TW200829266A - Peptides with high affinity for the prolactin receptor - Google Patents

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200829266 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明是有關於泌乳素之變異物，該等變異物係以較 同的親合力結合到泌乳素受體，以及有關於製造該等變異 物之方法。該等泌乳素變異突變物可有效於製造泌乳素拮 抗劑’以用於例如乳癌的治療。 【先前技術】 泌乳素（PRL)是具有多種生物功能的細胞激素，主 要是有關於分泌乳汁、生殖、滲透調控以及免疫調控。pRL 疋199個殘基的4_螺旋束蛋白質（s〇mers等人，他加e 372 : 478-481 ( 1994 ))。螺旋束的4個反向平行的螺旋是 以它們從一級序列的Ν•端之存在順序而編號成，也就 疋，螺紋1 (殘基15-43 )、螺旋2 (殘基78-103 )、螺旋 3 (殘基m_137)及螺旋4 (殘基161_193)，以及泌乳 素更包括2個小的螺旋，代號為螺旋丨，（殘基59_63 )及 螺旋1”（殘基69-74)，其存在於連接螺旋i及螺旋2的 圈環（Teilum 等人，J. Mol. Biol, ϋχ: 810-823 ( 2005 ))， 也請參見第1圖。 PRL對於乳腺上皮是有潛力的生長因子，並且pRL已 被指出與乳房腫瘤的發育以及生長有關連。此外，乳癌細 胞系也通常會過量表現PRL受體（prL-r )。藉由多巴胺 激動劑抑制PRL的腦下垂體分泌對於乳房腫瘤並不具有作 用’並且已經證實的是’腫瘤是藉由其本身PRL的自分泌 製造而繞過多巴胺激動劑的作用。因此，對於乳癌的治療 200829266

而言，抑制一般的腦下垂體PRL製造是不足的，而是pRL 拮抗劑疋必要的，以避免自分泌的pRL結合到在腫瘤上的 PRL受體。 PRL係經由在PRL上的兩個區域（稱為結合位置工 (BS1)以及結合位置2(BS2))而結合兩個分子的pRL 受體的兩個分子。在1 : 2的PRL : PRL $體複合體中所 得的二聚體化作用受體，對於受體的活化以及進一步的信 號傳導是必要的。經由僅與PRL上較高親合力的bsi交互 作用所形成之丨：i的PRL : pRL受體複合體是無活性的。 口此僅此經由B S 1結合的PRL·之變異物將具有拮抗的性 貝（例如參見 Clevenger 等人，Endocr. Rev· 24 ： 1 ( 2003 )； G〇ffin 等人，Endocr· Rev. ϋ : 26 ( 2005 )。 即使在PRL以及生長激素之間有明顯的同源性，pRL 也不g、、、cr a到生長激素受體（GH-R );然而，生長激素（GH ) 部可經由在生長激素上不同但重疊的位置，而結合 以及 PRL-R 兩者（Cunningham 及 Wells，Natl Acad Sci. USA 紐：3407 ( 1991 ) ) 0 PRL拮抗劑可藉由干擾PRL-R經由BS2對pRL的結 合而產生（例如藉由將BS2中的一個或多個小疏水性殘基 突變成例如大的極性殘基（例如，G129R，例如，參見G打如 等人’ Endocr· Rev.逆：26 (2〇〇5)))，或否則立體性 干擾PRL-R對BS2的結合而產生。該等變異的pRL之後 可僅經由BS1而結合PRL-R，並且因此將具有獲得的拮抗 性質。 。 200829266 雖然已經顯示泌謂去 孔京G1 29R拮抗劑可抑制活體内的腫 瘤生長（Chen 等人，Int· J. OncoH: 813-818 ( 2002 ))， 但也已確定的I，高水平的泌乳素受體拮抗劑是必要的， 以得到活體内的效果（文獻：Goffin等人，Endocr. Rev省： 400 422 ( 2005 ))。藉由改善藥物動力學參數可產生於對 $物而。疋可接受或想要的劑量顯示活體内效果的化合 物。 為了得到可與wt PRL有利地競爭BS1的拮抗劑，拮 抗劑對BS 1的結合親合力應被保留或甚至改善。在pRL拮 抗劑的BS1内之殘基，可例如以在BS1與pRL_R之結合 界面中增加有利的交互作用或產生新的交互作用之目的而 突變。 B S1已一般地被說明，係包括以螺旋1及螺旋4為邊 界的區域，特別地涉及殘基Val-23、His-30、Phe-37、Lys-69、

Ty卜 169、His_173、Arg-176、Arg-177、His-180、Lys-181、

Tyr-185 以及 Lys-187 (Teiliim 等人，J. Mol_ Bi〇1· 351 ： 810-823 ( 2005 ))。這些結果已藉由將所有prl殘基隨 機致突變同時篩選可影響PRL-R結合的突變而獲得。由於 例如突變的繼發效應，因此，這是冗長以及可能導致錯誤 的方法。結果’南親合力泌乳素枯抗劑的產生是有問題的， 因為PRL BS1尚未被精確地鑑定出來。 以鑑定對於受體結合是重要的殘基為目標之突變分析 也已被進行，參見 Goffin V.等人，Mol. Endocrinol. 1381-1392 ( 1992 )以及 Kinet S·等人，J. Biol. Chem· glL ： 7 200829266 14353-14360 ( 1996 ) 〇 【發明内容】 發明簡述 本發明是有關於結合到泌乳素受體的胜肽，其中該等 胜肽具有改善的經由結合位置1 ( B S1 )對泌乳素受體之結 合。 在一具體實例中，本發明是有關於分離的胜肽，該胜 肽是人類泌乳素或人類生長激素的變異物，以及其可結合 到泌乳素受體，該變異物包括： (i )在對應到序列識別號1的胺基酸殘基24至3 5之 區域中的一個或多個胺基酸突變；及/或 (ii) 在對應到序列識別號1的胺基酸殘基52至58 之區域中的一個或多個胺基酸突變；及/或 (iii) 在對應到序列識別號1的胺基酸殘基66至83 之區域中的一個或多個胺基酸突變；及/或 (iv )在對應到序列識別號1的胺基酸殘基1 76至1 99 之區域中的一個或多個胺基酸突變；及/或 (v )加到C-端的從1至5個胺基酸殘基。 【實施方式】 本發明是有關於結合到泌乳素受體的胜肽，其中該等 胜狀具有改善的經由結合位置1 ( BS1 )對泌乳素受體之結 合0 在一具體實例中，本發明是有關於分離的胜肽，該胜 月太是人類泌乳素的變異物，以及其可結合到泌乳素受體， 8 200829266 該變異物包括： (i )在對應到胺基酸殘基24至35之區域中的_個或 多個胺基酸突變；及/或 (ii) 在對應到胺基酸殘基52至58之區域中的一個 或多個胺基酸突變；及/或 (iii) 在對應到胺基酸殘基66至83之區域中的—個 或多個胺基酸突變；及/或 (iv )在對應到序列識別號1的胺基酸殘基1 76至i 99 之區域中的一個或多個胺基酸突變；及/或 (v )加到C-端的從1至5個胺基酸殘基。 在一具體實例中，本發明是有關於分離的胜肽，|亥胜 月太是人類泌乳素的變異物，以及其可結合到泌乳素受體， 該變異物在對應到序列識別號1的胺基酸殘基66至83之 區域中及/或在對應到胺基酸殘基189至199之區域中具有 一個或多個胺基酸突變。 在一具體實例中，本發明的胜肽具有與序列識別號i 至少80%相同性的胺基酸序列，其包括一個或多個本發明 的胺基酸突變。在一具體實例中，本發明的胜肽具有與序 列識別號1至少85%，例如至少90%，例如至少95%， 例如至少99%相同性的胺基酸序列，其包括一個或多個本 發明的胺基酸突變。 在一具體實例中，本發明的胜肽具有與序列識別號1 至少80%相似性序列的胺基酸序列，其包括一個或多個本 發明的胺基酸突變。在一具體實例中，本發明的胜肽具有 9 200829266 與序列識別號1至少85%，例如至少90%，例如至少95 % ’例如至少99%相似性序列的胺基酸序列，其包括—個 或多個本發明的胺基酸突變。 在一具體實例中，本發明是有關於分離的胜肽，該月生 肽是人類生長激素的變異物，以及其可結合到生長激素受 體’該變異物包括： (i )在對應到胺基酸殘基24至35之區域中的一個或 多個胺基酸突變；及/或 (Π)在對應到胺基酸殘基52至58之區域中的_個 或多個胺基酸突變；及/或 (iii )在對應到胺基酸殘基66至83之區域中的_個 或多個胺基酸突變；及/或 (iv )在對應到序列識別號1的胺基酸殘基1 76至1 99 之區域中的一個或多個胺基酸突變；及/或 (v )加到C_端的從1至5個胺基酸殘基。 在一具體實例中，本發明是有關於分離的胜肽，該胜 肽是人類生長激素的變異物，以及其可結合到泌乳素受 體’該變異物在對應到序列識別號1的胺基酸殘基66至83 之區域中及/或在對應到胺基酸殘基189至199之區域中具 有一個或多個胺基酸突變。 在一具體實例中，本發明是有關於分離的胜肽，該胜 肽是人類生長激素的變異物，以及其可結合到生長激素受 體’該變異物在對應到序列識別號1的胺基酸殘基66至83 之區域中及/或在對應到胺基酸殘基189至199之區域中具 200829266 有一個或多個胺基酸突變。 在一具體實例中，本發明的胜肽具有與序列識別號2 至少80%相同性的胺基酸序列，其包括一個或多個本發明 的胺基酸突變。在一具體實例中，本發明的胜肽具有與序 列識別號2至少8 5 %，例如至少9 0 %，例如至少9 5 %， 例如至少99%相同性的胺基酸序列，其包括一個或多個本 發明的胺基酸突變。 在一具體實例中，本發明的胜肽具有與序列識別號2 至少80%相似性序列的胺基酸序列，其包括一個或多個本 發明的胺基酸突變。在一具體實例中，本發明的胜肽具有 與序列識別號2至少85%，例如至少90%，例如至少％ %，例如至少99%相似性序列的胺基酸序列，其包括一個 或多個本發明的胺基酸突變。 第6圖顯示生長激素對泌乳素的校準，並且顯示在生 長激素（序列識別號2)的何種位置對應到在泌乳素（序 列識別號1 )的何種位置。 術浯胜肽是希望代表由胜肽鍵連結兩個或多個胺 基酸之序列，其中該等胺基酸可以是天然或非_天然的。該 術語涵蓋術語多胜肽以及蛋白質，蛋白質可由兩個或多個 多胜肽所組成’其係由共價交互作用（例，半胱胺酸橋 架）或非共價交互作用而支撐在一起。應理解的是，該術 語也希望包括已被衍生化的胜肽，例如，#由連接親脂基 團、PEG或輔基（prothetic gr〇up)而衍生化。術語胜狀 包括任何適合的胜肽，並可與術語多胜肽以及蛋白質同義 200829266 f % K.- 地使用’除非有其他不同的指明或與内文衝突；前提條件 為讀者認識到每一種類型包含個別胺基酸聚合物的分子都 可與明顯的差異結合，並且藉此形成本發明的個別具體實 例（例如，由數個多胜肽鏈所組成的胜肽（例如抗體）是 明顯不同於例如單鏈抗體、胜肽免疫黏附素或單鏈免疫原 性胜肽）。因此，術語胜肽在此應一般地理解為是指任何 適合大小以及組成份（關於胺基酸的數目以及在蛋白質分 子中相關鏈的數目）之任何適合胜肽。此外，在此處所說 月的本發明方法以及組成物的内文中之胜肽，也可包括非· 天然存在的及/或非—L型的胺基酸殘基，除非有其他不同 的指明或與内文衝突。 除非有其他不同的指明或與内文衝突（以及如果以術 3吾多胜肽以及/或蛋白質的個別具體實例討論的話），術語 胜肽也涵蓋衍生化的胜肽分子。簡言t，在本發明的内文 行生物是一種胜肽，其中胜肽的一個或多個胺基酸殘 基已被化學修冑（例如，藉由烷基化作用、醯基化作用、 ®旨形成或醯胺形成）或已與一個或多個非_胺基酸的有機及 /或無機原子或分子取代基結合（例如，聚乙二醇（peg) 土團親月日I•生取代基（其可視需要藉由間隔殘基或基團而 _胜肽的胺基酸序歹4，間隔殘基或基團例丙胺 胺基丁酸（GABA)、L/D_麩胺酸、琥㈣等）、 :光原、生物素、放射性核素等），並且也可或可替代地 =非★頁、非.天然存在、及/或非胺基酸殘基，除非 ”他不同的指明或與内文衝突（然而，應再次認知，該 12 200829266 等衍生物（在它們之中及它們本身）可視為是本發明獨立 的特徵，以及將該等分子納入在胜肽的意義内是為了便於 說明本發明，而不是暗示在裸露的胜肽以及該等衍生物間 之任何種類的均等）。該等胺基酸殘基之非限制性的例子 包括’例如，2 -胺基己二酸、3 -胺基己二酸、沒—丙胺酸、 冷-胺基丙酸、2 -胺基丁酸、4 -胺基丁酸、6 -胺基己酸、2_ 胺基庚酸、2-胺基異丁酸、3-胺基異丁酸' 2_胺基庚二酸、 2,4-二胺基丁酸、鎖連賴氨素（desmosine ) 、2,2，_二胺某 庚二酸、2,3-二胺基丙酸、N-乙基甘胺酸、N_乙基天冬酿 胺酸、羥基離胺酸、別-羥基離胺酸、3-羥基脯胺酸、4__ 基脯胺酸、異鎖連賴氨素、別-異白胺酸、N _甲基甘胺酸、 N-曱基異白胺酸、6_N_甲基離胺酸、N_甲基纈胺酸、正-網 胺酸、正-白胺酸、鳥胺酸以及斯達汀（statine) ^化的胺 基酸。 術語“相同性”，如同在此技藝中已知的，是指兩個 或多個胜肽的序列間之關連性，係藉由比對序列而測定。 在此技藝中’“相同性”也指在胜肽間之序列關係的程 度，係藉由兩個或多個胺基酸殘基串之間的配對數目而測 定。㈣性，，W藉由特定數學模式或電腦程^ (也就是 “演算法”）所處理的間隙校準（如果有的話），而測量 兩個或多個序列的較小者間之相同配對的百分比。相關胜 肽的相同性可輕易地藉由已知的方法而計算。㈣方法包 括，但並不限於在以下文獻中所說明的方法：電腦分子生 物學（C〇mpUtational M〇1⑽Ur Bi〇i〇gy),[心 a m 編 13 200829266 輯’牛津大學出版（Oxford University Press )，紐約，1988 ; 生物計算：資訊學以及基因體計畫（Bi〇computing:

Informatics and Genome Projects) ，Smith D.W.編輯，大 學出版（Academic Press )，紐約，1993 ;序列數據的電 腦分析（Computer Analysis of Sequence Data )，第 1 部分， Griffin Α·Μ·以及 Griffin，H.G·編輯，Humana 出版（Humana

Press)，紐澤西，1994;分子生物學之序列分析（Sequence Analysis in Molecular Biology) ，von Heinje G.，大學出 版 ’ 1987 ;序列分析入門（Sequence Analysis Primer)， Gribskov Μ·以及 Devereux J.編輯，Μ· Stockton 出版（M. Stockton Press)，紐約，1991 ;以及 Carillo 等人，SIAM J.

Applied Math. 4_8： 1073 ( 1988)。 測定相同性的較佳方法是設計成在所測試的序列之間 提供最大的配對。測定相同性的方法是說明於可公開獲得 的電腦程式中。在兩個序列之間測定相同性的較佳電腦程 式方法包括GCG套裝程式，其包括GAP ( Devereux等人， Nucl. Acid· Res. 12: 387 ( 1984 );遺傳學電腦組（Genetics Computer Group)，威斯康新大學，麥迪遜，威斯康新）、 BLASTP、BLASTN 以及 FASTA( Altschul 等人，】.]^1〇1』1〇1· 403-410 ( 1990 ) ) 。BLASTX程式是從國家生物科 技資訊中心(National Center for Biotechnology

Information，NCBI )以及其他來源（BLAST 手冊，Altschul 等人，NCB/NLM/NIH，貝紗達，馬理蘭，2〇894 ; Altschul 等人’上述文獻）而可公開獲得。熟知的Smith Waterman 14 200829266 演算法也可用於測定相同性。 例如，利用電腦演算法 新大學，麥迪遜，威斯庵如、得子电月“且威斯康

百分比的胜肽予 準:…、），將兩個要測定序列相同性 SI fi ( « ^ X ,，以用於它們的個別胺基酸之最適 配對（配對的跨距，，是由、、i ^ 、 yv ^ j： - ^ . 决开法而決定）。間隙開放罰 刀C其计异為三倍的平 th斟^ w & 句對角；“平均對角，，是所使用的 ^ ν —角之千均值；對角，，是藉由特定比對矩陣 而为配給母個最適者脸装 Β“ 週田&基酸配對的分數或數目）以及延伸 開放罰分（其通常是間隙 開放割分的{分數（1/10)})以及 比對矩陣（例如，ραΜ 25〇 —、Ώ 、卜冰、 250或BLOSUM 62)是用於結合 —法才不準的比對矩陣（對於ρΑΜ㈣比對矩陣，參見

Dayh〇ff等人，蛋白質序列及結構的圖解（Atlas of Protein Sequence and Structur〇，第 5 卷，增刊 3 ( i978);對 於BLOSUM 62比對矩陣，參見Henik〇ff等人，ρΓ〇〇则

Acad· Sci USA 妓：10915_1〇919 ( 1992 ))也被演算法所 使用。 用於胜肽序列比對之較佳的參數包括下列： 演算法：Needleman 等人，j_ Mol· Bi〇1•丛：443-453 ( 1970 );比對矩陣：BL〇SUM62，來自 Henik〇ff 等人， PNAS USA 处：10915-10919 ( 1992 );間隙罰分：12，間 隙長度罰分：4，相似度的閾值·· 〇。 使用上述參數GAP程式是有效的。上述參數對於利用 GAP演算法的胜肽比對（與對於末端間隙沒有罰分一起） 是預設的參數。 15 200829266 術語“相似性”是與相同性有關的概念，但相對於 相同性，相似性是指包括相同配對以及保守性取代配 對的序列關連性。如果兩個多胜肽序列具有例如（分數 (1 0/20 ))相同的胺基酸，以及剩餘的全部都是非保守性 取代的話，則相同性以及相似性百分比都將是5〇%。在相 同的例子中，如果有多5個位置是保守性取代的話，則相 同性百分比仍是50%，但相似性百分比將是75% (分數 (15/20))。因此，在有保守性取代的例子中，兩個多胜 肽間之相似性程度將高於這兩個多胜肽間之相同性百分 比。 包括序列識別號1 (或序列識別號2 )(以及編碼核 酸的對應修飾）的胺基酸序列之胜肽的保守性修飾，將產 生具有類似於包括序列識別號i (或序列識別號2)的胺 基酸序列者之胜肽的功能以及化學特性之胜肽。相對地， 在本發明胜肽的功能及/或化學特性之實質修飾，相較於包 括序列識別號1 (或序列識別號2 )的胺基酸序列之胜肽， 可藉由在胺基酸序列中選擇在對於維持下列者的影響明顯 不同的取代而達成：（a)在取代區域中的分子骨架之結構， 例如，片層或螺旋構形，（b )在標的位置處的分子之電 荷以及疏水性，或（c )側鏈的體積。 例如’ “保守性的胺基酸取代，，可涉及將天然胺基酸 殘基以非天然殘基取代，使得對於在該位置的胺基酸殘基 之極性或笔何有很少或沒有影響。此外，在多胜狀中的任 何天然殘基也都可以丙胺酸取代，如同先前已說明用於 16 200829266 “丙胺酸掃瞒致突變法”（例如’參見MacLennan等人，

Acta Physiol. Scand. Suppl. Mi： 55-67 ( 1998 ) ； Sasaki 等人，Adv· Biophys. 15. ： 1 -24 ( 1 qq〇 \ ^ t x . _ F J 、i998)，其討論丙胺酸掃 瞄致突變法）。 想要的胺基酸取代（無論保守性或非_保守性）可藉由 熟悉於此技藝者在希望該等取代的時間點決定。例如，除 了已說明的突變之外’胺基酸取代還可用於鑑定本發明的 胜肽之重要殘基，或用於增加或減少此處所說明的胜肽對 於受體之親合力。 天然存在的殘基可根據共同的側鏈性質而區分成以下 類型： 1 )疏水性：正-白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、lie ; 2 )中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gin ; 3 )酸性：Asp、Glu ; 4)驗性·· His、Lys、Arg ; 5 )可影響鏈方向的殘基：Gly、Pro ;以及 6 )芳香族：Trp、Tyr、Phe。 在進行該等改變中，可考慮胺基酸的水合指數 (hydropathic index)。每個胺基酸都已在它們的疏水性 以及電街特性的基礎上被分配一個水合指數，這些是：異 白胺酸（+4.5);纈胺酸（+4.2);白胺酸（+3·8);苯 丙胺酸（+2.8);半胱胺酸/胱胺酸（+2.5);甲硫胺酸（+1·9); 丙胺酸（+1.8);甘胺酸（-0.4);蘇胺酸（-0.7);絲胺 酸（-0.8) •’色胺酸（-〇·9);酪胺酸（-1.3) •，脯胺酸（_ 17 200829266 16);組胺酸（-3.2);麩胺酸（-3.5);麩醯胺酸（-3.5); 天冬胺酸（-3_5);天冬醯胺酸（-3.5);離胺酸（-3.9); 以及精胺酸（-4.5)。 在提供蛋白質交互作用的生物功能中，水合胺基酸指 數的重要性是在此技藝中明瞭的。Kyte等人，J. Mol· Biol. f : 105-13 1 ( 1982 )。已知特定的胺基酸可取代具有類 似水合指數或分數的其他胺基酸，並且仍保留類似的生物 活性。在進行基於水合指數的改變中，水合指數在±2範圍 内的胺基酸之取代是較佳的，在± i範圍内的胺基酸之取代 是更佳的，以及在±0.5範圍内的胺基酸之取代是還要更佳 的0 在此技蟄中也明瞭的是，類似的胺基酸之取代可在親 水性的基礎上而有效地進行，特別是當因此所產生的生物 功能等同蛋白質或胜肽是希望用於免疫學的具體實例時， 汝同在本發明的例子中。蛋白質的最大局部平均親水性（係 由其相鄰的胺基酸之親水性而決定）是與其免疫原性以及 抗原性（也就是，與蛋白質的生物性質）相互關連。 以下的親水性數值已分配至胺基酸殘基：精胺酸 (+3.〇)，雔胺酸（’3.0);天冬胺酸（+3〇土。；麵胺酸 -1 ) ’、、’糸胺酉夂（+0.3 );天冬醯胺酸（+〇 2 );麩 醢胺酸（+〇·2);甘胺酸（〇);蘇胺酸（-0.4);脯胺酸 〇·5土D ，丙胺酸（_0·5);組胺酸（-0.5);半胱胺酸 ΙΟ)，甲硫月女酸（-1.3);纈胺酸（_15);白胺酸（_ U);異白胺酸;路胺酸（_2_3);苯丙胺酸（_ 18 200829266 2.5);色胺酸（-3·4 )。在進行基於類似的親水性數值的 改變中，親水性數值在±2範圍内的胺基酸之取代是較佳 的，在±1範圍内的胺基酸之取代是更佳的，以及在±0.5範 圍内的胺基酸之取代是還要更佳的。也可在親水性的基礎 上從一級胺基酸序列中鑑定抗原決定部位。這些區域也稱 為“抗原決定部位的核心區域”。 本發明的胜肽也可包括非-天然存在的胺基酸。 在一具體實例中，本發明是有關於分離的胜肽，該胜 肽是人類泌乳素的變異物，以及其可結合到泌乳素受體， 以及該胜肽是具有序列識別號1的胺基酸序列之胜肽的變 異物，該變異物包括： (i )在對應到胺基酸殘基24至3 5之區域中的一個或 多個胺基酸突變；及/或 (ii)在對應到胺基酸殘基52至58之區域中的一個 或多個胺基酸突變；及/或 (iii )在對應到胺基酸殘基66至83之區域中的一個 或多個胺基酸突變；及/或 (iv )在對應到序列識別號1的胺基酸殘基1 76至1 99 之區域中的一個或多個胺基酸突變；及/或 (v )加到C-端的從1至5個胺基酸殘基。 在一具體實例中，本發明的胜肽具有包括序列識別號 1的胺基酸序列，其在序列識別號1的胺基酸殘基66至83 及/或在胺基酸殘基189至199中具有一個或多個胺基酸突 鱗。 19 200829266 在一具體實例中，本發明的胜肽具有包括序列識別號 2的胺基酸序列，其在序列識別號1的胺基酸殘基66至83 及/或在胺基酸殘基189至199中具有一個或多個胺基酸突 變。

