TW200817520A - Detection of microorganisms and devices therefor - Google Patents

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200817520 九、發明說明： C發明所肩之^技術領域1 發明領域 本發明係有關用於偵測諸如水路中的大腸菌等微生物 5 及諸如可能與其出現相關的酵素之敏感且迅速的方法’及 用於進行此等方法之裝置。 【先前技術3 發明背景 現今及既有之計算及識別包括諸如飲水中的糞便型大 10 腸菌等細菌之微生物之方法係包括直接視覺偵測，諸如菌 落叶數，或以與特定基材上的新陳代謝效應、流式細胞/細 胞分類技術、致免疫性偵測、與特定微生物相關聯的特定 酵素之彳貞測、或目標微生物内的特定核苷酸順序之偵測相 關聯的色彩變化為基礎之間接觀察。 15 _ 這些技術大部份係需要放大微生物細胞數，放大目標 偵剛材料(諸如特定核酸順序）量，及/或若一給定樣本中具 有夕數或預期具有少數的目標微生物細胞數時之基材的冗 ，蛑月。譬如，水樣本中的大腸菌偵測係需要培養微生物 扣错以增加細胞數。現今的產業慣例係獲得小的水樣本(〜ι〇〇 m1)」在視覺糞便型污染（亦即糞便敎腸菌）之特定指 〜物種的生長之前，使其穿過一濾'器以困陷細菌且然後 =適#生絲體巾培«器以放大細S數及/或容許充 刀4間以容許媒體中的一可偵測變化。或者，可使用特定 的核苦酸順序來谓測特定微生物的出現。繁於可能出現在 5 200817520 特疋本(諸如水）中之任何特定屬、種或株的有限細菌細胞 數_1較佳技術通常係包含PCR以在譬如由南方墨點作偵測 之刖放大目標核酸量。因為大腸菌為細菌的一互異群組， 技術可月b而要使用大量的PCR放大探針、及债測探針。 此外，放大探針的不良純度或特找”致不正確或誤導 的結果。 因此，現今用來制或計算樣本中的微生物、或微生 物類型之方法係時常耗時及/或需要精細研究室設備及合 理程度的技術專門性。從收集一樣本到記錄結果之通常時 1〇間一般至少為24小時。此外，難以從遠蠕部位獲得代表性 樣本且每次測試的成本一般很高。 此外，此等技術所產生之資料只可用來記載過去事件 (亦即，24小時前）而非能夠立即發展/採用獅性策略。此 外，上述困難排除了水供應的統計嚴密性測試方案之 15 實行方式。 【明内 本發明之一目的係提供一經改良、“ α 於 菌 艮車父快且敏感之用 偵測特定微生物、或微生物類型諸如水 ^、應/源中的大腸 之方法，及此目的之部件/裝置。 20 發明概要 現在已驚人地發現，可利用 化方式敏感且快速地偵測諸如與特定微生 相關聯者等特定酵素活動。 根據第一實施例，本發明提供 不複雜的技術及材料以 電 物或微生物類型 用於偵測一樣本中的 200817520 一相關酵素量之方法，包含·· (a)赙月一包含該樣本及可被該酵素作用於其上的 一基材之反應混合物； I) (b)使一第二酵素接觸於反應混合物，其中該第一 能夠作用在-選自該至少—基材及_導因於相關酵素= 在該至少一基材上之產物的一或多者之物質上且其中，# 二酵素作用在該至少—基材或產物上料致—第 ,,Λ F I極處 的電位之一變化；及 (c)在該接觸之後一或多次觀察該工作電極處的電位及 10從該一或多次電位觀察決定出樣本中的相關酵素量。 