TW200827450A - Biological organism identification product and methods - Google Patents

Description

200827450 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種生物體偵測產品及使用該產品1)快速 識別及偵測所收集生物體；2)測定其毒力；3)判定其抗藥 性及其他抗性標記或其組合之方法。 【先前技術】

Ο 眾多病原體（亦即病毒、細菌及寄生蟲）造成全世界人口 之感染及其他疾病。有時，病原體之一或多種突變會產生 典型的致病病原體，從而變成全面大流行。雖然此等病原 體及所引起的疾病各式各樣，但根據當前事件更為突出的 一種為流行性感冒病毒。 流行性感冒病毒及其變異體（本文統稱為”流感病毒，，）係 造成人類及動物（本文可互換地稱為，，宿主"、"患者"或，，個 體）之傳染性呼吸道疾病（一般地稱為”流行性感冒，，、，，疾 病’’或’’流感”）之原因，其可引起輕微至嚴重的疾病且有時 會導致死亡。僅在美國，平均每年即有5%至2()%的人羅患 流感；20多萬人因流感併發症而住院-且約3.6萬人死於流 感。 流感病毒通常㈣咳似打対傳染，以呼吸道飛泳形 式傳播纟人類患者中，儘管有時個體係因觸摸帶有流感 病毒之某物並接著觸摸盆口式畠 、$鼻而受到感染，然而病毒通 常在人與人之間傳播。大多數 丄 ， 夕数健康成人可能會在症狀顯現 之前1天開始至生病之後長達5 # 、 建5天内感染其他人。無併發症 之流行性感冒疾病常以全身乃 王身及呼吸道病徵及症狀之突然發 124810.doc 200827450 作為特徵，該等病徵及症狀包括發燒、肌痛、頭痛、不適 感、無痰乾咳、喉嚨痛及鼻炎。 流行性感冒病毒有三種主要類型：A型、B型及㈣。詳 2之’在A型中存在許多不同亞型。基於病毒表面上之特 • 定蛋白質’具體而言為血球凝集素蛋白（-般稱為”HA,·)及 ^ 神經胺酸酶蛋白（-般稱為，，NA”），該等亞型各不相同。目 A已头A i⑽行性感冒病毒的16種η a亞型及9種να亞型。 〇 可能存在ΗΑ與ΝΑ蛋白之許多不同組合，且各組合代表一 種不同亞型。”人類流行性感s病毒π通常係指在人類中廣 泛傳播之彼等亞型。已知有三種目前在人類中循環之八亞 型流打性感冒病毒（Η1Ν1、Η1Ν2&Η3Ν2)。犯犯亞型被稱 為’’亞洲流感病毒（Asian F1U)”，其係於1957」968年間於人 類群體中循環。 然而，A型流行性感冒病毒不斷變化，且自鳥類及動物 傳播至人類宿主，從而產生新的流行性感冒亞型，其可隨 〇 著時間而適應於在人類中更快速或更全面地感染及傳播， 如主流媒體所廣泛報道的包括H5、H7及H9亞型。 舉例而言，據報道H5N1亞型已發生突變而足以自鳥類 佰主傳播至人類宿主。目前，H5N丨病毒在人類之間的傳 播已得到控制。但是，因為所有流行性感冒病毒均會不斷 地適應，所以擔心H5N1型病毒或另外的病毒性流感亞型 將能夠有效地感染人類且更容易地在人與人之間傳播。另 外’由於H5N1亞型及許多其他亞型在人類群體中流行率 較低且通常不感染人類群體，因此目前幾乎沒有或沒有在 124810.doc 200827450 人類群體中對抗該等亞型之免疫保護。已普遍提出若 H5N1病,獲得易於在人與人之⑽播的能力，則將很可 能會開始全球性疾病爆發(亦即大流行病）。 〇‘ L) 大流行性病毒通常作為所謂”抗原轉移”之過程的結果而 出現’，亥過程引起病毒（例如A型流行性感冒病毒）之突铁 或意外的重大改變。就流行性感冒而言，自鳥類及動物傳 播至人類之A型流行性感f病毒促成此等改變，從而在病 毋表面上產生HA及/或NA蛋白之新組合。該等改變產生新 的A型机仃性感冒病毒亞型。新的a型流行性感冒病毒亞 型之出現係朝著大流行病發展之第一步。然而，對於引起 大流行病，新病毒亞型亦需要易於在人與人之間傳播的能 力且應為與人類群體中所發現之兩種典型病毒株（八及B)具 有足夠相異性之亞型。一旦新的大流行流行性感冒病毒 出現且傳播，即將最終得以確立且可於人類群體中傳 ^彳火而作為流行性感冒之季節性流行之一部分循環多 0 無法預測下次大流行病之嚴重性，但模擬研究表明大流 行病對美國及整個世界可能產生實質影響。在無任何控制 措施（疫苗接種或藥物）之情況下，據估計美國，，中等程度，， 大流行病可能造成8.9-20.7萬人死亡，31.4-73.4萬人住 院’ 1800-4200萬人門診就醫及另外2000-4700萬人生病。 據美國疾病控制中心（Centers for Disease Control，CDC)得 知’介於15%與35%之間的美國人口可能受到流行性感冒 大流行病侵襲，且經濟影響可能在大約710億與1670億美 124810.doc 200827450 元之間的範圍内。 主生物體（本文亦可互換地稱為”微生物”），諸如細菌及病 毋’如A型、_流行性感冒病或生物體之組合，且 特別是大流行性流行性感冒病毒帶來迅速地在廣泛地理範 圍内且經由廣大群體傳播而造成高死亡率及發病率之威 脅。在調動及實施預防措施以確保公眾健康之前，關鍵是 此等生物體一出現即對其進行伯測及識別。如果發 Ο

CJ I行病爆發（例如流行性感冒），早期伯測及監測追縱 該等生物體之傳播可能幫助減輕咖所_之廣泛破壞。 亦預期t期偵測為限制或幫助處理任何生物恐怖襲擊所帶 來之破壞之關鍵。因此，極1 物體之系統。 “要㈣速谓測及識別生 然而，用於_及_料之f知技術並不適用於此任 務。病毒監測1測及識別通常費時（例如，數天至數 週，且在一些情形下為數月）、操作麻須且可能給衛生保 2人員且甚至-般公„來諸多健康危險。f知技術通常 養及通常3至4級安全等級方案，此等條件伴隨 虽南的危險等級。習知監測、偵測及識別方法（本文統 柄為"監測方法"）通常包括培養活目標試樣（本文 稱為"標㈣樣"、"組織”或”樣本"），諸如鳥、人類或其他也 ^活細胞’·=樣本傳遞至合適的實驗室設施或其他測試地 样’ ^如國家、地區或州測試實驗室；及接著挪試目標試 ’之夕種生物體。基於對目標樣本中基因體物質(例如 RNA及/或DNA)之檢定，通常可識別生物體。、 124810.doc 200827450 在此識別及_方法中，固有地需要將目標試樣帶回實 驗室’從而增加整個過程的時間及危險。若在遠距離地方 發現目標試樣，則必需小^地將其傳遞至合適的診斷實驗 室，以便在傳遞期間不損害、污染試樣或承受試樣意外暴 露-或操作試樣人員意外暴露之危險。舉例而言，在傳遞 期間通常將試樣保持在冷藏或接近冷⑨之條件下以確保試 樣保持存活及待測試組織保持完好。 因此，本發明者已發現此項技術中需要一種使用簡便、 穩定、快速之診斷工具及產品，其勿需培養生物體及/或 將試樣傳送至遠距離的實驗室而將使得可於試樣收集地點 或其附近更快速地偵測及識別生物體，諸如微生物（例如 病毒及細菌）。該診斷工具應可攜帶且能夠自常規實驗室 遠距離操作，且較佳地可在此種環境中與地區性設施中所 用之習知診斷方法（諸如培養該等生物體）相比提供安全 性。 【發明内容】 本發明藉由提供發明性診斷產品（本文亦可互換地稱為，， 生物體識別產品”及，，診斷工具”）及使用該診斷產品快速偵 測及識別微生物之方法來滿足此項技術中未得到滿足之需 要。該診斷工具可用以收集目標試樣、製備目標試樣用於 檢定、分離基因體物質及隨後處理基因體物質以識別生物 體。一般而言，該診斷工具可用於現場收集一或多種生物 體並識別所收集之生物體，且提供一種針對潛在流行病、 疾病爆發、感染及其他所關注生物體之相對即時的監測形 124810.doc -10- 200827450 式。 本發明之實施例涵蓋一種生物體識別產品，其包括用於 收集一或多種樣本生物體之收集裝置，以足以殺死與該收 集裝置結合之一或多種樣本生物體之量存在之固定及傳遞 組合物，用於自一或多種樣本生物體提取足夠量之基因體 • 核^以便識別其之提取構件及可溶解該足夠量之基因體核 酸之穩定化聚合酶鏈反應（PCR)組份。 ζ) 本I明之較佳實施例包括一種可執行複數次現場診斷之 ί久獨立式生物體產品（本文可互換地稱為"套組”）。該 套組可較佳地包括可攜帶包裝用以保存包括收集裝置、固 疋及傳遞組合物、提取構件及穩定化組份之產品組件。套 組亦可包括執行PCR之機器及/或用以運轉任何機器之功率 源或電源。在某些實施例中，診斷套組亦可包括複數個足 以預防或治療由所識別生物體引起之一或多種病況之量的 活性醫藥成份劑量。 〇 在某些實施例中’本發明係關於識別生物體之方法，其 匕括自個體收集生物樣本，將生物樣本固定於足夠量之固 疋劑中以最小化或消除生物樣本之任何污染，自經固定之 生物樣本提取足夠量之基因體核酸及在凍乾之聚合酶鏈反 應組份中檢定足夠量之基因體核酸以獲得關於生物體之資 °孔。在較佳實施例中，聚合酶鏈反應組份具有足夠量之一 或多種引子’其識別預定生物體且其各者可與對於生物體 具有特異性之蛋白組份化學結合。較佳地，此均係於單一 位置進行。 124810.doc -11 - 200827450 、、在其他較佳實施例中，與習知生物體偵測技術相比該方 相對.乂决。在该方法之一些實施例中，從收集目標試樣 到檢定基因體物質以獲得識別資訊不超過約24至72小時。 在本^明之一些實施例中，檢定進行約3〇至工分鐘，較 佳45分鐘至15〇分鐘。 本發明亦涵蓋一種用於偵測微生物序列之試劑混合物， 該試劑混合物包括以混合物形式存在之—或多種微生物特 異性引子、探針或酵素或其組合，該混合物在室溫下至少 大體上穩定且係經調適及配置以用於聚合酶鏈反應（pcR) 裝置。在一實施例中，試劑混合物在室溫下大體上穩定歷 時至少約5天至長達2週。在另一實施例中，在自樣本提取 出微生物序列之後約90分鐘内進行微生物序列之偵測。該 試劑混合物可用於識別微生物序列，諸如病原體、細菌或 病毒序列或其組合。本發明之試劑混合物（本文亦稱為，，基 本混合物’’）亦可用於識別病毒或細菌序列之菌株或甚至流 行性感冒病毒亞株。 在另一實施例中，試劑混合物可作為器件之一部分使用 以便測定微生物胺基酸序列。在本發明之較佳實施例中， 試劑混合物尤其適合現場使用，且可與收集一或多種生物 體樣本之收集裝置結合使用。在其他實施例中，在約9 〇分 鐘内進行生物體之識別。 本發明之另一實施例包括一種用於偵測微生物序列之方 法’其包括自生物樣本獲得基因體核酸，及藉由將該核酸 添加至一或多種微生物特異性引子、探針或酵素或其組合 124810.doc •12- 200827450 之試劑混合物中來檢定該基因體物質，其中該混合物在室 溫下大體上穩定且適用於PCR裝置。在另一實施例中， PCR裝置包括用於即時PCR偵測之螢光偵測設備。 在一較佳實施例中，試劑混合物包括具有序列（FAM)-tcaggccccctcaaagc之流行性感冒病毒株A探針、具有序列 (FAM)-atgggaaattcagctct之流行性感冒病毒株B探針、具有 序列（FAM)-tctccaaagtatgtcagg之流行性感冒病毒H1亞型探 針、具有序列（FAM)-tgagatcagatgcacccat之流行性感冒病 毒H3亞型探針、具有序列（FAM)-agagrggaaataagtgg之流行 性感冒病毒H5亞型探針或其任一組合。 在另一實施例中，試劑混合物係經配置及調適以識別已 由收集裝置所收集之一或多種樣本生物體。在一較佳實施 例中，試劑混合物用於在現場地點或遠距離場所識別一或 多個樣本。 在另一實施例中，試劑混合物係以液體形式盛裝。在一 較佳實施例中，試劑混合物係以液體形式存在於試管、96 孔盤或毛細管中。在另一實施例中，混合物係經;東乾。 本發明另外涵蓋用於偵測微生物序列之方法，其包括自 生物樣本獲得基因體核酸，及藉由將該核酸添加至試劑混 合物中來檢定該基因體核酸，其中該混合物在室溫下至少 大體上穩定且係經配置及調適以用於聚合酶鏈反應（PCR) 裝置。在另一實施例中，該檢定另外包括將試劑混合物添 加至聚合酶鏈反應（PCR)裝置中，執行檢定及在少於約90 分鐘内完成檢定。在一較佳實施例中，檢定另外包括使用 124810.doc -13 - 200827450 適於與PCR裝置-起使用之營光設備即時價測微生物序 列。在另-實施例中因體物質係來自細菌或病毒或病 原體。在另-實施例中’基因體物質係來自流行性感冒病 毒。 本文中所說明t任何實施例均❹地成立，1除非明確 排除’否則實施例之任何特冑可以任何方式組合以達成一 較佳實施例。-般技術者在審閱本巾㈣之教示後亦將更 為瞭解本發明之其他優點及實施例。 【實施方式】 本發明提供-種診斷卫具及其使时法，該方法使得可 快速識別-或多種所關注之生物體。較佳地，伯測及識別 係足夠快速以便可即時或大體上即時監測一或多個宿主群 體中特定生物體之傳播。詳言之，本發明可組合重組 DNA/RNA分離及偵測技術以快速及遠距離债測及識別生 物體諸如祕生物，通常為病原體。根據本發明最常需要 〇 冑別之病原體包括引起癔疾之微生物、病毒（較佳為可傳 染病毒，且更佳為流行性感冒病毒）及細菌。有利的為識 Μ可進纟包括流行性感冒病毒株之分亞型及/或譜系區 分或其他微生物之相似物種識別。通常自宿主收集樣本， 丨中將待龍樣本提供於本發明之診斷 言，本發明有利地使得可自宿主組織分離生物體=生而 物體之基因體物質Μ貞測及識別目標樣品中之生物體1 場分析生物體及識別生物體。在一些實施例中，診斷工具 包括用於投予宿主之治療性或預防性藥劑，該藥劑係基於 124810.doc -14- 200827450

