TW200838552A - Methyl esters of hyaluronic acid - Google Patents

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200838552 ^ 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於產生玻尿酸（hyaluronic acid，HA )之 曱基酯之方法。 【先前技術】 玻尿酸（HA)為屬於非硫酸化葡萄糖胺聚糖類之天然 直鏈碳水化合物聚合物。其由乙醯葡萄糖胺及β_ 1，4-葡萄糖醛酸重複雙醣單元構成，分子量（ weight MW)達6 MDa。HA存在於透明軟骨、關節滑液 及皮膚組織真皮及表皮中。HA可自包括脊椎動物結締組 織在内之天然組織，自人類臍帶及自雞冠提取。然而，當 今其較佳係藉由微生物法製備，以最小化轉移傳染性劑之 潛在風險，且增加產物均一性、品質及可用性（美國專利 第 6,951，743 號；WO 03/0175902 )。 已鑑定體内HA之許多作用。其作為諸如皮膚、腱、 肌肉及軟骨之許多組織之細胞的機械支撐物，在生物有機 版中起重要作用。HA #及關鍵生物過程，諸如組織之濕 /門及潤π。亦猜測其在諸如貼附、發育、細胞活動、癌症、 血官生成及創π癒合之許多±理功能中具有仙。由於ηα 之獨特物理及生物學性質（包括黏彈性、生物相容性及生 物降解能力），ΗΑ被廣泛用於化妝品、眼科學、風濕病 學、藥物及基因傳遞、自口癒合及組織工程中之當前及正 在開發中的應用。ΗΑ在一些該等應用中之使用因以下情 5 200838552 形受到限制：HA甚至在室溫下，亦即約2〇〇c下於水中可 溶，其藉由體内之玻尿酸酶快速降解，且其難以加工成生 物材料。因此已引入HA之化學改質，以改良HA之物理 及機械性質及其活體内（Μ νζ·νο )滯留時間。 有文獻中描述藉由自人類臍帶提取而獲得之具有高分 子置的玻尿酸甲基酯（jeanloz R w及F〇rcheilli E J (1950)，

J· Biol. Chem. 1 86, 495-51 1 ;及 Jager κ E 及 Winkler U K

(1979) J. Bacteriology l〇65_1067 )。該酯係藉由用重氮甲 烷在醚溶液中處理游離玻尿酸獲得，且證明實質上所有羧 基被S旨化。亦已描述具有約5與1 5個之間的雙醣單元之η A 寡聚物曱基酯（Christener J E，Brown M L，Dziewiatkowski D D (1977) Biochem. J· 167，711-716)。亦描述用甲醇在 一部分羥基醇基中醚化之玻尿酸甲基酯（Jeanl〇z，1952, j.

Biol. Chem. 194，141-150 ;及 Jeani〇z r w (1952) Helvetica

Chimica Acta 35，262-271 )。 基於皮膚水合研究，已觀察到，與天然玻尿酸相比， 玻尿酸曱基酯之皮膚水合能力增強（美國專利4,851，521)。 為了建立玻尿酸與其衍生物之間的比較，della Valle F 及Romeo A已經進行了一些實驗（美國專利4,851，521 )。 基於該等貫驗’確#忍玻尿酸甲基醋之水合能力比天然化合 物好。 由 deiia Valle 及 Romeo ( EP 專利 216 453 B1 )描述 了製備玻尿酸之酯的方法，其中先在兩個步驟中將HA轉 化成四級敍鹽’以使其可’谷於有機溶劑中，且隨後與脂族、 6 200838552 芳脂族、芳族、環狀及雜環系列之醇衍生物反應。此舉產 生在HA羧基處完全或部分酯化之化合物。 在EP專利1 401 876 B1中，Mariotti及同事描述了羥 基部分或70全酯化且羧基完全或部分經醇酯化或呈鹽形式 的新穎HA衍生物。

Fedini在專利申請案w〇 2〇〇5/〇92929 A1中揭示具有 低取代度之玻尿酸丁酸酯的製備及用途。HA之四級銨鹽 _ 與醯化試劑反應，引起經基之部分酯化。

