender (1999 J·
Feri//· 54:193-205)闡述在家養反芻動物中黃體孕甾 酮的分子調節作用。美國專利第5,589,457號（公佈於1996 年12月31日）闡述使用GnRH、LH、及/或hCG與PGF2a在牛 中同步化排卵的方法。 許多該等治療使用來自糖蛋白激素家族（其由垂體蛋白 黃體生成激素（LH)、促濾泡激素（FSH)、促甲狀腺激素 (丁SH)及絨毛膜促性腺激素（CG)組成）之激素或激素類似 物。促性腺激素（其包含CG、FSH及LH)對生殖功能至關重 要。其係由兩個非共價結合的a與β亞單位組成的異二聚 體。二種亞單位均經糖基化，其包括天冬醯胺（Ν)連結之 128957.doc -10- 200846361 募糖且，若為CGp亞單位，則〇連結之碳水化合物亦存在 於胺基酸集群之C末端中。人類個體β亞單位係由單獨的基 因編碼，且LHP及CGp蛋白在結構及功能上相似，具有超 過 80% 的胺基酸一致性（pierce jg，pars〇ns (1981)
Glycoprotein hormones: structure and function，” Biochem· 50:465-495)。在同一種屬内，α亞單位胺基酸序列對所有4 種激素皆是相同的（Pierce JG，Pars〇ns (1981) BiQehem. 50:465-495) 〇 為使用促性腺激素在動物中改良繁殖效率，純化蛋白之 可用性至關重要。目前，促性腺激素之來源係血清及全垂 體提取物。欲獲得足量用於該任務之該等天然激素需要昂 貝的铯費且具有較大難度。垂體提取物可作為有效的生殖 治療劑，但其含有污染物且其之量可能會有所不 同。製備無交叉污染之純垂體促性腺激素並非易事。鑒於 天然促性腺激素具有動物間差異及Ν_連結碳水化合物中電 荷不均一性之問題，若能形成相應重組蛋白則將會產生組 成更均i可在質量與生物活性方面達到標準化的促性腺 激素。該等蛋白將對校準臨床實驗室分析法及飼養管理極 其重要，例如可縮短自然繁殖及人工授精過渡期及週期母 .…排印之時間。使用重組形式而非自赢清與垂體組織 提取之激素可避免具有導致朊病毒相關疾病傾向之病原體 與致病因子的共污染。 因此’需要活性重組促性腺激素類似物(尤其是FSH類似 物)及使用該等類似物來改良牛及其他動物繁殖力之方 128957.doc 200846361 法0 【發明内容】 本發明提供牛FSH(bFSH)類似物，尤其係單鏈重組bFSH 類似物。該等活性重組bFSH類似物產品可有益地在牛及 其他哺乳動物物種中改良生殖活性、超數排卵及胚胎產 生。重組bFSH類似物亦可避免交叉污染問題且不會在接 受處理動物中誘發強烈免疫應答。 本發明提供使用牛FSH類似物以在有蹄類動物（尤其係 牛）中提高生殖活性之方法。具體而言，係使用單鏈bFSH 類似物在雌性動物中刺激超數排卵、增加胚胎產生、及提 高繁殖力。期望在大量物種（包括但不限於牛、綿羊、山 羊、鹿類、耗牛、水牛、野牛、羚羊、瞪羚、麋鹿、馴 鹿、駆鹿、大角羊、長頸鹿、及駱駝（包括雙峰駱駝及單 峰駱駝、美洲駝）、豬、馬、羊駝、及小羊駝）中投與bFSH 來提高繁殖力、增加胚胎數或誘導超數排卵。該方法對在 牛中提高超數排卵、胚胎產生及妊娠尤其有效。用於本發 明實施例中之bFSH類似物具有至少95%之純度且較佳地為 重組多肽。更佳地，該bFSH類似物係單鏈重組bFSH。本 發明亦提供生產生物活性單鏈重組bFSH之方法。 本發明一個實施例係提供藉由表現編碼bFSH α及β亞單 位之DNA來製備重組bFSH類似物之方法。在一個實施例 中’所產生單鏈重組bFSH類似物其中係使用連結體肽將α 亞單位與β亞單位連結。天然FSH係以個別分離的α及β亞 單位產生’其非以共價方式組裝在一起。本發明單鏈重組 128957.doc 12- 200846361 bFSH具有高表現度及高生物活性。在一個實施例中，重 組bFSH類似物（稱作bFSHpCTPa)係單鏈重組bFSH，其中 係使用人絨毛膜促性腺激素羧端肽將源自於牛FSH之α及β 亞單位連結在一起。 bFSH α及β亞單位之胺基酸序列分別示於SEQ ID NO 1及 SEQ ID NO 2。咸應理解，bFSH類似物之胺基酸序列可能 有稍微差異但此並不影響功能。