根據本發明識別之生物體進行選擇 斷工具包括偵測對治療劑之抗性。 之更快速及

點或用於急救室及醫務室中。 本發明藉由提供對宿主或目標試樣中生物體 有效之偵測、分類/分亞型及分離而提 ( 本發明之較佳實施例允許於現場地點識別生物體。有利 的為包裝容納足夠設備以使得可在無需傳遞或返回至實驗 室或基礎處理中心之情況下現場多次識別不同收集樣本。 如本文所用，”現場”涵蓋傳統實驗室環境以外的任何環 境。此包括急救室及醫務室，以及戶外、村莊、住宅、商 務辦公室、倉庫、街道、野戰醫院等，及存在有限的或無 現代生活設施（例如飲用水及/或電）之地區。 在本發明之一些實施例中，診斷工具包括對於各檢定執 G 仃並分析pcR之設備及材料。一般技術者易於瞭解用於執 行PCR之機器，且可根據本發明視需要選擇較小重量及體 積以增加本發明套組之可攜帶性。檢定可與許多類型之 PCR儀器結合使用，較佳地可與幾乎每種pcR儀器結合使 用。較佳地，PCR設備係足夠輕且經調適汲取最小功率以 便增加可攜帶性及使用期限。亦可使用如此項技術中已知 的用於即時識別微生物樣本之螢光相連PCR設備。雖然本 發明之產品中可包括任何合適的PCR設備，但一種較佳類 型之PCR设備包括可自Idaho Techno logy購得之現場強化式 124810.doc -15- 200827450 R.A.P.I.D·® PCR設備。根據本發明可使用之其他市售儀器 包括 Roche LightCyclerlABI 7500 (7000)。 ° Ο u 在本發明之其他實施例中，尤其在PCR設備係與可攜帶 包裝結合包括在内之情況下，可攜帶包裝包括至少一個功 率源。雖訪制提供w敎之電輸㈣任何合適功率 源，但功率源較佳包括電池組、發電機、太陽電池板或其 組合，以及任何相關裝置，諸如電源線或插頭轉接器以便 將功率源連接至需要電力以執行本發明之方法之任何現場 設備(諸如PCR裝置)。在本發明之一些變體中，診斷產品 另外包括替換或修復組件以便在無重新補給之下維持或增 強診斷工具在現場長時間段内之運轉。在—些實施例中，曰 此特徵為必需的’因為由此可在不可能獲得新鮮補給品之 隔離區或受限制的旅行環境中使用本發明之產品。在其他 實施例中’診斷工具包括任何所需處理器(例如帶有相關 軟體之電腦或PDA)以執行診斷測試之分析。在某些變體 中’處理器確定經識別則貞測之生物體（若存在）。軟體可 經調適及配置用以首先取決於現場位置搜尋某些可能類型 ^生物f (例如熱帶環境中之癔疾），以及為生物體知識庫 提供使得任意相關人類操作者可進行任何所需調整或協助 偵測及識別（例如分析檢定結果）之資訊。 & Γ t文所用’術語"感染"、’·流行性感W感染，·、"病毒感 木、’、田菌感染"及類似術語一致地以其於此項技術中之 公認含義使用’但亦可涵蓋不會導致如習知意思上所理解 之感染之生物體有害作用。術語"治療方法"包括控制方 124810.doc • 16 - 200827450 田 >、生物體或感染相關使用時包括改善、消除、減 幸二預防或另外緩解或控制生物體之有害作用。在一較佳 =施：中，此等有害作用包括流行性感冒感染、流行性感 冒病毒'表徵個體之流行性感冒之症狀及/ . 行性感冒相關之作用或其組合。 机 • i在本發明之-些實施例中，可攜帶診斷工具配備有合適 里之、、且件用於執行多次檢定，而無需離開現場或有損無菌 f>-《隔離狀態°在—些變體中’可攜帶包裝包括足以執行至 2 10次現場診斷、較佳約2㈣現場料、更佳約5〇次現場 0斷且最佳約1GG次現場診斷之量的各經選定用以偵測及/ 或識別生物體之組件。在較佳變體中，可攜帶包裝包括至 夕足夠執仃複數次現場分析且同時保持診斷工具之可攜帶 性的組件。所存在組件之量之另一量度係在現場長時間段 内識別生物體所必需之各類型組件之足夠量。舉例而言， 此時間段可為約6小時至2週，較佳為12小時至丨週。 ii 在其他較佳實施例中，診斷工具係耐久及穩定的，特別 是在儲存及傳遞期間，並且較佳在現場使用期間如此。診 斷工具之組件係經硬化，使其可於約18它至27它，且較佳 約20 C至25 °C之儲存溫度下耐降解。 除耐溫性之外，根據本發明可攜帶包震及内含物較佳亦 經調繫及配置使其可阻止或防止其中組件之物理損壞及/ 或破損。包裝無需完整’且可包括間隙、孔或突出物以便 傳遞或儲存。產品亦可以模組化形式（諸如發泡包裝）排列 使得各種類型組件可單獨儲存或需要時一起儲存。舉例而 124810.doc -17- 200827450 :之=組：保存所有產品組件，或各模組可保存一種類 、、且。較佳地…個模組包括穩定化組份，且在冷卻 "(亦於至溫，諸如在低於4°C之冷藏條件下，或 更佳於^東條件下）單獨儲存，直至準備將產品傳遞至遠 距離現％地點。可藉由任何習知方式將經冷卻模組與其他 模組化組件組合或併入以形成完整產品。 ’