根據另一實施例，本發明提供一用於偵測一樣本中、 一相關酵素量之方法，包含： 、 (a)孵育一包含該樣本及可被該酵素作用於其上的至小 一基材之反應混合物； ^ 15 20 (b) 使一苐一酵素接觸於反應混合物，其中該第—酵素 能夠作用在-選自該至少—基材及—導因於相關酵素作用 在该至少一基材上之產物的一或多者之物質上且其中該第 一酵素作用在該至少一基材或產物上係導致一工作電極處 的電位之一變化；及 °处 (c) 在該接觸之後一或多次觀察該工作電極處的電位及 攸°亥或夕個所偵測電位決定出樣本中的相關酵素量。 該第二酵素被固定在該工作電極中或該工作電極上， ^作電極可為一電化感測器的部份。雖然特定實施例 中，第二酵素物理性連結至工作電極，亦可想見第二酵素 7 200817520 未被束缚但仍被固定，譬如，藉由將第_ 布一酵素扣持在一有 限容積内或者該工作電極中或上之一基曾 土貝干使侍第二酵素 充分緊鄰於工作電極表面令其在該至少一基材戈產物上、 作用導致工作電極處的電位之一變化。 用於偵測一樣本 因此，另一實施例中， 中的一相關酵素量之方法，包含： ⑷孵育n«本及可被_素作用於其上的至少 一基材之反應混合物； ⑻使-電化感測器及-第二酵素接觸於反應混合物， 10其中該感測器包含一已在其中固定該第二酵素或使該第二 «與其固定之工作電極’其中該第二酵素能夠個在= 選自該至少一基材及一導因於相關酵素作用在該至少一基 材上之產物的-或多者之物質上；其中該第二酵素作用在 該至少一基材或產物上係導致該工作電極處的電位之一變 15 化；及 (c)在該接觸之後-或多次觀察該工作電極處的電位及 從該一或多次電位觀察決定出樣本中的相關酵素量。 另一實施例中’本發明提供-用於_ — #1中的一 相關酵素量之方法，包含： 20 (a)孵育一包含該樣本及可被該酵素作用於其上的至少 一基材之反應混合物； ⑻使-電化感測器及-第二酵素接觸於反應混合物， 其中該感測器包含一已在其中固定該第二酵素或使該第二 酵素與其固定之工作電極，其中該第二酵素能夠作用在一 8 200817520 選自該至少一基材及一導因於相關酵素作用在兮至I其 材上之產物的-或多者之物質上；其中該第二酵素二用二 該至少-基材或產物上係導致該工作電極處的電位之一變 化；及 < 5 ⑷在該接狀後—❹:欠侧社作電極處的電位及 從該一或多個所偵測電位決定出樣本中的相關酵素 電化感測器譬如可在反應混合物的一選定孵育^寺間之 後接觸於反應混合物，使得與樣本中出現的酵素^成二= 之-基材量將已被轉換成產物且，可在該接觸之後從工作 10電極處所觀察的電位之變化來決定樣本中的相關酵素量。 ，另-進行本發明的-方法之方式中，電化感測器可在 形成反應混合物之同時或其短暫之後接觸於該反應混合 物。然後可頻繁地、或甚至連續地監·作電極處的電位， 且該工作電極處的電位在該接觸之後回到—實質穩態基線 值所需要的時間期間可能被決定且用來決定樣本中的相關 酵素量。譬如，若束缚至工作電極之第二酵素作用在與相 關酵素相同的基材上，樣本中出現的較多相關酵素將導致 使工作^極處的電位回到一穩態基線值之—較短的時間期 間，若第二酵素作用在相關酵素作用在基材上之一產物 2〇上#本中出現的相關酵素愈多將導致工作電極處的電位 回到一穩態基線值之一較長時間。 