在一個實施例中，單鏈 bFSH類似物之α及β亞單位與牛FSH α及β亞單位（SEQ ID NO 1與SEQ ID NO 2)具有至少80%的序列一致性。較佳 地，bFSH類似物包括與SEQ ID NO 1具有至少85%同源性 之第一多肽及與SEQ ID NO 2具有至少85%同源性之第二 多肽。更佳地，第一多肽與SEQ ID NO 1具有至少90%同 源性且第二多肽與SEQ ID NO 2具有至少90%同源性。尤 佳地，第一多肽與SEQ ID NO 1具有至少95%同源性且第 二多肽與SEQ ID NO 2具有至少95%同源性。 較佳地，該bFSH類似物係單鏈，其中第一多肽與第二 多肽係共價連結。共價連結指第一多肽直接或經由連結體 肽與第二多肽結合，其中該連結體肽之一端與第一多肽結 合且該連結體肽之另一端與第二多肽結合。在重組蛋白合 成中可與多肽結合之連結體肽為業内所熟知，且任何適宜 表現為bFSH類似物部分的連結體肽均可使用。在一個實 施例中，該連結體肽係人絨毛膜促性腺激素羧端肽 (CTP) 〇咸應理解，由於bFSH類似物可具有構型（α亞單 位連結體-(β亞單位）或（β亞單位連結體-(α亞單位），因 128957.doc -13- 200846361 此β亞單位之位置可調換。 本文提供bFSH亞單位之胺基酸序列。因此，熟習此項 技術者將能辨別編碼bFSH類似物之DNA及RNA序列。在 一實施例中，將編碼bFSH類似物之核酸分子納入表現載 體中’並將该表現載體轉染於能表現其之細胞或細胞系 中。 在一實施例中，使用bFSH類似物來產生超數排卵事件 以獲得存活胚胎。在另一實施例中，使用bFSH類似物來 增加胚胎產生。誘導超數排卵及增加胚胎產生可用於胚胎 移植及體外受精。在一實施例中，向一或多種有蹄類動物 (較佳係牛）投與有效量bFSH類似物以提高繁殖力。在先前 已知方法中，必須以多次劑量延續數天投與FSH。在本發 明中’僅需向各動情週期動物投與單次劑量之單鏈重組 bFSH類似物。此可歸因於該FSH類似物之活性增強或持續 活性時間更長。在一實施例中，藉由確定基準發情日（最 後發情日）確定準備進行FSH類似物注射之動物且隨後在動 物週期約第7天至約第13天之間以單次注射投類似 物。視6況在投與FSH後大約2至5天時向動物給予兩劑溶 黃體劑量之前列腺素（間隔大約12小時）。檢查動物發情迹 象且隨後藉由自然或人工授精繁殖動物。在又一實施例 中，在投與bFSH之後大約4至6天時進行授精。在另一實 施例中’在發情後大約6-8天時沖洗胚胎。 視情況在投與bFSH類似物的同時投與額外的激素，例 如黃體生成激素、絨毛膜促性腺激素及前列腺素。在一實 128957.doc -14- 200846361 施例中，除投與bFSH類似物外還向動物投與前列腺素。 視情況以單次劑量投與前列腺素（通常藉由注射），或間隔 數小％投與多次劑量。在一實施例中，在投與bFSH類似 物後給予動物第一次前列腺素劑量，隨後在第一次前列腺 素劑ΐ後大約6小時至1天時給予動物第二次前列腺素劑 量° 在一實施例中，向一或多種動物投與介於約〇 〇1吨至約 5 mg之間之bFSH類似物。較佳地，投與介於約1()吨至約 〇·2 mg之間之bFSH類似物，更佳地介於約1〇吨至約15〇吨 之間。可使用業内已知之任何方法（包括但不限於肌内注 射及靜脈内注射）投與bFSH類似物。較佳地，經由肌内注 射投與bFSH類似物。 另一實施例提供用於在哺乳動物（例如牛）單次動情週期 内誘導超數排卵或增加胚胎數之套組，其包括··至少一次 别ΐ之包含有效量單鏈重組bFSH類似物（包含與SEQ ID NO 1具有至少90%同源性之第一多肽及與把卩id NO 2具 有至少90%同源性之第二多肽，其中第一及第二多肽以共 價連結）；用於投與單次劑量bFSH類似物之裝置；及關於 投與bFSH類似物劑量之說明。各劑量中有效量類似 物介於約1 至約0.2 mg之間，較佳地介於約1〇叫至約 1 5 0 pg之間，且可視套組而改變。用於向動物投與劑量之 裝置可係業内已知之任何裝置，例如針及α即筒。視情況， 該裝置係適用於遞送單次劑量bFSH類似物之注射裝置。 該套組亦可包含諸如額外激素（例如前列腺素）等組份及用 128957.doc -15- 200846361 於投與額外激素之注射裝置。 