义佳地’其為足以抗滲水之完整包裝，且包裝較佳為防 ^的。在-些變化例中，可攜帶包裝視情況包括促進可攜 :性,器#，諸如拉手、綁帶等。在其他變化例中，可攜 帶包裝—可扣緊及可再密封之開閉構造，其使得可存取 組件、女全儲存可攜帶包裝，及/或維持經殺菌之組件， 例如7或多個門或掀頂拉手、拉鏈、閃鎖或其類似物。 /本身了由發明所屬技術領域中具有通常知識者可獲 得之任何具有足_性之包裝材料製成，其可保護易損二 内含物（諸如玻璃H瓜或PCR設備）或另外幫助增加產品組 件之整性，尤其是所存在之任何凍乾試劑或樣本。較佳 也匕名及組件係由除玻璃以外的合適且不易破碎之材料 製成，以利於將包裝運送或傳遞至現場地點。可用於形成 可攜帶包裝之包裝材料實例包括：鋁或塑膠薄片、發泡包 裝、硬紙板或其他紙板，或聚合或其他塑膠組份（諸如熱 塑性聚烯烴或溫度穩定性聚合物）。舉例而言，彈性包裴 材料可包括溫度穩定性聚合物，諸如丙烯均聚物或至少5〇 莫耳％丙烯與至少一種其他C2至α_烯烴之共聚物，或 其此合物。遠等共聚物之例示性α•浠烴包括乙烯、1 · 丁 124810.doc -18- 200827450 烯、1-戊烯、1-己烯、甲某】_ 那τ暴+ 丁烯、甲基+戊烯、 及1-癸烯或其組合。 〒碎 可經由任何可用方法形成包 力乂 l裒，该方法可由一般技術者 根據材料類型進行選擇。舉你 ^ 例而g，聚合材料可經模製或

擠出。雖然包裝可具有足以封I 丁褒組件之任何形狀，但較佳 地包裝具有足夠穩定（例如平括沾、 田…… 十坦的)而使其不會在儲存或使 用期間傾翻之底部。包裝可 匕忒了經布置成展開成桌子（若需 Ο c 要）’其中關閉時桌腿向内摺属故氺 η强$起來且打開時包裝之外表 面形成桌面。在執行本發明之方法時，可將内含物置於打 開之桌子上以提供便利的工作臺。可設想包装之其他便利 布置，諸#打開後形成彳置於現有桌子上之搁架。 診斷產品包括之-或多種類型之收集裝置詩自宿主捕 獲:收集或以其他方式取得目標試樣，且接著容納或保存 1式樣以供進-步分析。試樣可包括組織、血液、唾液，或 可測試試樣中所存在之微生物之基因體物質的其他生物製 。口。可使用任何合適的收集裝置實現此目標。舉例而言， 可使用拭子收集黏膜樣本。較佳自皮膚、鼻腔、口腔或其 組合收集樣本。需要時，可抽取血液以獲得必需樣本。較 佳地，收集裝置係無菌的。其他較佳收集裝置為與用處理 機器分析、檢定組合物及體積及/或可攜帶性之尺寸要求 或如本文所述之診斷套組所提出之尺寸要求相容之裝置。 如本文進一步所討論，應包括足夠數目之收集裝置以便可 在危機事件中長時間段於現場使用診斷產品。 在一較佳實施例中，將目標試樣或其組織或細胞在收集 124810.doc -19 - 200827450 後立即或在收集後不久即刻 J力以保存。較佳地，對目標試 樣進仃處理以殺死其中所含之生物體。本發明之一較佳實 知例包括一種固定及僂栌 料組合物，其通常為《且較佳為 乳液或懸浮液。固定及傳遞組合物幫助最小化或消 除樣本或環境之污染，以及抑制或防止樣本漏出。較佳 地’固^及傳遞組合物包括醇（例如乙醇）、硫氛酸納 (sodium cyothianate)、異硫氰酸胍或其組合。可使用任何

合適的固^及傳遞組合物（本文亦稱為,,固定及傳遞劑藉 由破壞生物體之細胞膜來殺死（亦即固定）生物體。接著可 更安全地將試樣傳遞至檢定地點，該檢定地點可在房間内 患者的對側、位於附近房間中，或甚至更遠，諸如穿過街 道或位於現場地點之不同區域。舉例而言，可在一帳篷或 房間内自患者收集基因體物質，而檢定及pcR設備係位於 附近，諸如幾分鐘車程之内。可將收集裝置在暴露於固定 及傳遞組合物之後乾燥，但較佳地收集器係保留於組合物 中直至即將開始檢定。 目標試樣之收集及固定可如下安排。可使棉拭子與宿主 之鼻腔接觸。接著將所收集之生物體固定。Krafft，A.E.等 人，Evaluation of PCR Testing of Ethanol-Fixed Nasal

Swab Specimens as Augmented Surveillance Strategy for Influenza Virus and Adenovirus Identification，Journal of

Clinical Microbiology，2005 年 4 月，第 43 卷，第 4 期，第 1768-1775頁（其以明確引用之方式併入本文）中概述了根據 本發明可進行之一種固定步驟。Chomczynski及 124810.doc • 20 - 200827450

Sacchi(1987’ Anal· Biochem 162·· 156-159)中提出了 藉由使 用異硫氣酸胍完成固定步驟之另一種方法。

將拭子心入或置於醇中以殺死生物體細胞，同時充分保 存4樣以供刀析。如本文所用，,,保存"意謂在固定過程中 未不田皮壞生物體之核酸物質以便可執行檢定及識別。固 定產生無需低溫保存之有效安全之試樣以致可經由標準郵 件（若需要）傳遞且甚至運送非存活試樣。此夕卜由於試樣 已被权死，因此不存在在遞送者或與樣本運送相關之人員 (若舄要）中另外爆發或感染之危險。舉例而言，即使可於 現場執行整個方法，亦可能需要於實驗室執行檢定及識 別，作為首次試驗或作為第二欠試驗用以癌認現場識別之 結果。在一較佳實施例中，固定及傳遞組合物包含可使用 診斷工具之組件處理之無危險經固定試樣。 另外，可以固定及傳遞組合物不同地使用及儲存第二收 集裝置。舉例而言，收集裝置中亦可包括第二拭子且用其 自宿主收集樣本用於第二次檢定或不同類型之檢定（諸 如，於地區實驗室中或於不同設備上）以便稍後幫助確認 診斷。舉例而言，一個拭子可用於在現場地點收集基因體 物質及檢定生物體，而第二拭子可收集基因體物質且安置 於冷卻包裝（諸如冷藏或冷凍機單元）中長達約4天，較佳能 夠被傳遞至遠距離實驗室進行進一步分析。第二拭子可用 於幫助識別生物體及測試新的疫苗候選者。適用於本發明 之可攜帶冷藏器之一實例為可由American Themai

Wizard

International購得之 American Thermal Wizard。 124810.doc -21 - 200827450 提取構件係用於提取基因體物質或其他相關生物材料用 以表徵及識別目標試樣中之一或多種生物體。如本文所 用，π基因體物質"包括核酸，諸如RNA及/或DNA，其提供 如一般技術者已知的有利於識別及表徵所關注生物體之資 訊。如熟習此項技術者所知，缓衝液、離心機、注射器等 為適用於本發明之例示性提取構件。合適的提取技術包括

Matthews，C.K.等人，Biochemistry，Second Edition，The Benjamin Cummings Publishing Co·，1996及 Tortora，G.J·等 人，Microbiology: An Introduction, The Benjamin Cummings Publishing Co.，1992(其以明確引用之方式併入 本文）中概述之技術。一般而言，所提取之基因體核酸係 約0.1¼升至約1〇,〇〇〇微升，更佳約1微升至約1〇〇〇微升且 更佳約10微升至1〇〇微升之量存在。例示性核酸量為25微 升。 對於提取構件及診斷工具中之其他裝置及/或器件，較 U 佳將設備及識別環境維持於無菌或無污染狀態。在某些實 轭例中，衫斷工具可視情況但較佳地包括如熟習此項技術 者已知的用於殺菌或維持無菌之一或多個組件。亦可選擇 固定劑以提供適當滅菌，此可為一種減少於現場有效地運 ' 作所必需之不同可選組件之數目的理想方法。 在本I明中，當PCR組份較佳地包括於產品中時，其較 佳地適合於可攜帶性及現場使用於分析。一例示性PCR檢 疋匕括如 Das，A·荨人 ’ Development of an Internal Positive for Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus 124810.doc -22- 200827450