Toida描述了一種產生烷基酯化葡萄糖胺聚糖之方法 (美國專利申請案2006/0172967 A1)。該方法包含使三 少兀基石夕烧基重氮烧與玻尿酸在二甲亞礙及甲醇中反應之步 — 驟。烷基酯化發生在羧基處且可為部分或全部酯化。 . 皮膚及其滋養物之水合作用似乎與皮膚組織之玻尿酸 含置密切相關。事實上已證明，HA之外源施用明顯促進 皮膚組織之水合狀態。在根據本發明之Ha酯化衍生物中， _ 亦發現該等特定特徵，且達到更高之程度，並且鑒於該原 因’其可在很大程度上用於化妝品領域。 玻尿酸之酯可藉由本身已知用於羧酸酯化的方法來製 備’例如藉由在催化物質’諸如強無機酸或酸型離子交換 劑存在下，用所要醇處理游離玻尿酸，或在無機或有機鹼 存在下，用能夠引入所要醇殘基之醚化劑處理游離玻尿 酸。作為醚化劑，可能使用文獻中已知者，包括各種無機 酸或有機磺酸之酯、氫酸，亦即烴基齒化物、碘曱烧或埃 乙烧，或中性硫酸酯或烴基酸、alfites、碳酸酯、石夕酸酿、 7 200838552

亞碗_或烴基姐酯、甲苯或對甲苯磺酸酯或氯减酸甲 醋或乙酿。反應可在適合溶劑，例㈣，較佳為相應於欲 引入竣基中之焼基之醇中進行。但反應亦可在非極性溶 劑’諸如酮，，諸如二噁烷或，非質子性溶劑，諸如二 甲亞石風中進行。作綠，可能使㈣彳如驗金屬或驗土金屬 或鎂或銀氧化物或鹼式鹽或該等金屬之一（諸如碳酸鹽） 之炎口物，及有機鹼二級氮化鹼（諸如吡啶或三甲基吡啶） 之水合物。亦可能使用鹼型離子交換劑來替代鹼。 ，玻尿酸之甲基酯亦可有利地根據另一通常用於製備具 有羧基之酸性多醣之羧酸酯的方法製備。該方法基於用醚 化劑，較佳在非質子性有機溶劑中處理含有羧基之酸性多 醣之四級銨鹽。作為起始酸性多醣，可能使用（例如）除 玻尿酸以外的其他來源於動物或植物之酸性多醣及其合成 修飾衍生物，諸如可自某些植物之鹼性萃取物且在木聚糖 沈澱後獲得，其雙醣組分由D_葡萄糖醛酸及D_吡喃木糖 (D_xylopyranose)組成之酸半纖維素（參見w. Pigman 之 “The Carbohydrates，，，第 668-669 頁 _R· L 職㈣％ w Μ· Corbett)，可自其獲得之果膠及酸性多醣，亦即，聚 半乳糖醛酸苷，可自植物膠（泌出物），諸如阿拉伯膠、 黃蓍膠獲得之酸性多醣，及最後得自海藻，諸如瓊脂及角 叉菜膠之酸性多醣。作為起始物質，當然亦可能使用藉由 上述所有多醣降解而獲得的分子部分。 已知之醋化方法常常藉由逐步將酯化劑添加至上述錄 鹽中至上述溶劑之一中，例如二曱亞颯中來進行。作為烷 8 200838552 — 化劑’可能使用上述烷化劑，尤其為鹵代烴，例如鹵代烷。 作為起始四級銨鹽，較佳使用低級四烧銨，其中烧基較佳 具有1到6個碳原子。通常，使用四丁基銨玻尿酸鹽。可 能藉由使酸性多醣之金屬鹽，較佳上述之一，尤其為鈉或 鉀鹽’在具有鹽化磺酸樹脂之水溶液中與四級銨驗反應來 製備該等四級銨鹽。 在近期報導中’使用三甲基矽烷基重氮甲烷（TMSD， ^ Hirano K，Sakai S，Ishikawa T，Avci F Y，Linhardt R j 及