因此，根據本發明另一實施例，提供—用於偵測一樣 本中的一相關酵素量之方法，包含： (a)畔育-包含該樣本及可被該酵素作用於其上的至少 9 200817520 一基材之反應混合物； (b) 在下列兩者的任一者中使一電化感测器及一第二酵 素接觸於包含樣本之反應混合物： ⑴反應混合物的一選定孵育時間之後或 5 (ii)製備反應混合物之同時或立即之後， 其中該感測器包含一其中固定有該第二酵素或可供★亥 第二酵素與其固定之工作電極，其中該第二酵素能夠作用 在選自該至少一基材及一導因於相關酵素作用在該至少_ 基材上之產物的一或多者之一物質上；其中該第二酵素作 10用在該至少一基材或產物上係導致該工作電極處的電位之 一變化； (c) 下列兩者任一者： ⑴在步驟(b)(i)的該接觸之後偵測該工作電極處的 電位之變化；或 15 (Π)決定該工作電極處的電位在步驟(b)(ii)的該接觸 之後回到一實質穩態基線值所需要的時間期間；及 (d) 從步驟(c)(i)所偵測的電位之變化或步驟(c)(ii)所決 定的時間期間來決定樣本中的相關酵素量。 工作電極可具有固定於其中或固定於其上或與其吸附 20 之第二酵素。 步驟(c)(1)所憤測的電位之變化可與對於下列所偵測的 電位之變化作比較：-不含相關酵素之控制反應混合物； -包含-已知相關酵素量之反應混合物；—用於電位變化 VS.相關酵素量之校準曲、線，或者其任何組合或步驟⑷⑼ 10 200817520 所決定的時間期間可與下列作比較：對於一包含一已知相 關酵素羞之反應混合物之該工作電極處的電位回到一穩態 基線值所費之時間期間；或對於該工作電極處的電位回到 一穩態基線值所費之時間期間VS·反應混合物中的相關酵素 5 量之一校準曲線。 相關酵素可分別為一 β_半乳糖苷酶或一卜葡萄苷酸 酶，且至少一基材可為一 Ρ_半乳糖或卜葡萄普酸化物衍生 物。此等基材可譬如包含一5务4養弓卜朵連結式化合 2 ’諸如5|4_氣_3斗朵0_連結式糖普或葡萄苦酸化物， 10譬如5-“氣-3』引哚β_〇_半乳α比喃糖苷。 第二酵素可與相關酵素相同，或可為一有關酵素。譬 如’第二酵素可為—卜半乳糖㈣或β·葡萄純酶。或者， 第-酵素可為-可作用在相關酵素作用在基材上的一產物 15 ^之酵素。第二酵素可藉由—諸如鏈菌素_生物素束缚對之 5向親和力束缚對被束缚至工作電極，可被直接地束缚至工 作電極，或可經由-_件分子被束缚至卫作電極。 電極的導電材料可包含一聚合性材料，其譬如為聚喵 咯或聚苯胺或者可包含一非聚合性材料諸如石墨、碳膏、 -鉑或其他適當導電材料。聚合性材料可為電傳導聚 2〇合性材料，譬如電傳導聚少各(PPy)或聚苯胺(PANI)。電傳 導聚合性材料的電阻係數可位於9〇 S/cniM，· S/cm或更 大、或400 S/cm至9〇〇 S/cm的範圍中。 樣本可得自—水源且相關酵素可與一諸如大腸菌等能 夠造成哺乳動物腸失調之微生物或微生物類型相關聯。 11 200817520 因此，根據本發明另一實施例，提供—用於偵測一樣 本中的大腸菌之方法，包含： 、 ⑻以-包含-β_半乳糖或β·葡萄㈣化物街生物之基 材在一反應混合物中孵育該樣本； 5 (b)使一酵素接觸於反應混合物，其中該酵素能夠作用 在該基材上，且其中該酵素作用在該基材上係導致一工作 電極處的電位之一變化；及 ⑷該接觸之後-或多次觀察紅作電極處的電位及從 該一或多次電位觀察來決定樣本中的細菌數。 10 根據本發明另一實施例，提供一用於偵蜊一铲本中的 大腸菌之方法，包含： (a)以一包含一 β-半乳糖或卜葡萄苷酸化物衍生物之美 材在一反應混合物中孵育該樣本； 1 ⑻使-酵素接觸於反應混合物’其中_素能夠作用 15在該基材上，且其中該酵素作用在該基材上係導致—工作 電極處的電位之一變化；及 (c)在該接觸之後一或多次偵測該工作電極處的電位及 從一或多個所偵測電位來決定樣本中的細菌數。 