使用ΗΧ-MS技術，目前已可精確定義prl BS1，其 提供優異的工具以用於產生高親合力的泌乳素拮抗劑。因 此’在這個區域中的胺基酸殘基是致突變法的標的物，具 有在BS 1處與PRL-R結合界面中增加有利的交互作用或 產生新的交互作用之目的。 ΗΧ-MS技術係利用蛋白質的氫交換（Ηχ )可輕易被 貝瑨（MS )追蹤。藉由以包含氘的水溶性溶劑取代包含氫 的水〉谷性溶劑，氘原子在蛋白質中的指定位置處之併入將 引起貝里1 Da的增加。質量增加可隨著時間的函數，藉由 質譜而在交換反應的中止樣品中監測。 ΗΧ-MS的一種用途是藉由鑑定在蛋白質-蛋白質複合 體形成後減少的氮交拖ρΕΓ代 L又換£域’而探測涉及分子交互作用的 1置通¥結合界面將會藉由因溶劑的空間排阻所致的 氫交換之明顯減少而顯示。 蛋白貝蛋白為複合體的形成可簡單藉由在個別結合夥 伴的存在及不存在之下 、 下’乂 4間的函數測量併入任一蛋白 ^成員中的氣之總量，葬 ^ ^ ^ ^ , 稭由ΗΧ-MS偵測。此外，藉由 將含JTI蛋白質樣品蛋白水 片^又化成短的胜肽以及分析每 個胜肽的氘含量，也可趑—挪 竹母 — 將7記次定位到個別蛋白質的特 疋£域。在結合夥伴的存 叮姑一 任下’可顯示改變的氘水平之胜 20 200829266 肽構成或結構上連結到結合界面（對於ΗΧ-MS技術的近 期回顧’參見 Wales 及 Engen，Mass Spectrom· Rev. 25l: 158 (2006 ))。應用HX-MS技術的相關例子可在H〇rn等人，

Biochem.il: 8488-8498 ( 2006 )中發現。

所使用的ΗΧ-MS技術提供了有關在pRL或其變異物 中哪個界面暴露驢胺氫被保護以避免在PrL_r結合時與溶 劑交換的資訊，藉此促進繪製結合界面的圖譜。然而，除 了這個資訊之外，這個方法也可顯示在PRL或其變異物中 於結合之後引起改變的HX之更間接的結構作用。來自pRL 的一種變異物之胜肽（vPRL)的原始資料以及所得到的Ηχ_ 日守間進程圖之實例，是顯示在第1圖以及第3圖。 令人驚訝地，發現到BS丨是大於先前已知的且bs i 包括來自螺旋1”的殘基以及在螺旋丨及螺旋2間的圈環之 第二半部（殘基66-83 )以及S-S鍵結的匕端（殘基189_ 199)。為了本篇說明書之目的，BS i被揭示包括由胺基 酸殘基 20-36、40-63、66-83、173-185 以及 189_199 所組 成的PRL之片段（第2圖以及第4圖）。 在這些區域中的殘基是易於被取代/修飾以增加 對BS 1的結合親合力。一般而言’對於修飾的候選物可藉 由與天然殘基相同的胺基酸殘基族群或密切相關的族群之 殘基而取代，以便不會引起BS丨的個別 又〈、、、。構完整性 的大擾動。在BS丨的一個區域中之突變可被單獨進行 與⑴的其他區域中之突變結合，或例如與可提供二： 抗性質的突變結合，例如，在BS 2中的 " 。？几大芰。四種該 21 200829266 等泌乳素受體拮抗子是目前已知的，即G129R-hPRL、 S179D-hPRL、G129R-hPRL ( △ 1-9)以及 G129R-hPRL ( △ 1-14 )，參見 Goffin 等人，Endocrine Rev. 2A · 400-422 (2005) 〇 對於在螺旋2以及螺旋3中的醯胺氫所觀察到之減少 的ΗΧ，是在PRL-R結合之後經由PRL結構傳播的間接結 構作用的例子（第5圖）。螺旋2以及螺旋3 (其位於PRL 分子的相反側以及BS 1的末端）的ΗΧ之減少，顯示這些 區域是透過在PRL-R的結合期間，於BS i在Prl結構的 改變而間接被穩定。在螺旋2以及螺旋3中觀察到的穩定 化作用，代表這些螺旋的短暫性展開以及可能在PRL中完 正的4-螺旋束是藉由pRL_R於Bs i的結合而明顯被穩定。 因此，已偵測到在 ECD-PRL_R ( ECD_PRL_R : PRL_R 的外質功能域，也就是，受體的可溶性形式，殘基25_234 ) 結合期間可使PRL的4_螺旋束結構穩定之間接結構作用， 觀㈣可藉由致突變法而使PRL的任何螺旋固有地穩定， 藉此有矛PRL #肖合形式。$將增加pRL優先經 姓—而、，口 α到PRL_R的結合親合力。這可例如與在BS 2 的結合界面中之破壞性突變結合。 =磁共振（NMR)光譜是_種已完善建立的技術，用 沾：合液中定性蛋白質_蛋白質複合體的結合界面。大部分 的：：是根據ιΗ’Ν_相關光譜法，並且包括骨架醯胺基團 丰位移擾動（Foster M.P等人，T R· Ί •寻人，J.Biomolec. NMR J_2_ ： 71 Γΐ998))、氫_氖交換 換（H-D) (paterson Υ·等人， 22 200829266

Science 2A9_ : 755-759 ( 1990 ))以及交叉飽和（Takahashi Η·等人，Nature Struc. Biol· I: 220-223 ( 2000))測量。 由於磁環境（化學位移）以及醯胺質子的交換率常數可被 直接的分子接觸以及構形重組及改變的動力性質所影響， 因此，化學位移擾動以及Η-D交換方法不會區別導源於在 蛋白質-蛋白質界面處的直接分子接觸之初級影響，以及歸 因於複合體形成所誘發的結構及/或動力學改變的間接作 用。相對地，交叉飽和方法係依賴磁化作用從一個分子到 其他分子經由短範圍質子-質子接觸的移轉，以及繼發效應 不會干擾。交叉飽和方法接著（理想地）獨特地鑑別位在 短於5-7A界面距離内的骨架醯胺基團。 會增加在PRL中4-螺旋束結構的穩定化作用之突變， 包括PRL的任何4個螺旋之末端部分（所謂的螺旋蓋）的 穩定化作用（包括例如E162D、A111D、A111N、A111S 以及A1 1 IT的突變）、在暴露至溶劑的PRL之螺旋片段 中導入新的鹽橋架（包括例如N92D的突變）、導入新的 S-S 雙硫鍵（包括例如 L81C/V134C、L88C/L127C、 V102/L113C、L95C/E120C、S90C/Y147C、L32C/I119C、 D160C/S193C、L81C/V134C、M105C/A108C、M3 6C/K1 15C、 S33C/L175C、A22C/G129C、H59C/P148C、F37C/L172C、 S26C/D183C、 S33C/S179C P66C/Q71C 或 P66C/A72C、 V23C/L186C、V99C/A116C、V102C/L113C、S57C/N170C、 R89C/Y147C、S82C/E143C、H195C/N198C、K190C/N198C、 S33C/R176C、H13 8C/T141C、M158C/R164C、E93C/W150C、 23 200829266 S86C/I146C、V85C/N144C、S82C/N144C、K78C/K142C、 K78C/H138C、Q77C/V137C、L63C/S86C、T45C/I51C、 L 1 C/S 1 3 5 C的突變）。在結合中，也可藉由以極性殘基取 代暴露至溶劑的疏水性殘基而增加PRL的穩定性（包括例 如I146S以及V149S的突變）。同樣地，也可藉由改善在 4-螺旋束結構的疏水核心處之包裝交互作用而增加的 穩定性（包括例如L95V/I119V/L175P的突變）。 在一具體實例中，本發明的突變是在對應到序列識別 號 1 的胺基酸殘基 25、28、31、33、68、73、75、76、80、 1 79以及1 90的一個或多個位置中之取代。在一具體實例 中’本發明的胜肽是具有序列識別號1的胺基酸序列的多 胜肽之變異物，其在胺基酸殘基25、28、31、33、68、73、 75、76、80、179以及190的一個或多個中帶有取代突變。 在一具體實例中，本發明的胜肽是具有序列識別號1的胺 基酸序列的多胜肽之變異物，其帶有一個或多個的取代突 變.L25Q、Y28N、N31S、S33A、D68N、Q73L、M75T、 N76S、F80L、S179T及K190R，以及視需要地其他的取代 /加成或刪除突變。在一具體實例中，本發明的胜肽是具有 序列識別號1的胺基酸序列的多胜肽之變異物，其帶有取 代突變· Q73L、M75T、N76S、F80L 以及 G129R。在一具 體貝例中’本發明的胜狀是具有序列識別號1的胺基酸序 列的多胜肽之變異物，其帶有取代突變：S33A、Q73L、G129R 以及K190R。本發明的胜肽以及醫藥組成物可用於治療可 藉由投予泌乳素拮抗劑而治療的疾病，例如，乳癌。 24 200829266

此處所使用的術語“治療，，是指為了戰勝症 疾病或失則之目的而處理及照護患者。該術語希望0 對於患者患有的特定症狀的治療之全部範圍，例如： 活性化合物以減輕徵候或併發症；延遲疾病、失調或：： 的進程；減輕或緩和徵候及併發症；及/或治癒或消除疾病、 失調或症狀'以及預防症狀，其中預防應理解成為了二 疾病、症狀或失調之目的而處理及照護患者，並且包括浐 予活性胜肽以預防徵候或併發症的開始。要被治療=患= 較佳是哺乳㈣’特別是人類，但也可包括動物，例:， 狗、貓、牛、綿羊以及_。應理解的是，治療以及預防（預 防性）攝生法代表本發明的不同形態。 、 此處所使用之胜肽的“治療有效量，，是指足以治癒、 減輕或部分阻止特定疾病及其併發症之臨床表現的量。足 以達成這個的量是定義為“治療有效量”。對於每個目的 之有效量將取決於疾病或傷害的類型及嚴重性以及個體的 重量及一般狀況而定。將可理解的是，決定適當的劑量可 利用例行的實驗，藉由建構數值的矩陣並且測試在矩陣中 的不同點而完成，這些都是在經過訓練的醫師或獸醫師的 一般技藝之内。 此處所使用的術語“核酸構築，，希望是指cDNA、基 因體DNA、合成的DNA或RNA來源的任何核酸分子。術 語“構築”希望是指核酸片段，其可以是單股或雙股，以 及其可以是基於編碼有興趣的胜肽之全部或部分天然存在 的核苷酸序列。構築視需要可包含其它的核酸片段。 25 200829266 本發明的核酸構築可適合地是基因體或cDNA來源， ^如，藉由製備基因體或cDNA資料庫，並且利用合成的 寡核苷酸探針，根據標準技術（參考j· Sambr〇〇k等人， 1989，分子選殖··實驗室手冊（从C7o以％ j = ，第二版，冷泉港，紐約），藉由雜 合而篩選編碼所有或部分胜肽的DNA序列，以及藉由導 入在此技藝中已知的相關突變所獲得者。 •本發明的核酸構築也可藉由已建立的標準方法而合成 地製備，例如，Beaucage及Caruthers，丁价心心.㈣· ^ : 18 59 1869 ( 1981 )所說明的將磷醯胺酸（ph〇sph〇ramidite ) 去或 Matthes 等人，EMBO J· 3_: 801-805 ( 1984 )所說明

2方法。根據磷醯胺酸法，將寡核普酸在例如自動DNA 口成儀中合成、純化、煉回、黏接並且選殖到適合的載體 中。 此外，核酸構築也可以是混合的合成及基因體、混合 的合成及cDNA或混合的基因體及eDNA來源，其係根據 標準技術，藉由黏接合成的、基因體或cDNA來源的片段 2製備（如果適合的話），該等片段係對應到完整核酸構 柴的各部分。 核酸構築也可利用專一性的引子，藉由聚合酶鏈鎖反 應而製備，例如說明於美國專利第4,683,2〇2號或Saiki等 人，Science : 487-491 ( 1988 )。 在一具體實例中，本發明的核酸構築是DNA構築， 為了方便的目的，該術語將專門在以下使用。以下的陳述 26 200829266 也可讀取本發明其他具有適當修飾的核酸構築，對於熟悉 於此技藝者將會是清楚的。 在一具體實例中，本發明是有關於重組載體，其包括 本發明的DNA構築。插入本發明DNA構築的重組載體可 以疋任何載體，其可方便地進行重組DNA方法，以及載 體的選擇通常將取決於要導入它的宿主細胞而定。因此， 載體可以是自主複製的載體，也就是，以染色體外的個體 而存在的载體，其複製不受染色體的複製所支配，例如， 貝體。可選擇地，f導入至宿主細胞内時，載體也可以是 甘入入到佰主細胞基因體並且與被它嵌入的染色體一起複製 之載體。 載體可以是表現載體，其中編碼本發明胜肽的DNA 序列可操作地連接到DNA轉錄所需的其他片段。一般而 言，表現載體是衍生自質體或病毒DNA，或可包含兩者的 凡件。術語“可操作地連接，，是指片段被以使它們協調發 揮它們想要的目的（例如，在啟動子開始轉錄繼續通過編 碼胜肽的DNA序列而）而排列。 啟動子可以是任何的DNA序列，其可在所選擇的宿 主細胞中顯示轉錄活性，並且可衍生自編碼對於宿主細胞 疋同源性或異源性的蛋白質之基因。 在酵母菌宿主細胞中使用之適合的啟動子的例子，包 括來自酵母菌解糖基因的啟動子（mtzeinan等人，j. Chem.21^ 12073-12080( 1980 );Alber&Kawasaki，jM1〇〇i· ΑΡΡ1· Gen. i: 419_434 ( 1982 ))或酒精脫氫酶基因的啟 27 200829266 動子（Young等人，用於化學品的微生物遺傳工程（Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals) ( Hollaender 等人編輯），Plenum 出版（Plenum Press )，紐約，1982 )， 或 TPI1 (美國專利第 4,599,31 1 號）或 ADH2_4c (Russell 等人，Nature 304 ： 652-654 ( 1983 ))啟動子。 在絲狀真菌宿主細胞中使用之適合的啟動子的例子， 例如是ADH3啟動子（McKnight等人，丑]\^〇尸4:2093-2099 ( 1985 ))或tpiA啟動子。其他有用的啟動子的例子 疋衍生自編碼米麴菌（i ) taka澱粉酶、毛黴菌 (及)天冬胺酸蛋白酶、黑麴菌（」⑴ 中性α -殿粉酶、黑麴菌酸穩定的α •殿粉酶、黑麴菌或盛 泡麴菌（i )葡萄糖澱粉酶（gluA )、毛黴菌脂 7酶、米麴菌鹼性蛋白酶、米麴菌磷酸三碳糖異構酶或^ 巢麴菌（i )乙醯胺酶基因的啟動子。在一具體

貫例中，本發明載體的啟動子是選自TAKA-澱粉酶或gluA 啟動子。 在細菌宿主細胞中使用之適合的啟動子的例子，包括 曰$、、月曰肪芽胞桿菌（5⑽)產麥芽 糖歲粉酶基因、薄樣芽胞桿菌（凡α -澱粉 輕基因、解殿粉芽胞桿菌U·謂少/咖—似）ΒΑΝ澱 粉酶基因、括I w 一 皁牙月匕柃囷（万.)鹼性蛋白酶基因或 短小芽胞桿菌f A · 7 、， ’ @ I K）木糖苷酶基因的啟動子， 體又p,或p私壬 l啟動子或大腸桿菌ζ·) &、trp或Uc 啟動子。 28 200829266

編碼本發明的胜肽之DNA序列，如果需要的話，也 可操作地連接到適合的終止子，例如，人類生長激素終止 子（Palmiter等人，上述引註）或（用於真菌宿主）TPI1 (Alber及Kawasaki，上述引註）或_3 (獻等 人’上述引註）終止子。載體可進—步包括例如聚腺苦酸 化信號（例如，得自_或腺病毒5饥區域）、轉錄增 強子序列（例如，SV40增強子）以及轉譯增強子序列（例 如，編碼腺病毒VA RNA者）的元素。 本發明的重組載體可進-步包括使載體在討論的宿主 細胞中複製之DNA序列。 可使載體複製之適合的 REP 1〇以及複製起源 當伤主細胞是酵母菌細胞時 序列是酵母菌質體2 #複製基因 (origin of replication) 〇 當伤主細胞是細菌細胞時，可使載體複製的序列是編 碼DNA聚合酶川複合體的基因以及複製起源。 載體也可包括可篩選的標記，例如，基因，其產物可 補充宿主細胞的不足，例如，編碼四氫葉酸還原酶（dhfr) 的基因或栗酒裂殖酵母（心心上⑽以以“⑺所打以^ ) τρι 基因（P.R· Russel卜 Gene 姐：125-130 ( 1985 )所說明） 或可提供對藥物（例如，氨苄青黴素、康那黴素、四環黴 素、氯彳放素、新Μ素、潮黴素或胺甲碟呤）的抗藥性之基 因。對於絲狀真菌，可篩選的標記包括amds、ρνΓΓτ、argR、 以及 〇 為了引導本發明的胜肽進入宿主細胞的分泌途徑，可 29 200829266 在重組載體中提供分泌信號序列（也稱為前導序列、前原 序列或w序列）。將分泌信號序列按照正確譯讀架構連結 到編碼胜肽之DNA序列。分泌信號序列通常是位在編碼 胜肽的DN A序列之5，處。分泌信號序列可以是與胜肽正 常相連者或可來自編碼另一分泌蛋白質的基因。 對於從酵母菌細胞的分泌，分泌信號序列可編碼任何 4口號胜狀其可確保將表現的胜肽有效引導至細胞的分泌 途徑内。信號胜肽可以是天然存在的信號胜肽或其功能部 分，或信號胜肽可以是合成的胜肽。適合的信號胜肽已發 現是α-因子信號胜肽（參考美國專利第4,87〇,〇〇8號）、 小鼠唾液殿粉酶的信號胜肽（參考〇· Hagenbuchle等人，

Native · 643·646 ( 1981 ))、修飾的羧基胜肽酶信號 胜肽（參考 L.A. Vails 等人，Cell 处：887-897 ( 1987 ))、 酵母菌BARI信號胜肽（參考w〇 87/〇267〇)或酵母菌天 冬胺酸蛋白酶3 (YAP3)信號胜肽（參考M· Egel-Mitani 等人，Yeast £ : 127-137 ( 1990 ))。 為了在酵母菌中有效的分泌，也可將編碼前導胜肽的 序列插入“號序列的下游以及編碼胜肽的DNA序列上游。 刚導胜狀的功能是要使被表現的胜肽從内質網引導至高基 氏體，以及進一步引導至分泌小泡，以分泌至培養基質中 (也就疋，將胜肽輸出穿過細胞壁或至少經由細胞膜到酵 母菌細胞的近膜間隙内）。前導胜肽可以是酵母菌因子 W導子（其用途是說明於例如美國專利第4,546,〇82號、Ep 16 201、EP 123 294、EP 123 544 以及 EP 163 529 )。可 30 200829266 選擇地，前導胜肽也可以是合成的前導胜肽，也就是前導 胜肽並未在自然中被發現。合成的前導胜肽可例如wo 89/02463或WO 92/1 1378之說明而建構。 對於在絲狀真菌中的使用，信號胜肽可方便地衍生自 編碼麴菌屬物種澱粉酶或葡萄糠澱粉酶的基因、編碼毛黴 囷月日肪S#或蛋白_；或棉毛土生菌（讯㈣） 脂肪酶的基因。信號胜肽可衍生自編碼米麴菌TAKA澱粉

酶、黑麵菌中性α -澱粉酶、黑麴菌酸穩定的澱粉酶或黑麴 菌葡萄糖殿粉酶的基因。 用於分別黏接編碼本發明胜肽的DNA序列、啟動子 及視而要終止子及/或分泌信號序列的方法，以及用於將它 們插入到包含複製所需資訊的適合載體中之方法，是熟悉 於此技蟄者热知的（例如’參考Sambr〇〇k等人，上述文 獻）。 本I月的DNA構築或重組載體所導入的宿主細胞可 、 可可製^本發明胜肽的細胞，並且包括細菌、酵母 菌、真菌以及高等真核細胞。 在培養時可制、生丄μ ^ 衣&本發明胜肽的細菌宿主細胞的例子是 革蘭氏陽性細菌 例如，桿菌屬的菌株，例如，枯草芽胞 桿菌、蘚樣芽胞炉# 一 干囷、豆形桿菌（凡/eWw )、短芽胞桿 菌（^ ^ 、％熱脂肪芽胞桿菌、嗜鹼芽胞桿菌（凡 alkolophilus )、初 解殺粉芽胞桿菌、凝結芽胞桿菌（万 coagulans) # 、牙胞桿菌（5. c/rcw/aw)、典雅芽胞桿 囷(5· /_?抑)、 — 大牙胞桿菌（5. megaier/wm )或蘇力 31 200829266 菌以6似以）的菌株，或鏈黴菌屬（心r卬 的菌株，例如，青紫鏈黴菌（& /Ζ·νζ·心似）或鼠鏈黴菌（& murinus)，或革蘭氏陰性細菌，例如，大腸桿菌。細菌的 轉形可藉由原生質體轉形或利用勝任細胞以其本身已知的 方式而達成（參考Sambrook等人，上述文獻）。其他適 合的伯主包括戊原鍵撤囷（& mohraewe )、青紫鏈黴菌 以及麩胺酸棒桿菌（C. g/w謂化請）（Appl· Microbiol. Biotechnol. 6± : 447-454 ( 2004 ) ) 〇 當在細菌（例如，大腸桿菌）中表現胜肽時，胜肽可 保留在細胞質中，通常為不溶性的顆粒（稱為包涵體）或 可藉由細菌分泌序列而被引導至近膜間隙。在前者的例子 中，將細胞溶解，並且將顆粒回收及變性，之後，藉由稀 釋變性劑而使胜肽再折疊。在後者的例子中，胜肽可藉由 使細胞瓦解（例如，藉由聲裂或滲透震擾）以將内容物釋 放到近膜間隙以及回收胜肽，而從近膜間隙中回收。 適合的酵母菌細胞的例子包括釀酒酵母菌屬 (心a/mromyca )或裂殖釀酒酵母菌屬的細胞，特別是釀 酒酵母arevWw)或克魯維酵母（& w吵Μ")的菌 株。用於以異源性DNA轉形酵母菌細胞，並且從其中製 造異源性蛋白質的方法是說明於，例如，美國專利第 〇99,31卜 4,931，373、4，謂，_、M37,743 以及 4,845,〇75 號其白4寸此以引用方式納入本文中。經轉形的細胞是藉 由可篩選的標記（通常是抗藥性）所測定 缺少特定養分（例如，白胺酸”生長的能力 32 200829266 於酵母菌的載體的例子是POT1載體，其揭露於美國專利 第4,931，373號。編碼本發明胜肽的DNA序列可在前面力