【實施方式】 本文所用繁殖指業内已知的關於使雕性動物受孕之任 何方法。該等方法包括自然及人工授精。繁殖方法可包括 觀察到動情行為或強制動情後之等待時間。 本文所用”動情”指動物最可能受孕之時期。本文所用 ’’強制動情"指業内已知用於強制發情之方法。強制動情可 視需要包括等待期。本文所用"動情行為，，指動物發情行為 之表現，包括表現持續發情Q本文所用”第〇天”係動物處 於動情行為狀態之日。 本文所用”奶牛”指雌性牛，包括小奶牛。 本文所用"受孕哺乳動物"指目前已受孕的哺乳動物且亦 包括已經授精且可能受孕的哺乳動物，或指複數個經授精 且其中數個可能已受孕的哺乳動物。 +又所周攸鬲繁短力”指提咼已經授精之一個動物或複 數個動物受孕、分娩存活後代、或發育存活胚胎之可能 性。提咼繁殖力亦指提高一個或複數個動物產生之存活胚 胎之數量。 本文所用”超數排卵”指增加排卵卵泡數量並產生多個受 精卵。f’超數排卵，’亦指藉由單次注射bFSH而產生多個胚 胎。 本文所用”有效量”指可有效產生期望結果之bFSH之量。 本文所用技與"指業内已知的向動物投與治療劑之任何 方法。投與之實例包括但不限於經皮下、肌内及靜脈内注 128957.doc -16- 200846361 射治療劑。 本文所用"類似物"指可模擬天然化合物生理效應之化合 物。類似物通常與天然化合物在結構上類似但可能由於生 產方法而具有結構或化學差異，或由於該等差異賦予類似 物有益活性。 本文所用"約95%純度”指藉由業内已知之任何方法（包括 但不限於蛋白電泳）量測之純度。 本文所用"授精，，指藉由業内已知之任何方法（包括但不限 於自然及人工授精）引入精子。 本發明之單鏈重組bFSH類似物可使用單次投與單次劑 量在雌牛中誘導超數排卵、增加胚胎產生、並提高繁殖 力。目前之FSH方案通常需要經數天以大約12小時之間隔 投與多次劑量。現場研究表明使用本發明重組bFSH類似 物可使用更少量之bFSH以更簡易及更有效之投與方式達 成超數排卵。 bFSHpCTPa(亦稱作 BoviPuj^jpsHTM)之 cDNA核苷酸序列 及胺基酸序列在圖1中提供且胺基酸序列進一步在seq NO 10中提供。如圖！中所示，第一部分（胺基酸卜I”）對 應於牛FSH β亞單位（SEq ID N〇 2)，下劃線部分對應於羧 知連結體肽（胺基酸130-157，SEQ ID NO 3)，且第三部分 (胺基酸158-253)對應於牛FSH α亞單位（SEQ ID NO 1)。 本發明之一實施例涵蓋具有SEq ID NO 10胺基酸序列、 或具有與SEQ ID NO 10胺基酸序列具有90%或更大、較佳 地95%或更大同源性之胺基酸序列的單鏈重組bFSH類似 128957.doc -17- 200846361 物。另一實施例係包含編碼與SEQ ID NO 10胺基酸序列具 有90%或更大、較佳地95%或更大同源性之單鏈胺基酸的 核酸的核酸或载體。另一實施例係包括編碼具有與SEQ ID NO 1具有90%或更大同源性、較佳地95%或更大同源性之 第一多肽及與SEQ ID NO 2具有90%或更大同源性、較佳 地95%或更大同源性之第二多肽的單鏈胺基酸的核酸的核 酸或載體。亦涵蓋由SEQ ID NO 10提供之核苷酸序列片段 編碼之功能性單鏈重組bFSH類似物。 實例1·構造單鏈重組bFSHpCTPa 自牛垂體cDNA(其係使用iScript cDNA合成套組（Bio-Rad Laboratories, Hercules， CA) 產生）擴增 編碼牛FSHP 亞 單位之cDNA。使用 Deep Vent DNA聚合酶（New England Biolabs，Ipswich ΜΑ)及 Techgene型 FTGENE2D熱循環儀 (Techne，Burlington，NJ，USA)實施擴增。在FSHβ擴增中使 周 2 μΜ以下各引子：5，-GTG CAT AGG ATG AAG TCT GTC C’3* (SEQ ID NO 4)及 5，-GGC GCG TTA TTC TTT GAT TTC CC-3f (SEQ ID NO 5)。