根據本發明另一實施例，提供一用於偵測一樣本中的 20 大腸菌之方法，包含： (a) 以一包含一β-半乳糖或0_葡萄苷酸化物衍生物之基 材在一反應混合物中孵育該樣本； (b) 使一感測器及一酵素接觸於反應混合物，其中該感 測器包含一其中固定有該酵素或供該酵素與其固定之工作 12 200817520 電極，其中該酵素能夠作用在該基材上，且其中該酵素作 用在該基材上係導致一工作電極處的電位之一變化；及 - (c)在該接觸之後一或多次觀察該工作電極處的電位及 • 從該一或多次電位觀察來決定樣本中的細菌數。 5 根據本發明另一實施例，提供一用於偵測一樣本中的 大腸菌之方法，包含： ’ （a)以一包含一 β·半乳糠或β_葡萄苷酸化物衍生物之基 材在一反應混合物中孵育該樣本； (b) 使一感測器及一酵素接觸於反應混合物，其中該感 10測器包含一其中固定有該酵素或供該酵素與其固定之工作 電極，其中該酵素能夠作用在該基材上，且其中該酵素作 用在該基材上係導致一工作電極處的電位之一變化；及 (c) 在該接觸之後一或多次偵測該工作電極處的電位及 從該一或多個所偵測電位來決定樣本中的細菌數。 .15 根據本發明一特定實施例，提供一用於偵測一樣本中 的大腸菌之方法，包含： (a) 以一包含一 β-半乳糖或β-葡萄苦酸化物衍生物之基 材在一反應混合物中孵育該樣本； (b) 在下列兩者的任一者中使一電化感謂器接觸於包含 20 樣本之反應混合物： ⑴反應混合物的一選定孵育時間之後或 (ii)製備反應混合物之同時或立即之後， 其中該感測器包含一其中固定有一能夠作用在★亥美材 上的酵素或可供該酵素與其固定之工作電極；其中該感、、則 13 200817520 酵素作用在該基材上係導致該工作電極處的電位之 一變化； (C)下列兩者任一者： ⑴在步驟(b)(i)的該接觸之後偵測該工作電極處的 5 電位之變化；或 (11)決定該工作電極處的電位在步驟(b)(ii)的該接觸 之後回到一實質穩態基線值所需要的時間期間；及 (d)下列兩者任一者： (1)步驟(c)(i)所偵測的電位之變化與下列作比較··對 10 於一不含大腸菌之控制反應混合物所偵測的電位之變 化；對於一已知大腸菌數所偵測的電位之變化；一用於 電位變化vs.細菌數之校準曲線；或其任何組合；或 (⑴步驟(c)(ii)所決定的時間期間與下列作比較：對 於一包含一已知大腸菌數之反應混合物使該工作電極處 15 的電位回到一穩態基線值所費的時間期間；或對於該工 作電極處的電位回到一穩態基線值所費的時間期間vs.反 應混合物中的細菌數之一校準曲線；及 0)從步驟(c)(i)所觀察的電位之變化或步驟(c)(ii)所觀 察的時間期間來決定樣本中的大腸菌數量。 20 步驟（c)(ii)可包含決定該工作電極處的電位在步驟 (b)(ii)中的該接觸之後回到一恆定基線值所需要的時間期 間。 本發明亦有關使用本發明的方法來偵測微生物之感測器。 因此，根據本發明的另一態樣，提供一包含一工作電 200817520 極之電化感測器，該工作電極中固定有一酵素或可供一酵 素與其固定’該酵素⑴能夠作用在一基材上，該基材身為 能夠被-相關酵素作用在其上者；或⑼能夠作用在一導因 於-相關酵素作用在-基材上之產物上；其中該相關酵素 5與-微生物或微生物類型相關聯；其中該電極固定式酵素 作用在該基材或產物上係導致該工作電極處的電位之一變 化0 笔極U疋式酵素可能能夠作用在一卜半乳糖或卜葡萄 苦酸化物衍生物上，且可能譬如為半乳料酶郭-葡萄 10 苷酸酶。 