上息序列以及視需要地前導序列’例如，以上所說明者 適合的酵母菌細胞的其他例子是克魯維酵母菌屬 (幻吵veromya )的菌株，例如，乳酸克魯維酵母（尺 Mem );漢遜酵母菌屬（好㈣)的菌株，例如，多 形漢遜酵母（//·或畢赤酵母菌屬（八·c/n.a) 的菌株，例如，巴絲德畢赤酵母（ρ.ΡΜί〇〜）（參考 等人，J· Gen· Microbiol· HI·· 3459-3465 ( 1986 );美國 專利第 US 4,882,279 號）。 其他真菌細胞的例子是絲狀真菌的細胞，例如，麴菌 屬物種、鏈孢黴屬（)物種、鐮刀菌屬（謂） 物種或木黴屬（7>/c )物種’特別是米麵菌、構巢 麴菌或黑麴菌的_。使用麴㈣物種以表現蛋白質是說 明於’例如’ EP 272 277以及EP 230 023。尖鐮刀菌（尺 〇叮_㈣）的轉形可藉由例如Malardier等人，Gene丛. 147-156 ( 1989 )之說明而進行。 — 田使用4狀真菌作為宿主細胞時，它可以本發明的 DNA構梁而轉形，盆 — 汰 卜 ，、便地措由將DNA構築嵌入至宿主 朱色體以獲得重相& & 評4 的但主細胞。這將更有可能使DNA序 ^ ^ 竹1^NA構杂肷入至宿主染色體， 細〇 進仃，例如，藉由同源性或異源性重 接著將上述經轉形或轉染 的宿主細胞在可表現本發明 33 200829266 胜肽的條件下培養於適合的營養培養基中，之後，將所得 的胜肽從培養物中回收。 用於培養細胞的培表其^Γ、θ 。蚕基可u疋適合於使宿主細胞生長 r 的任何傳統培養基’例如，包含適當補充物的最小或複合 :養基。適合的培養基可得自商業供應者，或可根據已發 方而製備（例如，在美國菌種保存中心的目錄中）。 接著可將由纟讀所製造的胜肽從培養基巾藉由傳統方法而 ，收二其包括错由離心或過濾而將宿主細胞與培養基分 ::、精由鹽（如’硫酸銨）而將上清液或過濾液的蛋白 貝成n殿、精由各種層析方法（例>，離子交換層析、 膠體過渡層析、親合力層析、或類似者，根據所討論的胜 肽之類型而定）而純化。 此處所引用的所古H々虹、^ 厅有參考文獻，包括公開案、專利申請 :以及專利’丨等的完整内容都特此以引用方式納入本文 以及其程度如同個別及特別指出每個參考文獻以引用方 以及以其完整内容於本文提出（在法律所允 内），而不管在本文其他地方分別提供的特 殊文獻之任何引用。 “在說明本發明的内文中，使用術語‘Ί “an”及 :二以及類似的指示對象，是要解釋成涵蓋單數以及複 人’：非有其他不同的指明或與内文衝突。例如，片語“化 二勿:、要理解成是指本發明的各種“化合物”或特定說 、>您，除非有其他不同的指明。 、有^他不同的指明，否則此處所提供的所有精確 34 200829266 數值都代表對應的近似值（例如， 有關特定因子或淨丨丨α 提供的所有精確例示數值，都可被考慮也藉由m 知飾’而提供對應的近似測量，如果適合的話^ 此處有關本發明之任何形能_ “包括” ‘‘且古，，“疋件所使用的術語例如 有m‘含有，，是希望提供本 發明：=元素所組成，，、“基本上由特定元素所組 成或λ貝上包括特定疋素，，的類似形態之支持，除非 有其他不同的指明或與内文衝突（例如’此處說明為包括 特定元件的組成物’應理解為也說明由該元件所組成的組 成物，除非有其他不同的指明或與内文衝突）。 醫藥组成物： 本發明提供醫藥調配物，其包括以1(rl5 mg/ml至2〇〇 mg/ml的濃度存在之本發明的胜肽，例如，1〇-1G mg/mi至 5 mg/ml ’以及其中該調配物具有2.〇至1〇 〇的pH。視需 要地’該調配物也可包括一種或多種如上述之其他的癌症 劑。調配物可進一步包括緩衝液系統、防腐劑、張壓劑、 螯合劑、穩定劑以及界面活性劑。在一個本發明的具體實 例中’醫藥調配物是水性調配物，也就是，包括水的調配 物。該等調配物通常是溶液或懸浮液。在一個本發明的具 體實例中’醫藥調配物是水溶液。術語“水性調配物”是 定義為包括至少50%重量/重量的水之調配物。同樣地， 術語“水溶液”是定義為包括至少50%重量/重量的水之 溶液，以及術語“水性懸浮液，，是定義為包括至少50%重 置/重ΐ的水之懸浮液。 35 200829266 医受在一具體實例中，醫藥調配物是冷陳乾燥的調配物， 醫師或患者在使用之前可將溶劑及/或稀釋劑加到其中。 在一具體貫例中，醫藥調配物是可立即使用的乾燥調 配物（例如’冷凍乾燥的或喷霧乾燥的），而不需要任何 先前的溶解。 在一具體實例中，本發明是有關於醫藥調配物，其包 括本發明胜肽的水溶液以及緩衝液，其中該〇Gp蛋白質是 以0.1-100 mg/ml的濃度而存在，以及其中該調配物具有 從約2.〇至約10.0的pH。 在一個本發明的具體實例中，調配物的pH是選自由 2·〇、2.1、2.2、2.3、2.4、2·5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、 3_1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3·9、4·0、4·1、 4.2 > 4.3 4.4 4.5 、 4·6 、 4_7 、 4·8 、 4_9 、 5·〇 、 5·1 、 5·2 、 5·3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5·9、6.0、6·1、ό·2、6.3 6.4 、 6.5 、 6.6 、 6.7 、 ό·8 、 6.9 、 7·〇 、 7·1 、 7.2 、 7·3 、 7 4 7·5 、 7·6 、 7·7 、 7.8 、 7·9 、 8.0 、 8·1 、 8·2 、 8·3 、 8·4 、 8·5 8·6、8.7、8.8、8·9、9·0、9·1、9.2、9·3、9_4、9·5、9_6 9·7、9·8、9.9以及10.0所組成的列表中。 在一個本發明的具體實例中，緩衝液是選自由醋酸 鈉、碳酸鈉、獰檬酸鹽、甘氨醯甘胺酸、組胺酸、甘胺酸、 離胺酸、精胺酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉及三（羥 甲基）胺基甲烷、Ν，Ν-(2-羥乙基）甘胺酸（bicine)、Ν_ [三（經 曱基）曱基]甘胺酸（tricine)、蘋果酸、琥珀酸、馬來酸、 富馬酸、酒石酸、天冬胺酸或其混合物所組成的族群中。 36 200829266 這些_衝液的每一個都構成本發明的替代具體實例。 在们本發明的具體實例中，調配物進一步包括醫藥 ^:接又的防腐劑。在_個本發明的具體實例中，防腐劑 是選自由酚、鄰-曱酚、間_曱酚、對_甲酚、對_羥基苯甲酸 甲酉曰、對-¾基苯曱酸丙酯、2_苯氧基乙醇、對_羥基苯甲 酉欠丁酯苯基乙醇、节基醇、氣丁醇及硫柳汞 (thiomerosal )、溴硝醇（br〇,〇i )、苯甲酸、咪唑啉 基=(imidurea)、氯己咬、去氫醋酸納、氯甲 基苯甲酸乙酯、节乙氧胺氯（benzethonium chloride )、氯 酚辛（chl〇rphenesine，3p_氯苯氧基丙二醇）或其混 合物所組成的族群中。在一個本發明的具體實例中，防腐 劑是以0.1 mg/ml至20 mg/ml的濃度而存在。在一個本發 明的具體實例中，防腐劑是以〇」mg/ml至5叫㈤的濃 度而存在。在一個本發明的具體實例中，防腐劑是以5mg/mi 至1 0 mg/ml的濃度而存在。在一個本發明的具體實例中， 防腐劑是以10 mg/ml至20 mg/mi的濃度而存在。這些特 定防腐劑的每一個都構成本發明的替代具體實例。在醫藥 組成物中使用防腐劑是在此技藝中之人士所熟知的。為了 方便起見，請參考雷明頓氏··製藥科學及實務（Remingt〇n: The Science and Practice ofPharmacy)，第 20 版，2000。 在一個本發明的具體實例中，調配物進一步包括等張 劑。在一個本發明的具體實例_，等張劑是選自由鹽（例 如，氯化鈉）、糖或糖醇、胺基酸（例如，L_甘胺酸' L_ 組胺酸、精胺酸、離胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、色胺酸、 37 200829266 穌胺酸）、祕（例如，甘油（丙三醇）、u-丙二醇（丙 一私卜1，3-丙二醇、丁二醇）、聚乙二醇（例如，PEG400) 或其混合物所組成的族群中。可使用任何的糖，例如，單 糖、雙糖或多醣或水溶性的聚葡糖，其包括例如果糖、葡 甸糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、乳糖、薦糖、海 (pui^ 精、可溶性澱粉、羥乙基澱粉以及羧甲基纖維素，。在一 具體實例中’糖加成物是魏。糖醇是定義為具有至少一 個-OH基團的C4_C8碳氫化合物，並且包括，例如，甘露 糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、甜醇、木糖醇以及阿 拉伯糖醇。在-具體實例中，糖醇加成物是甘露糖醇。上 述的糖或糖醇可個別或組合地使用。所使用的量並沒有固 定的限制，只要糖或糖醇可溶於液體製備物中並且不會不 利地影響利用本發明方法所達到的穩定效果即可。在一具 體實例中，糖或糖醇的濃度是在約i mg/ml至約15〇mg/mi 之間。在一個本發明的具體實例中，等張劑是以i mg/mi 至50 mg/ml的濃度而存在。在一個本發明的具體實例中， 等張劑是以1 mg/ml至7 mg/mi的濃度而存在。在一個本 發明的具體實例中，等張劑是以8 mg/ml至24 mg/ml的濃 度而存在。在一個本發明的具體實例中，等張劑是以25 mg/ml至50 mg/ml的濃度而存在。這些特定等張劑的每一 個都構成本發明的替代具體實例。在醫藥組成物中使用等 張劑是在此技藝中之人士所熟知的。為了方便起見，請參 考雷明頓氏：製藥科學及實務，第20版，2000。 38 200829266 在一個本發明的具體實例中，調配物進一步包括螯合 劑。在一個本發明的具體實例中，螯合劑是選自乙二胺四 乙酸（EDTA )、檸檬酸以及天冬胺酸的鹽及其混合物。 在一個本發明的具體實例中，螯合劑是以〇·1 mg/ml至5 mg/ml的濃度而存在。在一個本發明的具體實例中，螯合 劑疋以0.1mg/ml至2 mg/ml的濃度而存在。在一個本發明 的具體實例中，螯合劑是以2 mg/mi至5 mg/ml的濃度而 存在。這些特定螯合劑的每一個都構成本發明的替代具體 貫例。在醫藥組成物中使用螯合劑是在此技藝中之人士所 熟知的。為了方便起見，請參考雷明頓氏：製藥科學及實 務，第20版，2000。 在一個本發明的具體實例中，調配物進一步包括穩定 劑。在醫藥組成物中使用穩定劑是在此技藝中之人士所熟 知的。為了方便起見，請參考雷明頓氏：製藥科學及實務， 第 20 版，2000。 更特別地，本發明的組成物是穩定化的液體醫藥組成 物’其治療活性成分包括在儲存於液體醫藥調配物期間可 能顯示聚集形成的多胜肽。“聚集形成，，意指在導致募聚 物形成的多胜肽分子間之物理交互作用，其可保持溶解或 是可從溶液中沈澱之大的可看見的聚集物。“儲存期間” %、心液體醫樂組成物或調配物一旦製備之後，並沒有立即 投予個體。反之，在製備之後，它以液體形式、冷凍狀態 或乾燥形式包裝而用於儲存，以用於之後再溶解成液體形 式或適合於投予個體的其他形式。“乾燥形式，，意指液體 39 200829266 醫藥組成物或調配物是藉由冷涞乾燥（也就是，束乾；例 如，參見 Williams 及 Polli( 1984 )，J. Parenteral Sci. Technol. 38: 48-59)、喷霧乾燥（參見Masters ( 1991 )，喷霧乾 燥手冊（Spray-Drying Handbook)(第 5 版；Longman 科 學及技術（Longman Scientific and Technical ) ，Essez， 英國），第 491-676 頁；Broadhead 等人（1992 )，Drug Devel. Ind· Pharni. 18: 1 169-1206;以及 Mumenthaler 等人（1994)， Ph arm· Res· 11:12-20)或風乾（Carpenter 及 Crowe( 1988 )，

Cryobiol. 25 : 459-470 ;以及 Roser ( 1991 )，Bi〇pharm 4 ·· 47-53 )而乾燥。在液體醫藥組成物的儲存期間藉由多胜肽 的聚集形成，可能不利地影響該多胜肽的生物活性，導致 失去醫樂組成物的治療功效。此外，聚集形成也可能引起 其他的問題，例如，當包含多胜肽的醫藥組成物利用灌注 系統而投予時，阻斷管線、膜或幫浦。 本發明的醫藥組成物可進一步包括一定量的胺基酸鹼 基，其足以在組成物的儲存期間減少藉由多胜肽的聚集形 成。“胺基酸鹼基”意指胺基酸或胺基酸的組合，其中任 何指定的胺基酸都是以其游離鹼基形式或以其鹽形式而存 在。當使用胺基酸的組合時，所有的胺基酸都可以其游離 鹼基形式而存在，或所有的胺基酸都可以其鹽形式而存 t τ α其游離驗基形式存在，而其他部分則以其 鹽形式存在。在—具體實例中，用於製備本發明組成物i 使用的胺基酸是帶有電荷的側鏈之胺基酸，例如，精胺酸、 離胺酸、天冬胺酸以及_酸。特定胺基酸（例如，甘胺 40 200829266 酸、曱硫胺酸、組胺酸、咪唑、精胺酸、離胺酸、異白胺 酸、天冬胺酸、色胺酸、蘇胺酸及其混合物）的任何立體 異構物（也就是，L、D或其混合物）或這些立體異構物 的組合，都可存在於本發明的醫藥組成物中，只要特定的 胺基酸是以其游離鹼基形式或其鹽形式而存在。在一具體 貝例中係使用L -立體異構物。本發明的組成物也可以這些 胺基酸的類似物而調配。“胺基酸類似物，，意指天然存在

的胺基酸之衍生物，其可引起在本發明液體醫藥組成物的 儲存期間減少藉由多胜肽的聚集形成之所要效果。適合的 精胺酸類似物包括，例如，胺基胍、鳥胺酸以及N_單乙基 L-精胺酸；適合的甲硫胺酸類似物包括乙硫胺酸以及丁硫 胺酸；以及適合的半胱胺酸類似物包括s_曱基_l半胱胺 酸。如同其他的胺基酸，胺基酸類似物是以其游離鹼基形 式或其鹽形式而併入到組成物中。在一個本發明的具體實 例中，胺基酸或胺基酸類似物是以足以預防或延遲蛋白質 的聚集的濃度而使用。 、 在-個本發明的具體實例中，當扮演治療作用劑的多 胜肽是包括至少一個易受該氧化作用影響之甲硫胺酸殘基 :多胜肽時，可加入甲硫胺酸（或其他含硫的胺基酸或胺 二酸類似物）以抑制甲硫胺酸殘基氧化成甲硫胺酸亞碾。 抑制”意指在一段時間甲硫胺酸氧化的物種之最小累 貝。抑制的甲硫胺酸氧化會導致多胜肽以其適當的分子形 :之較大保留。甲硫胺酸的任何立體異構物“、直 合…其組合都可被使用。要加入的量應為足以抑制 41 200829266 甲硫胺酸殘基的氧化作用的量 1之件甲硫胺酸亞石風的晋 於管理機關是可接受的。通當，、"士 夂亞風的里對 這代表組成物包含不超過 約H)%至約3〇%的甲硫胺酸 。— 3不交過 二风 般而言，這可藉由 加入曱硫胺酸使得加入的甲炉险祕& 节，⑽ 酸與甲硫胺酸殘基的比例 疋從約1 : 1至約1000 ·· 1的銘 1的乾圍而達成，例如，1() 約 100 : 1 〇

，， W❿w 1運一步句括藉 定劑，其係選自高分子量聚合物或 括敉 U忒低刀千里化合物的族群 卞。在一個本發明的具體實例中 ^ ^ r %疋劑疋選自聚乙二醇 (例如’ PEG 3350 )、聚乙烯醇（ 旰、VAJ>聚乙烯吡咯烷 …羧基_/羥基纖維素或其衍生物（例如，歌、咖说、 c L以及HPMC )、核糊精、含硫的物質（如單硫甘油、 疏基乙酸以及2-甲基硫代乙醇）以及不同的鹽（例如，氯 化鈉）。這些特定穩定劑的每—個都構成本發明 體實例。 八 醫藥組成物也可包括其他的穩定劑，其可進一步增強 在醫樂組成物中的治療活性多胜肽之穩定性。對於本發明 4寸別有興趣的穩定劑包括，但並不限於，甲硫胺酸以及 EDTA (其可保護多胜肽避免甲硫胺酸氧化），以及非離 子性的界面活性劑（其可保護多胜肽避免與冷凍-解 械剪力有關的聚集）。 在一個本發明的具體實例中，調配物可進一步包括界 面活性劑。在一個本發明的具體實例中，界面活性劑是選 自β β劑、乙氧基化的蓖麻油、多甘醇化的甘油酯、乙酸 42 200829266 化的甘油單酯、山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧丙烯_聚氧乙烯嵌 I又聚合物（例如，波洛薩姆（p〇1〇xamers )，例如，Plu⑺nic⑧ F68、波洛薩姆188及4〇7、Trh〇n χ_1〇〇)、聚氧乙烯山 梨聚糖脂肪酸酯、聚氧乙烯及聚乙烯衍生物，例如，烷基 化及烧氧基化的衍生物（Tweens，例如，Tween_2〇、

Tween-40、Tween_80及Brij_35 )、甘油單酯或其乙氧基 化的衍生物、甘油二酯或其聚氧乙烯衍生物、醇、甘油、 外源凝集素及磷脂質（例如，磷脂醯絲胺酸、磷脂醯膽鹼、 磷脂醯乙醇胺、磷脂醯肌醇、二磷脂醯甘油及神經鞘磷 脂）、磷脂質的衍生物（例如，二棕櫊醯磷脂酸）以及溶 血磷脂（例如，棕櫚醯溶血磷脂醯_L_絲胺酸及乙醇胺、膽 I 、4 fee i文或|禾胺酸的1 _醯基_sn_甘油基_3 _鱗酸自旨）以及 /谷血喊知I及鱗脂醯膽驗的烧基、烧氧基（烧基酯）、烧氧 基（烧基鱗 >衍生物，例如，溶血磷脂醯膽鹼的月桂醯及肉 旦宼衍生物、二棕櫚醯填脂醯膽驗以及極性頭部基團的 修飾物’也就是，膽鹼、乙醇胺、磷脂酸、絲胺酸、蘇胺 酸、甘油、肌醇及帶正電荷的DODAC、DOTMA、DCP、 BISHOP、溶血石鼻月旨酿絲胺酸及溶血麟月旨酸蘇胺酸以及甘油 碟脂（例如，腦磷脂）、甘油糖脂（例如，半乳糠吡喃糖 皆） 神經勒糖脂（例如，神經醢胺（ceramide )、神經 節苷脂）、十二基磷酸膽鹼、雞蛋溶血卵磷脂、梭鏈孢酸 衍生物（例如，牛磺-二氫梭鏈孢酸鈉等等）、長鏈脂肪酸 及其鹽C6-C 12 (例如，油酸及辛酸）、醯基肉鹼及衍生物、 離胺酸、精胺酸或組胺酸的Να-醯基化衍生物、或離胺酸 43 200829266 或精胺酸的側鏈醯基化衍生物、包括離胺酸、精胺酸或組 胺酸及中性或酸性胺基酸的任何組合之二胜肽的Ν α _酿基 化衍生物、包括中性胺基酸及兩個帶電荷胺基酸的任何組 合之三胜肽的Ν、醯基化衍生物、DSS(多庫酯鈉（d〇cusate sodium) ，CAS登記編號[577-1 1-7]、多庫酯鈣，CAS登 記編號[128-49-4]、多庫酯鉀’ CAS登記編號[7491 _09-0])、 SDS (硫酸十二酯鈉或硫酸月桂酯納）、辛酸鈉、膽酸或 其衍生物、膽酸及其鹽及甘胺酸或牛磺酸共軛物、熊去氧 膽酸、膽酸鈉、去氧膽酸、牛續膽酸鈉、甘膽酸納、十 六烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸、陰離子（烷基-芳基 •磺酸）單價界面活性劑、兩性離子界面活性劑（例如，N_ 烷基-N，N-二甲基氨基-1-丙磺酸' 3_膽醯胺基丙基二曱 基氨基-1 -丙磺酸）、陽離子界面活性劑（季銨鹼）（例如， 魚京蝶基-二甲基 >臭化叙、錄蝶基吼σ定鑌氯）、非離子界面活 性劑（例如，十二烷基/3 葡糖吡喃糖苷）、波洛薩胺（例 如，Tetronic’s)，其為衍生自環氧丙烷及環氧乙烷連續加 到乙二胺的四功能性喪段共聚物，或該界面活性劑可選自 咪嗤淋衍生物或其混合物的族群。這些特定界面活性劑的 每一個都構成本發明的替代具體實例。 在醫樂組成物中使用界面活性劑是在此技藝中之人士 所熟知的。為了方便起見，請參考雷明頓氏：製藥科學及 實務，第2〇版，2000。 其他的成分也可能存在於本發明的胜肽醫藥調配物 中。該等其他的成分可包括濕潤劑、乳化劑、抗氧化劑、 44 200829266 增稠劑、張壓修飾劑、螯合劑、金屬離子、油質載劑、蛋 白質（例如，人類血清白蛋白、明膠或蛋白質）以及兩性 離子（例如，胺基酸，例如，甜菜鹼、牛磺酸、精胺酸、 甘胺酸、離胺酸及組胺酸）。當然，該等其他的成分不應 不利地影響本發明醫藥調配物的整體穩定性。 "T將包έ本叙明的胜肽之醫藥組成物在許多部位投予 至有需要該等治療的患者，例如，在局部的位置處（例如， 皮膚及黏膜部位）、在可繞過吸收的部位冑（例如，在動 脈、靜脈、心臟投予）以及在可涉及到吸收的部位處（例 如，在皮膚、皮下、肌肉或腹部投予）。 本卷明的w藥組成物之投予可經由數種途徑，例如， 舌、舌下、頰、口中、口服、胃及腸中、鼻、肺部（例如， 經由細支氣管及肺泡或其組合）、表皮、真皮、經皮、陰 逼、直腸、眼冑（例如’經由結膜）、輸尿管、以及非腸 胃道，而投予至有需要該等治療的患者。 本發明的組成物可以數種劑型而投予，例如，、容、夜 懸浮液、乳液、微乳液、多重相次乳液（multiple :、軟霄、糊劑、膏藥、油膏、錠劑、膜衣錠、潤洗劑、 胗囊（例如’硬明膠膠囊及軟明膠膠囊）、栓劑、直腸膠 囊、滴劑、凝膠、喷劑、粉劑、氣溶膠、吸入劑、眼滴劑： 眼樂貧、眼潤洗劑、陰道藥栓、陰道環、陰道藥客 = '原㈣形錢（例如，原位膠化劑、原^化劑、 '、位沈;I又劑、原位晶化劑、灌注溶液以及植入物） ，經由 可將本發明的組成物進一步化合或附著（例如 45 200829266