Infections by Real-Time Reverse transcriptase-PCR with Lyophilized Reagents，Journal of Clinical Microbiology, 2006年9月，第44卷，第9期，第3065-3073頁（其以引用之 方式併入本文）中概述之即時逆轉錄酶-PCR(rRT-PCR)。用 於執行rRT-PCR之一例示性方案亦包括於Das等人之發表文 獻中。 在較佳實施例中，將預先選定之PCR試劑於一或多個 PCR適用容器中預混合以包括目標引子及探針。在最佳實 施例中，該等容器經調適及配置而可與所選PCR機器（亦即 PCR裝置）相容、一起操作及一起運作。舉例而言，可將大 小及尺寸經設計成可與所包括之PCR裝置可操作地聯結在 一起之毛細吸管直接插入相容PCR設備中以快速使用。根 據本發明之某些實施例，此等毛細吸管含有經調適及配置 以用於PCR裝置中之基因體物質的穩定化濕潤試劑。在一 較佳實施例中，所有PCR試劑均經穩定化。穩定化試劑可 已安置於PCR儲料裝置中，稍後向其中添加包括所提取基 因體物質之液體。或者，PCR可用容器可包括可普遍適合 各種PCR機器之穩定化材料或小球體，或可將診斷產品中 之穩定化PCR材料放入含有所提取基因體物質之溶液或其 他液體中。接著將溶液添加至PCR儲料裝置，接著可將其 置於PCR機器中。在一實例中，PCR儲料裝置含有穩定化 材料，且向其中添加呈溶液形式之所提取基因體物質。或 者，作為另一實例，可將穩定化材料添加至光析槽中，向 其中添加呈溶液形式之所提取基因體物質，或者可將呈溶 124810.doc -23 - 200827450 液形式之所提取基因體物質添加至光析槽中，向其中添加 t定化材料，且接著可將適當量之該溶液添加至儲料 裝置（例如吸管）中，且置於PCR機器中。 在本發明之另一較佳實施例中，將用於容納及檢定所選 類型樣本之所需PCR組份預先裝載至一或多個容器中，且 接著進行穩疋化以維持容器及其内含物之品質以便在將所 提取基因體物質併入後即可用於現場使用。 PCR^疋杈佳地包括於現場使用之產品中，且涵蓋偵測 生物體之基因體物質。因此，在較佳實施例中，pCR組份 之至少一種試劑包括對於一或多種預定生物體之偵測具有 特異性之一或多種引子及/或一或多種探針。診斷工具較 仫包括用於識別某些特定生物體而預定及預選之引子。如 本文所用，引子為用於偵測特定基因體物質之組合物，諸 如正向及反向引子，且探針為與微生物序列結合用於擴增 之序列。PCR提供可與特定引子及/或探針化學結合之擴增 基因體物質。在一些實施例中，引子、探針或其組合可包 括與所偵測生物體之遺傳物質化學結合之反義核酸序列。 在/、他實;^例中，引子、楝針或其組合與對於自生物體提 取之基因體物質具有特異性之蛋白質或組份化學結合。此 特異丨生有利於快速識別生物體及/或分亞型，例如包括A型 流行性感冒病毒亞型HI、H3、H5、H7、H9，此可由一般 技術者特別參考本發明而容易地判定。舉例而言，若在檢 定中對於H5N1型流行性感冒病毒具有特異性之引子及/或 探針化學結合，則證明在標靶試樣中偵測到及識別（例 124810.doc •24- 200827450 如）H5型流行性感冒病毒。 0斷工具中所包括之引子、探針或兩者之類型較佳由一 般技術者預先選定。在一些變體中，包括種類廣泛之引 子探針或其組合以偵測及識別相應種類廣泛之生物體中 之任者，特別是在當使用診斷工具時事先不瞭解預期生 物體類型之情況下。在懷疑特定生物體（例如H5Ni型流行 性感冒病毒）之情形下，裝入可攜帶包裝中之引子、探針 或其組合之範圍可集中於H5Ni型流行性感冒病毒及具有 相似基因體組成之流行性感冒病毒，或可專用於流行性感 冒病毒。對於SARS之偵測，引子、探針或其組合可為對 於SARS病毒具有特異性之序列。另外，引子、探針或其 組合可對SARS病毒株或亞株序列具有特異性。pcR組份可 包括冗餘量之引子及/或探針以確保所懷疑生物體及其基 因體之偵測。引子及探針庫通常隨新生物體基因體序列之 測定而增加，從而為診斷產品之未來使用提供更多合適的 Q 引子及探針選擇。可與本發明結合使用之某些圖譜、引子 及探針之描述包括Das發表文獻（其以明確引用之方式併入 本文）中所述之彼等。較佳地，設計流行性感冒病毒引子 及探針用以偵測涵蓋八或3型，且更佳地涵蓋16個^1亞型之 各者及兩個B譜系之各者的至少一種流行性感冒病毒菌株 株。 在一尤其較佳實施例中，PCR組份為以混合物形式存在 之包括一或多種微生物引子、探針及酵素或其任_組合之 試劑。此混合物可另外包括標準pCR組份，諸如水、緩衝 124810.doc -25- 200827450 液、核苷酸、聚合酶或A ^ # •φμ"、、θ 物或其任一組合。在此項技 術中準組伤之混合物彳纟& 物拉…工” 物。可將-或多種微生 物特異性引子、探針、酸备 酵素或其任一組合添加至主混合物 中而形成基本混合物。其太、β入^ 基本混合物可具有一種、兩種、三 種或四種或更多種微生物引 千抓針及/或酵素。微生物 弓子、探針及/或酵素通常可對傳染性病毒因子或細菌因 子具有特異性’或對特定料，諸如與流行性感冒、登革

C 熱、癔疾、HIV、SARS、MRSΑ及肺結核相關之因子具有 特異性。在-較佳實施例中’基本混合物中之引子、探針 及/或酵素對流行性感胃病毒株A、B或兩者具有特異性。 在另一實施例中’引子、探針及/或酵素對諸如HI、H3、 H5、H7及H9之流行性感冒病毒亞株具有特異性。在另一 實施例巾，針對所有流行性感冒病#亞株（HUM及 N1-N9)及兩種主要B型流感循環病毒株之引子、探針及/或 酵素。 舉例而言，適用於本發明之對於流行性感冒病毒株或類 型，或亞株或亞型具有特異性之某些引子及探針呈現於圖 5中。圖5之棟針為位於正向及反向擴增引子之内的寡核苦 酸序列。此等寡核苷酸係經雙標記，含有數種類型5,榮光 報導體（例如6-羧基螢光素N-琥珀醯亞胺酯（FAM))之一及 數種類型3’抑止劑（TAMRA、MGB深色抑止劑等）之一。流 行性感冒病毒株A及B之序列係位於RNA片段7上，RNA片 段7包括兩個基質基因Ml及M2之開放閱讀框架，該等開放 閱讀框架在流行性感冒病毒株之間高度保守。流行性感冒 124810.doc -26- 200827450 之序列係位於RNA片段4上，魏片段（編碼血球 列位2 =白。核㈣"Υ"及，，R"為展現高度變異性之序 中所包括之簡幷核普酸’且分別表示核芽 主 田土因體内特疋核苷酸位置處存在病 毋株之間的遺傳變異性時，使用簡幷鹼基。

C u π、且~可為如本文所討論之任何組份或可為或可包括 :處合物’其係以足以溶解所提取之基因體核酸物質之 里存在。當將組份;東乾時，必需在併入所提取、經固定之 基因體物質之前、之時或之後經添加水或其他合適溶劑使 材料復水。將裝有基因體物質之咖容器置於PCR機器中 歷時才曰疋之時間段。舉例而言，檢定時間可歷時約Μ分鐘 至180分鐘，較佳約45分鐘至15〇分鐘。在一更佳實施例 中’檢定時間為約60分鐘至12〇分鐘。在pcR組份為基本 混合物之實施例中’較佳可在自提取開始大約90分鐘内完 成偵測。此等時間意欲涵蓋dna擴增以及r财擴增之較佳 :夺間，RNA擴增包括逆轉錄酶步驟中將rna轉化為歷之

5刀鐘 般技術者可根據待檢定之物質及所選pcR 裝置類型容易地確定確切時間。 在車又佳實施例中’根據本發明所用之pcR試劑係經設計 為至少大體上穩定且更佳為穩定。具體而言，本發明之基 本此合物形式之試劑較佳在室溫下大體上穩定，且此穩定 性如圖1及圖2所示經量測及標準化。圖i說明病原體制 :劑之穩定性。此處所選之標準為職克來自A型流感病 毋及H5型流行性感冒病毒之初始cRna ^將a型流感病毒 124810.doc -27- 200827450 及H5型病毒樣本儲存於_2〇°c、4°C及室溫下（約25°C)。沿Υ 軸為記錄讀數時已執行之PCR循環數。本發明所定義之穩 定性為基本混合物之功能穩定性，其係藉由經擴增及螢光 债測序列來指示。在圖1中，藉由偵測序列（初始樣本含有 1 pg cRNA)多達35個PCR循環來指示功能穩定性。以 指出表示樣本陽性讀數（及由此其偵測結果）之基線螢光含 塁。循環臨限值（CT)定義為螢光性通過臨限值時的分數循 p 數。臨限含量為即時檢定中CT測定所用之ARn。此含量 a又疋在基線以上且足夠低以致其處於擴增曲線之指數生長 區之内。ARn為由指定PCR條件組所產生之信號幅度 (△Rn=Rn-基線）。（參見 ABI Relative Quantificati〇n Users

Guide for 7300/7500/7500 Fast Systems ^ Copyright 07.2006) 如圖1所示，穩定性定義為於起始樣本中使用i pgcRNA 在35個循環或少於35個循環下達到Ct之能力。因此，，，大 ϋ 體上穩定，，涵蓋在將本發明之基本混合物儲存於指定溫度 下歷經一段時間之後在1 Pg下經由不超過35個PCR循環可 偵測到之基本組合物。舉例而言，，，大體上穩定，，包括於室 溫下儲存長達約2週、較佳長達約4週且更佳長達約2個月 A甚至約3個月之基本混合物，其中如藉由在ι叩之量下 在不超過35個PCR循環内進行價測所量測，基本混合物仍 口、毛揮作用以達成其預期目的。在低於室溫之各種測 試溫度下，基本混合物歷時甚至更長時間段亦至少大體上 124810.doc •28- 200827450 圖2為病原體偵測試劑穩定性研究，其中cRNA初始量為 1毫微微克。此處cRNA係來自A型流感病毒、流感病 毒及H5型流行性感冒病毒。圖i及圖2說明所選擇之本發明 之基本混合物試劑於所有三個溫度下之優良穩定性。如自 曲線圖可見，對於所有三種病毒基本混合物試劑於_2〇它 及4 C下至第22天時仍保持穩定。室溫下之穩定性曲線亦 令人驚訝，持續約2週或更久。另外應注意圖丨及圖2中第

Lj 21天附近之偏差很可能係歸@於樣本尺寸極小之事實。如 自曲線圖可觀察到，第22天之測試結果顯示返回與早期測 試曰-致之仙水平，從而表明可合理預期第取以外之 穩定性。 基於圖1及圖2中呈現之資料，當將樣本保持冷束於 約-抓至約（TC下，冑將樣本諸如於代以上至約代之冰 箱中於冷珠條件以上料及#將樣本於冷藏溫度以上至室 溫下（諸如在約rc至約2rc之範圍内）儲存時，達成長時間 段之實質穩定性。在另-實施例中，冑質穩定性甚至可於 約沉以上至赋或約2rwc之溫度下產生。在不受 理論限制之情況下’據認為溫度愈低，樣本將愈久保持稃 定。舉例而言’樣本可於冷;東時保持穩定3_6個月，在卜 藏時為1-4個月，而在室溫下為約丨個月。 7 較佳地可藉由W項技財6知以種方式來達成 性，諸如藉由將組料乾。在—實施例t，可藉由將㈣ 明之柬乾組份維持於室溫以下直至產品準備進行: 遞或使用來增強穩定性。基於如上、、専 又所时蜗之穩定性研究 124810.doc -29- 200827450 資料，可達成穩定性並將其維持至少2個月、更佳3個月之 時段。 可藉由將所有PCR試劑在裝入包括於包裝中之容器中之 前或在與容器結合包裝（例如薄片或發泡包裝）之前束乾來 達成此穩定性。Das，A等人，Deve/opme价〇/ αλ2