因此，根據本發明的一特定態樣，提供-包含一工作 電極之電化感測器，該工作電極中固定有—酵素或供一酵 素與其固定，該酵素能夠仙在—β_半乳糖或㈣萄普酸化 15 物衍生物上以導致該工作電極處的電位之_變化，諸如一 β-半乳糖苦酶。 酵素可藉由-高親和力束缚對被束缚至電極，可直接 地束缚至電極，或可經由一間隔件分子被束缚至電極。 20 選定孵育時間可位於i分鐘至24小時或更大的範圍中 且將依據反應混合物的本質及預期位於樣本中的細胞數或 酵素數里而疋。粹育時間譬如可能位於選自由下列各物所 組成的群組之範圍中·· 1至24、2至24、3至24、4至24、5至 24、1 至20、2至20、3至2〇、4至2〇、5至2〇、e 15、2至 15、 15 200817520 列各物所組成的群組：1至60分鐘，諸如5至60 ' 10至60、 15至 60、20至 60、30至 60、5至 50、10至 50、15至50、5至 45、10至45、15至45、5至30、10至30、20至30、5至20、 10至20、40至60或50至60分鐘。若電化感測器在製備反應 5 混合物之後緊接著接觸於反應混合物則其可能在任何適當 的時間被接觸，諸如一將容許被感測器中或上的至少一酵 素所催化之反應抵達穩態反應速率、且可容許所有酵素催 化式反應抵達穩態之充分時間。因此，譬如，電化感測器 可在製備反應混合物之1秒至20分鐘的範圍内接觸於反應 10 混合物’諸如製備反應混合物之10秒至10分鐘、20秒至10 分鐘、30秒至10分鐘、丨分鐘至10分鐘、1分鐘至5分鐘、3〇 秒至5分鐘、20秒至5分鐘、10秒至5分鐘、1〇秒至3分鐘、 20秒至3分鐘、30秒至3分鐘、1分鐘至3分鐘、1分鐘至2分 鐘、30秒至2分鐘、20秒至2分鐘、或10秒至2分鐘、1〇秒至 15 1分鐘、秒至1分鐘、或30秒至1分鐘以内。 本發明亦有關藉由本發明的方法來偵測微生物且包含 如上述的感測器之裝置。 定義 如此處所用的“包含，，用語係指“主要包括，但未必只 20 有。包各（comprising)用语的變異堵如“包含(comprise)’’ 及“包含(comprises)”等係具有對應的類似意義。 如此處所用的“偵測，，用語係包括觀察、測量及量化及 偵測，且這些用語可在全文互換使用。貞測（detecti〇n)，，用 語的變異諸如“偵測（detecting)”、“偵測（detect)，，及“债測 16 200817520 (detects)料具麵應的類似範圍。 轉換用的“酵素”用語係指能夠便利-或多個基材 薄膜之任何生物摧化性分子，且2夕個基材運运橫越一 5 10 15 20 八子_7錢雜酵素、薄_送蛋白f、催化性舰 勿子（堵如核酸代峰）。 如此處所用的“微生物”係 生命形式，包括細菌、古細菌、^戈人相尺寸的任何 藻。 囷古，田囷'原生動物、真菌、病毒及 “如此處在束缚至此等電極的酵素之上下文中所 導致该工作電極處之電位的一變化_ :上:接地或間接地導致電極處的電位的一變化。擘如， «處之電位的變化可能來自於酵素作用在物質上賴， 或一或多個產物與其環境的一 ,飞夕個化合物、電極表面、 Μ…後績反應所致。電位的變化可能包含工作電極 處的=極電位相對於電極束缚式酵素曝露於基材前之工作 電位之減小或增加。所_變化可能包含曝露於 作電極處的電位之實質連續的測量/债測’或可 :包含曝露於基材後之一或多個離散時間所作之工作電極 之測量，或用於決定此等變化之任何其他的手段。 