PCR條件如下：起始變性 94°C 5分鐘，1-30個循環，變性94°C 30秒，退火55°C 30 秒，延伸72°C 30秒，且最終延伸72°C 5分鐘。將FSH0 PCR產物選殖至PCR-Script載體（Stratagene，La Jolla，CA) 並測序以進行驗證。為構建重組bFSHpCTPa單鏈，使用 bLH模板作為用於重疊PCR的兩個PCR模板之一。如上所 述，另一模板係pCRScript-bFSHp。以下引子用於構建重 組bFSHpCTPa單鏈： 128957.doc -18- 200846361 引子 1 (SEQID NO 6> 5f>GC CGA AAG CTT ATT ATG AAG TCT GTC 03, bFSHp引子 引子 2(SEQIDN0 7> 5-GAG GAAGAG GAT TCT TTG ATT TCC C-3, bFSHp(粗體)/bLHCTPa重疊引子 引子 3(SK)IDM0 8> ff-GGG AAATCA AAG AATCCTCTT CCT C-3, bFSHp(粗體)/bLHCTPa重疊引子 引子 4 (SEQ ID NO 9) 5，-CGT GCT GGA TCC TTA TTA GGA TTT GTG-3, bLHCTPa 引子 在第一個PCR反應中，使用PCR-Script-bFSH作為模板以 引子1與2擴增包含5’ Hindlll限制位點、移除終止密碼子 (TAA)之bFSHp編碼序列、及重疊bLHCTPoc序列的PCR產 物A。在平行反應中，使用bLH cDNA作為模板以引子3與4 擴增包含添加至3’末端之BamHI限制位點、重疊bFSHa序 列（上文中以粗體表示）、及添加額外終止密碼子（TAA)之 bLHCTPa編碼序歹，J的PCR產物B。使用片段A與B以弓|子1 與4實施重疊PCR，從而得到最終重組產物bFSHpCTPa。 PCR(A及B)條件與上文用於bFSHp之條件相同。將PCR產 物以Hindlll與BamHI消化、插入穿梭載體並測序以進行驗 證。最終序列展示於圖1中。在一個實施例中，本發明包 含由圖1之核苷酸序列編碼的蛋白或肽或其與圖1(SEQ ID NO 10)胺基酸序列具有至少90%相似性之片段。 重組bFSHpCTPot之表現及純化 重組bFSHpCTPa作為模板DNA，以進一步擴增並亞選殖 至專利 GPex® 表現系統（Gala Design/Cardinal Health-Middleton)中。該系統闡述於美國專利第6,852,510B2中。 在適宜層析管柱中，使用SP_Sepharose Fast Flow樹脂 128957.doc -19- 200846361 (Amersham Biosciences，Sweden)純化細胞培養上清液。總
蛋白載量保持低於30 mg/ml樹脂。以〇·1 M NaCl、8 mM C2H3Na02緩衝液在pH 4·5下以90 cm/hr之流速平衡管柱。 細胞培養上清液經以濃乙酸調節至PH 4·5並以60 cm/hr之
流速載入管柱。以3倍管柱體積之〇·1 M NaCl、8 mM C2H3Na02、pH 4.5洗滌管柱。然後將兩種額外洗滌缓衝液
施用於管柱：3倍管柱體積之〇·1 M NaH2P04緩衝液pH 5·5，隨後係3倍管柱體積之0.16 M NaCl、8 mM C2H3Na02 缓衝液pH 4.5。在最終洗滌之後，用5倍管柱體積及介於
0·16 M NaC卜 8 mM C2H3Na02緩衝液至 〇·8Μ NaC卜 8 mM C2H3Na02、pH 4.5緩衝液之間之線性梯度實施洗脫，以自 樹脂洗脫重組bFSHpCTPa。藉由SDS-PAGE分析可知，在 該步驟中洗脫的重組bFSHpCTPa之純度為95%。以 ELISA、免疫印潰及MALDI-TOF分析證實重組bFSHpCTPa 之特性。如圖2中所示，該核苷酸序列之表現主要係產生 大約45 kDA之單一產物。 bFSHpCTPa之生物活性 bFSHpCTPa的生物活批乂么 係以體外分析法與Folltropin-