Toshihiko Toida 2005，Carbohydrate Research 340，2297 ) 製備了羧基完全酯化之低分子量玻尿酸之甲基酯。甲基酯 係藉由先將玻尿酸之鈉鹽轉化成其酸形式來製備。在該方 • 法中’將玻尿酸溶於水中且施用於Dowex 50X8陽離子交 換官柱，且收集酸性溶離份且隨後冷凍乾燥。將經製備玻 尿酸（H+)溶於DMSO-甲醇（20:1)混合物中。所使用之 玻尿酸具有低分子量（平均分子量20,〇〇〇 Da)，以使能 φ 在所使用濃度溶於DMS0中。將三甲基矽烷基重氮甲烷添 加至反應混合物中。反應在室溫下進行6〇分鐘。向所得 反應'/¾合物添加乙酸’以移除TMSD。另外在〇。〇下用以 無水乙酸鈉飽和之乙醇處理1小時。離心反應混合物且將 沈澱物溶於水中，且隨後添加乙酸，有力混合且在1〇〇〇 g 下離心。將離心後獲得之水層對水透析且冷凍乾燥。所得 產物經表徵為玻尿酸之甲基酯。然而，Hiran〇及同事所開 發之該方法已被應用於低分子量HA，僅「使其在所使用 濃度溶於DMSO中」。此外，其需要許多繁瑣步驟來達到 9 200838552 甲基酯以及使用諸如DMSO之有毒溶劑。 玻尿酸甲基酯對如玻尿酸酶及甲基酯酶之酶更為穩 定。除此之外’新穎化合物之水合性質比天然玻尿酸更好 (Hirano K，Sakai S，Ishikawa T, Avci F Y，Linhardt R J 及 Toshihiko Toida 2005, Carbohydrate Research 340, 2297)。 因此，此項技術領域中存在對使用簡單易行之方法製 備玻尿酸之曱基酯的需要。又，該等方法應適用於低分子 量及高分子量Η A。然而，文獻中已知之方法太複雜及/或 涉及一系列步驟來獲得最終化合物。 如先前所討論，重氮甲烷（CH2N2 )為用於甲基化反 應之熟知试劑（Black TH，1983 Aldrichimica Acta 16，3)， 但其具高毒性、熱不穩定性及爆炸性。重氮甲烧之使用具 有以下主要缺點：（a )重氮甲烧之製備相當耗時且繁瑣； (b )用於製備重氮甲烧之前驅物為強突變劑且在eu中歸 為致癌物質；（c )重氮甲烷自身亦為致癌性以及爆炸性， 由此使其操作複雜化。當使用重氮甲烷時，不可能控制酯 化度’原因在於試劑具有極高揮發性，使得實際上難以量 測反應之重氮甲烷之莫耳數，因而導致低再現性。由於實 際困難’迄今還未使用重氮甲烷製備偏酯。使用四丁基銨 鹽及再用鹵基化合物處理之方法導致涉及許多複雜過程及 有毒化學品之使用。 重氮甲烧之缺點可藉由用三甲基矽烷基置換CH2N2之 一個氫來克服。所得安全穩定三甲基矽烷基重氮甲烷 (TMSD )隶初主要用於分析目的（Hashimoto N，Aoyama T， ίο 200838552

Shioiri T? 1981? Cnem Phatm Bull 29, 1475 ) 〇 在開發大規 模製備TMSD之方法期間，該取代物日益用於合成應用 (Shioiri T，Aoyama T，1993，Adv Use Synthons Org Chem 1， 51 ) 。TMSD由於C-Si ρΠ -dll共振而為熱穩定化合物。 其為重氮甲烷之方便替代物且展現重氮甲烷之許多反應， 包括與羧酸反應產生曱基酯，及在一碳同系化中，如在阿 恩特-埃斯特爾特（Arndt-Eistert )反應中（Aoyama and Shirori，1980，Tetrahedron Letters，21，461 9 )，羧基化合 物之同系化（Aoyama and Shirori，1980，Tetrahedron Letters， 21，4619 ; Hashimoto N，Aoyama T， Shirori T， 1981， Heterocycles，15, 975)及叛酸、酴及醇之O-甲基化。Aoyama 及其同事已成功將其用於先前由重氮曱烷支配之許多反應 中。TMSD 化學已由 Shiori Bl Aoyama.( Shiori T5 Aoyama T? 1993，in: Dondoni，Α·(編），Advances in the Use of Synthons in Organic Chemistry，1，51-101 )評論。藉由與 TMSD 反 應所產生之酯甲基之碳係得自帶有重氮基之碳。然而，必 須存在甲醇來引起向甲基酯之轉化。其為安全的市售試 劑。

Lappert及Lorberth在1967報導了 TMSD之首次製備 (Lappert MF? Lorberth J5 1967, Chem Commun 16: 836 ) 〇 然而，此後已公開若干種製備TMSD之合成方法。該等方 法當中，氯化三甲基矽烷基甲基鎂與二苯基磷醯基疊氮化 物（DPPA )之重氮-轉移反應（Shioiri T，Aoyama T，Mori S， 1993，Oi:g Synth Coll第8卷：612)為優選方法，因為該 11 200838552 方法最實用且能進行高產率大規模製備。DPP A有市售。 然而，該前驅物亦可以如Shi〇iri 及γamada所述之合成之 修飾方式製備（Shioiri τ，Yamada s，1984, 〇rg Synth 62: 187)。TMSD之大規模合成之特徵為，才虽廣泛之純化，接 著溶劑系統自Ete改變至正己烷（Shi〇iri 丁，A〇yama 丁，