圖式間早說明 弟1圖提供本發明的一方法中> ,,fflM , 電極束缚式酵素的 =式之示意圖，其中酵素被動地吸附至電極的表面。 將被偵測的相關酵素以虛線顯示於一箱中以顯示酵素在感 17 200817520 測器與反應混合物接觸時可能未實際出現於反應混合物中 之事實； 第2圖提供對於增加濃度的卜半乳糖苷酶(2_1(^g/mL) 浸於2x酵母胰化蛋白生長媒體中之一恆定濃度的5_溴_4_氯 5 各°引哚P-半乳°比喃糖苷（X-Gal-5(^g/mL)之電極的飽和之 本發明的一工作電極與一參考電極之間的電位差隨著時間 之一圖形； 第3圖提供本發明的一工作電極與一參考電極之間的 電位差隨著時間之圖形，其中：第3A圖一1000ng/mL β-半 10乳糖普酶施加至電極且浸於2χ酵母胰化蛋白生長媒體中之 增加漠度的5漠-4-氯_3_ , Π朵β_半乳α比喃糖苦 (X-Gal-1.5-100pg/mL);第 36圖_1〇〇〇叩/1^ β-半乳糖苷嗨 施加至電極且浸於2χ酵母胰化蛋白生長媒體中之2倍稀釋 的5_溴-4-氣-3-吲哚β-D-半乳吡喃糖苷 15 (X-Gal-50-0_625pg/mL);第 3C圖-30U/mL β-半乳糖苷酶施 加至電極且浸於2χ酵母胰化蛋白生長媒體中之減小濃度的 5-溴-4-氣-3_吲哚β-D-半乳吡喃糖苷(x_Gal-5〇-〇|ulg/mL);及 第3D圖-7500ng/mL β-半乳糖苷崎施加至電極且浸於2又酵 母胰化蛋白生長媒體中之減小濃度的5_溴_4_氯_3_σ引哚 2〇 半乳吡喃糖苷（X-GaMO-Opg/mL)。 第4圖顯示本發明的一工作電極與一參考電極之間的 電位差之結果，其中工作電極包含藉由不同部件或以不同 數里施加至電極之生物素化β-半乳糖普酶，如下： 7500ng/mL生物素化卜半乳糖苷晦經由束缚至電極表面 18 200817520 的鏈菌素施加至電極；750〇ng/mL生物素化β-半乳糖苷酶 被動地束缚至電極表面；75〇〇ng/mL生物素化卜半乳糖苷 酶被動地束缚至電極表面；325〇ng/mL生物素化卜半乳糖苷 酶被動地束缚至電極表面；175〇ng/mL生物素化卜半乳糖苷 5酶被動地束缚至電極表面；浸於2x酵母胰化蛋白生長媒體 中之50pg/mL的5-溴-4_氯-3·°引哚β-D-半乳吡喃糖苷中。第 4A圖以柱狀圖形式提供結果而第4B圖提供電位變化隨著 時間之原始資料(經鏈菌素束缚之卜半乳糖苷酶結果係以經 充填三角形代表，而未充填符號代表Ogg/mL· X-Gal控制 10 組）； 第5圖提供一柱狀圖，顯示製備工作電極之後或製備工 作電極前β-半乳糖苷酶在乾冰上作三天儲存之後當浸於 50pg/mL X-Gal中時不同濃度的未經生物素化β_半乳糖苷 酶施加（直接地，被動地)至工作電極之結果； 15 第6圖顯示對於塗覆有6U/mL β-半乳糖苷酶且曝露於 一範圍的X-Gal濃度（經界定媒體中介於1〇(^G/mLs OpG/mL)之經絲網列印聚嗞咯感測器的感測器校準圖形。各 柱係代表一式二份的讀數，附有誤差柱。輸出係表示為全 尺度偏向中的％下降；