Vtm(一種市售的豬FSH製舞 ^ i〇niche Animal Health))進行 比較。該分析使用FSH^ _ 合時產生CAMP。藉由量〜、’其在顺類似物與該受體結 以下時）所釋放CAMP之量可之其在類似物的量為1吨^丨及 l向，山 知，重組bFSHpCTPcx會展示出 更大的活性。如圖3中所系 二七 in I X ττ 、 P〇11tropin在 1 pg/ml時活性較 低，而在10 pg/ml及1〇〇 kg/ml時具有顯著的活性。 128957.doc 200846361
Folltropin在低於1 pg/ml時不具有顯著活性。比較而言， bFSHpCTPa在100 gg/ml時顯示具有相同或稍高活性、在 1 pg/ml及10 pg/ml時具有顯著更大的活性、且在低至1〇 ng/ml之量時仍展示活性。 圖4展不在兩頭不同牛中投與600 pg本發明重組bps η類 似物後之金清F S Η濃度水平。F S Η之金清含量在投藥後大 約12小時時立即達到峰值。藉由在投與bFSH後大約4天再 投與前列腺素可誘導排卵。 實例2-在牛中bFSHpCTPa與Folltropin之比較效果 比較Folltropin與bFSHpCTPa對牛之效果。在一個實驗
中，在動情後大約7-8天時開始向動物投與兩種產品，如 圖5所示。在大約第10天（第一劑bFSH類似物後大約2_3天） 投與前列腺素且在約第12天（投與bFSH類似物後大約 天）進行人工授精。在約第19天（投與bFSH類似物後大約 11-13天）時沖洗胚胎及卵，並對相關數量的存活胚胎進行 計數。投與Folltropin與bFSHpCTPoi二者均可在動物群體 中成功達成胚胎產生及超數排卵，然而如圖5戶斤示，禮R 1重夺又 與單一劑量之bFSHpCTPa而Folhropin需經4天連續投與8 次劑量。 圖6顯示一個實驗，其中向21頭安格斯（angus)肉用奶牛 投與0.2 mg bFSHpCTPa。在動情後7-8天時進> bFSHpCTPa投與。投與bFSHpCTPa後大約2.5天時可檢測 到卵泡發育，並在投與bFSHpCTPa後4-4.5天時投與、、办龙_ 劑量之前列腺素。投與bFSHpCTPa後5-6·5天時檢測到動物 128957.doc -21 - 200846361 發情並在顯示發情後對動物進行授精。在投與bFSH類似 物後11-12天時沖洗胚胎並計數。
表1顯示回收的未受精卵數與來自經bFSHpCTPa處理動 物之存活胚胎之比較，如上文所述及圖6中所示。如表1所 示，存活胚胎數稍多於未受精卵數。該研究證明單次 bFSHpCTPa處理足以使卵泡發育，且在投與前列腺素後動 物表現出預期的動情時序。以bFSHpCTPa處理較以 Folltropin進行類似處理能觀察到更多的存活胚胎/次沖 洗。亦觀察到接受0.2 mg bFSHpCTPa的動物出現過度刺 激，表明低劑量bFSHpCTPa可能更佳。 表1 奶牛編號 總回收卵 未受精卵 存活胚胎* BHRD156E 27 14 12 BHR 24J 53 16 13 BHR51F 1 1 0 BHRH299 28 1 25 BHRH311 30 0 24 BHR M384 7 0 6 BHR E454E 36 21 5 ASP 718 26 15 6 ASP 400 8 8 0 ASP 446 8 3 4 ASP 142 19 19 0 ASP 248 51 25 18 ASP 990 23 4 9 ASP 509 50 4 43 ASP 653 19 9 1 ASP 279 33 12 6 ASP 186 21 3 14 ASP 162 30 12 4 ASP 380 31 6 12 ASP 890 22 20 1 ASP 164 35 20 13 小計 558 213 216 平均 26.57 10,14 10.29 128957.doc •22- 200846361 實例3-在牛中bFSHpCTPa劑量之比較效果