共仏、疏水性及靜電交互作用）至藥物載劑、藥物傳遞系 統以及新型藥物傳遞系統，以進一步增強本發明的胜肽之 穩定性、增加生物可利用率、增加溶解度、減少不利的影 %"、達到在此技藝中熟知的生物時鐘療法以及增加患者的 順從性或其任何組合。載劑、藥物傳遞系統以及新型藥物 傳遞系統的例子包括，但並不限於，聚合物（例如，纖維 素及衍生物）、多醣（例如，右旋糖聚糖及衍生物、澱粉 及衍生物）、聚（乙烯醇）、丙烯酸及甲基丙烯酸聚合物、 聚乳酸及聚甘醇酸及其嵌段共聚物、聚乙二醇、載體蛋白 質（例如，白蛋白）、膠體（例如，熱膠化系統，例如， 在此技藝中熟知的嵌段共聚物系統）、微胞（micelle)、 脂質體、微球體、奈米微粒、液晶及其分散物、L2相及其 分散物、在相變技藝中熟知的脂肪·水系統、聚合微胞、多 重相乳液、自乳化物、自微乳化物、環糊精及其衍生物以 及樹狀聚合物（dendrirner)。 本發明的組成物是有效於固體、半固體、粉末及溶液 的調配，以用於本發明的胜肽之肺部投予，其係利用例如 計量的劑量吸人器、乾粉吸人器以及喷霧器，這些都是在 此技藝中熟知的裝置。 本發明的組成物是特別有效於控制、持續、延長、延 遲及緩慢釋放藥物傳遞系統的調配物。更特別&，但並不 限於’組成物是有效於非腸胃道控制釋放以及持續釋放系 統的調配物（兩個系統都將投予次數減少數倍），這兩個 系統是在此技藝中熟知的。還要更佳地是皮下投予的控制 46 200829266 釋放以及持續釋放系統。並非限制本發明的範•，有效的 控制釋放系統以及組成物的例子是水凝膠、油質膠、液晶、 聚合的微胞、微球體、奈米顆粒。 括 澱 製造有效於本發明組成物的控制釋放系統之方法包 但並不限於’結晶、冷凝、共同結晶、沈澱、共同沈 乳化、分散、高壓均質化、包膜、喷霧乾燥、微包膜、

凝聚、相分離、溶劑蒸發以產生微球體、擠壓以及超臨界 流體方法。一般請參考醫藥品控制釋放手冊（Handb〇〇k of Pharmaceutical Controlled Release )( Wise , Marcel

Dekker，紐約，2000 )以及藥物及醫藥品科學（以叫and pharmaceutical Sciences)，第99卷：蛋白質調配及傳遞 (Protem Formulation and Delivery) (MacNaUyE J·編輯， Marcel Dekker，紐約，2000 )。 非腸月運投予可以皮下、肌肉内、腹膜内或靜脈注射， 藉由注射器'(視需要像筆的注射器）而進行。可選擇地， ，腸胃道投予也可藉由灌注幫浦而進行。其他的選項可以 疋用於投予本發明的胜肽的溶液或懸浮液的組成物，其為 ::戈肺噴劑的形式。作為另一個選項，包含本發明胜肽的 醫藥組成物也可適合於例如藉由無針注射或從貼片（視需 =地離子電滲貼片）而經皮投予，或是經黏膜（例如，頰） 術語“穩定化的調配物”是指具有增加的物理穩定 1±增加的化學穩定性、或增加的物理及化學穩定性之1 47 200829266 / 此處所使用之術語蛋白質調配物的“物理穩定性，，是 指蛋白質因為暴露至熱_機械壓力及/或與不穩定的界面及 表面（例如，疏水性表面及界面）交互作用，使蛋白質有 形成蛋白質的生物失活性及/或不溶性聚集物的傾向。水溶 性蛋白質調配物的物理穩定性是在將裝滿於適合容器（例 如胃卡匣或小瓶）中的調配物，在不同溫度暴露至機械/物 里I力（例如，展動）各種期間之後，藉由目測檢視及/或 濁度測里而„平估。调配物的目測檢視是以強烈的聚焦光線 與黑暗背景而進行。調配物的濁度之特徵在於以例如，從 0到3 @等級將濁度程度排序的目測分數（沒有顯示濁度 的調配物相當於目卿〇’以及在曰光中顯示目測濁度 的調配物相當於目測分數3)。當調配物在日光中顯示目 測濁度時，它就被列入有關蛋白質聚集的物理不穩定。可 選擇地，物的濁度也可藉由在此技藝中之人士所孰知 的間易濁度測量而評估。水溶性蛋白質調配物的物理釋定 性也可藉由㈣光譜劑或蛋白質的構形狀態之探針而\平 估。振針較佳是可優先結合到蛋白質的非天然構造之小分 子。蛋白質結構的小分+ Φ i h Al 先S板針的一個例子是硫代黃素 τ。硫代頁素τ是一稽馨也、、九 乐悧，其已廣泛用於澱粉樣 纖維的偵測。在原纖維的存 、 杨樣原 ,^ ^ Try ，以及或终也有其他的蛋 亦如此，當與原纖維蛋白質的形式結合時，硫代 “約450 nm引起新的激發最大值，以及在約482 疆引起增強的發散。未結 及在、力482 質上非螢光的。 心以素T在料波長是本 48 200829266 其他的4、^ m ^ & 天然狀態的探：：rf結構從天然改變成非 ^木針。例如，疏水性小埗h e u t patch^ M f ,11； * 塊。疏水性小塊在其天然狀態中一般是埋‘：、‘：性小 級結構内’但會因為}白質的三 的。這此小八早丄'開始打開或變性而變成暴露 例如，：、；！、t針的例子是芳香族疏水性染劑， 胺基嶋二广其他的光譜探収 例如’疏水性胺基酸（例如，苯丙胺酸、 屬2物異白胺酸、甲硫胺酸及綠胺酸或類似物）的録金 匕此處所使用之術語蛋白質調配物#“化學穩定性，，是 指蛋白質結構的化學共價改變，相較於天然的蛋白質結 構’其導致具有可能較少的生物效價及/或可能增加的免疫 原性質之化學降解產物的形成。許多的化學降解產物都可 能形成，其取決於天然蛋白質的種類及特性以及蛋白質所 暴露的環境而定。化學降解的消除大部分可能無法完全避 免:以及增加數量的化學降解產物通常可在蛋白f調配物 的儲存及使用期間被觀察到，如同在此技藝中之人士所熟 知。大部分的蛋白質有去醯胺化的傾向，這是在楚醯胺基 或天冬醯胺基的側鏈醯胺基團被水解以形成游離羧酸的過 耘。其他的降解途徑涉及到高分子量轉形產物的形成，其 中兩個或多個蛋白質分子彼此是經由轉醯胺化及/或雙硫交 互作用而共價地結合，導致共價結合的二聚的、寡聚的及 聚合的降解產物之形成（蛋白質醫藥品的穩定性（&以山以 49 200829266

Ahern T.J.及 Manning M.C.， 。可提及氧化（例如，甲硫胺 of Protein Pharmaceuticals) Plenum 出版，紐約，1992) 酉夂k基的）作為化學降解的另_個變體。*白質調配物的 本I疋f生可藉由在暴露至不同環境條件之後，於不同時 間關ϊ化學降解產物的量而評估（降解產物的形成通常 可藉由例如增加溫度而加速）。每個個別降解產物的量通 吊疋利用各種層析技術（例如，SEC-HPLC及/或RP- HPLC)，根據分子大小及/或電荷將降解產物分離而測定。 因此，如以上之概述，“穩定化的調配物，，是指具有 曰加的物理穩定性、增加的化學穩定性、或增加的物理及 /