20 第7圖顯示以30u/lnL β-半乳糖苷酶對於浸入5〇!Ig/mL X-Gal中時之電極所記錄的電位差之增力口時間量（相對於一 參考電極）之孵育工作電極的結果。第7A圖為顯示浸於 5(^g/mL X-Gal中近似3分鐘之後對於各電極之所記錄的電 位差（一式二份的讀數，附有誤差柱）之柱狀圖，而第76圖 19 200817520 提供在自其取得最大讀數之工作電極浸於5〇|Ig/mL x_Gal 中之後隨著時間經過之電位差的第一組讀數之原始資料； 第8圖顯示一對於在2X酵母胰化蛋白生長媒體中浸於 5(^g/mL X-Gal中之根據本發明的11感測器之可重覆性研 5究的結果’已藉由將一包含7.5pg/mL經生物素化β_半乳糖 苷酶的溶液施加至工作電極一小時來製備感測器。第8八圖 顯示浸於Kg/mL X-Gal中之後近似3分鐘對於各電極之經正 常化電位差（相對於〇 pg/mLX-Gal控制）的柱狀圖，而第8B 圖提供工作電極浸於50 pg/mL X-Gal中之後隨著時間經過 10 對於電位差之原始資料； 弟9圖顯示基材的繼續存在(Carry_〇ver)對於根據本發 明的感測器所獲得讀數之精確度之效應。第9A圖為對於六 [減小]濃度的X-Gal (黑柱）所決定的電位差㈦”之柱狀 圖，其後電極固持件被倒置然後以相反次序來測定六x_Gal 15濃度（影線狀柱）。第9B圖顯示對於各對感測器由於基材繼 續存在所導入之誤差； 第10圖顯示對於包含β-葡萄苷酸酶（第10A圖）或包含β_ 葡萄糖苷酶（第10Β圖）之本發明的感測器之所獲得的結果； 第11圖提供根據本發明的細菌偵測測定之示意圖。基 20材顯示為經充填三角形而細菌細胞顯示為具有一管腔之卵 形； 第12圖提供一圖形，其顯示5-溴-4-氯-3-α引哚p_D_半乳 。比喃糖苦的細菌耗盡導致較低的感測器輸出：全程採用 15pg/mL 5_溴冰氣-3-吲哚β-D-半乳吡喃糖苷，其中有 20 200817520 〇-5χ106五·μ/ζ·細胞(ATCC 11775)及一“無基材”控制組； 第13A及13B圖顯示以（及因此藉由下列之混合物中 X-Gal的耗盡）減小初始接種體的五.⑶// ATCC 11775的反應 混合物孵育之後對於X-Gal之反應混合物的測定所獲得的 5 結果，結果被顯示為全尺度偏向的％降低(相對於0細菌細胞 控制）。第13A圖-1·2χ107至1·2χ105細胞/mL歷時三小時。第 13B圖-3·7χ105至3·7χ102細胞/mL歷時五小時。反應混合物 中之X-Gal的初始濃度為2x酵母胰化蛋白生長媒體中之 50pg/mL ; 10 第14A及14B圖顯示包含（且因此藉由下列之混合物中 X-Gal的耗盡）增加初始接種體的五c〇// ATcc 11775之反應 混合物孵育之後（以包含0_半乳糖苷酶之根據本發明的感測 器）對於X-Gal之反應混合物的測定所獲得的結果。在包含 5〇gg/mL X-Gal之2x酵母胰化蛋白生長媒體的初始接種之 15後2小時後直到6小時為止每小時採取樣本。結果提供為所 觀察之％電位差降低(相對於〇細菌細胞控制）。第14B圖的資 料代表對於各初始接種體之一式二份的結果； 第15A至15(：圖顯示對於浸於5(^g/mL X-Gal中4小時 2之後如根據本發明的感測器（包含束缚至工作電極之β_半乳 糖芽轉)所決定從所觀察的％電位差降低(相對於〇細菌細胞 =制）來決定初始樣本細胞濃度（對於五·⑺"ATCC 11775)所 獲得的校準曲線； 一第16圖顯不在包含5〇从§/11^的2}^酵母胰化蛋白生長媒 一中％月4小時之後以一式二份的減小初始接種體的野型 21 200817520 株365之反應混合物孵育之後對KX_Gal之反應混合物的測 定（藉由包含β_半乳糖苷酶之根據本發明的感測器）所獲得 的結果。以所觀察的％電位差降低(相對於〇細菌細胞控制） 來提供結果。 