Mon S，1993, Org Synth Coll 第 8 卷：612)。presser 及

Hufner觀察到並非必須轉移為正己烷，因為原始价2〇溶 液亦具反應性且可儲存數月而無分解（presser A及 A，2004, Monatshefte fur Chemie，135，1015)。TMSD 由 於其商業可用性及其與甲醇之相容性而成為最有吸引力之 试劑。用TMSD甲基化與用重氮甲烷相比，更易標準化， 因此傳遞更具再現性之結果。 在Hirano等人之近期方法中，藉由將低分子量玻尿酸 溶於DMSO中，接著用TMSD處理來製備曱基酯。所得化 合物藉由繁瑣的沈澱及萃取法分離。 用於HA之甲基酯化及後續純化之已知方法仍費時且 複雜。 此項技術領域中存在對用於製備及純化H A之甲基酯 之簡單方法的需要。 【發明内容】 發明概要 本發明之方法由於所使用酯化試劑之極高反應性而極 為快速。使用該簡單快速方法，可在6小時内完成酯化。 12 200838552 在本發明之方法中存在很少副產物， 田j座物，且所產生之副產物與 先前報導之方案相比，易於移昤。名筮 十& 士 丄 ^ ^ 在弟一方面中，本發明 係關於產生玻尿酸之甲基酯之方法，兮古土 a八^ ㈡〜乃凌，該方法包含之步驟 為：

(b) 且混合， 提供包含於甲醇中之玻尿酸之酸形式的懸浮液； ^懸浮液添加三甲基㈣基重氮甲烧之有機溶液 藉以產生玻尿酸之曱基酯；及

(c )回收玻尿酸曱基醋。 【實施方式】 發明之詳細說明 本發明係關於產生玻尿酸之甲基酯之方法，其包含以 下步驟： (a )提供包含於甲醇中之玻尿酸之酸形式的懸浮液； (b )向懸浮液添加三曱基矽烷基重氮曱烷之有機溶液 且混合，藉以產生玻尿酸之曱基酯；及 (c )回收玻尿酸曱基酯。 利用本發明方法，HA可受控制地經曱基酯化，而具 有適合不同應用之廣泛範圍之性質。該等應用包括··（ i) 局部化妝品調配物，（ii )高級傳遞系統，諸如用於化妝 品、生物醫學及藥物應用之微米及奈米粒子、微米及奈米 膠囊、聚合微胞，（iii)呈各種形式（敷料、薄膜、纖維 等）之創口癒合及組織工程化支架結構，及廣泛範圍之其 他生物醫學應用。 13 200838552 術°口玻尿酸」或「HA」在本文中定 葡萄糖胺聚糖，1由蕤我為未經硫酸化 -起之β，及M，3糖㈣連接在 _乙^葡萄糖胺（GlcNAc)及葡萄糖 之重複雙料元構成，天然存在於細胞表面巾，料Γ物