化學穩定性之調配物。一般而言，調配物在使用及儲存期 間必須疋穩定的（依照所建議的使用及儲存條件），直到 達到過期日為止。 在一個本發明的具體實例中，包括本發明胜肽的醫藥 凋配物對於大於6週的使用以及大於3年的儲存是穩定 的0 在一個本發明的具體實例中，包括本發明胜肽的醫藥 Ό周配物對於大於4週的使用以及大於3年的儲存是穩定 的。 在一個本發明的具體實例中，包括本發明胜肽的醫藥 調也η ^ 物對於大於4週的使用以及大於2年的儲存是穩定 的。 在一個本發明的具體實例中，包括本發明胜肽的醫藥 -物對於大於2週的使用以及大於2年的儲存是穩定 50 200829266 的0 以下是本發明具體實例之非限制性的列舉。 具體實例1 : 一種分離的胜肽，該胜肽是人類泌乳素 的變異物，以及其結合到泌乳素受體，該變異物包括·· (i )在對應到序列識別號丨的胺基酸殘基24至35之 區域中的一個或多個胺基酸突變；及/或 (ii) 在對應到序列識別號1的胺基酸殘基52至58 之區域中的一個或多個胺基酸突變；及/或 (iii) 在對應到序列識別號1的胺基酸殘基66至83 之區域中的一個或多個胺基酸突變；及/或 (iv )在對應到序列識別號1的胺基酸殘基1 76至！ 99 之區域中的一個或多個胺基酸突變；及/或 (v )加到C_端的從1至5個胺基酸殘基。 具體實例2 :根據具體實例1之分離的胜肽，其中至 少一個在（i )所說明的突變是在對應到序列識別號1的胺 基酸殘基25的位置中。 具體實例3 ··根據具體實例2之分離的胜肽，其中在 對應到序列識別號1的胺基酸殘基25的位置中之胺基酸 殘基是以Gin取代。 具體實例4 :根據具體實例1至3的任一個之分離的 胜肽，其中在（i )所說明的突變是在對應到序列識別號1 的胺基酸殘基26至33的區域中。 具體實例5 :根據具體實例1至4的任一個之分離的 胜肽，其中至少一個在（i )所說明的突變是在對應到序列 51 200829266 識別號1的胺基酸殘基28的位置中。 具體實例6 :根據具體實例5之分離的胜肽，其中在 對應到序列識別號1的胺基酸殘基28的位置中之胺基酸 殘基是以Asn取代。 具體實例7 ··根據具體實例1至6的任一個之分離的 胜肽’其中至少一個在（i )所說明的突變是在對應到序列 識別號1的胺基酸殘基3 1的位置中。 具體實例8 :根據具體實例7之分離的胜肽，其中在 對應到序列識別號1的胺基酸殘基31的位置中之胺基酸 殘基是以Ser取代。 具體實例9 :根據具體實例1至8的任一個之分離的 胜肽，其中至少一個在（i )所說明的突變是在對應到序列 識別號1的胺基酸殘基33的位置中。 具體實例1 0 :根據具體實例9之分離的胜肽，其中在 對應到序列識別號1的胺基酸殘基3 3的位置中之胺基酸 殘基是以Ala取代。 具體實例1 1 :根據具體實例1至10的任一個之分離 的胜肽，其中在（i )所說明的突變不是在對應到序列識別 號1的胺基酸殘基3 0的胺基酸殘基中。 具體實例1 2 :根據具體實例1至11的任一個之分離 的胜肽，其中至少一個在（Π )所說明的突變是在對應到 序列識別號1的胺基酸殘基55的位置中。 具體實例13 :根據具體實例1至12的任一個之分離 的胜肽，其中至少一個在（ii )所說明的突變是在對應到 52 200829266 序列識別號1的胺基酸殘基56的位置中。 具體實例14 ··根據具體實例1至13的任一個之分離 的胜肽，其中在（ii )所說明的突變不是在對應到序列識 別號1的胺基酸殘基66的胺基酸殘基中。 具體實例1 5 :根據具體實例1至14的任一個之分離 的胜肽，其中在（ii )所說明的突變不是在對應到序列識 別號1的胺基酸殘基69的胺基酸殘基中。 具體實例1 6 ··根據具體實例1至1 5的任一個之分離 的胜肽，其中至少一個在（iii )所說明的突變是在對應到 序列識別號1的胺基酸殘基73的位置中。 具體實例17 :根據具體實例16之分離的胜肽，其中 在對應到序列識別號1的胺基酸殘基73的位置中之胺基 酸殘基是以Leu取代。 具體實例1 8 :根據具體實例1至1 7的任一個之分離 的胜肽，其中至少一個在（iii )所說明的突變是在對應到 序列識別號1的胺基酸殘基75的位置中。 具體實例1 9 :根據具體實例1 8之分離的胜肽，其中 在對應到序列識別號1的胺基酸殘基75的位置中之胺基 酸殘基是以Thr取代。 具體貝例2 0 ·根據具體貫例1至19的任一個之分離 的胜肽，其中至少一個在（iii )所說明的突變是在對應到 序列識別號1的胺基酸殘基76的位置中。 具體實例21 :根據具體實例20之分離的胜肽，其中 在對應到序列識別號1的胺基酸殘基76的位置中之胺基 53 200829266 酸殘基是以Ser取代。 具體實例22 :根據具體實例1至21的任一個之分離 的胜肽，其中至少一個在（iii )所說明的突變是在對應到 序列識別號1的胺基酸殘基80的位置中。 具體實例23 :根據具體實例22之分離的胜肽，其中 在對應到序列識別號1的胺基酸殘基8 0的位置中之胺基 酸殘基是以Leu取代。 具體實例24 :根據具體實例1至23的任一個之分離 的胜肽，其中至少一個在（iii )所說明的突變是在對應到 序列識別號1的胺基酸殘基67至70的區域中。 具體實例25 :根據具體實例1至24的任一個之分離 的胜肽，其中至少一個在（iii )所說明的突變是在對應到 序列識別號1的胺基酸殘基68的位置中。 具體實例26 :根據具體實例25之分離的胜肽，其中 在對應到序列識別號1的胺基酸殘基68的位置中之胺基 酸殘基是以Asn取代。 具體實例27 :根據具體實例1至26的任一個之分離 的胜肽，其中在（iv )所說明的突變不是在對應到序列識 別號1的胺基酸殘基1 76的胺基酸殘基中。 具體實例28 :根據具體實例1至27的任一個之分離 的胜肽，其中在（iv )所說明的突變不是在對應到序列識 別號1的胺基酸殘基1 77的胺基酸殘基中。 具體實例29 ··根據具體實例1至28的任一個之分離 的胜肽，其中在（iv )所說明的突變不是在對應到序列識 54 200829266 別號1的胺基酸殘基180的胺基酸殘基中。 具體實例30:根據具體實例丨至29的任一個之分離 的胜肽，其中在（iv )所說明的突變不是在對應到序列識 . 別號1的胺基酸殘基181的胺基酸殘基中。 具體實例··根據具體實例1至30的任一個之分離 的胜肽，其中在（iv )所說明的突變不是在對應到序列識 別號1的胺基酸殘基1 8 5的胺基酸殘基中。 具體實例3 2 :根據具體實例1至3 1的任一個之分離 f 的胜肽，其中在（iv )所說明的突變不是在對應到序列識 別號1的胺基酸殘基1 8 7的胺基酸殘基中。 具體貫例3 3 :根據具體實例1至3 2的任一個之分離 的胜肽，其中至少一個在（iv )所說明的突變是在對應到 序列識別號1的胺基酸殘基179的位置中。 具體實例3 4 :根據具體實例3 3之分離的胜肽，其中 在對應到序列識別號1的胺基酸殘基1 79的位置中之胺基 酸殘基是以Thr取代。 ί 具體實例35 :根據具體實例1至34的任一個之分離 的胜肽，其中至少一個在（iv )所說明的突變是在對應到 序列識別號1的胺基酸殘基1 88至1 99的區域中。 具體實例36 :根據具體實例1至35的任一個之分離 的胜肽，其中至少一個在（iv )所說明的突變是在對應到 序列識別號1的胺基酸殘基190的位置中。 具體實例37 :根據具體實例36之分離的胜肽，其中 在對應到序列識別號1的胺基酸殘基19〇的位置中之胺基 55 200829266 酸殘基是以Arg取代。 具體實例38 :根據具體實例1至37的任一個之分離 的胜肽，該胜肽是人類泌乳素的變異物，以及其結合到泌 - 乳素受體，該變異物具有在對應到序列識別號1的胺基酸 殘基66至83之區域中及/或在對應到胺基酸殘基189至199 之區域中的一個或多個胺基酸突變。 具體實例39 :根據具體實例38之分離的胜肽，該胜 肽是人類泌乳素的變異物，以及其結合到泌乳素受體，該 Γ 變異物具有在對應到序列識別號1的胺基酸殘基67至70 之區域中及/或在對應到胺基酸殘基189至199之區域中的 一個或多個胺基酸突變。 具體實例40 : —種分離的胜肽，該胜肽是人類泌乳素 的變異物，以及其結合到泌乳素受體，以及該胜肽是具有 序列識別號1的胺基酸序列之胜肽的變異物，該變異物包 括： (i )在對應到胺基酸殘基24至35之區域中的一個或 U 多個胺基酸突變；及/或 (ii)在對應到胺基酸殘基52至58之區域中的一個 或多個胺基酸突變；及/或 (iii )在對應到胺基酸殘基66至83之區域中的一個 或多個胺基酸突變；及/或 (iv )在對應到序列識別號1的胺基酸殘基1 76至1 99 之區域中的一個或多個胺基酸突變；及/或 (v )加到C-端的從1至5個胺基酸殘基。 56 200829266 具體實例41 :根據具體實例40之分離的胜肽，其中 至少一個在（i )所說明的突變是在對應到序列識別號1的 胺基酸殘基25的位置中。 具體實例42 :根據具體實例41之分離的胜肽，其中 在對應到序列識別號1的胺基酸殘基25的位置中之胺基 酸殘基是以Gin取代。 具體實例43 :根據具體實例40至42的任一個之分離 的胜肽，其中在（i )所說明的突變是在對應到序列識別號 1的胺基酸殘基2 6至3 3的區域中。 具體實例44 :根據具體實例40至43的任一個之分離 的胜肽，其中至少一個在（i )所說明的突變是在對應到序 列識別號1的胺基酸殘基28的位置中。 具體實例45 :根據具體實例44之分離的胜肽，其中 在對應到序列識別號1的胺基酸殘基28的位置中之胺基 酸殘基是以Asn取代。 具體實例46 :根據具體實例40至45的任一個之分離 的胜肽，其中至少一個在（i )所說明的突變是在對應到序 列識別號1的胺基酸殘基3 1的位置中。 具體實例47 :根據具體實例46之分離的胜肽，其中 在對應到序列識別號1的胺基酸殘基3 1的位置中之胺美 酸殘基是以Ser取代。 具體實例48 :根據具體實例40至47的任一個之分離 的胜肽，其中至少一個在（i )所說明的突變是在對應到序 列識別號1的胺基酸殘基3 3的位置中。 57 200829266 具體實例49 :根據具體實例48之分離的胜肽，其中 在對應到序列識別號1的胺基酸殘基3 3的位置中之胺基 酸殘基是以Ala取代。 具體實例5 0 :根據具體實例4 0至4 9的任一個之分離 的胜肽，其中在（i )所說明的突變不是在對應到序列識別 號1的胺基酸殘基30的胺基酸殘基中。 具體貫例5 1 :根據具體貫例4 0至5 0的任一個之分離 的胜肽，其中至少一個在（ii )所說明的突變是在對應到 序列識別號1的胺基酸殘基55的位置中。 具體實例52 ··根據具體實例40至5 1的任一個之分離 的胜肽，其中至少一個在（ii )所說明的突變是在對應到 序列識別號1的胺基酸殘基5 6的位置中。 具體實例53 :根據具體實例40至52的任一個之分離 的胜肽，其中在（Π )所說明的突變不是在對應到序列識 別號1的胺基酸殘基66的位置中。 具體實例54 :根據具體實例40至53的任一個之分離 的胜肽，其中在（ii )所說明的突變不是在對應到序列識 別號1的胺基酸殘基69的位置中。 具體實例55 :根據具體實例40至54的任一個之分離 的胜肽，其中至少一個在（iii )所說明的突變是在對應到 序列識別號1的胺基酸殘基73的位置中。 具體實例5 6 :根據具體實例5 5之分離的胜肽，其中 在對應到序列識別號1的胺基酸殘基73的位置中之胺基 酸殘基是以Leu取代。 58 200829266 具體實例57 :根據具體實例40至56的任一個之分離 的胜肽，其中至少一個在（iii )所說明的突變是在對應到 序列識別號1的胺基酸殘基75的位置中。 具體實例58 :根據具體實例57之分離的胜肽，其中 在對應到序列識別號1的胺基酸殘基7 5的位置中之胺基 酸殘基是以Thr取代。 具體實例59 :根據具體實例40至58的任一個之分離 的胜肽，其中至少一個在（iii )所說明的突變是在對應到 序列識別號1的胺基酸殘基76的位置中。 具體實例6 0 :根據具體實例5 9之分離的胜肽，其中 在對應到序列識別號1的胺基酸殘基76的位置中之胺基 酸殘基是以Ser取代。 具體貫例6 1 ·根據具體貫例4 0至6 0的任一個之分離 的胜肽，其中至少一個在（iii )所說明的突變是在對應到 序列識別號1的胺基酸殘基80的位置中。 具體實例62 :根據具體實例61之分離的胜肽，其中 在對應到序列識別號1的胺基酸殘基80的位置中之胺基 酸殘基是以Leu取代。 具體實例63 :根據具體實例40至62的任一個之分離 的胜肽，其中至少一個在（iii )所說明的突變是在對應到 序列識別號1的胺基酸殘基67至70的區域中。 具體貫例6 4 ·根據具體貫例4 0至6 3的任一個之分離 的胜肽，其中至少一個在（iii )所說明的突變是在對應到 序列識別號1的胺基酸殘基68的位置中。 59 200829266 具體實例65 :根據具體實例64之分離的胜肽，其中 在對應到序列識別號1的胺基酸殘基68的位置中之胺基 酸殘基是以Asn取代。 具體實例66 :根據具體實例40至65的任一個之分離 的胜肽’其中在（iv )所說明的突變不是在對應到序列識 別號1的胺基酸殘基1 76的胺基酸殘基中。 具體實例67 :根據具體實例40至66的任一個之分離 的胜肽，其中在（iv )所說明的突變不是在對應到序列識 別號1的胺基酸殘基1 77的胺基酸殘基中。 具體實例68 :根據具體實例40至67的任一個之分離 的胜肽，其中在（iv )所說明的突變不是在對應到序列# 別號1的胺基酸殘基1 80的胺基酸殘基中。 具體實例69 :根據具體實例40至68的任一個之分離 的胜肽，其中在（iv )所說明的突變不是在對應到序列識 別號1的胺基酸殘基1 8 1的胺基酸殘基中。 具體貫例7 0 ··根據具體實例4 0至6 9的任一個之分離 的胜肽，其中在（iv )所說明的突變不是在對應到序列％ 別號1的胺基酸殘基1 8 5的胺基酸殘基中。 具體實例71 :根據具體實例40至70的任一個之八^ 、刀離 的胜肽，其中在（iv )所說明的突變不是在對應到序 別號1的胺基酸殘基1 87的胺基酸殘基中。 具體實例72 :根據具體實例40至71的任一個夕八 的胜肽，其中至少一個在（iv )所說明的突變是在斟鹿 序列識別號1的胺基酸殘基1 79的位置中。 60 200829266 具體實例73 :根據具體實例72之分離的胜肽，其中 在對應到序列識別號1的胺基酸殘基179的位置中之胺基 酸殘基是以Thr取代。 具體實例74 :根據具體實例40至73的任一個之分離 的胜肽，其中在（iv )所說明的突變是在對應到序列識別 號1的胺基酸殘基1 8 8至19 9的區域中。 具體實例75 :根據具體實例40至74的任一個之分離 的胜肽，其中至少一個在（iv )所說明的突變是在對應到 序列識別號1的胺基酸殘基190的位置中。 具體實例76 :根據具體實例75之分離的胜肽，其中 在對應到序列識別號1的胺基酸殘基190的位置中之胺基 酸殘基是以Arg取代。 具體實例77 :根據具體實例40至76的任一個之分離 的胜肽，該胜肽是人類泌乳素的變異物，以及其可結合到 泌乳素受體，以及該胜肽是具有序列識別號1的胺基酸序 列之胜肽的變異物，該變異物在對應到序列識別號1的胺 基酸殘基66至83的區域中及/或在對應到胺基酸殘基189 至1 99的區域中具有一個或多個胺基酸突變。 具體實例78 :根據具體實例77之分離的胜肽，該胜 肽是人類泌乳素的變異物，以及其可結合到泌乳素受體， 該變異物在對應到序列識別號1的胺基酸殘基67至7〇的 區域中及/或在對應到胺基酸殘基189至199的區域中具有 一個或多個胺基酸突變。 具體實例79 : —種分離的胜肽，該胜肽是人類泌乳素 61 200829266 的變異物’以及其可結合到泌乳素受體，盆中” 括-個或多個可穩定泌乳素分子的結構之胺基酸二異物包 具體貫例8G:根據具體實例1至79的任—個义。 的胜肽…該變異物包括一個或多個可穩定泌乳：分離 的二級結構之胺基酸突變。 I分+ 具體實例81 :根據具體實例79或具體實例 〃 的胜肽，其’泌乳素的穩定化是藉由利用如實施例1分離 明的ΗΧ-MS技術而測定。 所言兒 具體實例82 :根據具體實例79至81的任—個之八 的胜肽，其中一個或多個該胺基酸突變可穩定泌乳素刀離 螺旋束結構。 ’、的4、 具體實例83 :根據具體實例79至82的任一 的胜狀，其甲一個或多個該胺基酸突變可改善泌乳素、 旋1、螺旋2、螺旋3及/或螺旋4中之螺旋蓋。 、、' 具體實例84 :根據具體實例79至83的任一個之分離 的胜肽，其中一個或多個該胺基酸突變是選自在對應到 Ala-111以及Glu-162的胺基酸殘基中之突變。 具體貫例8 5 ··根據具體實例8 4之分離的胜肽，其中 對應到Ala-1 11的胺基酸殘基是以Asp、Asn、Ser或Thr 取代。 具體實例86 :根據具體實例84或具體實例85之分離 的胜肽，其中對應到Glu-162的胺基酸殘基是以Asp取代。 具體實例87 :根據具體實例79至86的任一個之分離 的胜肽，其中一個或多個該胺基酸突變係在暴露至溶劑的 62 200829266 螺旋片段中導入鹽橋架。 具體實例88 :根據具體實例79至87的任一個之分離 的胜肽，其中該等胺基酸突變之一是在對應到Asn-92的胺 基酸殘基中之突變。 具體實例89 :根據具體實例88之分離的胜肽，其中 對應到Asn-92的胺基酸殘基是以Asp取代。 具體實例90 :根據具體實例79至89的任一個之分離 的胜肽，其中兩個或多個該等胺基酸突變係將非-天然的雙 硫鍵導入至泌乳素。 具體實例91 :根據具體實例90之分離的胜肽，其中 該兩個胺基酸突變是選自在對應到 L1C/S135C、 A22C/G129C、V23C/L186C、S26C/D183C、L32C/I119C、 S33C/L175C 、 S33C/R176C 、 S33C/S179C 、 M36C/K115C 、 F37C/L172C、T45C/I51C、S57C/N170C、H59C/P148C、 L63C/S86C、P66C/Q71C、P66C/A72C、Q77C/V137C、 K78C/K142C、K78C/H138C、L81C/V134C、S82C/E143C、 S82C/N144C、V85C/N144C、S86C/I146C、L88C/L127C、 R89C/Y147C、S90C/Y147C、E93C/W150C、L95C/E120C、 V99C/A1 16C 、 V102C/L1 13C 、 M105C/A108C 、 H13 8C/T141C、M158C/R164C 以及 D160C/S193C 的位置中 之突變。 具體實例92 ··根據具體實例1至91的任一個之分離 的胜肽，其中一個或多個該胺基酸突變是將暴露至溶劑的 疏水性殘基以極性殘基取代。 63 200829266 具體實例93 :根據具體實例92之分離的胜肽，其中 一個或多個該胺基酸突變是選自在對應到lie-146以及 Val-149的胺基酸殘基中之突變。 具體實例94 :根據具體實例93之分離的胜肽，其中 對應到lie-146的胺基酸殘基是以絲胺酸或蘇胺酸取代。 具體實例95 :根據具體實例93或具體實例94之分離 的胜肽，其中對應到Val-149的胺基酸殘基是以絲胺酸或 蘇胺酸取代。 具體實例96 :根據具體實例1至95的任一個之分離 的胜肽，其中一個或多個該胺基酸突變可改善在4-螺旋束 結構的疏水性核心處之包裝交互作用。 具體實例97 :根據具體實例96之分離的胜肽，其中 一個或多個該胺基酸突變是選自在對應到Leu-95、Ile-119 以及Leu-175的胺基酸殘基中之突變。 具體實例98 :根據具體實例97之分離的胜肽，其中 對應到Leu-95的胺基酸殘基是以Val取代。 具體實例99 :根據具體實例97或具體實例98之分離 的胜肽，其中對應到lie-119的胺基酸殘基是以Val取代。 具體實例100 :根據具體實例97至99的任一個之分 離的胜肽，其中對應到Leu-175的胺基酸殘基是以Pro取 代。 具體實例101 :根據具體實例1至100的任一個之分 離的胜肽，其中該胜肽也在對應到序列識別號1的胺基酸 殘基20至36及/或40至63及/或173至185的一個或多 64 200829266 個位置中突變。 具體實例102 :根據具體實例i至1〇1的任一個之分 離的胜肽’其中該胜肽對於泌乳素受體比人類泌乳素具有 增加的親合力。 具體實例103 :根據具體實例1〇2之分離的胜肽，其 中對於泌乳素受體的親合力是根據如此處所說明的分析 (I )而測定。 具體實例104 :根據具體實例丨至1〇3的任一個之分 離的胜肽，其中該胜肽對於泌乳素受體的結合比起野生型 人類泌乳素結合到泌乳素受體，具有至少3倍少的解離常 數（Kd) 〇 具體貫例105 :根據具體實例1至104的任一個之分 離的胜肽，其中該胜肽可結合到人類生長激素受體。 士具體實例106 :根據具體實例1〇5之分離的胜肽，其 中結合到人類生長激素受體是藉由利用如此處所說明的分 析（I )而測定。 體貝例1 〇7 .根據具體實例丨至1 的任一個之分 離的胜肽’其為泌乳素受體的拮抗劑。 上具體貫例108 :根據具體實例1〇7之分離的胜肽，其 中該：抗作用是利用如此處所說明的分析（II)而測定。 具體貫例109 ··根據具體實例或具體實{列108之 分離的胜肽，盆由分上丄 /、T邊拮抗作用是藉由將一個或多個突變導 入至結合位晋 9 &、各、 ， 而達成，以避免或減少結合位置2與泌乳 素受體的交互作用。 65 200829266 具體實例11 〇 :根據具體實例丨07至1 09的任一個之 分離的胜肽’其中至少一個或多個該拮抗突變是選自在對 應到Gly-129以及Ser_179的胺基酸殘基中之突變。 具體實例111 :根據具體實例11 0之分離的胜肽，其 中至少一個或多個該拮抗突變是選自對應到G129R以及 S179D的突變。 具體實例112 :根據具體實例111之分離的胜肽，其 中至少一個或多個該拮抗突變是選自對應到G129R的突 變。 具體實例1 13 :根據具體實例112之分離的胜肽，其 中對應到泌乳素的位置1到9之胺基酸殘基已被刪除。 具體實例1 1 4 :根據具體實例1 1 3之分離的胜肽，其 中對應到泌乳素的位置1到14之胺基酸殘基已被刪除。 具體實例1 1 5 : —種分離的胜肽，該胜肽是人類生長 激素的變異物，以及其可結合到生長激素受體，該變異物 包括： (i )在對應到胺基酸殘基24至3 5之區域中的一個或 多個胺基酸突變；及/或 (ii)在對應到胺基酸殘基52至58之區域中的—個 或多個胺基酸突變；及/或 (iii )在對應到胺基酸殘基66至83之區域中的—個 或多個胺基酸突變；及/或 (iv )在對應到序列識別號1的胺基酸殘基1 76至1 99 之區域中的一個或多個胺基酸突變；及/或 66 200829266 (V )加到C-端的從1至5個胺基酸殘基。 具體實例116 :根據具體實例115之分離的胜肽，其 中至少一個在（i )所說明的突變是在對應到序列識別號i 的胺基酸殘基25的位置中。 具體實例117:根據具體實例116之分離的胜肽，其 中在對應到序列識別號1的胺基酸殘基25的位置中之胺 基酸殘基是以Gin取代。 具體實例1 1 8 ··根據具體實例11 5至1 1 7的任一個之 分離的胜肽，其中在（i )所說明的突變是在對應到序列識 別號1的胺基酸殘基26至33的區域中。 具體實例1 1 9 :根據具體實例1 1 5至1 1 8的任一個之 分離的胜肽，其中至少一個在（i )所說明的突變是在對應 到序列識別號1的胺基酸殘基28的位置中。 具體實例120:根據具體實例119之分離的胜肽，其 中在對應到序列識別號1的胺基酸殘基28的位置中之胺 基酸殘基是以Asn取代。 具體實例121 :根據具體實例115至120的任一個之 分離的胜肽，其中至少一個在（i )所說明的突變是在對應 到序列識別號1的胺基酸殘基3 1的位置中。 具體實例122 :根據具體實例121之分離的胜肽，其 中在對應到序列識別號1的胺基酸殘基3 1的位置中之胺 基酸殘基是以Ser取代。 具體實例123 :根據具體實例40至122的任一個之分 離的胜肽，其中至少一個在（i )所說明的突變是在對應到 67 200829266 序列識別號1的胺基酸殘基3 3的位置中。 具體實例124:根據具體實例123之分離的胜肽，其 中在對應到序列識別號1的胺基酸殘基33的位置中之月安 基酸殘基是以Ala取代。 具體實例125 :根據具體實例115至124的任一個之 分離的胜肽，其中在（i )所說明的突變不是在對應到序％ 識別號1的胺基酸殘基30的胺基酸殘基中。 具體實例126 ··根據具體實例115至125的任一個之 分離的胜肽，其中至少一個在（ii )所說明的突變是在對 應到序列識別號1的胺基酸殘基55的位置中。 具體實例127 :根據具體實例115至126的任一個之 分離的胜肽，其中至少一個在（Π )所說明的突變是在對 應到序列識別號1的胺基酸殘基56的位置中。 具體實例128 :根據具體實例115至127的任一個之 分離的胜肽，其中在（ii )所說明的突變不是在對應到# 列識別號1的胺基酸殘基66的胺基酸殘基中。 具體實例129 :根據具體實例115至128的任一個之 分離的胜肽，其中在（ii )所說明的突變不是在對應到序 列識別號1的胺基酸殘基69的胺基酸殘基中。 具體實例1 30 :根據具體實例1 1 5至1 29的任一個之 分離的胜肽，其中至少一個在（iii )所說明的突變是在對 應到序列識別號1的胺基酸殘基73的位置中。 具體實例131:根據具體實例130之分離的胜肽，其 中在對應到序列識別號1的胺基酸殘基73的位置中之胺 68 200829266 基酸殘基是以Leu取代。 具體實例132 :根據具體實例115至131的任一個之 分離的胜肽，其中至少一個在（Hi )所說明的突變是在對 應到序列識別號1的胺基酸殘基75的位置中。 具體實例133 :根據具體實例132之分離的胜肽，其 中在對應到序列識別號1的胺基酸殘基75的位置中之胺 基酸殘基是以Thr取代。 具體實例134 :根據具體實例115至133的任一個之 分離的胜肽，其中至少一個在（iii )所說明的突變是在對 應到序列識別號1的胺基酸殘基76的位置中。 具體實例135:根據具體實例134之分離的胜肽，其 中在對應到序列識別號1的胺基酸殘基76的位置中之胺 基酸殘基是以Ser取代。 具體實例136 :根據具體實例115至135的任一個之 分離的胜肽，其中至少一個在（iii )所說明的突變是在對 應到序列識別號1的胺基酸殘基80的位置中。 具體實例137 :根據具體實例136之分離的胜狀，其 中在對應到序列識別號1的胺基酸殘基80的位置中之胺 基酸殘基是以Leu取代。 具體實例138 :根據具體實例115至137的任一個之 分離的胜肽，其中至少一個在（iii )所說明的突變是在對 應到序列識別號1的胺基酸殘基67至70的區域中。 具體實例139 :根據具體實例115至138的任一個之 分離的胜肽’其中至少一個在（in)所說明的突變是在對 69 200829266 應到序列識別號1的胺基酸殘基68的位置中。 具體實例140 :根據具體實例139之分離的胜肽，其 中在對應到序列識別號1的胺基酸殘基6 8的位置中之胺 基酸殘基是以Asn取代。 具體實例141 :根據具體實例115至140的任一個之 分離的胜肽，其中在（iv )所說明的突變不是在對應到序 列識別號1的胺基酸殘基1 76的胺基酸殘基中。 具體貫例14 2 ·根據具體貫例11 5至141的任一個之 分離的胜肽，其中在（iv )所說明的突變不是在對應到$ 列識別號1的胺基酸殘基1 77的胺基酸殘基中。 具體實例143 :根據具體實例115至142的任一個之 分離的胜肽，其中在（iv )所說明的突變不是在對應到# 列識別號1的胺基酸殘基1 80的胺基酸殘基中。 具體實例144 :根據具體實例115至143的任一個之 分離的胜肽，其中在（iv )所說明的突變不是在對應到序 列識別號1的胺基酸殘基1 8 1的胺基酸殘基中。 具體實例1 45 :根據具體實例11 5至1 44的任一個之 分離的胜肽，其中在（iv )所說明的突變不是在對應到序 列識別號1的胺基酸殘基1 85的胺基酸殘基中。 具體實例146 :根據具體實例11 5至145的任一個之 分離的胜肽，其中在（iv )所說明的突變不是在對應到序 列識別號1的胺基酸殘基1 8 7的胺基酸殘基中。 具體實例147 :根據具體實例115至146的任一個之 分離的胜肽，其中至少一個在（iv )所說明的突變是在對 70 200829266 應到序列識別號1的胺基酸殘基179的位置中。 具體實例148 ··根據具體實例147之分離的胜肽，其 中在對應到序列識別號1的胺基酸殘基1 79的位置中之胺 基酸殘基是以Thr取代。 具體實例149 :根據具體實例1 1 5至148的任一個之 分離的胜肽，其中至少一個在（iv )所說明的突變是在對 應到序列識別號1的胺基酸殘基1 88至1 99的區域中。 具體實例150 :根據具體實例115至149的任一個之 分離的胜肽，其中至少一個在（iv )所說明的突變是在對 應到序列識別號1的胺基酸殘基190的位置中。 具體實例151 :根據具體實例150之分離的胜肽，其 中在對應到序列識別號1的胺基酸殘基19 0的位置中之胺 基酸殘基是以Arg取代。 具體實例1 52 :根據具體實例1 1 5至1 5 1的任一個之 分離的胜肽，該胜肽是人類生長激素的變異物，以及其可 結合到生長激素受體，該變異物在對應到序列識別號1的 胺基酸殘基66至83的區域中及/或在對應到胺基酸殘基ι89 至1 99的區域中包括一個或多個胺基酸突變。 具體實例153 :根據具體實例115至丨52的任一個之 分離的胜肽，該胜肽是人類生長激素的變異物，以及其可 結合到生長激素受體，該變異物在對應到序列識別號1的 胺基酸殘基67至70的區域中及/或在對應到胺基酸殘基189 至1 99的區域中包括一個或多個胺基酸突變。 具體貫例1 54 : —種分離的胜肽，該胜肽是人類生長 71 200829266 • 激素的變異物，以及其可結合到生長激素受體，其中該變 異物具有一個或多個可穩定生長激素分子的二級結構二二 基酸突變。 - 具體實例155 :根據具體實例115至154的任—個之 分離的胜肽’其中§亥變異物具有一個或多個可穩定生長激 素分子的二級結構之胺基酸突變。 具體實例156 ··根據具體實例154或具體實例155之 分離的胜肽’其中生長激素分子的穩定化是藉由利用如實 ( ' 施例1所說明的ΗΧ-MS技術而測定。 具體實例1 5 7 :根據具體實例1 5 4至1 5 6的任一個之 分離的胜肽，其中一個或多個該胺基酸突變可穩定生長激 素的4-螺旋束結構。 具體實例1 58 :根據具體實例1 54至1 57的任一個之 分離的胜肽，其中一個或多個該胺基酸突變可改善生長激 素的螺旋1、螺旋2、螺旋3及/或螺旋4中之螺旋蓋。 具體實例159 :根據具體實例154至158的任一個之 t 分離的胜肽，其中一個或多個該胺基酸突變是選自在對應 到序列識別號1的Ala-111以及Glu-162的胺基酸殘基中 之突變。 具體實例160 :根據具體實例1 59之分離的胜肽，其 中對應到Ala-1 11的胺基酸殘基是以Asp、Asn、Ser或Thr 取代。 具體實例161 :根據具體實例159或具體實例160之 分離的胜肽，其中對應到Glu-162的胺基酸殘基是以Asp 72 200829266 取代。 具體實例162 :根據具體實例154至161的任一個之 分離的胜肽，其中一個或多個該胺基酸突變係在暴露至溶 劑的螺旋片段中導入鹽橋架。 具體實例163 :根據具體實例154至162的任一個之 分離的胜肽，其中該等胺基酸突變之一是在對應到序列識 別號1的Asn-92之胺基酸殘基中的突變。 具體實例164 :根據具體實例163之分離的胜肽，其 中對應到Asn-92的胺基酸殘基是以Asp取代。 具體實例1 65 :根據具體實例1 54至1 64的任一個之 分離的胜肽，其中兩個或多個該等胺基酸突變係將非-天然 的雙硫鍵導入至生長激素。 具體實例166 :根據具體實例165之分離的胜肽，其 中該兩個胺基酸突變是選自在對應到序列識別號1的 L1C/S135C、A22C/G129C、V23C/L186C、S26C/D183C、 L32C/I119C 、 S33C/L175C 、 S33C/R176C 、 S33C/S179C 、 M36C/K115C、F37C/L172C、T45C/I51C、S57C/N170C、 H59C/P148C、L63C/S86C、P66C/Q71C、P66C/A72C、 Q77C/V137C、K78C/K142C、K78C/H138C、L81C/V134C、 S82C/E143C、S82C/N144C、V85C/N144C、S86C/I146C、 L88C/L127C、R89C/Y147C、S90C/Y147C、E93C/W150C、 L95C/E120C、V99C/A1 16C、V102C/L113C、M105C/A108C、 H138C/T141C、M158C/R164C 以及 D160C/S193C 的位置中 之突變。 73 200829266 具體實例167 :根據具體實例11 5至1 66的任一個之 分離的胜肽，其中一個或多個該胺基酸突變是將暴露至溶 劑的疏水性殘基以極性殘基取代。 具體實例1 68 :根據具體實例167之分離的胜肽，其 中一個或多個該胺基酸突變是選自在對應到序列識別號1 的Ile_146以及Val-149的胺基酸殘基中之突變。 具體實例169 ··根據具體實例168之分離的胜肽，其 中對應到lie-146的胺基酸殘基是以絲胺酸或蘇胺酸取代。 具體實例1 70 :根據具體實例1 68或具體實例1 69之 分離的胜肽，其中對應到Val-149的胺基酸殘基是以絲胺 酸或蘇胺酸取代。 具體實例171 :根據具體實例154至170的任一個之 分離的胜肽，其中一個或多個該胺基酸突變可改善在4-螺 旋束結構的疏水性核心處之包裝交互作用。 具體實例172 :根據具體實例171之分離的胜肽，其 中一個或多個該胺基酸突變是選自在對應到序列識別號1 的Leu-95、lie-119以及Leu-175的胺基酸殘基中之突變。 具體實例173:根據具體實例172之分離的胜肽，其 中對應到Leu-95的胺基酸殘基是以Val取代。 具體實例1 74 :根據具體實例1 72或具體實例1 73之 分離的胜肽，其中對應到lie-119的胺基酸殘基是以Val取 代。 具體實例1 75 :根據具體實例1 72至1 74的任一個之 分離的胜肽，其中對應到Leu-175的胺基酸殘基是以pro 74 200829266 取代。 具體實例176 :根據具體實例152至175的任一個之 为離的胜肽，其中該胜肽也在對應到序列識別號丨的胺基 酸殘基20至36及/或40至63及/或ι73至185的一個或 多個位置中突變。 具體實例1 77 :根據具體實例丨丨5至丨76的任一個之 刀揭隹的胜肽，其中該胜肽對於泌乳素受體比人類生長激素 具有增加的親合力。 具體實例178 :根據具體實例丨77之分離的胜肽，其 中對於泌乳素受體的親合力是根據如此處所說明的分析 (I )而測定。 具體貫例1 79 :根據具體實例1丨5至1 78的任一個之 分離的胜肽，其中該胜肽對於泌乳素受體的結合比起野生 型人類生長激素結合到泌乳素受體，具有至少3倍少的解 離常數（Kd )。 具體實例1 80 ··根據具體實例丨丨$至丨79的任一個之 分離的胜肽，其中該胜肽對於生長激素受體比人類生長激 素具有增加的親合力。 具體貫例181 :根據具體實例180之分離的胜肽，其 中對於生長激素的親合力是根據如此處所說明的分析（） 而測定。 具體貫例1 82 :根據具體實例丨丨5至1 8 i的任一個之 刀每隹的胜肽，其中该胜肽對於生長激素受體的結合比起野 生型人類生長激素結合到生長激素受體，具有至少3倍少 75 200829266 的解離常數（Kd)。 /、豆貝例I83 :根據具體實例n5至1S2的任一個之 分離的胜肽，复盘、、、，、+ ，、為/必孔素受體的拮抗劑。 目 舍 , V、丑貝歹丨1 84 :根據具體實例1 83之分離的胜肽，其 中°亥^几作用是利用如此處所說明的分析（Π )而測定。 具體貝例1 85 ··根據具體實例1 83或具體實例丨84之 刀離的胜肽’其中該拮抗作用是藉由將一個或多個突變導 入至結合位置2而達成，以避免或減少結合位置2與泌乳 素受體的交互作用。 具體貫例1 86 ··根據具體實例1 83至1 85的任一個之 分離的胜狀’其中至少一個或多個該拮抗突變是選自在對 應到序列識別號2的Giyl20之胺基酸殘基中的突變。 具體實例187:根據具體實例186之分離的胜肽，其 中至少一個或多個該拮抗突變是選自G120R或G120K。 具體實例1 88 : —種分離的核酸，其編碼根據具體實 例1至1 8 7的任一個胜狀。 具體實例1 89 ·· —種載體，其包括根據具體實例i 88 的核酸構築。 具體實例19〇 : —種宿主細胞，其包括具體實例188 的核酸構築或具體實例丨89的載體。 具體實例191: 一種抗體，其可專一性地結合根據具 體實例1至1 87的任一個胜肽。 具體實例192:根據具體實例191的抗體，該抗體並 不結合到包括序列識別號1的胺基酸序列之胜肽。 76 200829266 具體實例193 :根據具體實例191或具體實例192的 抗體’該抗體並不結合到包括序列識別號2的胺基酸序列 之胜肽。 具體實例194 ·· 一種醫藥組成物，其包括根據具體實 例1至187的任一個胜肽。 具體實例195 : —種治療乳癌之方法，該方法包括將 根據具體實例1至187的任一個胜肽或根據具體實例194 的調配物投予至有需要的患者。 具體實例196 ·· —種根據具體實例1至丨87的任一個 胜肽之用途，其係用於製備乳癌的治療用醫藥品。 具體實例1 97 : —種根據具體實例1至丨87的任一個 胜肽之用途，其係用於產生乳癌以及前列腺癌的治療用泌 乳素拮抗劑。 實施例： 實施例1 在PRL中的BS1彡鑑定 用於這個實施例中的泌乳素分子是泌乳素的變異物， 其中胺基酸殘基i-u已被刪除，以及其包含突變Qi2s及 G129R。G129R突變以及1-n刪除使結合位置2分裂，而 Q12S突變被導入以確保MetAp的最適活性，以產生更均 質的產物。甲硫胺酸胺基肽酶（MetAp)是負責從新合成 的蛋白質中移除啟動子胺基端的甲硫胺酸之酵素。為了本 說明書之目的’這個變異物將稱為vPRL。 77 200829266 pET32_a(+)表現載體（N〇vagen，麥迪遜，威斯康辛） 疋用於表現所有的蛋白質。重組的hpRL以及突變的 是在大腸桿菌中以包涵體製造。溶解於8M尿素、〇 ι Μ THs、2-20 mM DTT (ΡΗ 8.5)的緩衝液中，以及之後藉由 稀釋於 20 mM Tris、0.05% Tween 20 ( pH 8.0)而再折疊。 蛋白質純化是利用S〇Urce30Q離子交換管柱（Amersham