Positive Control for Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus Infections by Real-Time Reverse transcriptase-PCR p 从⑽紐⑸d 心（如上所述）中描述了凍乾程序及 試劑。然而，應注意Das論文中之試劑凍乾僅包括主混合 物（核苷酸、緩衝液、聚合酶）之凍乾。 根據本發明之一實施例，將凍乾試劑安置於pCR適用容 器中。有利的為包括並使用凍乾法對所有PCR試劑進行處 理可達成以下各項中之一或多者：以最小工作量來檢定及 以另外方式偵測及識別生物體，尤其在困難環境中或在困 難條件下；由於最小化或避免組份降解而增加檢定可靠 1/ 性；使本發明之診斷工具需要較低技術操作者，·及確保所 有組份之較高耐久性。 可藉由一般技術者所知之任何適當方法來達成穩定性。 雖然凍乾法係製備本發明之基本混合物之一較佳實施例， 但亦可將試劑包囊於（例如）脂質體或石蠟微珠中，如一般 技術者可容易地判定其在PCR中於典型操作溫度下解離。 由於通书於約5〇 c下執行PCR方法，因此可將脂質體或微 珠没计為於此溫度下熔融或溶解。亦可藉由將呈液體形式 之基本此合物之所有組份提供於試管、96孔盤或塑膠或玻 124810.doc -30· 200827450 璃毛細官中來達成穩定性。一般技術者可根據本文所提供 之扣導設想出用於達成本發明之基本混合物之必需穩定性 之其他可用方法。 在利用PCR儀器、引子及/或探針進行基因體核酸檢定之 可對結果加以分析。根據化學指示劑、顏色及基於反 應之其他可觀察結I，一I技術者通常可知一或多種引子 及/或探針疋否已與一或多種生物體相聯。舉例而言，可 藉由螢光性偵測引子及/或探針與生物體遺傳物質之間的 肖合以便_生物體。在本發明之某些實施例中，套組包 括用以提供關於那些探針（若存在）提供陽性結果（例如，陽 性結果為由對於生物體具有特異性之探針偵測到該生物 體）之診斷資訊的分析器。在一些實施例中，分析器係與 PCR檢定合併。 在私疋及識別之後，本發明之診斷產品視情況但較佳地 亦包括必需醫藥劑以及醫藥學上可接受之載劑，以在現場 U &療與生物體相關之疾病或病況或與其相伴之-或多種症 狀。雖然該等醫藥組合物可與產品一起包裝，但較佳地其 係、與產品分開包裝’尤其在習知醫藥組份之穩定性低於凍 • ϋ組份之情形下。此允許將具有較長存放期之醫藥組合物 纟即將使用或傳遞至現場地點或附近儲存地點之前包括於 可攜帶包褒中或與其其他模組化組件包括在__起。較佳 地，視所债測及識別之生物體而定，診斷產品包括複數種 足=預防或治療由所選擇之生物體引起之一或多種病況之 μ里及數里之所需醫藥組合物。較佳地，以習知方式將此 124810.doc -31 - 200827450 等醫藥組合物調配為所需劑型及濃度，諸如錠劑、膠囊、 貼片、溶液、洗劑或其類似劑型。適當時，可針對特定類 型之病原體提供不同劑量濃度。實際上，基於（例如）現場 位置、第-線救護員報告、先前經驗或其類似因素，視一 般技術者可能遇到的預期生物體或患者群體而定，可攜帶 包裝可裝有任何種類之不同組份’諸如活性醫藥成份：舉 例而5 ’若預期患者為小兒或老年人，則可選擇較大部分 之液體調配物。

活性醫藥成份視情況（但較佳為在可攜帶包裝中）可包括 -或多種疫苗、生物製劑、治療劑、藥物、預防劑、組合 物€例如免疫原性）、解毒劑、治療劑、治癒劑或針對治: 或預防所選生物體之任何其他醫療物品。舉例而言，若識 別某些流行性感冒病毒株，則診斷工具可包括 Tamiflu®(Roche Pharmaceuticals Inc., New Jersey, USA)^ 以治療相應流行性感冒感染。若識別某些細菌，則診斷工 具可包括某些抗生素，諸如阿奇黴素（azithr〇mycin)，以有 效治療相應細菌感染。在任何情況下，劑量應以治療或預 防有效量存在。 在根據本發明之一實施例之原型檢測且微生物為病毒 時，可將自拭子或組織樣本提取之RNA添加至基本混合物 中。視情況，可將對照品添加至混合物。對照品可為諸如 目標微生物之cRNA的陽性對照，用以進行比較而確定樣 本身份，及/或陰性對照，諸如不含RN A酶之水。對照品 亦可同時或相繼分別進行測試。接著，可依本文之指導並 124810.doc -32- 200827450 結合發明所屬技術領域中具有通常知識者之知識，將已添 加待識別之RNA序列之基本混合物於任何適當PCR儀器上 操作。偵測在自提取出樣本之時開始約90分鐘内進行。在 使用基本混合物之檢測中，僅需要極少數目之微生物序列 複本即可完成識別。圖3為約〇.1 ng至10 ag之標準濃度曲 線’其顯示了在10 ag濃度下僅具有10個序列複本之樣本 的螢光性項數。如圖3左上方所示之跑膠係用以驗證螢光

性曲線中所示之資料。圖3中，B型流行性感冒病毒為所識 別之樣本。如曲線所示，10個複本足以用於識別。另外應 注意，根據本發明，有可能在5個或更少序列複本之情況 下識別序列。 本發明之方法包括偵測微生物序列，其包括自生物樣本 獲得基因體物質，及藉由將樣本物質添加至基本混合物中 來檢定基因體物質（亦即核酸）。在本發明之某些實施例 中，基本組合物之組份可以液體形式存在於一或多個實驗 容器中’諸如試管、96孔盤或塑膠或玻璃毛細管。檢定較 佳適合以任何PCR儀器來進行，PCR儀器亦可包括可講得 或此項技術中已知的任何榮光儀器以用於即時_ 序列。 切 本發明之基本混合物亦可用 齡一〜丄 疾病監測。疾病易感性診 斷仏疋可為本發明之增強性 注退傳基本混合物檢定，其提佴 關於一或多種細菌或病基 、捉供 額外醫學資訊，諸如由 呈現對已知樂物治療方 w几注之已知逍傳多熊參 所產生之抗性標記。 m現象/大變 124810.doc -33 - 200827450 舉例而言，逐漸增多的由美國患者獲得之A型流行性感 冒病毒（H3N2)分離株展示92.3%含有已知與金剛烷抗性（例 如金剛烷胺及金剛乙胺）相關之M2基因胺基酸31(S3in)處 之改變，且8個A型流行性感冒病毒（H1N1)病毒株中有2 = 含有相同突變（JAMA，Bright等人，2〇〇6)。A型流行性感冒 ，(卿)及一些H1N1病毒料之金剛烷抗性使得抗病 毒抗性之快速（救護地點）監測之臨床重要性變得突出。根 〇 縣發明之—實施例，基本混合物可乾向對於神經胺酸酶 抑制劑之抗性標記（例如，藉由使用探針）。 可如下確定對於特定病毒株及亞株之流行性感冒病毒識 別。應瞭解根據本發明可靶向任何病毒因子或細菌因子， 且本文大部分對流行性感冒病毒之提及可以任何其他合適 的病毒因子或細菌因子替代。首先，藉由上文概述之方法 執行檢疋以判定樣本中是否存在流行性感冒病毒病原體。 右樣本中存在傳染性流行性感冒病毒，則執行第二次測試 υ 以判定病毒是否為流行性感冒病毒株a或Β。若識別生物 體=A型流行性感冒病毒，則可執行一或多次額外測試以 判疋亞型，諸如H1、H3、H5等。較佳地，此舉均使用相 同樣本來達成以便不再需要患者或個體之額外樣本。或 者針對多種病毒株及亞型，使用患者樣本及引子、探 針、酵素或其任_組合執行單一測試。 使用本發明之基本混合物可賦予幾個優點。首先，當基 2此合物已組裝於適用於插人PCR裝置之容器中時，不必 於一地點儲存多份個別試劑及過量實驗設備或將其裝入本 124810.doc -34- 200827450 發明之可攜帶包裝中。此於不易進行儲存、冷藏、傳遞或 其任一組合之區域及需要移動性之區域尤其有益（因為不 再需要傳遞及儲存個別試劑）。使用預組裝基本混合物之 另一盈處在於識別過程得以簡化，從而需要較少時間、較 少混合及吸移、較少容器清洗或回收及較小量測誤差容 限。簡化過程可減少使用者誤差及污染之機會，且可有利 地加快檢定結果。 Ο