之結締組織之基本細胞外物質中，關節之滑液中，眼睛之 球内液體中：人類臍帶組織及雞冠中。玻尿酸〜— ⑽）亦稱之為玻尿酸（hyaWnan )、玻尿酸鹽 (hyaluronate)或HA。術語玻尿酸&㈣贿⑷及玻尿 酸（hyaluronic acid)可在本文中交替使用。 旦在本文中應瞭解，術語「玻尿酸」涵蓋具有變化分子 量之沁乙醯基葡萄糖胺及D-葡萄糖醛酸之多醣或甚至 其降解部分之群。 本發明描述用於製備HA之甲基酯之簡單方法，其避 免利用使用四丁基衍生物之冗長方法或使用毒性重氮甲 烷，其為即刻製備以用於反應。欲藉由本發明解決之問題 為如何在極簡單易行之方法中，可控制地製備玻尿酸之甲 基酯。 本發明中使用之HA可為任何可用HA，包括得自包括 脊椎動物結締組織在内之天然組織、人類臍帶及得自雞冠 之HA。在一特定具體實例中，玻尿酸或其鹽較佳藉由革 蘭氏陽性菌（Gram-positive bacterium)或宿主細胞，更佳 200838552 藉由桿菌屬（genus以C⑴w )之細菌重組產生。在另一具 脰貝例中’ HA係自鏈球菌細胞（cell )獲得。 宿主細胞可為任何適於重組產生玻尿酸之桿菌細胞。 桿S宿主細胞可為野生型桿菌細胞或其突變體。適用於本 fx月之知行之桿菌細胞包括（但不限於），Bacillus agaraderhens、,鹼簧孢择蛰 q Bacillus alkalophilus)、 解’廣又私牙孢才干囷（厶、短芽抱桿 菌（)、環狀芽孢桿菌（心dr⑶/“似）、 先勞氏芽抱桿菌（Bacillus c丨ausii)、凝結芽孢桿菌（Bacillus eoagWa似）、堅強芽孢桿菌（"心价騰^)、燦爛芽 孢桿菌（心d//似/⑽加）、缓慢芽胞桿菌（以以//似加）、 台癖桿菌 C Bacillus licheniformis)、1 大芽抱桿菌（BaciHus 謂）、短小芽胞桿菌（5齡·"似夕謂"似）、嗜熱 脂肪芽孢桿菌（似）、枯草桿菌 {Bacillus subtilis)反蘇力椁議（Bacillus thuhngiensi〇 細胞。尤其適於重組表現之突變枯草桿菌細胞描述於w〇 98/22598中。非囊封桿菌細胞尤其適用於本發明。 在一較佳具體實例中’桿菌宿主細胞為解澱粉芽孢桿 菌、克勞氏芽孢桿菌、緩慢芽胞桿菌、苔癖桿菌、嗜熱脂 肪芽孢桿菌或枯草桿菌細胞。在一更佳具體實例中，桿菌 細胞為解澱粉芽孢桿菌細胞。在另一更佳具體實例中，桿 菌細胞為克勞氏芽孢桿菌細胞。在另一更佳具體實例中， 桿菌細胞為緩慢芽胞桿菌細胞。在另一更佳具體實例中， 桿菌細胞為台癬桿菌細胞。在另一更佳具體實例中，桿菌 15 200838552 細胞為枯草桿菌細胞。在一最佳具體貫例中’桿菌宿主細 胞為枯草桿菌Α164Δ5(參見美國專利第5,891，701號） 或枯草桿菌168Δ4。 玻尿酸之平均分子量可使用此項技術領域中之標準方 法，諸如藉由 Ueno 等人，1988，Chem. Pharm. Bud. 365 4971-4975 ; Wyatt，1993，Anal· Chim. Acta 272，1-40 ； A Wyatt Technologies，1999， “ Light Scattering University DAWN Course Manual” 及 “DAWN EOS Manual” Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, California 描述之 方法來測定。 在一較佳具體實例中，本發明之玻尿酸或其鹽具有約 5 00至約10,000,000 Da之分子量；較佳為約10,000至約 1，5 00,000 Da。在另一更佳具體實例中，玻尿酸或其鹽具 有在約10,000與5 0,000 Da之間的平均分子量。在另一更 佳具體實例中，玻尿酸或其鹽具有在約50,000與500,000 Da 之間，較佳在約80,〇〇〇與300,000 Da之間的平均分子量。 在另一更佳具體實例中，玻尿酸或其鹽具有在約500,000 與1，500,000 Da之間的平均分子量；或較佳在約750,000 與1，000,000 Da之間的平均分子量。 在本發明之方法中，所使用之三甲基矽烷基重氮曱烷 可為任何可用三甲基矽烷基重氮甲烷，TMSD，TMSD之結 構如圖3所示。TMSD為在阿恩特-埃斯特爾特（Arndt-Eistert)合成及羰基化合物之同系化中，高毒性及爆炸性 重氮甲烧之穩定安全取代物。其與羧酸在含有甲醇之溶液 16 200838552 中平穩反應’以得到良好產率之相應甲基酿。其為-市售且 比使用重氮甲烷安全得多❶TMSD為綠黃色液體’在烴熔 液中穩定（Dietmar Seyferth 等人，1972，J〇urnal 〇f

Organometallic Chemistry 44, 279)。已提出 TMSD 與羧酸 之反應係藉由顯著不同於重氮曱烷與鲮酸者之反應機制發 生。該反應必須有甲醇存在，以得到良好產率之所要甲基 酯（圖4)。