Bi〇sciences)，然後是大量製備級的陶瓷羥基磷灰石管柱 (BioRad)以及最後在Sephadex G25管柱上的大小區別層 析而進行。 ECD-PRL-R是以兩個稀釋步驟而使其再折疊，首先 疋在0.4 Μ精胺酸（ρΗ 8·5)，然後進一步稀釋於2〇 Tris、〇.〇5%Tween 2〇 (pH 8 〇)中。 酿胺氫/氘交換（HX)是在ECD-PRL-R (泌乳素受體 的殘基25-234 )的存在或不存在之下，藉由將vpR]L以1〇 倍稀釋到含氘的緩衝液（也就是，2〇 mM Tris、15〇 mM NaCl、99%D2〇 ( ΡΗ 7·4 (未校正的數值））而開始。不 含氘的對照組是藉由稀釋到相等含氕的緩衝液而製備。所 有的HX反應都是在30°C進行，並且在12 // M ECD-PRL· R的不存在或存在之下包含6//]^的vPRL變異物。在適當 的日守間間隔，將Ηχ反應的分裝物藉由加入等體積冰冷的 中止緩衝液（1.25 Μ的三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽，利用Na〇H 。周i至pH 2 ·0 )而中止，得到最終pH 2·5(未校正的數值）。 將中止的樣品立即冷凍於液態氮中，並且儲存於_80°C。 將樣品在冷卻的高壓液體層析-質譜儀系統中處理，以 78 200829266 J. Biol. Chem. vPRL胜肽的 快速去鹽以及進行質量分析，如Rand等人

Ml : 23018 ( 2006 )之說明。得自兩個不同 原始數據之實施例是顯示於第2圖。 、胃蛋白酶肽是在不同的實驗中利用標準的ms/ms方 法而鑑定。胜肽同位素被膜的平均f量是利用Exeei空白 表格程式’而從質量鎖定校正的f心數據中測定（利用

MassLynx軟體處理，Waters公司）。對照組樣品的完全 氛化作用是藉由在9(TC併入6小時而達成。對於分析的胜 肽，平均返回交換（也就是’氣損耗）經測量是大約15_2〇 %。 27種胜肽（涵蓋vPRL 一級序列的9〇% )之時程 是在ECD-PRL_R的存在及不存在之下監測（第2及3圖）。 在ECD-PRL-R的存在下於1〇〇〇s Ηχ之後顯示減少的氘併 (>0·3 Da)之vPRL胜肽，繪圖於泌乳素的nmr結構 上，經發現可形成如結合位置丨所定義之局部的表面區域 (第4圖）。 結果，結合位置1被指明為包括泌乳素的片段，其係 由胺基酸殘基 20-36、40-63、66_83、173-1 85 以及 189_199 所組成。 實施例2 赴_员NMR光譜繪製在g素中^^體結合__包^丨之圖譜 蛋白質表現以及純化 用於NMR研究之同位素標示的 ([2H，15N]PRL-G129R 以及是藉 79 200829266 :發酵如同對應未標示的蛋白質，利用包含2H2〇以及適 “票不的氮及碳源氨鹽及％各葡萄糖〜D_葡萄 糖）之生長培養液而製備。 NMR樣品的製備 2 ^辰度範圍在 0.2-0.5 mM 間的[2H，15N]pRL_G129R 以及

[H’ C5 N]PRL_G129R 樣品，是在 2 mM NH4HC〇3、J mM NaN3以及i〇% (體積/體積）的ίο ( pH 8 〇)(代表性 的nmr緩衝液）中製備。在[2h，15n]prl_gi29r (或 [2H，13C，15N]PRL-G129R)以及泌乳素受體間之複合體（人 類泌乳素受體的可溶性細胞外功能域）是藉由以1 : 1.2的 比例混合[2H，15N]PRL-G129R以及PRLR而製備。這個由 兩α卩分構成的衩合體是利用sUper(jex 75製備級26/6管柱， 藉由在 2 mM NH4HC03 及 50 mM NaCl ( pH 8.0)中膠體過 濾而純化。最後，將複合體濃縮並且交換至NMR緩衝液。 對於排布實驗以及化學位移擾動測量，緩衝液包含1 〇 %的 2H2〇。對於交叉飽和實驗，緩衝液包含90-95%的2H20， 以中止在[2H，15N]PRL_G129R中可能的醯胺質子介導之旋 轉擴散。 NMR實驗 NMR實驗是在配備三共振低溫探針的Varian Inova 800 MHz儀器或配備室溫三共振探針的Bruker Avance 600 MHz 光譜儀上，·於 35°C 紀錄。aD^H^N-HSQC、20-4,15^ TROSY、15N-剪輯的 3D-NOESY-HSQC、HNCO、HNCA、 NHCOCA、HNCACB以及HNCOCACB光譜是利用標準的 200829266

Bruker或Varian脈衝序列而紀錄。光譜是藉由Felix軟體 (Accelrys軟體公司）而進行，波峰是藉由Sparky軟體（T D. Goddard 及 D.G. Kneller，SPARKY 3，加州大學，舊金山） 而挑選。骨幹排布是藉由 AutoAssign軟體（D.E. Zimmerman > H.N.B. Moseley、C.A_ Kulikowski、G.T. Montelione及Rutgers，紐澤西州立大學）而協助。 交叉飽和實驗基本上是如Takahashi H.等人，Nature Struct. Biol· 7 : 220-223 ( 2000)之說明而紀錄。因此，脂 肪族共振的飽和疋猎由一連串長度15 ms，以0.9 ppm施 加的軟性WURST-形狀之反相脈衝而達成。參考光譜是相 同地紀錄，除了位移到-5 ppm用於飽和的補償之外。光 譜是以插入的方式而紀錄。 在PRL及PRL-G129R中的骨幹醯胺基團之排布 對於人類泌乳素在pH 8.0及37°C的化學位移排布已 由Teilum等人寄存於BioMagResBank，登記編號6643 (厂 Mol· Biol· 351 : 810-823 ( 2005 ) )。182 個主鏈醯胺基團 中的1 3 7個被排布。 [2H，15N]PRL-G129R 的1H，15N-HSQC 光譜是在不同溫 度獲得，以及在 35°C 時，[2H，15N]PRL-G129R 的1H，15N-HSQC 光譜非常類似於Teilum ( 2005 )所發表的15N-PRL光譜。 部分的骨幹醯胺信號轉移它們在PRL-G129R光譜中相對於 PRL光譜的位置，然而，主要的位移卻可直接歸因於g 1 29R 突變。骨幹排布是藉由標準的排布實驗而證實，包括 [2H，15N]PRL-G129R 的 HNCO、HNCACO、HNCA、HNCOCA、 81 200829266 NHCACB 及 HNCOCACB 以及 15N_剪輯的 3D-NOESY-HSQC 光譜，其利用在骨幹醯胺基團間觀察到的連續NOE而作為 進一步確效排布（表1 )。 在與泌乳素受體複合的[2H，15N]PRL-G129R中之骨幹排布 在與泌乳素受體複合的PRL-G129R中之骨幹醯胺共 振，是利用一組TROSY為基礎的3D三共振實驗而排布， 其包括由3D 15N-剪輯的NOESY-HSQC實驗所補充之 HNCO、HNCA、NHCOCA、HNCACB 以及 HNCOCACB。 骨幹排布是顯示於表1。 利用化學位移擾動方法繪製結合界面的圖譜 1H，15N-TROSY 光譜是對於[2H，15N]PRL_G129R 以及 PRLR間的1對1複合體在800 MHz而紀錄。因為泌乳素 受體是沒有標示的，因此，只有對應到複合體的泌乳素部 分之信號被觀察到。參考光譜是在相同條件下對於 [2H，15N]PRL-G129R 而獲得。 對於在PRL-G129R中游離及受體結合狀態的骨幹醯 胺質子之化學位移擾動，是從游離的PRL-G129R及結合到 泌乳素受體的PRL-G129R之骨幹排布而計算（表1)。 對於受到泌乳素結合到泌乳素受體所誘發的每個胺基酸殘 基，觀察到的化學位移差異是透過圖表而顯示於第7圖。 表1

對於游離的PRL-G129R以及與PRLR複合的PRL-G129R

之醯胺質子（Η )、氮（Ν )、羰基碳（CO ) 、α -碳（C α )以及冷-碳（C /3 )的骨幹化學位移（5 )排布。列出 82 200829266 的是化學位移差異（（5、结合-δ游離），係對於醯胺質子以及 氮（分別是△ 5 η以及△ (5 N )，從其中，組合的質子-氮化 2+ ( O.lx 學位移差異指數（ACS)是以ACS二[(△ 5 H) △ 5 N) 2]0·5 而計算。 游離的 PRL-G129R PRL-G129R/PRLR 複合«

殘基 δΗ δΝ 3c〇a δ〇α δΗ δΝ ^c〇a δ〇α δ€β △δΗ L1 P2 13 8,07 121,8 176,6 61,0 38,0 8,08 121,9 176,6 61,0 38,0 0,01 C4 P5 G6 G7 A8 A9 R10 C11 Q12 V13c T14c 7,95 8,31 122,4 118,0 176,1 176,4 62,3 61,8 32.2 70.3 L15 R16 D17 7,65 120,7 177,7 57,2 40,5 7,65 120,8 177,6 57,1 40,7 0,00 L18 8,11 121,2 179,2 57,8 41,5 8,17 121,3 179,5 57,9 41,2 0,06 F19 8,49 119,5 179,8 62,7 38,9 8,52 119,6 179,6 62,9 38,7 0,03 D20 8,56 121,5 178,2 57,5 39,7 8,60 120,8 178,4 57,4 39,8 0,04 R21 7,77 118,5 179,2 57,6 28,9 7,76 118,1 179,1 57,3 -0,01 A22 8,19 124,1 178,8 55,2 17,4 8,34 123,8 178,8 55,5 17,1 0,15 V23 8,11 116,4 178,3 64,1 30,8 7,87 114,5 177,9 63,3 -0,24 V24 7,42 123,3 179,1 66,2 31,0 7,43 123,8 179,2 66,5 31,0 0,01 L25 7,64 121,6 179,2 57,4 42,2 7,67 121,2 179,4 57,3 0,03 S26 9,23 118,0 178,9 62,3 61,5 9,65 119,7 178,7 62,3 61,0 0,42 H27 8,14 127,4 178,1 59,5 29,4 8,12 131,2 178,4 61,1 -0,02 Y28 7,88 122,6 177,4 59,7 38,2 7,84 122,6 177,5 60,0 39,5 -0,04 129 8,83 120,5 178,0 65,7 37,8 9,07 120,3 181,1 65,7 37,1 0,24 H30 8,21 122,2 178,4 58,5 27,7 7,98 120,4 178,8 59,1 26,2 -0,23 N31 8,13 122,7 177,9 56,6 37,5 8,08 121,1 177,6 57,1 38,2 -0,05 L32 8,54 122,2 177,6 57,5 42,3 8,36 121,1 177,4 57,3 42,2 -0,18 S33 8,58 117,7 179,6 62,1 62,5 8,27 118,1 179,4 62,2 -0,31 S34 8,05 122,6 177,6 62,0 62,6 8,17 122,3 177,6 61,8 0,12 E35 8,29 124,9 176,8 58,9 29,0 8,12 124,4 176,7 58,9 28,9 -0,17 M36 8,82 121,0 179,2 59,6 32,8 8,72 121,2 179,1 59,7 32,4 -0,10 F37 7,98 119,4 177,4 61,8 38,4 8,08 119,4 177,2 61,9 38,1 0,10 S38 8,21 115,9 176,5 61,7 62,8 8,22 115,9 176,2 61,7 62,7 0,01 E39 8,38 122,5 177,2 58,5 28,7 8,23 122,3 177,1 58,5 28,6 -0,15 F40 8,35 122,8 178,8 61,8 39,8 8,30 122,7 178,7 61,8 40,0 -0,05 D41 8,68 121,3 178,1 55,6 41,7 8,74 121,8 176,8 55,2 42,1 0,06 K42 8,04 118,6 178,8 58,7 31,5 8,03 118,1 178,8 58,7 31,6 -0,01 R43 7,32 117,7 178,1 56,9 29,9 7,21 117,7 178,0 56,9 29,5 -0,11 Y44 8,10 116,1 177,5 59,5 40,3 8,11 115,4 177,6 59,4 0,01 T45 H46 7,67 8,50 110.3 125.4 176,6 175,8 62.7 57.8 69,0 28,6 7,70 110,6 174,9 61,7 67,9 0,03 G47 R48 G49 比較 ΔδΝ ACSb

0,10 0,03 0,10 0,07 0,10 0,04 -0,70 0,22 -0,40 0,13 -0,30 0,18 -1,90 0,65 0,50 0,16 -0,40 0,13 1,70 0,68 3,80 1,20 0,00 0,04 -0,20 0,25 -1,80 0,61 -1,60 0,51 -1,10 0,39 0,40 0,33 0,30 0,15 -0,50 0,23 0,20 0,12 0,00 0,10 0,00 0,01 -0,20 0,16 -0,10 0,06 0,50 0,17 -0,50 0,16 0,00 0,11 -0,70 0,22 0,30 0,10

83 200829266

游離的PRL-G129R PRL-G129R/PRLR 複合髏 比較 殘基 δΗ δΝ 5Ca δΗ δΝ 5〇〇a δ〇α δ〇β △δΗ △δΝ F50 151 7,56 122,8 176,4 61,1 37,4 8,11 122,4 178,2 62,9 ca,37 0,55 •0,40 T52 7,75 117,0 176,5 62,3 68,8 7,02 113,3 176,2 64,0 68,6 -0,73 -3,70 K53 7,07 120,4 176,1 55,5 31,8 A54 7,32 124,0 176,2 51,7 17,4 155 7,89 120,6 177,7 60,3 37,9 6,94 120,1 179,2 60,1 36,7 -0,95 -0,50 N56 10,36 124,1 176,6 54,5 37,1 S57 7,95 113,5 176,1 59,8 65,2 C58 8,42 123,6 53,0 34,2

H59 _ Τ60 7,40 110,0 176,4 61,6 67,9 561 562 7,88 119,8 176,9 58,0 7,86 119,6 176,5 61,1 64,1 -0,02 -0,20 Η L63 7,50 124,6 174,9 54,0 41,6 7,49 125,1 175,0 53,8 42,2 -0,01 0,50 0,16 Α64 8,32 128,3 176,3 51,5 17,0 8,39 129,2 176,0 51,4 16,6 0,07 0,90 0,29 Τ65 Ρ66 8,00 114,7 176,9 57,7 68,4 8,09 114,9 177,0 57,4 68,0 0,09 0,20 0,11 Ε67 9,04 125,4 179,0 55,7 30,8 D68 7,61 118,6 175,9 52,6 42,2 7,63 115,5 173,8 52,4 42,7 0,02 -3,10 0,98 Κ69 8,16 121,9 175,3 58,7 30,9 H· Ε70 8,32 122,3 177,9 58,9 28,2 7,76 121,2 177,9 59,0 27,8 -0,56 -1,10 0,66 Q71 8,48 120,3 179,2 57,8 28,1 9,01 121,0 179,9 58,3 28,0 0,53 0,70 0,57 Α72 7,92 123,3 179,2 54,1 17,6 8,03 122,6 180,1 54,5 17,5 0,11 -0,70 0,25 Q73 8,02 117,4 178,8 57,3 28,0 8,22 117,4 178,9 57,8 28,0 0,20 0,00 0,20 Q74 7,37 116,9 176,9 55,3 28,4 7,29 116,3 177,4 55,5 28,5 -0,08 •0,60 0,21 Μ75 7,26 121,9 176,4 55,5 32,6 7,02 122,4 176,1 55,3 31,7 -0,24 0,50 0,29 Ν76 Ε77 8,96 125,5 175,9 53,1 38,9 8,96 127,9 176,0 53,6 38,9 0,00 2,40 Κ78 8,17 121,9 176,9 59,5 30,7 8,20 123,5 176,2 59,8 30,9 0,03 1,60 0,51 D79 7,88 121,7 178,6 56,4 39,7 7,90 121,4 178,7 60,0 39,6 0,02 -0,30 0,10 F80 8,29 123,3 178,9 59,2 39,0 8,45 124,0 178,9 58,8 0,16 0,70 0,27 L81 8,29 119,9 178,8 528,2 40,9 8,35 119,4 179,2 58,2 40,4 0,06 -0,50 0,17 S82 8,10 114,8 178,5 61,6 62,7 7,87 114,9 178,7 61,6 -0,23 0,10 0,23 L83 7,94 125,4 176,9 57,8 41,3 8,06 125,1 177,0 57,7 41,3 0,12 -0,30 0,15 184 7,85 120,0 177,7 65,7 37,8 7,95 120,4 178,5 65,8 37,8 0,10 0,40 0,16 V85 7,83 119,2 177,6 67,2 30,8 7,81 119,6 177,6 67,4 30,4 -0,02 0,40 0,13 S86 8,47 117,7 62,6 63,5 8,36 117,7 177,3 62,6 62,3 •0,11 0,00 0,11 187 8,41 123,2 176,8 66,0 37,6 8,38 122,7 176,6 65,9 37,7 •0,03 -0,50 0,16 L88 8,10 120,9 179,0 58,4 42,3 8,19 121,3 179,4 58,2 42,1 0,09 0,40 0,16 R89 8,94 119,7 179,9 59,0 28,9 8,95 119,8 179,8 58,9 28,9 0,01 0,10 0,03 S90 7,88 116,0 179,7 60,6 63,1 7,87 116,3 179,8 60,5 63,1 -0,01 0,30 0,10 W91 7,72 123,3 175,7 59,1 29,5 7,73 123,3 175,5 59,1 29,3 0,01 0,00 0,01 Ν92 7,31 121,4 176,5 57,4 38,4 7,30 121,2 176,6 57,4 38,3 -0,01 -0,20 0,06 Ε93 Ρ94 9,18 121,0 177,2 60,6 26,5 9,17 121,2 177,2 60,7 26,4 -0,01 0,20 0,06 L95 7,78 115,4 178,3 57,8 40,6 7,68 115,4 178,2 57,9 41,1 -0,10 0,00 0,10 Υ96 7,80 121,9 178,3 60,8 37,2 7,78 121,8 178,2 60,7 36,9 -0,02 -0,10 0,04 Η97 8,16 121,1 179,3 59,5 8,19 121,4 179,3 59,8 0,03 0,30 0,10 L98 8,80 123,6 176,9 58,3 41,0 8,79 123,6 176,9 58,3 40,9 -0,01 0,00 0,01 V99 7,73 118,1 177,6 66,9 31,1 7,67 117,9 177,6 66,9 31,0 -0,06 -0,20 0,09 Τ100 7,57 115,1 177,4 66,4 68,4 7,58 115,1 177,3 66,4 68,4 0,01 0,00 0,01 Ε101 8,84 122,9 177,6 58,1 28,8 8,92 122,7 177,7 58,2 28,7 0,08 -0,20 0,10 V102 8,47 121,7 180,4 65,6 30,1 8,51 122,1 180,5 65,7 29,6 0,04 0,40 0,13 R103 8,19 120,7 178,6 58,9 29,4 8,17 120,7 178,6 58,9 29,4 •0,02 0,00 0,02 G104 7,42 105,3 177,7 44,5 7,42 105,3 177,7 44,5 0,00 0,00 0,00 Μ105 7,48 123,3 174,4 55,8 32,6 7,49 123,5 174,4 55,9 32,5 0,01 0,20 0,06 Q106 8,60 125,3 176,4 57,5 27,9 8,58 125,4 176,4 57,5 27,8 -0,02 0,10 0,04 Ε107 8,66 120,7 176,8 55,6 28,0 8,66 120,8 176,8 55,6 27,9 0,00 0,10 0,03 Α108 7,77 126,1 175,7 50,5 17,7 7,76 126,0 175,6 50,5 17,6 -0,01 -0,10 0,03 P109 84 200829266 游離的 PRL-G129R PRL-G129R/PRLR 複合« 比較 δΗ δΝ 3c〇a 5Ca δΗ δΝ 8c〇a δ〇α δ〇3 △δΗ △δΝ 7,25 116,0 179,7 63,6 37,1 7,26 115,8 179,6 63,7 36,7 0,01 -0,20 0,06 7,83 122,2 176,5 58,1 40,5 7,84 122,1 176,4 58,1 40,3 0,01 -0,10 0,03 8,48 113,1 177,8 61,2 62,4 8,47 112,8 177,7 61,1 62,6 -0,01 -0,30 0,10 7,19 122,3 177,8 59,0 32,1 7,17 122,6 178,1 59,1 -0,02 0,30 0,10 8,29 124,9 177,1 55,3 16,8 8,30 125,0 177,0 55,4 16,7 0,01 0,10 0,03 8,24 118,7 178,8 65,5 31,6 8,25 118,5 178,8 65,5 31,6 0,01 -0,20 0,06 7,56 122,3 179,1 58,6 29,3 7,45 122,5 179,0 58,6 -0,11 0,20 0,13 8,94 122,1 178,9 66,0 37,2 8,94 122,2 178,9 66,1 36,9 0,00 0,10 0,03 8,42 126,2 178,6 60,4 28,1 8,47 125,9 178,8 60,5 28,0 0,05 -0,30 0,11 7,72 119,6 179,9 58,7 28,9 7,67 119,8 178,0 60,5 29,1 -0,05 0,20 0,08 9,03 117,9 179,6 57,4 26,9 9,05 117,8 179,6 57,4 26,8 0,02 -0,10 0,04 8,51 118,3 179,2 67,5 8,53 118,9 179,1 67,5 0,02 0,60 0,19 7,17 123,2 176,9 59,9 31,1 7,18 123,2 176,8 60,0 31,2 0,01 0,00 0,01 7,79 120,8 179,9 58,3 7,71 120,6 180,0 59,2 29,2 -0,08 -0,20 0,10 8,83 124,3 179,8 57,4 39,4 8,80 124,6 179,8 57,5 39,6 -0,03 0,30 0,10 8,53 123,5 178,3 58,4 40,0 8,50 123,3 178,3 58,2 -0,03 -0,20 0,07 7,85 119,5 59,1 28,2 7,82 120,0 177,7 58,9 29,0 -0,03 0,50 0,16 7,71 119,4 58,5 29,0 7,70 119,3 179,9 58,6 -0,01 -0,10 0,03 8,7〇 118,9 178,6 55,2 28,3 8,66 118,9 178,5 55,1 28,3 -0,04 0,00 0,04 8,73 121,6 179,0 59,7 28,6 8,65 121,5 179,0 59,7 28,5 -0,08 -0,10 0,09 7,51 122,6 180,0 57,3 40,9 7,45 122,2 180,1 57,3 40,8 -0,06 -0,40 0,14 7,97 122,8 180,0 66,3 37,3 8,11 123,0 179,9 66,5 37,4 0,14 0,20 0,15 8,67 121,2 67,3 30,8 8,69 120,9 178,1 67,4 31,0 0,02 -0,30 0,10 7,77 114,4 177,7 61,1 63,1 7,74 114,5 177,7 61,1 63,0 -0,03 0,10 0,04 7,47 118,9 175,0 56,8 28,9 7,46 118,9 175,0 57,0 28,6 -0,01 0,00 0,01 7,97 117,9 177,3 63,5 32,5 7,98 117,8 177,4 63,6 32,3 0,01 -0,10 0,03 8,56 119,8 175,6 53,6 29,8 8,62 119,8 175,5 53,6 29,8 0,06 0,00 0,06 9,11 121,1 177,5 56,6 28,2 7,94 118,9 176,7 62,7 69,4 7,91 119,2 176,6 62,8 69,3 -0,03 0,30 0,10 8,29 127,0 174,3 55,6 32,4 8,30 127,3 174,3 55,5 32,4 0,01 0,30 0,10 8,39 123,4 176,4 56,2 29,5 8,42 123,5 176,4 56,2 29,5 0,03 0,10 0,04 8,36 121,1 176,2 52,9 38,4 8,38 121,1 52,9 38,3 0,02 0,00 0,02 8,31 123,7 175,0 56,1 29,7 8,37 123,8 175,0 56,1 29,6 0,06 0,10 0,07 7,99 123,4 176,1 60,4 38,0 7,99 123,2 176,1 60,4 37,9 0,00 -0,20 0,06 7,44 124,6 175,0 54,3 37,6 7,37 124,2 174,9 54,1 37,7 -0,07 -0,40 0,14 8,14 124,0 176,0 61,4 32,6 8,19 124,4 175,9 61,5 32,4 0,05 0,40 0,14 8,78 129,6 176,1 56,8 28,1 8,78 129,9 176,0 56,9 27,8 0,00 0,30 0,09