圖7及表2顯示一個研究，其中5頭奶牛以0.20 mg bFSHpCTPa處理（標記為FSH 200，編號1-5)，5頭奶牛以 0.15 mg bFSHpCTPa 處理（標記為FSH 150，編號 1-5)，且5 頭奶牛以〇·1〇 mg bFSHpCTPci處理（標記為FSH 100，編號 1-5)。如圖7所示，動情後7-8天時向動物投與 bFSHpCTPa，並在動情後13天時進行人工授精。在第11天 投與兩劑前列腺素。作為對照，以Folltropin處理5頭安格 斯肉用奶牛（標記為Folltropin，編號1-5)。各組之回收卵 數及存活胚胎數示於表2中。 表2 奶牛編號 總回收卵 存活胚胎 奶牛編號 總回收卵 存活胚胎 Folltropin 1 未發情 FSH 200 1 12 2 Folltropin 2 6 5 FSH 200 2 15 14 Folltropin 3 6 6 FSH 200 3 未發情 Folltropin 4 28 18 FSH 200 4 過度刺激 未沖洗 Folltropin 5 18 13 FSH 200 5 53 8 小計 58 42 小計 26.7 24 平均 14.50 10.50 平均 26.7 8 奶牛編號 總回收卵 存活胚胎 奶牛編號 總回收卵 存活胚胎 FSH 150 1 25 11 FSH100 1 5 4 FSH150 2 8 7 FSH 100 2 11 10 FSH150 3 34 2 FSH100 3 6 5 FSH150 4 50 4 FSH100 4 29 24 FSH150 5 16 2 FSH 100 5 46 42 小計 133 26 小計 97 85 平均 26.7 5.2 平均 19.4 17 該等結果表明0.10 mg bFSHpCTPa可較其他方案（包括
Folltropin)產生更多存活胚胎。在該劑量下亦未觀察到過 度刺激。 128957.doc -23- 200846361 現已為便於清晰理解之目的藉由圖示及實例詳細闊述了 本發明’熟習此項技術者顯然會瞭解，可在寬廣及等效條 件、調配物及其他參數範圍内藉由修飾或改變本發明而實 施相同技術，此並不影響本發明之範疇或其任何具體實施 例，且邊等修飾或改變意欲涵蓋於隨附申請專利範圍之範 疇内。 當本文揭示一組材料、組合物、組份或化合物時，應理 解為分別揭示該等群組及其所有亞組之所有單個成員。當 本文使用Markush群組或其他分組時，意欲將該群組之所 有單個成員及該群組之所有可能的組合與子組合包含於本 發明中。除另外指明外，本文所述或所例示組份之每一種 調配物或組合皆可用於實踐本發明。在本說明書中每當給 出一範圍（例如溫度範圍、時間範圍、或組成範圍）時，所 有中間範圍及子範圍以及包括於所給定範圍中之所有單獨 值皆意欲包括於本發明揭示内容中。此外，給定範圍内之 終點欲包括在該範圍内。在本發明揭示内容及申請專利範 圍中，"及/或”意指另外或或者。而且，任何以單數形式使 用的術語亦涵蓋複數形式。 熟習此項技術者應瞭解，無需藉助過多實驗即可在本發 明之實踐中使用除彼等具體例示者以外之起始材料、試 劑、純化方法、材料、基質、裝置元件、分析方法、檢驗 方法、組份之混合物及組合物。本發明意欲包含任何此等 材料及方法之所有為此項技術所熟知之功能等效材料或方 法。本文中所用之措詞及用語係用作說明性而非限定性措 128957.doc -24- 200846361 祠，且並非旨在藉由使用此等措詞及用語來排除所示及所 述特徵或其部分之任何等效物，而是應瞭解，在所請求之 本發明範疇内亦可存在各種修改形式。本文適當例示性說 明之發明可在不存在本文中未具體揭示之任何要素、限制 情況下實施。 本文所提及之所有出版物皆在不違背本發明之情況下併 入本文中。本文所提供之若干參考文獻以引用的方式併入 本文中以提供本發明額外用途之詳細說明。本說明書中所 提及之所有專利及出版物皆表示熟習本發明所涉及技術者 之熟練程度。本文所引參考文獻之整體内容引用的方式併 入本文中以指明該技術在其申請日期之狀態，且其意謂在 舄要日τ本文可使用該資訊以排除先前技術中之具體實施 例。舉例而言，當對一化合物提出申請時，應理解為不欲 將業内已知的化合物（包括本文所揭示參考文獻中揭示之 化合物）包括於本申請專利範圍中。 【圖式簡單說明】 圖置係重組bFSHpCTPa的序列表。小寫字母代表〇1：^八序 列且大寫字母表示胺基酸序列。連結β與α亞單位之叛端 hCG肽以下劃線表示。 圖2係重組bFSHpCTPa之SDS-PAGE分析，其顯示單一主 要產物大約係45 kDa。 圖3係在體外分析法中bFSHpCTPa與Folltropin-V™(—種 市售的豬FSH製劑（Bioniche Animal Health))之間之生物活 性比較。