所得甲基酯中質子之一來源於重氮曱烷衍生物，一個 來自甲醇且剩餘一個為來自羧酸之捐贈酸性質子。 在本發明之方法中，HA根據圖5中所示之反應與TMsd 反應。 在本發明-料具體實例中，a)之水溶液係藉由將玻 尿酸之鈉鹽轉化成其酸形式來製備。在該方法中，將玻尿 酸溶於水中並施用於陽離子交拖# 勿雕卞又換&柱，且收集酸性溶離份 (HA H+ )並接著冷凍乾燥。 在本發明之另—料具體實例中，將玻尿酸之酸开厂 懸浮於質子或非質子性溶财。所選溶劑較佳為低彿^ 混溶液體。低沸點可混溶液體可選自由以下者組成 乙醚、甲醇、二氯甲烷、四氫呋嗔、二噁烷 二甲基甲醯胺、二甲基乙醮胺等。在本發明之—更二 反應之溶劑可較佳具有曱醇以作為反應期 ，將TMSD提供於包含 烷之有機溶液中。 在本發明之一較佳具體實例中 乙醚或己烷之三曱基矽烷基重氮甲 17 200838552 在本發明之一特定具體實例中，在將Η A懸浮於反應 混合物中之後，使反應之溫度降低至約〇它至5它，且在反 應期間保持在0°C與25°C之間以避免TMSD蒸發。在本發 明之一更特定具體實例中，反應溫度在反應期間保持在〇。〇 與5 °C之間。在第一方面之一較佳具體實例中，在添加有 機溶液之前，包含於曱醇中之玻尿酸之酸形式的懸浮液具 有在-20°C至20°C之範圍内，較佳在-1〇。〇至1〇。〇之範圍内， _ 更佳在-5°C至5。(：之範圍内且最佳在〇它至5它之範圍内之 溫度。 為達成反應’將酯化試劑添加至反應混合物中。自旨化 劑添加完成後，攪拌液體反應混合物以確保完全反應。一 • #又佳具體實例係關於第一方面之方法，其中在攪拌懸浮液 ' 的同時，將三甲基矽烷基重氮甲烷之有機溶液添加至懸浮 液中。 另一較佳具體實例亦係關於第一方面之方法，其中藉 由攪拌進行混合。較佳地，混合持續至少5分鐘，較佳為 至少10分鐘、20分鐘、30分鐘、4〇分鐘 時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、^時/8 小時、9小時、10小時、u小時或最佳為至少小時。

在另-較佳具體實例中，混合係在_2〇。〇至抓之範圍 内，較佳在]代至_之範圍内，更佳在听至代之範 圍内且最佳在〇 C至5。。之範圍内之溫度下進行。 本發明之一較佳具體實例係關於第一方面之方法，其 中混合物中玻尿酸鱼二甲其々 * Τ基矽烷基重虱甲烷之莫耳濃度比 18 200838552 率係在1·0·01至1:1⑽之範圍内，較佳在⑽至U之 靶圍内’且最佳在1:01至1:10之範圍内。混合物中之 HA-TMSD莫耳濃度比率最佳在1:〇.5與1:4之間的範圍内。 在一較佳具體實例中，用125吣之TMSD (於乙醚中之2Μ /合液〇·25 mm〇l)，以大致1:1之比率處理1〇〇 mg之於 各有甲醇之/合劑中的Ηα ( 〇·25 mm〇1)，產生之約% 酉曰化在另較佳具體實例中，用更高量之酯化試劑（25〇 μ!〇 ’以1:2之比率處理相同濃度之ha ( 〇·25 mm〇1)， 產生HA之80/〇酯化。在一更佳具體實例中，用叫之 TMSD以大致1:4之比率處理〇125 之，產生 之100%酯化。 反應完成後，分離酯化HA產物，較佳地玻尿酸曱基 酯藉由過濾回收；較佳地，用至少一體積之一或多種有機 溶劑，較佳用曱醇及/或乙醚，將包含玻尿酸甲基酯之所得 固體過濾物洗滌至少一次，較佳洗滌至少兩次；更佳地， 將包含玻尿酸甲基酯之經洗滌固體過濾物乾燥、透析且冷 凍乾燥。 為了純化衍生產物，將其離心，且用諸如乙醇、甲醇 或丙酮之溶劑洗滌。產物可經透析以提供實質上純的甲基 化HA產物。 酯化HA可（例如）藉由冷凍乾燥或藉由喷霧乾燥調 配成乾粉。 在一特定具體貫例中，本發明揭示具有如圖6所示之 結構之甲基酯化HA。 19 200838552 甲基酉旨化HA產物可益山新7 、 物了稭由貝子NMR表徵。酯化度或取 代度（D S ’以％計）係由甲其 f田甲基酉曰質子3.84 ppm ( 3H)與玻