L 另外，基本混合物使得可簡便且快速地偵測樣本微生物 序列s剷之病原體及疾病抗性偵測方法要花費長達數天 時間。相比而言，藉由使用本發明之基本混合物，在一實 轭例中可在約90分鐘内完成谓測。如圖w所說明，可使 用任何標準PCR儀器及少量起始序列來完成㈣。使用 100萬個序列複本之起始量，可在少於35個循環中完成積 測。改良谓測使得可識別較少量之樣本。此於需要由單一 樣本執仃夕一人測试，其中要留下額外樣本以用於其他測試 之h心下尤其有利。在樣本可能因運輸或暴露而受損及較 少完整樣本心測試之情況下此特徵亦可為有益的。 广驚訝的是基本混合物展現明顯增加的穩定性，可於 室溫下持續數天或更久。 在另—更佳實施例中，基本混合 勿於至溫下展現實質穩定性歷時至少約2週且長 非傳、切境中時均具有高度靈活性。 聚擊自然k害或處於戰場中的地區中使 124810.doc -35- 200827450 用。本發明可在機場及邊境站使用以幫助最小化或防止受 感染個體傳播疾病。 此外，基本混合物可提供高度使用靈活性及相容性。基 本混合物適用於數種rRt PCR型式，且可於反應容器中備 用以進行直接及立即分析。基本混合物可用於任何提取或 純化套組，且可包括此項技術中可用的任何標準主混合物 組份（緩衝液、核苷酸、聚合酶）以及本文所述之組份。 應注意本發明涵蓋獨立於任何器件或套組而存在之單獨 基本混合物。本發明之獨立額外實施例係針對基本混合物 與其他器件、套組等一起之用途。 如本文所用，一般技術者可理解，，有效量，，為將提供對抗 生物體、其感染或生物體或其感染之症狀或其任一組合的 治療性、預防性或其他方式之有益作用。 如本文所用，術語”快速”涵蓋短於習知偵測及識別方法 所用時間的時間段，習知方法通常包括培養目標試樣，·將 其運达至實驗室（通常以冷鏈模式）；檢定所提取之核酸； 及接著分析檢定結果。在某些實施例中，使用診斷工具之 組件（亦即執行從開始收集到檢定之方法）之時間係少於約 24小時、更佳少於約12小時、甚至更佳少於約6小時且進 -步更佳少於約3小時。在較佳實施例中，自收集步驟開 始在約30分鐘至3小時、較佳約45分鐘至15〇分鐘或更佳約 60分鐘至2小時内執行全部檢定步驟。在一較佳實施例 中，自收集步驟開始在約5至150分鐘、較佳約1〇至12〇分 鐘内完成檢定。在另一實施例中，自收集步驟開始在約】 124810.doc -36 - 200827450 至120分鐘、較佳約5至90分鐘内執行檢定。在某些較佳實 施例中，識別步驟可在自收集步驟開始與上文針對檢定步 驟所述相同之時間範圍内進行。 Ο 如本文所用，術語"有效"涵蓋本發明之診斷工具及方法 與此項技術中之工具及方法之間的比較，後者需要一或多 個額外步驟，包括確保培養樣本之存活力，將樣本運送至 遠離收集地點之遠距離場所或兩者。習知方法通常需要傳 遞至具有足夠安全性之實驗設施來處理有害病原體，而本 毛月女王地將偵測檢定移至現場進行而可快速偵測及監 測0 如不又所用 曰保珥稼”马 ▼㈠工W肢伯工队采Μ贤1貝 測、識別或兩者之生物樣本。如本文所用，術語"患者本 文可互換地稱為”宿主”或"個體”）係指可能受生物體（諸如 流订性感冒病毒）感染之任何宿主。較佳地，帛主包括任 何土類以及任何哺乳動物。在一實施例中，其包括任何烏 類宿f °在—較佳實施例中，患者包括任何哺乳動物宿 家金：如人類、鯨、猩猩、狗、1苗、牛、馬、豬、家畜及 禽專。在-更佳實施例中，宿主為人類宿主。 如^文所用’術語"套組"可用於描述可攜帶、自足式包 :之交體，其包括用於執行本發明之方法之至少—組組 枝於 Θ之方法包括收集樣本、固定樣本、自樣本提取 二斤：Γ亥例如偵測生物體之存在)及視情況分析檢 如公文勺：之貝訊以識別生物體。"套組"可極易攜帶，諸 L小，還可大些。較大套組可為皮箱大小，例如 124810.doc -37- 200827450 約1至3吸寬、約3至8吸長及約1至4叹深。根據本發明可使 用甚至更大之套組’諸如篷車或18吸卡車，其中設備係散 放束緊或可釋;^地連接或永久地連接於可移動結構。較 佳地，套組係足夠小以便易於安裝至飛機及可移動地面交 通工具上從而迅速傳遞至幾乎任何位置中之流行病地點。 μ動醫療單位或醫院可在内部裝有套組或可用作本發明套 組之可攜帶包裝。 如本文所用’術語”約”通常應理解為係指數字範圍中之 兩個數值。另外，本文之所有數字範圍應理解為包括該範 圍内之全部各整數。 實例 參考以下可用於製備或投予本發明組合物之說明性實例 進一步說明本發明。此等實例係僅用於說明性目的，而不 應被理解為限制所隨申請專利範圍。 實例1:現場收集及提取基因體物質之方案 ^ 獲取個體（諸如雞）之口咽、泄殖腔及氣管拭子。將拭子 懸浮於1.5 ml ΒΗΙ中且用RNeasy Mini®套組（製造商Qiagen of Valencia，CA，USA，MagMax Kit，Ambien)進行提取。將 RNA於60 μΐ不含RNase®之水中溶離。 實例2 :識別基因體物質之方案 餘苯揉名從痛及滅妾爹：在Department of Defense Global Emerging Infectious Surveillance(DoD-GEIS)網路之 資助下，分別經 7 個（99/00、00/01、01/02、02/03、 03/04、04/05 及 05/06)及 3 個（03/04、04/05 及 05/06)流行性 124810.doc -38- 200827450 感冒季節收集此研究中所用之所有原始初級試樣（咽喉拭 子/鼻部洗出液）及經培養樣本。在表現出口腔溫度大於等 於100.5°F之發燒及咳嗽或喉嚨痛之患者之症狀發作的最初 48-72小時内收集初級試樣。將Dacron咽喉拭子試樣浸沒 於3.0 ml病毒傳遞培養基（M4 MicroTest Multi-Microbe培養 基）中。將經浸沒之咽喉拭子及生理食鹽水鼻部洗出液物 質（5 ml)於乾冰上運送至Brooks City Base，San Antonio, TX。使用離心快速平底小瓶培養技術實現自初級試樣繁 殖流行性感冒病毒，接著使用A型或B型流行性感冒病毒 特異性單株抗體（Chemicon International，Temecula，CA)按 照廠商建議以及螢光顯微法進行分型。（Daum LT，Canas LC，Smith CB 等人：Genetic and antigenic analysis of the first A/New Caledonia/20/99-like H1N1 influenza isolates reported in the Americas. Emerg. Infect. Dis. 2002 ； 8: 408-412)。將初級試樣（培養前後）之等分樣本（0.25 ml)用作試 樣RNA之來源。 及见4之提屏··使用Qiagen M48自動化基於微珠之提取機 器人（Qiagen，Valencia，CA)以及 MagAttract Virus Mini M48套組（Qiagen，Valencia，CA)按照廠商方案完成RNA提 取，將RNA於50 μΐ溶離緩衝液中溶離且儲存於_80°C下直 至使用。 基因體引子/探針設計··良於由 Los Alamos National

Laboratory and Department of Defense 資料庫獲得之序列資 料進行引子/探針設計。類型特異性（A型及B型流行性感冒 124810.doc -39- 200827450 病毒）檢定靶向基質蛋白（MP)基因之高度保守區，且分別 基於所有16個A型流行性感冒病毒亞型及兩個B型流行性 感冒病毒譜系（B/維多利亞（Victoria)及B/亞馬它達 (Yamagata))所共有的100及50個比對來進行設計。A型流行 性感冒病毒亞型Η1、H3及H5特異性檢定乾向各別血球凝 集素之保守區。Η1引子/探針序列比對係使用於2005/06及 2006/07流行性感冒季節期間所獲得之5 1個不同地理來源 之病毒株（包括A/New Caledonia/20/99疫苗株）來完成。Η3 1 ； 引子/探針序列比對係使用於2004至2006年間所收集之140 個Η3Ν2野生株來完成。Η5引子/探針序列設計係基於代表 分枝系1及2(亞分支系1、2及3)病毒之22個Η5Ν1臨床分離 株之比對分析。所有引子及探針均係自Applied Biosystems(Foster City, CA)獲得。 令碎iir-PCi? f著：基於實驗室之Lightcycler 2.0儀器 (Roche Molecular Diagnostics)及其輕質攜帶型（50 lbs)版本 I,, 加固局級病原體識別裝置（Ruggedized Advanced Pathogen

Identification Device)(R.A.P.Ld.? Idaho Technologies, Salt Lake City，Utah)均為32孔毛細即時儀器，其使用相似組件 及操作軟體。R.A.P.I.D·係配置於硬化箱内且可於救護地 點使用。 命碎赛嘮：引子及探針序列如圖5中所示。引子 對熔點係在2°C以内且於58_6(rc下黏接/延伸。各別探針於 南於引子8-10 C下黏接/延伸。熱循環以快速、2_溫度型式 操作’其中各別擴增子之較短性質促進黏接及延伸（3〇秒 124810.doc -40- 200827450 鐘）。由於流行性感冒病毒基因體之遺傳變異性，將簡幷 核苷酸置於特定基因座處。 以單步驟、單反應容器型式執行即時擴增。使用 mtraSense Platinum單步驟定量RT pcR系統㈣如㈣ • ―，CA) ’將2 μ1 RNA添加至18 μ1含有所示最終濃度 之以下組份之主混合物中：lx反應緩衝液；邮素混合 物，其含有500 ηΜ各引子及3〇〇 ηΜ探針，探針之5，端以6_ 〇 基螢光素（FAM)報導染料標記且3,端以非螢光性抑止劑 及小溝區結合物標記。如下執行熱循環：45它下3〇分鐘及 95 C下2分鐘，分別用於逆轉錄（RT)及變性，接著進行 個由95 C下5秒鐘（變性）及6〇t下3〇秒鐘（延伸）組成之擴增 循環。根據方程式Ε=[10(-ι/斜率Μ]χ1〇〇使用&斜率法（參 見，圖4，畫面B)測定擴增效率。此處所述之所有檢定均 展現大於98.5 °/〇之擴增效率。 對於各分析，包括，，無模板，，及，，陽性”對照。將各分析之 U 基線螢光值手動調節至各別，，無模板，，對照反應之螢光值。 陽性’’對照（0.1 ng CRNA)引起螢光強度相對於無模板基線 增加（CT值介於18與22之間）。未知，，陽性，，定義為超過基線 榮光值之擴增’其中在40個循環操作中相應CT值不超過 36 °此處使用兩個平臺報告之所有原始（亦即未經培養）試 樣及經培養樣本分別展現26_35(n=144，平均值=31.5)及 17-27(11=407 ’平均值=23)之CT值範圍。 與族之產兰··用於對應於（A/B)型流行性感冒 病毒及A型流行性感冒病毒亞型旧1、H3及H5)RNA序列之 124810.doc •41 - 200827450 目標互補RNA(cRNA)模板之活體外產生的正向及反向引子 係如圖5所示。 簡言之，如下執行傳統RT-PCR :使用Superscript III單 步驟 RT-PCR 系統（Invitrogen，Carlsbad，CA)，將 5 μΐ病毒 RNA添加至45 μΐ含有所示最終濃度之以下組份之主混合物 中：IX反應緩衝液，其含有1.6 mM MgS04 ; IX酵素混合 物，其含有400 nM HA或MP引子對。於50°C下進行逆轉錄 30分鐘，接著於95°C下進行”熱啟動"步驟（2分鐘）。如下執 行熱循環（40個擴增循環）：95°C下30秒鐘，52°C下15秒 鐘，68°C下1分鐘，及68°C下最終延伸7分鐘。使PCR反應 產物（5 μΐ)於含溴化乙錠之2%預製凝膠（Invitrogen， Carlsbad, CA)上經歷分析電泳，且使用Qiaquick PCR純化 套組（Qiagen，Valencia，CA)純化剩餘產物（45 μΐ)。使用T7 MegaScript套組（Ambion，Austin，ΤΧ)按照廠商建議來執行 活體外轉錄歷時4小時。使用Turbo DNase(Ambion，Austin， TX)對反應物進行核酸酶消化且隨後使用MegaClear套組 (Ambion，Austin，TX)力口以純化。使用 NanoDrop(NanoDrop Technologies，Wilmington，DE)分光光度計定量 RNA，將其 分成等份且用作對照cRNA。 游铲鑀；t β :使用Τορο 2.0選殖套組（InVitrogen， Carlsbad, CA)對經純化擴增子進行選殖且使用Big Dye Terminator ν3· 1試劑套組定序。使用Dye Ex 96孔盤套組按 照廠商建議（Qiagen，Valencia，CA)移除未併入之螢光核苷 酸。使用 ABI 3100 遺傳分析儀（ABI Inc·，Foster City，CA) 124810.doc -42- 200827450 執行核苷酸定序。 ： 如圖6中所示，A型及B型流行性感冒病毒類型特異性檢 定分別偵測出所有已知A型流行性感冒病毒血球凝集素亞 型（H1-H16)及兩種B型（亞馬它達譜系及維多利亞譜系）病 毒。重要的是在A型與B型病毒特異性探針之間未觀察到 '交叉反應性，從而證實此等檢定極具特異性。（A型流行性 感冒病毒H1-15亞型之總RNA係自Dr· David Suarez， (、 ·