該分析法使用FSH受體，其在FSH類似物與受體 128957.doc -25- 200846361 結合時可產生c AMP。藉由量測（尤其在類似物的量為1 |xg/ml及以下時）所釋放cAMP之量可知，重組bFSHpCTPa 展示出更大的活性。 圖4展示在兩頭不同牛中投與6〇〇 本發明重組 似物後之金清FSH濃度水平。在投與bFSH類似物後大約4 天（96小時）藉由投與前列腺素誘發排卵。 圖5顯示一向牛投與重組bFSHpCTPa(稱作B〇vipure-FSH)及Folltropin-V™之投與方案。在動情後第8天開始第 一次投與Folltropin，且在動情後7天時投與bFSHpCTPa。 在第12天進行人工授精（動情/AI)並在第19天沖洗胚胎。如 圖所示’ bFSHpCTPa僅需單次投與，而F〇iitr〇pin需在第7 天至第11天之間連續投與8次劑量。 圖6顯示一個實驗，其中在動情後7-8天之間向21頭奶牛 投與 0·2 mg 重組 bFSHpCTPa(稱作 BoviPiire-FSH)。在第 13 天進行人工授精並在第20天沖洗胚胎。所得存活胚胎數稍 高於未受精印數，此表明單次bFSHpCTPa處理足以使卵泡 發育，且在投與前列腺素後動物表現出預期的動情時序。 圖7顯示一個實驗，其中5頭奶牛以0.20 mg bFSHpCTPa(亦稱作 BoviPure-FSH)處理，5 頭奶牛以 0.15 mg bFSHpCTPa 處理，且 5頭奶牛以 0.10 mg bFSHpCTPa 處 理。在動情後7-8天時向動物投與bFSHpCTPa，並在動情 後13天時進行人工授精。在第11天投與兩劑前列腺素。 128957.doc -26-
Claims (1)
- 200846361 十、申請專利範圍： I. 一種牛促濾泡激素（bovine follicle stimulating hormone ; bFSH)類似物，其包含與SEQ ID NO 1具有至少90%同源 性之第一多肽、及與SEQ ID NO 2具有至少90%同源性之 第二多肽，其中該第一及第二多肽共價連結。 ' 2·如請求項1之bFSH類似物，其進一步包含連結體肽，其 ； 中該連結體肽之一端與該第一多肽結合，且該連結體肽 之另一端與該第二多肽結合。 • 3.如請求項1之bFSH類似物，其中該連結體肽係人絨毛膜 促性腺激素魏端肽（carboxy terminal peptide ; CTP)。 4. 如請求項1之bFSH類似物，其中該第一多肽與SEQ ID NO 1具有至少95%之同源性。 5. 如請求項1之bFSH類似物，其中該第二多肽與SEQ ID NO 2具有至少95%之同源性。 6， 如請求項1之bFSH類似物，其與SEQ ID NO 10具有至少 95%之同源性。 ® 7.如請求項1之bFSH類似物，其中該類似物係重組多肽。 - 8. —種核酸分子，其編碼如請求項7之bFSH類似物。 9. 一種載體，其包含如請求項8之核酸分子。 10. —種細胞系，其能表現如請求項9之載體。 II. 一種bFSH類似物之用途，其係用於製造用以提高在一或 多種有蹄類動物中繁殖力之藥劑，其中該bFSH類似物包 含與SEQ ID NO 1具有至少90%同源性之第一多肽、及與 SEQ ID NO 2具有至少90%同源性之第二多肽，其中該第 128957.doc 200846361 一及第二多肽共價連結。 12_如請求項11之用途，其中該有蹄類動物係牛。 1 3 ·如請求項11之用途，其中該藥劑係在動情後7至丨3天之 間投與。 14·如請求項11之用途，其中該一或多種有蹄類動物係在投 與該藥劑後4至6天之間授精。 15.如請求項11之用途，其中該bFSH類似物之量介於0.01吨 至5 mg之間。 16·如請求項π之用途，其中該bFSH類似物之量介於i叫至 0.2 mg之間。 17·如請求項11之用途，其中該bFSH類似物之量介於1〇吨 至150 之間。 18·如請求項π之用途，其中該1>1^11類似物係重組多肽。 19·如請求項u之用途，其中該1)1^11類似物包含連結體肽， 其中該連結體肽之一端與第一多肽結合，且該連結體肽 之另一端與第二多肽結合。 20·如明求項η之用途，其中該^81^類似物與①ι〇 具有至少95%之同源性。 