殘基 E110

Alll 1112 L113 S114 K115 A116 V117 E118 1119 E120 E121 Q122 T123 K124 R125 L126 L127

E128 R129 M130 E131 L132 1133 V134 S135 Q136 V137 H138 P139 E140 T141 K142 E143 N144 E145 1146 Y147 P148 V149 W150 S151 G152 L153c 7,37 124,9 174,0 58,0 Ρ154 S155 7,47 114,6 179,1 60,4 62,7 L156 7,58 121,2 175,1 56,0 40,8 Q157 7,29 115,6 177,8 54,7 27,7 Μ158 7,10 121,0 176,1 55,5 32,6 Λ〇7 121,3 176,2 55,8 32,6 -0,03 0,30 0,10 Α159 8,22 125,2 175,8 53,2 18,5 D160 7,82 119,2 178,2 53,4 41,8 7,79 119,4 178,4 53,6 42,0 -0,03 0,20 0,07 Ε161 8,74 128,0 175,7 60,0 29,5 8,74 128,7 175,7 60,1 29,3 0,00 0,70 0,22 Ε162 8,54 120,0 177,8 59,9 28,3 8,58 120,3 177,7 60,1 28,7 0,04 0,30 0,10 S163 8,07 118,0 179,5 61,7 62,7 8,01 117,2 179,2 61,8 62,8 -0,06 -0,80 0,26 R164 8,32 126,1 177,0 59,5 29,8 8,33 126,4 177,0 59,3 29,8 0,01 0,30 0,10 L165 8,77 119,6 178,4 58,1 40,9 8,77 119,3 178,3 57,8 41,1 0,00 -0,30 0,09 S166 8,02 115,6 180,0 61,5 62,7 7,81 114,7 179,3 59,8 62,8 -0,21 -0,90 0,35 Α167 7,88 127,0 176,3 54,9 17,8 7,73 124,5 175,8 54,9 17,8 -0,15 -2,50 0,80 Υ168 8,46 121,7 62,4 39,1 8,30 120,8 181,9 62,3 39,3 -0,16 -0,90 0,33 Υ169 8,74 122,0 177,3 62,3 38,5 8,82 122,6 177,1 62,4 38,4 0,08 0,60 0,21 85 200829266

殘基 N170 L171 L172 H173 C174 L175 R176 R177 D178 S179 H180 K181 1182 D183 N184 Y185 L186 K187 L188 L189 K190 C191 R192 1193 1194 H195 N196 N197 N198 C199 游離的PRL-G129R δΗ δΝ 5c〇a δ〇α δ〇3 8,49 117,8 177,4 56,6 38,9 8,08 123,4 177,3 58,7 41,9 8,53 119,6 178,9 57,4 40,7 8,95 124,9 180,1 60,1 29,8 8,62 121,6 178,7 58,8 38,9 8,69 125,8 175,9 57,3 39,8 7,88 123,9 179,2 59,1 28,8 7,80 121,2 177,7 58,6 29,3 8,96 123,6 179,6 57,1 8,64 117,8 178,6 61,8 62,5 7,71 127,2 177,4 58,8 29,8 7,69 120,6 177,0 59,3 31,3 8,13 117,5 177,2 64,8 36,6 7,34 120,2 176,9 57,3 41,8 7,86 117,8 177,5 55,9 37,7 9,06 121,5 178,9 55,9 36,5 8,86 122,6 58,0 41,0 7,89 120,7 60,3 31,5 7,76 123,0 179,9 57,6 40,9 8,62 122,6 179,8 57,4 41,3 8,51 122,1 178,2 59,6 31,7 7,70 118,5 178,1 59,7 41,3 8,05 120,7 176,6 58,9 30,4 8,22 118,3 178,0 63,4 37,6 7,82 118,8 176,8 60,2 35,4 7,18 117,7 176,9 55,4 29,5 7,99 120,8 174,5 52,7 7,75 124,9 174,0 56,3 44,6 PRL-G129R/PRLR 複合« δΗ δΝ Sc〇a δαα 8,94 119,7 177,5 55,7 37,4 7,95 124,5 178,1 58,9 42,0 8,38 120,1 178,9 57,5 41,0 9,43 126,2 180,3 59,3 27,4 8,88 124,6 179,2 59,0 8,80 126,6 175,6 56,9 39,9 8,06 125,4 179,8 59,9 7,16 119,7 176,4 58,9 30,2 8,99 121,4 177,3 56,8 37,9 8,46 114,7 179,0 61,1 7,44 129,5 177,6 62,6 29,3 7,84 123,1 177,0 59,2 29,8 7,98 116,5 176,4 64,1 36,4 6,93 119,5 177,2 56,5 41,6 8,38 120,8 55,0 39,3 9,07 120,4 56,0 36,0 8,66 122,9 177,8 58,0 41,6 8,19 122,9 179,0 60,4 7,68 123,8 179,7 56,7 42,6 8,61 121,5 179,3 57,0 41,6 8,96 123,0 178,5 59,6 31,9 7,62 119,3 179,4 61,0 41,7 8,85 123,9 177,1 60,0 31,5 8,86 118,0 178,2 64,0 38,0 7,91 118,2 177,2 59,4 34,2 6,58 115,0 177,6 54,6 7,32 120,3 176,3 54,3 36,6 9,21 114,0 174,3 53,8 36,2 7,35 117,9 174,1 52,0 38,8 8,80 127,1 176,1 58,2 43,6 比較ΔδΗ ΛδΝ Acsb 〇'45 〇,75 '°43 0,37 °45 〇,5〇 0,22 〇'48 ^3〇 〇#63 〇,26 3,〇〇 〇/98 041 _ 〇,28 048 U0 〇,5ι -〇'64 -1，50 〇/8〇 0,03 ·2,2〇 0,70 '0#18 -3,10 1,00 -〇'27 2,30 0；78 0/15 2,50 0,80 -〇45 -ΐ,〇〇 035 -〇,41 -〇,7〇 〇,47 〇,52 3,〇〇 1,08 〇t〇1 -U〇 0/35 ·0,20 〇,30 〇/22 〇,30 2,2〇 〇,76 ’8 〇/8〇 〇#27 〇,35 〇,45 〇'9〇 〇/53 -〇'〇8 0,80 〇；27 _ 3,20 1/29 _ -0,30 〇,65 0,09 -〇,60 0,21

-〇,64 -2,90 1/12 1/05 2,2〇 1,26 對於前面的殘基之羰基化學位移 3組合的質子-氮化,位移差異指數（ACS)是以Acsy (△〜）2 (0.1

χγΝ) L而$算。紅色格子標記在游離或結合狀態都沒有獲得骨幹醯 排布的殘基，育色及綠色格子標記分別僅對於游離或結合狀態獲得与^布^ 殘基。對應到脯胺酸的格子（沒有骨幹酿胺質子出現）是以灰色呈 ^排布是暫時性的。 ' 利用交又飽和方法繪製結合界面的圖譜 圖譜 以及 紀錄 對於繪製PRL-G129R以及PRLR之間接觸表面的不同 ，係應用交叉飽和方法。因此，將[2H，15n]PRL-G1 29R PRLR間之複合體的一對2DJh，15N-TROSY光譜予以 ’在脂肪族區域中應用飽和的光譜（於〇·9 ppm )以 及在非共振區域中應用飽和場的參考光譜（_ 5 ppm )。交 叉飽和實驗是以不同長度的飽和期間（0 · 5及1秒）以及 86 200829266 在緩衝液中不同含量的屯2〇 (90及95%)而紀錄。從95 %的屯2〇以及〇_5秒飽和期間的實驗中所得到的光譜是顯 示於第8圖。 測量在兩個光譜中的波峰強度，並且計算在飽和光譜 中的波峰強度相對於在參考光譜中的對應波峰強度之比 例。在飽和光譜中顯示強烈衰減的信號可歸因於在pRL_ G129R中的殘基，其對應的醯胺質子是非常接近（<7人距 離）在受體鏈中的質子，因此對於受體的交互作用可能是 重要的。 在交叉飽和實驗中，醯胺信號的最強烈衰減（> 4〇% ) 是在以下殘基中觀察道： S26、S33、155、N56、D68、K69、M130、K142、R177、 D178、K181、1182、D183、L189、1194 以及 C199。 強烈的哀減（2 5 - 4 0 % )也在許多其他的殘基中觀察到， 包括 151、E67、A72、S90、L98、V99、Q106、V117、L126、 L127、L132、T141、Y169、S179、H180、L186 以及 L188。 來自交叉飽和實驗的完整數據是顯示於第9圖，其中 對於每個胺基酸殘基之醯胺質子信號所觀察到的信號強度 比例，是對殘基數目而作圖。顯示最強烈衰減（> 40% ) 的殘基在第10圖的3D泌乳素結構（pdb-代碼1RW5 )上 繪圖。 在PRL-G129R以及PRLR間的結合界面之說明 分佈在整個一級序列的許多殘基在化學位移擾動實驗 (chemical shift perturbation experiment)中被記錄為擾動 87 200829266 的。這些殘基是受到在結合界面處與受體的直接接觸而影 響，或受到由於結合所誘發的的繼發效應（構形改變）而 影響。許多的擾動（包括數個埋藏的殘基）顯示泌乳素的 結構重組是被受體結合而誘發。然而，結構擾動的重要性 不會從目前的數據中被推論，並且僅可能是微小的。

Teilum ( 2005 )觀察到，因為醯胺質子的彈性以及快 速父換，因此，醯胺基團的NMR信號在蛋白質的許多區 域的伸展中是不存在的。因此，除了 13之外，沒有醯胺共 振在游離的泌乳素中之殘基1_15觀察到，這也是游離的 PRL-G129R以及在PRL-G129R及PRLR間之複合體的事 貫。這表示彈性的胺基端部分並不涉及結合或不受結合而 影響。在泌乳素中，於NMR靜止區域中被誘發的也是螺 旋1及螺旋2間之圈環部分（H46-H59 )、螺旋3及螺旋4 間之圈環部分（S151-A159)以及C-端片段（H195-N198)。 如弟7圖（綠色條棒）所示’位於這些區域中的許多殘基 (I51-S57 及 H195-N198)，在 PRL-G129R 及 PRLR 間之 複合體中顯示醯胺質子共振，代表它們變得被保護、穩定 化’或藉由部分其他工具保護，以避免在複合體形成之後 的溶劑交換。因此，這些觀察特別指出兩個區域（I5 1-s57 以及H195-C199)對於受體的交互作用是重要的。 交叉飽和的數據可用於鑑定在PRL-G129R中與受體 直接接觸的殘基。交叉飽和實驗的結果是在第1〇圖的3D 泌乳素結構上繪圖。 由NMR方法所決定的整體位置1結合界面，一般是 88 200829266 與以鑑定對受體結合是重要的殘基為目的之突變實驗的结 果一致（Goffin V.等人，Mol. Endocrinol. 6 ·· 1381-1392 ( 1992 )，以及 Kinet S.等人，J· Biol. chem. 271 : 14353-14360 ( 1996 ))。 然而，在PRL-G129R/PRLR複合體中的其他重要交互 作用，卻由NMR數據而顯示出。令人驚舒地，c_端的半 胱胺酸（C199)被觀察到非常強烈的衰減，其最有可能與 受體分子直接接觸。涉及到PRL-G129R的C_端片段之提 議的受體交互作用，是進一步被上述對於H195-N198片段 所觀祭到的結構穩定化作用以及減少的酿胺質子交換率而 支持。此外，位於螺旋1及螺旋2間之圈環中的155及N56， 也觀察到強烈的衰減，再次與I51-S57區域中的醯胺質子 被穩定化及保護以避免在受體複合體形成之後的溶劑交換 —致° 資施例3 兩個熱點資料庫是利用PRL G129R作為模板，以錯 誤傾向的PCR而產生。將資料庫以閃爍親近分析（SpA) 而篩選。大約1 %標的物（hit )被擇優而用，並以閃爍親 近分析而確認。將閃爍親近分析確認所鑑定的大約1 〇%標 的物予以純化，並以Biacore分析以及細胞為基礎的生物 刀析而分析。兩個標的物[PRL Q73L，M75T，N76S，F80L， Gl29R]以及[prl S33A，Q73L，G129R，K190R]經鑑定具有 比野生型泌乳素更高的親合力，並且具有比PRL G129R高 6至8倍的拮抗劑活性。此外，以下的位置也被發現對於 89 200829266 泌乳素對泌乳素受體的親合力具有正向的影響·· L25Q、 Y28N、N31S、S33A、D68N、Q73L、M75T、N76S、F80L 以及 S179T、K190R。 生： 資料庫 LibMixNew是根據EZclone策略而產生 (Genemorphll EZclone 功能域致突變套組，stratagene 目 錄編號200552 )。將錯誤傾向PCR所產生的引子Lib23-83 以及Libl73-199之混合物使用作為巨大引子，以用於pfu 聚合酶的環繞PCR。在DpW消化之後，進行6個不同的 反應，將3//1的PCR產物轉形到5〇/ζι的DH5勝任細胞， 在37 C回收20分鐘，於室溫鋪在LBA培養盤隔夜。從所 有的培養盤中收集大約50,〇〇〇個菌落，以用於質體純化， 可回收10// g的質體。將1〇〇 ng轉形到宿主菌株〇rigami， 在37°C回收20分鐘，在37°C鋪在LBA培養盤隔夜，以得 到用於篩選的選殖株。根據〇rigami細胞的序列分析結果， 資料庫的突變效率是86%。 方法： "藉由Qpix2菌落挑選器將選殖株接種至96槽孔深培 養 > 中纟37C培養隔夜而製備菌種，以此方式，可將菌 種的細胞密度常態化到0D_為2〇的飽和階段。藉由液 體操作器，將20 // 1的菌插作& μ | , 围檀k隔仪培養的深孔培養盤中轉 移到96槽孔深培養盤中230 ^ 1的τ π Δ μ、， ， 1的[BA培蚕液。將所有的 培養盤在搖晃器錐形瓶中於3 7。厂+ 立莫 — 曰 T趴j / C培養，同時以220 rpm搖 晃2·5小時，至〇D6〇〇 = 〇 q，LV壯上古、士从 以1填液體分散器將10// 1 90 200829266 的500 #M IPTG母液加到每個槽孔，將所有以個％槽孔 深培養盤在搖晃器巾於25t培養，同時以22()㈣搖晃隔 夜（16小時）。

BirA-Ser-PRLR ( 1·210 )之見嚴二^ 將 pET3 9b-BirATag-Ser-PRLR( 1-210) /大腸桿菌 BL21 (DE3)在補充25//g/ml的康那黴素以及1〇//g/ml的氯 Μ素之LB培養液中’於37°C培養至光學密度〇·8，並且 將細胞以0_5 mM IPTG及1〇0//Μ生物素誘發6小時（37 °C，250 rpm )。將細胞沈澱物藉由離心而回收，再懸浮於 緩衝液中（20 mM Tris( pH 8·〇)、5 mM EDTA、2 mM DTT、 0·05 % Tween 20 )，並以細胞破碎器（z_plus，c〇nstant Systems )而破壞。將包涵體沈殿，並以loo Tris、pH 8.0、 8 M尿素、5 mM DTT而溶解。將溶解的材料藉由離心而 使澄清，然後於再折疊缓衝液（20 mM Tris ( pH 8.0 )、〇.〇5 % Tween 20、0·5 mM GSSH、0.1 mM GSSG)中稀釋 20 倍， 並於16。(：授拌65小時。再折疊的蛋白質是以QHP瓊脂糖 (GE )而純化，然後再以SoftLink™軟性釋放抗生物素蛋 白樹脂（Promega )進行親合力純化。 SPA分析： 在96-槽孔盤中的細胞是藉由離心而回收。以溶解緩 衝液（CelLytic Express，Sigma )而將細胞沈殿物再懸浮， 並且於室溫停留1小時以完成溶解。將細胞溶胞產物以純 水稀釋3次。將1 5 // 1的溶胞產物加到85 // 1的分析緩衝 液（50 mM Tris ( pH 8.0) 、0.05% Triton X-100、0.2% 牛 91 200829266 血清白蛋白），其包含〇 ·3 mg的鍵菌素抗生物素蛋白s pA 小珠（RPNQ0066V，GE ) 、〇. 1 # Ci的氚標示的野生型泌 乳素以及150 nM BirA-Ser-PRLR ( 1-210)。於室溫停留3 小時，並以冷光計數器（MicroBeta TriLux，PerkinElmer ) 而計數。液體的移動是以液體操作器（Biomek fx， Beckman)而進行。 標的物之純化： 將pET32_PRL突變物（標的物）/大腸桿菌〇rigami 在補充100 // g/ml氨苄青黴素的LB培養液中，於37°C培 養至光學密度0.8〜1.0,並將細胞以50// M IPTG誘發隔夜。 細胞沈殿物是藉由離心而回收，然後以溶解緩衝液 (CelLytic Express，Sigma )而溶解。將細胞溶胞產物藉 由離心而使澄清，並且以Sei-PRLR ( 1-210)偶聯的瓊脂 糖 4 FF ( NHS-活化的瓊脂糖 4 FF ( sepharose 4 FF) ，GE) 而純化。

Biacore 分析: 將生物素基化的泌乳素受體BirATag-Ser-PRLR ( 1-210)於 10 mM 的醋酸鈉 ρΗ 4·0 ( Biacore BR-1003-49 )中 稀釋至20//g/ml，並且以固定化試劑卜乙基_3_(3_二甲胺 基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC ) 、N-羥基琥珀醯亞胺 (NHS )以及！_〇 M 乙醇胺 _HC1 ( pH 8·5 ) ( Biacore BR1000-50 )而固定在 CM5 晶片（Biacore BR-1006-68 )。 固定化作用的水平是i 500 RU。將泌乳素類似物稀釋成一 系列如下的濃度：1 6/3 13/6 25/12 5/25 nM，並且經由泌 92 200829266

乳素受體固定化的晶片，利用HBS-EP ( 10 mM HEPES ( pH 7.4) ; 150 mM NaC1 ; 3 mM EDTA ; 〇 〇〇5% (體積 / 體幻

Tween-20)作為運轉缓衝液，在以下條件而進行·· 樣品：接觸時間300秒；流速4〇 #丨/分鐘；分離時間 1 8 0 秒。 恢復：接觸時間5〇秒；流速2〇 #丨/分鐘；穩定化期間 5秒。 … 4·5 M MgCl2是使用作為恢復緩衝液。 穩定地表現Ba/F3細臉系產生·· 為了產生以細胞為基礎的參考生物分析以用於泌乳素 受體拮抗劑評估，因此將Ba/F3細胞以包含泌乳素受體基 因的質體而轉染。將可在i ng/ml的野生型泌乳素刺激之 下存活的細胞予以次選殖，並且挑選48個具有快速生長 的選殖株用於進一步在不同野生型泌乳素刺激之下的劑量 反應研究。大約50%的這48個選殖株可在〇·4 ng/ml的野 生型泌乳素存活，但它們中僅有2個可在〇1 ng/ml的野生 型泌乳素保持增殖。在刺激分析中，這2個細胞系（pRLR_〇9 以及PRLR-32 )顯示對於野生型泌乳素的優異反應 (PRLR-09 EC50 : 5·4χ1(Γ" μ 以及 PRLR-32 EC50 : 3.75χ 10 Μ )。並且這2個細胞系在i ηΜ的野生型泌乳素（ ng/ml )刺激之下也都可達到最大的生物反應，其非常類似 於成功用於相同目標之Ba/F3_PRLR細胞模式的報導數據 (10 ng/ml )。 動劑/拮枕劍决物公折： 93 200829266 使Ba/F3 (在第二輪次選殖之後的pRLR-32)細胞在 饥餓培養液（具有10%胎牛蛋白的rPM I 1640 )上生長24 小時。然後將細胞再懸浮於飢餓培養液至5χ丨〇5個細胞/mi， 將1 00 V 1的細胞投入96槽孔的培養盤中，將不同濃度的 5 0 // 1之激動劑或野生型泌乳素（1 nM )/拮抗劑加到細胞， 並且培養68小時。將50 # 1的AiamarBlue (飢餓培養液： AlamarBlue試劑=7 : i )加到每個槽孔，然後培養*小時。 勞光是以培養盤 BMG LABTECHNOLOGIES 96 ( 544 nm 的 激發滤光器以及590 nm的發散濾光器）而測量。Prism4 軟體是用於分析數據。 第11圖顯示部分泌乳素類似物的Biacore分析結果。 [PRL S61A，Q71A，Q73A，G129R]是合理設計的突變物。 [PRL Q73L，M75T，N76S，F80L，G129R]以及[PRL S33A，

Q73L，G129R，K190R]是由SPA分析所鑑定的兩個標的物。 結果顯示兩個標的物的親合力是比野生型泌乳素以及[pRL G129R]高幾乎2倍。 第12圖顯示Ba/F3_pRLR增殖分析結果。野生型泌乳 素在大約1 nM達到最高的刺激活性，以及EC5〇是ι 〇2χ 1 Ο·10 Μ。PRL_G129R在大約！】〇碰達到最高的刺激活性， 以及EC5G是3.2xlG_9 Μ。在pRL_G129R刺激之下的最高 曰殖速率僅為野生型泌乳素的i 2%。對於兔子多株抗體抗 -hPRLR以及兩個泌乳素的突變物，可偵測到非常弱的激 動劑活性。 第13圖顯示Ba/F3_PRLR競爭分析結果的一個例子。 94 200829266 HTPN-62 是突變物[prl q73l，M75T，N76S，F80L， G129R] ’係由SPA分析以及Biacore分析所鑑定標的物之 一。結果顯示突變物的拮抗劑活性是比[PRL G129R]高大 . 約4倍。 藥理學方法 分析（I) 藉由表面電漿共振測量而評估泌乳素受體結合 將測試化合物（在這個例子中為ECD_pRL_R( 25 # g/ml 1 於10 mM醋酸鈉，ΡΗ 3·0))以5" 1/min的流速注射到

Biacore 3 000儀器，並且藉由胺偶聯化學而連接到€μ5感 應為曰曰片。接著將泌乳素及其變異物（5 〇〇 nM於緩衝液中； 20 mM Hepes ( pH 7_4)，其包含 〇」μ NaCn、2 mM CaCl2 以及0·005%Ρ20)以相同流速注射在固定化的受體上5分 釦，然後是1 0分鐘的分離期間，在該期間内注射緩衝液， 以評估受體結合親合力。數據評估是在BiaEvaluati〇n 41 厂中進行。恢復是在運轉之間以4·5 MMgCl2而完成。 I 分析（II) f體分析河一^體的拮抗作用/激動作 1 將AU 565細胞在6槽孔的培養皿中培養2天。在具 有< 1 %胎牛血清的培養液中使細胞飢餓丨8小時，之後將 它們以泌乳素或其變異物刺激15分鐘。製備細胞溶胞產 物，亚且藉由西方墨潰對STAT5酪胺酸磷酸化作用而分 析0 95 200829266 【圖式簡單說明】 第1圖：vPRL的一級序列（利用wt prl編號）以及 二級結構是在HX分析的胜肽（以水平條棒顯示）之上而 展示。在ECD-PRL-R的存在下，藉由在1000sHX之後顯 示減少的氘併入（>0.3Da)而鑑定為包括bs 1的胜肽（殘 基 20-36、40-63、66-83、173-185 以及 189-199)是以灰 色著色。 第2圖·· （ A)在ECD-PRL-R的存在或不存在下，於 HX l〇s之後，對應到涵蓋PRL殘基189-199 ( C-端）的胜 肽片段（m/z= 664.3，z = 2)之質量/電荷光譜。（在 ECD-PRL- R的存在或不存在下，於HX l〇s之後，對應到 涵蓋PRL殘基66-80 (螺旋1，，）的胜肽片段（m/z = 918.4， z = 2 )之質量/電荷光譜。納入不含氘的對照組以作為比較。 第3圖：在ECD-PRL-R的存在（三角形）及不存在 (圓形）下，vPRL胜肽的氘併入是在對數的刻度上對時 間作圖。除了胜肽1 〇 1 -113之外，所顯示的胜肽是在prl 中的BS 1之部分。 第4圖：（A)藉由鑑定在ECD-PRL-R的存在下， 在1000s氫交換之後具有減少的氘併入的胜肽（以黑色顯 示），繪圖至PRL的NMR結構上的結合位置1。（ B )沿 著在（A )圖中顯示的結構之垂直軸9〇。旋轉。圖是是利用 人類PRL (pdb登記：1RW5)的NMR結構，以軟體程式 PyMol而製備。 第5圖：在ECD-PRL-R的存在（三角形）及不存在 96 200829266 (圓形）下，PRL胜肽的氘併入是在對數的刻度上對時間 作圖。在10000s之後於兩個胜肽中觀察到之減少的氘併入 鮮頁示螺旋2及3的結構動力學是連結到與b S 1結合的 ECD-PRL-R。