Southeast Poultry Research Laboratory, USDA Agricultural

Research Service，Athens，Georgia 30605獲得。H16 RNA係 由 Dr· R.A. Fouchier 及 A.D. Osterhaus，Department of Virology，Erasmus Medical Center，The Netherlands提供。 B型流行性感冒病毒參照病毒株係自Department of Defense Global Emerging Infectious Surveillance(DoD-GEIS)網路獲 得。） q 最初使用180個存檔的臨床分離株評估a型流行性感冒病 毒亞型HI、H3及H5特異性檢定。如圖7中所示，在盲蔽方 式研究中178個樣本經正確分型及分亞型；相當大數目之 樣本經識別為A型流行性感冒病毒（91 %)，其餘（亦即9%)為 B型流行性感冒病毒。在a型流行性感冒病毒樣本中，H3 亞型最為普遍（93.2%)，其餘6.8%為H1亞型。兩個樣本 (Columbia特區）經測試呈流行性感冒病毒陰性（使用文中所 報告之類型及亞型檢定）且稍後經證實為B型科沙奇病毒 (Coxsackie B)及腺病毒（資料未顯示）。與類型特異性探針 124810.doc •43- 200827450 之無父叉反應性相一致，亦未觀察到亞型特異性探針之交 叉反應性，亦即m、H3及H5檢定之交又反應性。此外， 同時測試40種常遇細菌/病毒且不使用表j中所列之任一類 型及亞型特異性引子/探針進行擴增（資料未顯示）。 使用未經培養（低病毒力價）之初級試樣於救護地點對流 行性感冒病毒分型及分亞型對於展開監測而言至關重要。 圖8中顯不了 167個未經培養之初級臨床樣本之分析。在 p I67個試樣中，1〇0個得到正確識別，亦即分型（A型或6型 流行性感冒病毒，分別為6〇個及4〇個）且八型樣本經分出亞 型為H1或H3，分別為12個（20%)及48個（80%)。此外，67 個陰性流行性感冒病毒樣本隨後經確定為流行性感冒病毒 培養陰性。在60個A型流行性感冒病毒樣本中，16個樣本 與原始培養資料相反最初經測試呈流行性感冒病毒陰性。 1 〇〇個机行性感冒病毒試樣中有丨6個未能偵測可能係由於 各別引子/探針結合區中之鹼基對序列，，漂移”，其中低於臨 ο 限量之提取目標RNA係由於-8(rc下之長期儲存/降解及不 良樣本收集。因此，將所有16個樣本之等分樣本移除且轉 移至單層PMK培養管及平底小瓶中進行進一步分析。48小 時後，藉由類型特異性rRT-PCR及標準免疫試劑螢光染色 16個富集樣本之平底小瓶中有丨〇個經測試呈陽性。此後每 曰檢查/篩檢剩餘6個樣本，且在接種後5天6個樣本中有3 個經測試呈陽性且在接種後9天剩餘3個經測試呈陽性。藉 由序列分析進一步驗證所有16種A型流行性感冒病毒擴增 子（資料未顯示）。使用原始試樣作為RNA來源之檢定的整 124810.doc -44- 200827450 體特異r生為100/〇(無交叉雜交），而整體靈敏性為9〇·4%(總 共167個樣本中有151個識別為正確陽性及陰性）。 雖然在吾人之樣本收集中未觀察到Η5型流行性感冒病毒 (圖7及8)，但藉由已知ΑΜΗ5流行性感冒病毒與奶引子纗 針序列之比對分析及由模板連續稀釋所示之Η5檢定靈敏性 可證明Η5亞型特異性檢定之有效性。圖4(畫面Α)中顯示了 22個Α型Η5流行性感冒病毒血球凝集素序列（包括自首次人 類H5爆發（1997)及隨後至2〇〇6年間爆發所獲得之分離株） 與H5亞型特異性引子/探針序列之比對分析。可觀察到完 全（100%)引子/探針、H5型病毒序列同源性（鳥類及哺乳動 物來源）。圖4(晝面B)中顯示了在對應於大約⑺以固把 cRNA目；f示分子（1〇 16公克）之8q〇g稀釋範圍（1〇-9至丨〇_16公 克）内連績稀釋之H5 cRNA模板（自人類死亡事故獲得）之代 表性曲線。連續稀釋之cRNA目標（A型及B型以及⑴及H3 亞型）展現與圖4畫面B中所示非常類似之曲線（資料未顯 本報告中所述之流行性感冒病毒類型特異性檢定偵測到 所有16種已知A型病毒，包括近來發現之H16病毒株以及 亞馬它達及維多利亞譜系B型病毒。F〇uchier RA，Munster V，Wallensten A 等人：ν α influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained /rom fc/ad/ieac/ed gw//s· J Virol 2005 ; 79: 2814-2822。使 用基於實驗室之Lightcycler 2·0儀器及其輕質（50 ibs)版本 124810.doc -45- 200827450 加固高級病原體識別裝置（ReA P I E)·)，將347個存檔的初 級臨床樣本（咽喉拭子/鼻部洗出液，18〇個經培養且167個 未經培養）分型，亦即A型或B型流行性感冒病毒，且若為 A型，則分出亞型。在所評估之347個總樣本中，278個經 正確識別為A型（222)或B型（56)流行性感冒病毒，且隨後 將所有A型分出亞型為HI、H3或H5。隨後流行性感冒病毒 陰性（69)樣本（表7及表8 :分別為2個來自Columbia特區， ρ 66個來自Nepal且1個來自Texas)經證實為B型科沙奇病 毒、腺病毒、副流行性感冒病毒丨、2及3或病毒陰性（資料 未顯示）。100個未經培養之初級臨床試樣中有16個（表句需 要隨後培養。雖然即時RT-PCR能夠自非活性病毒偵測核 酸之存在，但情況並非總如此，因為所有16個初級樣本均 經成功培養及識別，從而表明因-8(rc下長期儲存而引起 之目標RNA降解、不良樣本收集或與對連續稀釋之cRna 所觀察到之結果相比臨床樣本中之較低靈敏性。 U 不存在任何交叉反應性（亦即假陽性（尤其注意H5))凸顯 了檢定特異性。假陰性可源於多種原因，亦即存在RT_ PCR抑制劑，低初始病毒力價，RNA降解，提取期間不良/ 低程度的RNA回收，使用者誤差或試劑降解。雖然與機器 人提取模板相比使用手動提取模板時未觀察到RNA回收之 顯著差異（資料未顯示），但包含内部陽性對照對於監控從 提取到擴增之過程具有一定價值。Das a等人， Development of an internal positive control f〇r rapid diagnosis of avian influenza virus infections by realtime 124810.doc -46- 200827450 reverse transcription-PCR with lyophilized reagents. J Clin

Microbiol 2006 ; 44: 3065-3073。應瞭解此參考文獻提供 了關於根據本發明可使用之合適凍乾技術之指導，且因此 此參考文獻以明確引用之方式併入本文。 實例3 自64隻棉鼠之肺及鼻組織獲取ι28個樣本。部分動物為 流行性感冒病毒培養陰性。自樣本提取cRNA且將其添加 至基本混合物中。使用ABI 7500執行即時rRT PCR分析， 乡 且在90分鐘内偵測樣本中之流行性感冒病毒RNA。重要的 是在組織中約1至大於100個流行性感冒病毒之含量下偵測 流行性感冒病毒。 雖然已在前述說明書中描述本發明之較佳實施例，但應 瞭解本發明並不限於本文所揭示之具體實施例，而是能夠 由一般技術者作出許多修改。應瞭解在不偏離本發明所揭 不及教不之方法及組合物之情況下，所用材料及化學與醫 ( 藥細節可稍微不同於本文說明或加以修改。 【圖式簡單說明】

時間之穩定性； 於不同溫度下試劑隨

時間之穩定性； 於不同溫度下試劑隨

序列之擴增及彳貞測； 一實施例，B型流行性感冒病毒之 124810.doc -47- 200827450 圖5為用於即時RT-PCR擴增及cDNA目標模板活體外產 生之引子/探針序列表； 圖6為偵測流行性感冒病毒A/B型病毒株之表格； 圖7為藉由即時RT-PCR偵測經培養之臨床分離株中（A/B) 型及（HI、H3及H5)亞型流行性感冒病毒之表格；且 圖8為藉由即時RT-PCR偵測未經培養之初級臨床試樣中 (A/B)型及（HI、H3及H5)亞型流行性感冒病毒之表格。

124810.doc -48- 200827450 序列表

<110> 美商泛福祿股份有限公司 <120> 生物體識別產品及方法 <130> 105178-4000 <140> 096134063 <141> 2007-09-12 <150> 60/843,711 ； 11/844,933 <151> 2006-09-12 ； 2007-08-24 <160> 25 <170〉 Patentln version 3.3 <210> SEQ. ID. NO. 1 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> A型流行性感冒病毒正向擴增引子 <400> SEQUENCE 1 taaccgaggt cgaaacgta <210〉 SEQ. ID. NO. 2 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> A型流行性感冒病毒反向擴增引子 <400> SEQUENCE 2 gcacggtgag cgtgaa <210〉 SEQ. ID. NO. 3 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223〉 A型流行性感冒病毒探針 <400> SEQUENCE 3 tcaggccccc tcaaagc <210> SEQ. ID. NO. 4 <211> 24