21 ·如π求項11之用途，其中該藥劑係用於在單次動情週期 内向各有蹄類動物投與單次劑量之1^811類似物。 22’如明求項丨i之用途，其中該藥劑係併與至少一種前列腺 素注射劑投與該一或多種有蹄類動物。 23. -種bFSH類似物之用途，其用於製造用以誘導在一或多 種有蹄類動物中超數排印之藥劑，其中該類似物包 128957.doc 200846361 含與SEQ ID NO 1具有至少90%同源性之第一多肽、及與 SEQ ID NO 2具有至少90%同源性之第二多肽，其中該第 一及弟 <一多狀共價連結。 24·如請求項23之用途，其中該有蹄類動物係牛。 25·如請求項23之用途，其中該藥劑係在動情後7至13天之 間投與。 -26·如凊求項23之用途，其中該一或多種有蹄類動物在投與 ‘ 該藥劑後4至6天之間授精。 _ 27.如請求項23之用途，其中該bFSH類似物之量介於〇 〇1肫 至5 mg之間。 28·如請求項23之用途，其中該^81^類似物之量介於^叫至 0.2 mg之間。 29.如請求項23之用途，其中該bFSH類似物之量介於1〇吨 至150 pg之間。 如明承$ d之用途，其中該bFSii類似物係重組多肽。 • 31·如4求項23之用途，其中該bFSH類似物包含一連結體 月太’其中該連結體肽之一端與該第一多肽結合，且該連 • 結體狀之另一端與該第二多肽結合。 月求項23之用途，其中該bFSH類似物與SEQ ID NO 1〇 • 具有至少95%之同源性。 33·如請求項23>田、人 u 、 <用岐’其中該藥劑係用於在單次動情週期 内向各有蹄類動物投與單次劑量之士外則員似物。 34·如請求項23之田、么 ^ 、 <用途，其中該藥劑係併與至少一種前列腺 素注射劑投與該—或多種有蹄類動物。 128957.doc 200846361 35· —種bFSH類似物之用途，其用於製造用以增加在一或多 種有蹄類動物中胚胎產生之藥劑，其中該bFSH[類似物包 含與SEQ ID NO 1具有至少90%同源性之第一多肽、及與 SEQ ID NO 2具有至少90%同源性之第二多肽，其中該第 及弟一多狀共價連結。 36·如請求項35之用途，其中該有蹄類動物係牛。 37.如請求項35之用途，其中該藥劑係在動情後了至13天之 間投與。 3 8 ·如明求項3 5之用途，其中該一或多種有蹄類動物在投與 該藥劑後4至6天之間授精。 39·如請求項35之用逯，其中該1>1^11類似物之量介於〇 盹 至5 mg之間。 40.如請求項35之用途，其中該1)][^11類似物之量介si盹至 〇·2 mg之間。 41·如請求項35之甩途5其中該奸§11類似物之量介於ι〇眧 至150 之間。 42·如睛求項35之用途，其中該bFSH類似物係重組多肽。 月求項35之用途，其中該^^811類似物包含連結體肽， 其中該連結體肽之一端與該第一多肽結合，且該連結體 肽之另一端與該第二多肽結合。 月求項35之用途，其中該bFSH類似物與SEq工D no 具有至少95。/。之同源性。 45·如明求項35之料，其中該藥劑係用於在單次動情週期 内向各有蹄類動物投與單次劑量之bFSH類似物。 128957.doc 200846361 後如明求項35之用*，其中該藥劑係併與至少一種前列腺 素注射劑投與該一或多種有蹄類動物。 47· -種用於在牛中單次動情週期内誘導超數㈣或增加胚 胎數之套組，其包含·· 勾至少-次劑量有效量之咖類似物，纟包含與seq ID NO 1具有至少9〇%同源性之第一多肽及與剛I。 N一〇 2具有至少9G%同源性之第二多肽，其中該第一及第 一多肽共價連結；. b) —個用於投與單次劑量該卯811類似物之裝置；及 c) 用於4又與該bFSH類似物之說明書。 48·如請求項47之套組’其中該有效量包含介於0.01肫至5 mg之間。 其中該有效量包含介於！吨至〇 2 /、丁 5亥有效里包含介於pg至15〇 其進一步包含至少一次劑量之前列 49·如睛求項47之套組 mg之間。 5u•如睛求項47之套組 Kg之間。 51·如清求項47之套組 腺素及用&投與該前列腺素之裝置 128957.doc
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