第6圖：泌乳素以及人類生長激素的序列校準。星號 (* )代表相同的胺基酸，冒號（：）代表結構及化學上 相似的胺基酸，以及點（，）代表屬於相同類型的胺基酸（疏 水性或親水性）。列為“泌乳素，，的序列是序列識別號i， 以及列為人類生長激素的序列是序列識別號2。 第7圖：來自化學位移擾動實驗的結果（表丨的數據） 之圖示。正向條棒代表在游離及受體結合的pRL_Gl29R中 之醯胺所觀察到的化學位移差異，表示為(八占^) + (Ο-ΙχΛο^ν)2]0·5。負向條棒代表骨架醯胺排布是缺少 (表1的陰影）的殘基。 第8圖：在包含95 %咕2〇的緩衝液中紀錄的 [H，N]PRL-G129R 及 PRLR 間之複合體的 2D_lHl5N_ TROSY光瑨。a組（藍色）是參考以及b組（紅色）光譜 是在脂肪族質子（〇·9 ppm)飽和〇 5秒之後而獲得。在。 組中，將得自A組以及B組的兩個光譜重疊。D組顯示放 大，其包括指名為K181以及Lm的波峰，顯示強烈的衰 減0 第9圖·在父叉飽和實驗中觀察到❸NH-訊號強度比 是對於每個胺基酸殘基，以由顏色編碼所表示之具有最強 、衰咸勺位i (強度比< 〇·6 ) #條棒所顯示。對於強度比 97 200829266 因為缺少排布或光譜重疊而不能計算的位置，是由負向條 棒而表示。 第10圖：交叉飽和實驗在PRL ( pdb代碼1 rw5 )的3D 結構上繪圖之結果。PRL是以表面而表示，以及在交叉飽 和實驗中顯示最強烈作用（強度比< 0.6 )的殘基是塗成紅 色。 第1 1圖：部分泌乳素類似物的Biacore分析結果。[PRL S61A，Q71A，Q73A，G129R]是合理設計的突變物。[PRL f Q73L，M75T，N76S，F80L，G129R]以及[PRL S33A，Q73L， G129R，K190R]是由SPA分析所鑑定的兩個標的物。 第12圖：Ba/F3-PRLR增殖分析結果。 第13圖：Ba/F3-PRLR競爭分析結果的一個例子。 【主要元件符號說明】 無

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Claims (1)

1. 200829266 十、申請專利範園： 1 · 一種分離的胜肽，該胜肽是人類泌乳素的變異物， 以及其可結合到泌乳素受體，該變異物包括： (i )在對應到序列識別號1的胺基酸殘基24至3 5之 區域中的一個或多個胺基酸突變；及/或 (ii) 在對應到序列識別號1的胺基酸殘基52至58 之區域中的一個或多個胺基酸突變；及/或 (iii) 在對應到序列識別號1的胺基酸殘基66至83 之區域中的一個或多個胺基酸突變；及/或 (iv )在對應到序列識別號1的胺基酸殘基1 76至1 99 之區域中的一個或多個胺基酸突變；及/或 (v )加到C-端的從1至5個胺基酸殘基。 2 ·根據申請專利範圍第1項之分離的胜肽，其中至少 一個在（i )所說明的突變是在對應到序列識別號1的胺基 酸殘基2 5的位置中。 3·根據申請專利範圍第2項之分離的胜肽，其中在對 應到序列識別號1的胺基酸殘基25的位置中之胺基酸殘 基是以Gin取代。 4 ·根據申請專利範圍第1至3項中任一項之分離的胜 月大’其中在（i )所說明的突變是在對應到序列識別號1的 胺基酸殘基26至33的區域中。 5 ·根據申請專利範圍第1至4項中任一項之分離的胜 狀’其中至少一個在（i )所說明的突變是在對應到序列識 別號1的胺基酸殘基28的位置中。 99 200829266 6 ·根據申請專利範圍第5項之分離的胜肽，其中在對 應到序列識別號1的胺基酸殘基28的位置中之胺基酸殘 基是以A s η取代。 7 ·根據申凊專利範圍第1至6項中任一項之分離的 胜肽，其中至少一個在（i )所說明的突變是在對應到序列 識別號1的胺基酸殘基3 1的位置中。 8 ·根據申請專利範圍第7項之分離的胜肽，其中在對 應到序列識別號1的胺基酸殘基31的位置中之胺基酸殘 基是以S e r取代。 9 ·根據申請專利範圍第1至8項中任一項之分離的胜 肽，其中至少一個在（i )所說明的突變是在對應到序列識 別號1的胺基酸殘基3 3的位置中。 1 〇 ·根據申請專利範圍第9項之分離的胜肽，其中在 對應到序列識別號1的胺基酸殘基33的位置中之胺基酸 殘基是以Ala取代。 1 1 ·根據申请專利範圍第1至1 〇項中任一項之分離的 胜肽，其中在（i )所說明的突變不是在對應到序列識別號 1的胺基酸殘基3 0的胺基酸殘基中。 12 ·根據申請專利範圍第1至11項中任一項之分離的 胜肽，其中至少一個在（ii )所說明的突變是在對應到序 列識別號1的胺基酸殘基5 5的位置中。 13.根據申請專利範圍第1至12項中任一項之分離的 胜肽，其中至少一個在（ii )所說明的突變是在對應到序 列識別號1的胺基酸殘基5 6的位置中。 100 200829266 1 4·根據申請專利範圍第1至1 3項中任一項之分離的 胜肽’其中在（ii )所說明的突變不是在對應到序列識別 號1的胺基酸殘基66的胺基酸殘基中。 1 5 ·根據申請專利範圍第i至1 4項中任一項之分離的 胜肽’其中在（ii )所說明的突變不是在對應到序列識別 號1的胺基酸殘基69的胺基酸殘基中。 1 6·根據申請專利範圍第1至1 5項中任一項之分離的 胜肽，其中至少一個在（iii )所說明的突變是在對應到序 列識別號1的胺基酸殘基73的位置中。 17·根據申請專利範圍第16項之分離的胜肽，其中在 對應到序列識別號1的胺基酸殘基73的位置中之胺基酸 殘基是以Leu取代。 1 8 ·根據申請專利範圍第1至1 7項中任一項之分離的 胜肽，其中至少一個在（iii )所說明的突變是在對應到序 列識別號1的胺基酸殘基75的位置中。 1 9 ·根據申請專利範圍第1 8項之分離的胜肽，其中在 對應到序列識別號1的胺基酸殘基75的位置中之胺基酸 殘基是以Thr取代。 2〇·根據申請專利範圍第1至19項中任一項之分離的 胜肽，其中至少一個在（iii )所說明的突變是在對應到序 列識別號1的胺基酸殘基76的位置中。 2 1 ·根據申請專利範圍第2 0項之分離的胜肽，其中在 對應到序列識別號1的胺基酸殘基76的位置中之胺基酸 殘基是以Ser取代。 101 200829266 22·根據申請專利範圍第1至2i 丄項中任一項之分離的 胜肽，其中至少一個在门彳η斛屻 隹Uu)所浼明的突變是在對應到序 列識別號1的胺基酸殘基8〇的位置中。 23.根據申請專利範圍第22項之分離的胜狀，其中在 對應到序列識別號1的胺基酸殘基8〇的位置中之胺基酸 殘基是以Leu取代。 24. 根據申請專利範圍第！至23項中任一項之分離的

   胜肽’其中至少-個在（iii)所說明的突變是在對應到序 列識別號1的胺基酸殘基67至70的區域中。 25. 根據申請專利範圍第i至24項中任一項之分離的 胜肽，其中至少一個在（iii )所說明的突變是在對應到序 列識別號1的胺基酸殘基68的位置中。 2 6 ·根據申請專利範圍第2 5項之分離的胜肽，其中在 對應到序列識別號1的胺基酸殘基68的位置中之胺基酸 殘基是以Asn取代。 2 7 ·根據申清專利範圍弟1至2 6項中任'一項之分離的 胜肽，其中在（iv )所說明的突變不是在對應到序列識別 號1的胺基酸殘基1 76的胺基酸殘基申。 28·根據申請專利範圍第1至27項中任一項之分離的 胜肽，其中在（iv )所說明的突變不是在對應到序列識別 號1的胺基酸殘基1 77的胺基酸殘基中。 29.根據申請專利範圍第1至28項中任一項之分離的 胜肽，其中在（iv )所說明的突變不是在對應到序列識別 號1的胺基酸殘基1 80的胺基酸殘基中。 102 200829266 3〇·根據申請專利範圍第1至29項中任一項之分離的 胜肽，其中在（iv )所說明的突變不是在對應到序列識別 號1的胺基酸殘基1 8 1的胺基酸殘基中。 3 1 ·根據申請專利範圍第1至3 0項中任一項之分離的 胜肽，其中在（iv )所說明的突變不是在對應到序列識別 號1的胺基酸殘基1 85的胺基酸殘基中。 32. 根據申請專利範圍第1至31項中任一項之分離的 胜肽，其中在（iv )所說明的突變不是在對應到序列識別 號1的胺基酸殘基1 87的胺基酸殘基中。 33. 根據申請專利範圍第1至32項中任一項之分離的 胜肽，其中至少一個在（iv )所說明的突變是在對應到序 列識別號1的胺基酸殘基179的位置中。 3 4.根據申請專利範圍第3 3項之分離的胜肽，其中在 對應到序列識別號1的胺基酸殘基1 79的位置中之胺基酸 殘基是以Thr取代。 35.根據申請專利範圍第1至34項中任一項之分離的 胜肽，其中至少一個在（iv )所說明的突變是在對應到序 列識別號1的胺基酸殘基1 88至1 99的區域中。 3 6 ·根據申請專利範圍第1至3 5項中任一項之分離的 胜肽，其中至少一個在（iv )所說明的突變是在對應到序 列識別號1的胺基酸殘基190的位置中。 37.根據申請專利範圍第36項之分離的胜肽，其中在 對應到序列識別號1的胺基酸殘基190的位置中之胺基酸 殘基是以Arg取代。 103 200829266 3 8 ·根據申請專利範圍第1至3 7項中任一項之分離的 胜肽，該胜肽是人類泌乳素的變異物，以及其可結合到泌 乳素受體’該變異物具有在對應到序列識別號1的胺基酸 殘基66至83之區域中及/或在對應到胺基酸殘基ι89至ι99 之區域中的一個或多個胺基酸突變。 39·根據申請專利範圍第38項之分離的胜肽，該胜肽 是人類泌乳素的變異物，以及其可結合到泌乳素受體，該 、欠異物具有在對應到序列識別號1的胺基酸殘基6 7至7 〇 之區域中及/或在對應到胺基酸殘基189至丨99之區域中的 一個或多個胺基酸突變。 40. —種分離的胜肽，該胜肽是人類泌乳素的變異物， 以及其可結合到泌乳素受體，其中該變異物包括一個或多 個可穩定泌乳素分子的結構之胺基酸突變。 41 ·根據申請專利範圍第丨至4〇項中任一項之分離的 胜肽，其中該變異物包括一個或多個可穩定泌乳素分子的 二級結構之胺基酸突變。 42·根據申請專利範圍第4〇項或申請專利範圍第41 項之分離的胜a，其中泌乳素的穩定化是藉由利用如實施 例1所說明的ΗΧ-MS技術而測定。 43·根據申請專利範圍第40至42項中任一項之分離 的胜肽，其中一個或多個該胺基酸突變可穩定泌乳素的7 螺旋束結構。 ' 44·根據申請專利範圍第4〇至43項中任一項之分離 的胜肽，其中一個或多個該胺基酸突變可改善PRL ϋ 的螺旋 104 200829266 1、螺旋2、螺旋3及/或螺旋4中之螺旋蓋。 45·根據申請專利範圍第40至44項中任一項之分離 的胜肽’其中一個或多個該胺基酸突變是選自在對應到 Ala-1 11以及Glu-162的胺基酸殘基中之突變。 46·根據申請專利範圍第45項之分離的胜肽，其中對 應到Ala-111的胺基酸殘基是以Asp、Asn、Ser或Thr取 代。 47·根據申請專利範圍第45項或申請專利範圍第46 項之分離的胜肽，其中對應到Glu-162的胺基酸殘基是以 Asp取代。 48·根據申請專利範圍第40至47項中任一項之分離 的胜肽，其中一個或多個該胺基酸突變係在暴露至溶劑的 螺旋片段中導入鹽橋架。 49.根據申請專利範圍第4〇至48項中任一項之分離 的胜肽，其中該等胺基酸突變之一是在對應到Asn-92的胺 基酸殘基中之突變。 5〇·根據申請專利範圍第49項之分離的胜肽，其中對 應到Asn-92的胺基酸殘基是以Asp取代。 5 1 ·根據申晴專利範圍第4 〇至5 0項中任一項之分離 的胜肽，其中兩個或多個該等胺基酸突變係將非-天然的雙 硫鍵導入至泌乳素。 52·根據申請專利範圍第5丨項之分離的胜肽，其中該 兩個胺基酸突變是選自在對應到L1C/S135C、 A22C/G129C、V23C/L186C、S26C/D183C、L32C/I119C、 105 200829266 S33C/L175C 、 S33C/R176C 、 S33C/S179C 、 M36C/K115C 、 F37C/L172C、T45C7I51C、S57C/N170C、H59C/P148C、 L63C/S86C、P66C/Q71C、P66C/A72C、Q77C/V137C、 K78C/K142C、K78C/H138C、L81C/V134C、S82C/E143C、 S82C/N144C、V85C/N144C、S86C/I146C、L88C/L127C、 R89C/Y147C、S90C/Y147C、E93C/W150C、L95C/E120C、 V99C/A116C 、 V102C/L113C 、 M105C/A108C 、 H138C/T141C、M158C/R164C、與 D160C/S193C 的位置中 之突變。 53. 根據申請專利範圍第1至52項中任一項之分離的 胜肽，其中一個或多個該胺基酸突變是將暴露至溶劑的疏 水性殘基以極性殘基取代。 54. 根據申請專利範圍第53項之分離的胜肽，其中一 個或多個該胺基酸突變是選自在對應到lie-146以及Val-149的胺基酸殘基中之突變。 5 5.根據申請專利範圍第54項之分離的胜肽，其中對 應到lie-1 46的胺基酸殘基是以絲胺酸或蘇胺酸取代。 56. 根據申請專利範圍第54項或申請專利範圍第55 項之分離的胜肽，其中對應到Val-149的胺基酸殘基是以 絲胺酸或蘇胺酸取代。 57. 根據申請專利範圍第1至56項中任一項之分離的 胜肽，其中一個或多個該胺基酸突變可改善在4-螺旋束結 構的疏水性核心處之包裝交互作用。 58. 根據申請專利範圍第57項之分離的胜肽，其中一 106 200829266 個或多個該胺基酸突變是選自在對應到Leu-95、lie-11 9以 及Leu-175的胺基酸殘基中之突變。 59·根據申請專利範圍第58項之分離的胜肽，其中對 應到Leu-95的胺基酸殘基是以Val取代。 60·根據申請專利範圍第58項或申請專利範圍第59 項之分離的胜肽，其中對應到lie-119的胺基酸殘基是以Val 取代。 61·根據申請專利範圍第58至60項中任一項之分離 的胜肽，其中對應到Leu-175的胺基酸殘基是以pro取代。 62_根據申請專利範圍第1至61項中任一項之分離的 胜肽’其中該胜肽也在對應到序列識別號1的胺基酸殘基 20至36及/或40至63及/或173至185的一個或多個位置 中突變。 63.根據申請專利範圍第丨至62項中任一項之分離的 胜肽’其中該胜肽對於泌乳素受體比人類泌乳素具有增加 的親合力。 64·根據申請專利範圍第63項之分離的胜肽，其中對 於泌乳素受體的親合力是根據如此處所說明的分析（j )而 測定。 65 ·根據申請專利範圍第1至64項中任一項之分離的 胜狀’其中該胜肽對於泌乳素受體的結合比起野生型人類 泌乳素結合到泌乳素受體，具有至少3倍少的解離常數 (Kd)。 66·根據申請專利範圍第1至65項中任一項之分離的 107 200829266 胜肽’其中該胜肽可結合到人類生長激素受體。 入，根據申晴專利範圍第66項之分離的胜肽，其中結 口〗人颌生長激素受體是藉由利用如此處所說明的分析 (I )而測定。 根據申凊專利範圍第1至6 7項中任一項之分離的 胜肽，其為泌乳素受體的拮抗劑。 69·根據申請專利範圍第68項之分離的胜肽，其中該 抬抗作用疋利用如此處所說明的分析（II )而測定。 7〇·根據申請專利範圍第08項或申請專利範圍第69 項之分離的胜肽，其中該拮抗作用是藉由將一個或多個突 、艾&入至BS-2以避免或減少BS2與PRL-R的交互作用而 達成。 7 1 ·根據申請專利範圍第68至70項中任一項之分離 的胜狀’其中至少一個或多個該拮抗突變是選自在對應到 Gly-129以及Ser_179的胺基酸殘基中之突變。 72. 根據申請專利範圍第71項之分離的胜肽，其中至 少一個或多個該拮抗突變是選自對應到G129R以及S179D 的突變。 73. 根據申請專利範圍第72項之分離的胜肽，其中至 少一個或多個該拮抗突變是選自對應到g129r的突變。 74. 根據申請專利範圍第73項之分離的胜肽，其中對 應到PRL的位置1到9之胺基酸殘基已被刪除。 75 ·根據申請專利範圍第74項之分離的胜肽，其中對 應到PRL的位置1到14之胺基酸殘基已被刪除。 108 200829266 76. —種分離的胜肽，該胜肽是人類生長激素的變異 物，以及其可結合到生長激素受體，該變異物包括： (i )在對應到胺基酸殘基24至3 5之區域中的_個或 多個胺基酸突變；及/或 (ii)在對應到胺基酸殘基52至58之區域中的—個 或多個胺基酸突變；及/或 (iii )在對應到胺基酸殘基66至83之區域中的一個 或多個胺基酸突變；及/或 (iv)在對應到序列識別號1的胺基酸殘基ι76至199 之區域中的一個或多個胺基酸突變；及/或 (v )加到C-端的從1至5個胺基酸殘基。 77· —種分離的胜肽，該胜肽是人類生長激素的變異 物’以及其可結合到生長激素受體，其中該變異物具有一 個或多個可穩定生長激素分子的二級結構之胺基酸突變。 78.根據申請專利範圍第76至77項中任一項之分離 的胜肽’其中該變異物包括一個或多個可穩定生長激素分 子的二級結構之胺基酸突變。 79·根據申請專利範圍第77項或申請專利範圍第78 項之分離的胜肽，其中生長激素分子的穩定化是藉由利用 如實施例1所說明的ΗΧ-MS技術而測定。 80·根據申請專利範圍第77至79項中任一項之分離 的胜肽，其中一個或多個該胺基酸突變可穩定生長激素的 4-螺旋束結構。 根據申睛專利範圍第7 7至8 0項中任一項之分離 109 200829266 的胜肽，其中一個或多個該胺基酸突變可改善生長激素的 螺旋1、螺旋2、螺旋3及/或螺旋4中之螺旋蓋。 82·根據申請專利範圍第77至81項中任一項之分離 的胜肽，其中一個或多個該胺基酸突變是選自在對應到序 列識別號1的Ala-111以及Glu-162的胺基酸殘基中之突 變〇 83 ·根據申請專利範圍第82項之分離的胜肽，其中對 應到Ala-1 11的胺基酸殘基是以ASp、Asn、Ser或Thr取 代。 84·根據申請專利範圍第82項或申請專利範圍第83 項之分離的胜肽，其中對應到Glu-162的胺基酸殘基是以 Asp取代。 85·根據申請專利範圍第77至84項中任一項之分離 的胜肽，其中一個或多個該胺基酸突變係在暴露至溶劑的 螺旋片段中導入鹽橋架。 86·根據申請專利範圍第77至85項中任一項之分離 的胜肽，其中該等胺基酸突變之一是在對應到序列識別號 1的Asn-92之胺基酸殘基中的突變。 87. 根據申請專利範圍第86項之分離的胜肽，其中對 應到Asn-92的胺基酸殘基是以Asp取代。 88. 根據申請專利範圍第77至87項中任一項之分離 的胜肽，其中兩個或多個該等胺基酸突變係將非-天然的雙 硫鍵導入至生長激素。 89·根據申請專利範圍第88項之分離的胜肽，其中該 110 200829266 兩個胺基酸突變是選自在對應到序列識別號 1的 L1C/S135C、A22C/G129C、V23C/L186C、S26C/D183C、 L32C/I119C、S33C/L175C、S33C/R176C、S33C/S179C、 M36C/K115C、F37C/L172C、T45C/I51C、S57C/N170C、 H59C/P148C、L63C/S86C、P66C/Q71C、P66C/A72C、 Q77C/V137C、K78C/K142C、K78C/H138C、L81C/V134C、 S82C/E143C、S82C/N144C、V85C/N144C、S86C/I146C、 L88C/L127C、R89C/Y147C、S90C/Y147C、E93C/W150C、 L9 5C/E120C、V99C/A1 16C、V102C/L113C、M105C/A108C、 H138C/T141C、M158C/R164C、a 與 D160C/S193C 的位置 中之突變。 90. 根據申請專利範圍第76至89項中任一項之分離 的胜肽，其中該胜肽對於生長激素受體的結合比起野生型 人類生長激素結合到生長激素受體，具有至少3倍少的解 離常數（Kd )。 91. 根據申請專利範圍第76至90項中任一項之分離 的胜肽，其為泌乳素受體的拮抗劑。 92. 根據申請專利範圍第91項之分離的胜肽，其中該 拮抗作用是利用如此處所說明的分析（II )而測定。 93. 根據申請專利範圍第91項或申請專利範圍第92 項之分離的胜肽，其中該拮抗作用是藉由將一個或多個突 變導入至BS-2以避免或減少BS2與PRL-R的交互作用而 達成。 94·根據申請專利範圍第91至93項中任一項之分離 111 200829266 的胜肽，其中至少一個或多個該拮抗突變是選自在對應到 序列識別號2的Gly 120之胺基酸殘基中的突變。 95.根據申請專利範圍第94項之分離的胜肽，其中至 少一個或多個該拮抗突變是選自G12〇R4 G12〇K。 96· 一種分離的核酸，其編碼根據申請專利範圍第1 至95項中任一項之胜肽。 97· —種載體，其包括根據申請專利範圍第％項之核 酸構築。 ' 98. —種宿主細胞，其包括申請專利範圍第％項之核 酸構築或申請專利範圍第97項之載體。 斤"· 一種抗體，其可專一性地結合根據申請專利範圍 苐1至9 5項中任一項之胜肽。 100·根據巾請專利範圍第99項之抗體，該抗體並不 結合到包括序列識別號i的胺基酸序列之胜肽。 101.根據申請專利範圍第99項或申請專利範圍第1〇〇 項之抗體，該抗體並不結合到包括序列識別號2的胺基酸 序列之胜狀。 其包括根據申請專利範圍第1 102· —種醫藥組成物 至95項中任一項之胜肽。 103.-種治療乳癌之方法’該方法包括將根據申請專 利乾圍第1至95項中任—項之胜肽或根據申請專利範圍 第1 02項之調配物投予至有需要的患者。 1〇4· 一種根據申請專利範圍第1至95項中任一項的 胜肽之用途’其係用於製備乳癌的治療用醫藥品。、 112 200829266 105. —種根據申請專利範圍第1至95項中任一項的 胜肽之用途，其係用於產生乳癌以及前列腺癌的治療用泌 乳素拮抗劑。 十一、圖式： 如次頁

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