尿酸之N-乙醯基質子f M 、于〔-NHC0CH3，3H，2·0 ppm)之積分 值來確定。 本文中所述及主语夕 張之本务明的範疇不欲受所揭示之特 疋具體貫例或實例所附在I m 、斤限制因為該等具體實例或實例欲主 要作為本發明之說明。杯 … ^ 任何荨價方面欲在本發明之範疇

内。當然’除本文中戶斤+ Θ W T所不及所述者外，本發明之各種修改 對熟習此項技術者而言，將白 口 將自本文中之描述及實例而變得 明顯。該等修改亦欲落在附加申請專利 實施例 〇 範圍之範疇内 實施例1 中等分子量玻尿酸（ 750，_·ι，〇〇〇，_道爾頓）藉由 通過陽離子交換樹脂（Dowex 5〇 WX8_2〇〇)而轉化成h+ 形式。在冷凍乾燥機中將其冷凍乾燥。 在室溫下（20。(：）下，將所得產物（5〇呵，〇125顏〇1) 心浮於曱醇（1 〇 mL )中。隨後，將反應混合物之溫度降 低至0C。向上述反應混合物添加新鮮製備之重氮甲烷之 醚溶液（ίο mL)。在低溫（0_rc) 了，在擾摔下進行反 應。玻尿酸與重氮曱烷之莫耳濃度比率為1:8。4 h後，過 濾反應混合物。用甲醇（3x5〇mL)及乙醚（3x5〇mL)洗 滌。真空乾燥所得固體。將其溶於去離子水中且冷凍乾燥。 產物之產率為>90%(47mg)。所得產物之取代度（degree of substitution，DS)為 1.0。 20 200838552 實施例2 中等分子量玻尿酸（750,00〇_l，〇〇〇,〇〇〇道爾頓）藉由 通過陽離子交換樹脂（Dowex 50 WX8-200 )而轉化成H+ 形式。在冷凍乾燥機中將其冷凍乾燥。 在室溫下（20°C )下，將所得產物（1〇〇 mg，0.25 mmol) 懸浮於甲醇（1〇 mL )中。隨後，將反應混合物之溫度降 低至0 C。向上述反應混合物，添加三甲基矽烧基重氮甲 之 溶液（125 μΐ，0.25 mmol )。在低溫（〇_5。〇)下， 在攪拌下進行反應。玻尿酸與TMSD之莫耳濃度比率為 1 · 1。6 h後，過濾反應混合物。用有機溶劑，即甲醇及乙 醚（各3x50 mL)洗滌。乾燥所得固體。將其透析且冷凍 乾燥。產物之產率為>90% ( 93 mg)。所獲得Ds為約〇·5。 t施例3 中等分子量玻尿酸（750,000-1，000,000道爾頓）藉由 用0.6 N乙醇HC1處理轉化成h+形式。在冷凍乾燥機中將 其冷凍乾燥。 將所得產物（100 mg，〇·25 mmol )懸浮於曱醇（1〇111]^) 中匕後，將反應混合物之溫度降低至。將TMSD之 醚溶液之部分（125 μ，0.25 mm〇1)添加至上述反應混合 物中。在低溫（0说）下’在㈣下進行反應。玻尿酸與 TMSD之莫耳濃度比率為1:1。6 h後，過歧應混合物。 用有機溶劑，即甲醇及乙醚洗滌。將所得固體乾燥、透析 且冷凍乾燥。產物之產率為>9〇% ( 94 mg )。所獲得ds 為約0.5 。 21 200838552 • 使用上述方法，藉由用變化莫耳量之TMSD處理獲得 具有變化醋化百分比之不同甲基酯化玻尿酸衍生物。酯化 %係藉由比較在2·02 ( 3H，-NHCOCH3)及3·84 (破尿酸 之甲基酯之質子）處之信號來計算。經修飾產物之產率為 >90% 〇 實施例4 4 NMR ( Varian-300 )用以測定酯化玻尿酸（於d2〇 中）之最終官能度及純度。2H20用作分析溶劑且在4.79 ppm 處之峰用作參考線。曱基酯化玻尿酸之質子-Nmr 在3.84 ppm處展現銳峰。修飾程度係由甲基酯與玻尿酸之 N乙酉皿基貝子（·νη€0(：Η3，3H，2.0 ppm)之相對積分確 定。 具有不同酯化度之甲基酯藉由如早先所討論，改變 HA-TMSD莫耳濃度比率（1:〇·5至1:4)而獲得。 0 【圖式簡單說明】 圖1顯示根據本發明之酯化玻尿酸之分子結構。 圖2顯示ΗΑ之鈉鹽之結構式。 圖3顯示三曱基矽烷基重氮曱烷或tmSD之結構。 圖4顯示TMSD與魏酸在含有甲醇之溶液中之反應流 私’其產生良好產率之相應曱基酯。 圖5顯示，根據本發明，ha與TMSD在含有甲醇之 溶液中之反應流程。 圖6顯示根據本發明之曱基酯化ha之結構。 22 200838552 # 【主要元件符號說明】 無