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<212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> B型流行性感冒病毒正向擴增引子 <400> SEQUENCE 4 ggaattgcaa aggatgtaat ggaa <210> SEQ. ID. NO. 5 <211> 28 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> B型流行性感冒病毒反向擴增引子 <400> SEQUENCE 5 agaacaaatt gaaagaatct gaaatggt <210> SEQ. ID. NO. 6 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> B型流行性感冒病毒探針 <400> SEQUENCE 6 atgggaaatt cagctct <210> SEQ. ID. NO. Ί <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> HI亞型流行性感冒病毒正向擴增引子 <400> SEQUENCE 7 agycttcctt tccagaatgt aca <210> SEQ. ID. NO. 8 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> HI亞型流行性感冒病毒反向擴增引子 24 28 17 23 <400> SEQUENCE 8 agtcctgtar ccatycttaa ttttg -2 -

124810-序列表.DOC 25 200827450

<210> SEQ. ID. NO. 9 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> HI亞型流行性感冒病毒探針 <400> SEQUENCE 9 tctccaaagt atgtcagg <210> SEQ. ID. NO. 10 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> H3亞型流行性感冒病毒正向擴增引子 <400> SEQUENCE 10 aatacgaagt gggaaaagct ca <210> SEQ. ID. NO. 11 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> H3亞型流行性感冒病毒反向擴增引子 <400> SEQUENCE 11 gccccrtatg tgatyctgtt tac <210> SEQ. ID. NO. 12 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> H3亞型流行性感冒病毒探針 <400> SEQUENCE 12 tgagatcaga tgcacccat <210> SEQ. ID. NO. 13 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> H5亞型流行性感冒病毒正向擴增引子 18 22 23 19

124810-序列表.DOC 200827450 <400> SEQUENCE 13 actayccgca gtattcagaa gaagc <210> <211> <212> <213> SEQ. ID. NO. 14 21 DNA 人工序列 <220> <223> H5亞型流行性感冒病毒反向擴增引子 <400> SEQUENCE 14 gaccagcyay catgattgcc a <210> <211> 、 <212> <213> SEQ. ID. NO. 15 17 DNA 人工序列 <220> <223> H5亞型流行性感冒病毒探針 <400> SEQUENCE 15 agagrggaaa taagtgg <210> <211> <212> <213> SEQ. ID. NO. 16 45 DNA 人工序列 <220> <223> A亞型流行性感冒病毒正向擴增引子 <400> SEQUENCE 16 gctaatacga ctcactatag ggagaagcaa aagcaggtag atatt <210> <211> <212> <213> SEQ. ID. NO. 17 24 DNA 人工序列 <220> <223> A亞型流行性感冒病毒反向擴增引子 <400> SEQUENCE 17 agtagaaaca aggtagtttt ttac <210> <211> <212> <213> SEQ. ID. NO. 18 46 DNA 人工序列

124810-序列表.DOC 200827450 <220> <223> B亞型流行性感冒病毒正向擴增引子 <400> SEQUENCE 18 gctaatacga actcactata gggagatcgc tgtttggaga cacaat <210> SEQ. ID. NO. 19 <211> 20 <212> DNA <213 > 人工序列 <220> <223> B亞型流行性感冒病毒反向擴增引子 <400> SEQUENCE 19 ctccaaaact gtttcaccca <210> SEQ. ID. NO. 20 <211> 43 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> HI亞型流行性感冒病毒正向擴增引子 <400> SEQUENCE 20 gctaatacga ctcactatag ggagaaagca ggggaaaata <210> SEQ. ID. NO. 21 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> HI亞型流行性感冒病毒反向擴增引子 <400> SEQUENCE 21 gtaatcccgt taategea <210> SEQ. ID. NO. 22 <211> 43 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> H3亞型流行性感冒病毒正向擴增引子 <400> SEQUENCE 22 gctaatacga ctcactatag ggagaactat cattgctttg age

<210> SEQ. ID. NO. 23 <211> 18

124810-序列表.DOC 200827450 <212> DNA <213 > 人工序列 <220> <223> H3亞型流行性感冒病毒反向擴增引子 <400> SEQUENCE 23 atggctgctt gagtgctt <210> SEQ. ID. NO. 24 <211> 47 <212> DNA <213 > 人工序列 <220> <223> H5亞型流行性感冒病毒正向擴增引子 ^ <400> SEQUENCE 24 ' gctaatacga ctcactatag ggagatcatc tgtcaaatgg agaaaat <210> SEQ. ID. NO. 25 <211> 22 <212> DNA <213 > 人工序列 <220> <223> H5亞型流行性感冒病毒反向擴增引子 <400> SEQUENCE 25 aaggatagac cagctaccat ga

124810·序列表.DOC

Claims (1)

1. 200827450 十、申請專利範圍： 1 · 一種生物體識別產品，其包含： 用於收集一或多種樣本生物體之收集裝置； 以足以殺死該收集裝置中該或該等樣本生物體之量存 在之固定及傳遞組合物； 用於自該或該等樣本生物體提取足夠量之基因體核酸 以便識別該或該等樣本生物體之提取構件；及 可將該足夠量之基因體核酸添加至其中之大體上穩定 之I合酶鏈反應（PCR)組份。 2.如請求項1之產品，其另外包含： 可攜帶包裝，其係用以保存包含該收集裝置、固定及 傳遞組合物、提取構件及穩定化組份之產品組件。 3·如請求項2之產品，其中該可攜帶包裝另外包含聚合酶 鏈反應機器。 4. 如明求項3之產品，其中該產品另外包含複數個足以預 防或治療由所識別的生物體引起之一或多種病況之量 活性醫藥成份劑量。 、 5. 如請求項丨之產品，其中該pCR組份係經凍乾而可耐受約 30°C之溫度至少約8小時。 '、 6·如睛求項3之產品，其中該固定及傳遞組合物包八 石爪氣®文鈉（sodium cyothianate)或其組合。 7·如清求項3之產品，其中該聚合酶鏈反應組份包括於 或多個容器中之複數種預混合之聚合酶鏈反應試劑。 月求項7之產品’其中該等容器係經調整及配、 124810.doc 200827450 於與—所需聚合酶鏈反應裝置共同操作。 9·如請求項7之產品，其中該穩定化組份包含用於偵測一 或多種預定生物體之一或多種特異性引子。 10·如請求項9之產品，其中該生物體包括細菌、病毒或寄 生蟲。 如月求項1 〇之產品，其中該病毒為流行性感冒病毒。 . 12·如請求項11之產品，其中該流行性感冒病毒為A型、 或其組合，且該識別係對流行性感冒病毒類型具有特昱 U 性。 /、 13· —種識別生物體之方法，其包含： 將自個體收集之生物樣本固定於足夠量之固定劑中以 最小化或消除該生物樣本之任何污染； 自汶、纟二固疋之生物樣本提取足夠量之基因體核酸； 在大體上穩定之聚合酶鏈反應組份中檢測該足夠量之 基因體核酸以獲得關於該生物體之資訊，其中該聚合酶 c, 鏈反應組份另外包含足夠量之一或多種引子，其各自化 學性相關對生物體具特異性之蛋白組份；及 分析該資訊以識別該生物體，其中從收集到檢定獲得 資訊不超過約24小時。 ".如請求項u之方法，其中該檢測包含將該基因體核酸溶 解於一或多種聚合酶鏈反應組份中。 15·如請求項13之方法，其中該檢測係執行約⑽至15〇分 鐘。 !6.如請求項Π之方法，其中該聚合酶鏈反應組份係藉由預 124810.doc 200827450 混合複數種聚合酶鏈反應試劑而製得。 17. 如請求項13之方法，其中該分析係在自收集該樣本開始 30分鐘至3小時内完成。 18. —種用於偵測微生物序列之試劑混合物，其包含：一或 多種微生物特異性引子、探針或酵素或其組合，其中該 混合物於室溫下至少大體上穩定，且係經調整及配置以 '適用於聚合酶鏈反應（PCR)裝置。 19. 如請求項18之混合物，其中該混合物在室溫下大體上穩 1 定達至少約5天至約2週。 20. 如請求項1 8之混合物，其中該微生物序列偵測發生於自 樣本提取該微生物序列之後約90分鐘内。 21. 如請求項19之混合物，其中該微生物序列係來自流行性 感冒病毒。 22. 如請求項2 1之混合物，其中該混合物包含具有序列 (?八1^1)-<^&88(^(^(：1:〇&&&8(：之流行性感冒病毒株人探針、具 禮 有序列（FAM)-atgggaaattcagctct之流行性感冒病毒株B探 針、具有序列（FAM)-tctccaaagtatgtcagg之流行性感冒病 毒H1亞型探針、具有序列（FAM)-tgagatcagatgcacccat之 ' 流行性感冒病毒H3亞型探針、具有序列（FAM)- agagrggaaataagtgg之流行性感冒病毒H5亞型毒探針或其 任一組合。 23 .如請求項1 8之混合物，其中該混合物係經配置及調整以 適於識別由收集裝置收集之一或多種樣本生物體。 24.如請求項23之混合物，其中該混合物係用於在現場地點 124810.doc 200827450 或遠距離場所識別該或該等樣本。 25 ·如味求項丨8之混合物，其中該混合物係以液體形式盛 裝。 26·如晴求項丨8之混合物，其中該混合物係以液體形式存在 於試管、96孔盤或毛細管中。 27·如請求項丨8之混合物，其中該混合物係經凍乾。 28. —種偵測微生物序列之方法，其包含： 自生物樣本獲得基因體核酸；及 將該核酸添加至包含一或多種微生物特異性引子、探 針、酵素或其組合之混合物中來檢測該基因體核酸， 其中該混合物在室溫下至少大體上穩定且係經配置及 调整以適用於聚合酶鏈反應（PCR)裝置。 29·如請求項28之方法，其中該檢測另外包含將該混合物添 加至該聚合酶鏈反應（PCR)裝置中，執行檢測，及在少 於約90分鐘内完成該檢測。 〇 30·如請求項29之方法，其中該檢測另外包含使用適於與該 PCR裝置一起使用之螢光設備即時偵測該微生物序列。 31·如請求項28之方法，其中該基因體物質係來自細菌或病 、32·如請求項28之方法，其中該基因體物質係來自流行性感 冒病毒。 33·如請求項31之方法，其中該混合物包含具有序列（ρΑΜ)_ tcaggCCCCCtCaaagc之流行性感冒病毒株a探針、具有序列 (FAM)-atgggaaattcagctct之流行性感冒病毒株b探針、具 124810.doc 200827450 有序列（FAM)-tctccaaagtatgtcagg之流行性感冒病毒HI亞 型探針、具有序列（FAM)-tgagatcagatgcacccat之流行性感 冒病毒H3亞型探針、具有序列（FAM)-agagrggaaataagtgg 之流行性感冒病毒H5亞型探針或其任一組合。

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