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Claims (1)

1. 200838552 • 十、申請專利範園： 1· 一種產生玻尿酸之曱基酯之方法，該方法包含之步 驟為： (a) 提供包含於甲醇中之該玻尿酸之酸形式的懸浮 液； (b )向該懸浮液添加三曱基矽烷基重氮曱烷之有機 溶液且混合，藉以產生玻尿酸之甲基酯；及 (c ) 回收該玻尿酸甲基酯。

   2.如申請專利範圍第1項之方法，其中該玻尿酸具有 在5 00與1 〇,〇〇〇,〇〇〇 Da之間的平均分子量；較佳為在1〇,〇〇〇 與l，500,000 Da之間的平均分子量。 3·如申請專利範圍帛2項之方法，其中該玻尿酸具有 在10,000與50,000 Da之間的平均分子量。 4.如申請專利範圍第 2 jg > f、、土 e i τ月寸〜鹎囷乐2項之方法，其中該玻尿酸具有 在50,000與5 00,000 Da之間，較佳為名_ J 平乂 1 土馮在 80,〇〇〇與3〇〇,〇〇〇〇& 之間的平均分子量。 5·如申請專利範圍第2項之方法，其中該玻尿酸具有 在500，_肖！，，_ Da之間的平均分子量；較佳為在 750,000與l，〇〇〇,〇〇ODa之間的平均分子量。 6·如申請專利範㈣丨_5項中任—項之方法，其中該 三甲基矽烷基重氮甲烷之有機溶液包含乙醚或己烷。 7.如申請專利範圍帛w項中任一項之方法，1中該 混合㈣玻尿酸與三^錢基重氮甲炫之莫耳濃度㈣ 在1:0.01至1:100之範圍内，較佳在1:0.05至1:50之範圍 24 200838552 内’且最佳在1··〇·1至1:10之範圍内。 8·如申請專利範圍第1-5項中任一項之方法，其中在 添加該有機溶液之前，$包含於甲醇中之該玻尿酸之酸形 式的懸、子液具有在_20°c至2(TC之範圍内，較佳在_10。〇至 10 C之範圍内，更佳在-5 c至5°C之範圍内，且最佳在〇。〇 至5°C之範圍内之溫度。 9·如申請專利範圍第i_5項中任一項之方法，其中在 攪拌該懸浮液的同時，向該懸浮液添加該三甲基矽烷基重 氮甲烷之有機溶液。 1 0 ·如申明專利範圍第1 _ 5項中任一項之方法，其中藉 由攪拌進行該混合。 u·如申請專利範圍第i — 5項中任一項之方法，其中該 此合持績至少5分鐘，較佳為至少丨〇分鐘、分鐘、Μ 分鐘、40分鐘、5〇分鐘、i小時、2小時、3小時、*小 日寸、5小日寸、6小時、7小時、8小時、9小時、⑺小時、 11小時’或最佳為至少12小時。 12·如申請專利範圍第1-5項中任一項之方法，其中該 此a係在20 C至20 C之範圍内，較佳在_ 1 〇。〇至丨〇。〇之範 圍内，更佳在_5。(：至5。〇之範圍内，且最佳在至5它之 範圍内之溫度下進行。 13. 如申請專利範圍帛1-5肖中任一項之方法，其中藉 由過濾回收該玻尿酸曱基酯。 14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中用至少一體 積之一或多種有機溶劑，較佳用曱醇及/或乙醚，將包含玻 25 200838552 * 尿酸曱基酯之該固體過濾物洗滌至少一次，較佳洗滌至少 兩次。 15·如申請專利範圍第14項之方法，其中將包含玻尿 酸甲基酯之經洗滌固體過濾物乾燥、透析且冷凍乾燥。 ^^一、圓式： 如次頁

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