5 第17圖顯示在包含5(^g/mL X-Gal的2χ酵母胰化蛋白 生長媒體中5小時孵育之後以（及因此藉由下列之混合物中 X-Gal的耗盡）一式二份之野型株365的初始接種體的系列 稀釋之反應混合物的孵育之後對於x_Gal2反應混合物的 測定（藉由包含β-半乳糖苷酶之根據本發明的感測器）所獲 10得的結果。結果提供為所觀察的％電位差降低(相對於〇細菌 細胞控制）。第16圖亦顯示五小時孵育之培養中的培養1 (40,000cfu/mL初始接種體）及4 (40cfu/mL初始接種體）中的 細胞數； 第18圖顯示對於進入包含用來作為基材之$μΜ iptg 15 及100或60Kg/niL X_Gal的2χ酵母胰化蛋白生長媒體中之一 給定接種體之經正常化％感測器輸出下降的差異； 第19圖顯示使用包含束缚至工作電極的β_半乳糖苦 酶之根據本發明的感測器之細胞培養期間的pH減小對於 X-Gal測定所獲得讀數的敏感度之效應； 20 第2〇圖顯示使用包含束缚至工作電極的β-半乳糖苷 酶之根據本發明的感測器之1 mM十二烷基硫酸鈉（SDS)對 於X-Gal測定所獲得讀數的敏感度之效應； 第21圖顯示使用包含束缚至工作電極的β-半乳糖苷 酶之根據本發明的感測器之反應混合物中出現的乳糖對 22 200817520 於X_Gal測定所獲得讀數的敏感度之效應； 第22圖顯示使用包含束缚至工作電極的β-半乳糖苷 酶之根據本發明的感測器之反應混合物中出現的異丙基 -β-D-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG)對於X_Gal測定所獲得讀數 5 的敏感度之效應； 第23A及23B圖顯示使用兩型的經絲網列印碳膏電極 來測量X-gal濃度，其中β-半乳糖苷酶以6U/mL及OU/mL被 吸附至感測器表面。以一毫伏特計來讀取輸出。 第24A及24B圖顯示使用兩型的經絲網列印碳膏電極 10來測量脲濃度，使用以所顯示三種濃度吸附至感測器表面 之脲酶。以一毫伏特計來讀取輸出。 L資施方式3 較佳實施例之詳細說明 如上述，大部份或許多既有之用以偵測及計算微生物 15體的標準技術係具有身為緩慢及/或技術嚴格要求、需要至 少24小時來得到結果及/或專業化技術、裝備及訣竅之缺 點’特別是在一給定樣本中可能有小數量的微生物體時尤 然。特別是在環境監測等許多應用中，由於常需要頻繁測 試及/或大量樣本，若需要的話（譬如在水路被高位準的大腸 2〇菌驟然3染之案例中），可能快速地需要結果藉以採取行 動，這些缺點很顯著。 酵素的偵測 本發明提供一快逮且敏感之用於偵測一樣本中出現一 相關酵素之方法。根據本發明之一製程係包含：⑷以可被 23 200817520 相關酵素作用在其上的至少一基材在一反應混合物中孵育 樣本；接下來(b)使一電化感測器接觸於包含樣本之反應混 合物，其中電化感測器包含一能夠作用在該至少一基材的 至少一者上或相關酵素作用在該至少一基材上的一或多個 5產物上之第二酵素；（c)該接觸之後決定工作電極處的電位 之變化；及⑷從步驟⑷所觀察的電位之變化來決定樣本中 的相關酵素量。 根據本發明之-替代性製程係包含：在製備反應混合 物同時、或立即之後使電化感測器接觸於反應混合物；監 10測工作電極處的電位且決定工作電極處的電位回到一實質 穩態基線值所需要的時間期間，其可實質地等同於對於一 不含基材的反應混合物之相同電極所先前獲得的一數值； 及從對於該工作電極處的電位回到一穩態基線值所需要的 時間期間來決定樣本中的相關酵素量。 15 實f地穩態基線值或穩態基線值可能為-值定基線 值0

參照第1圖，感測器包含一工作電極1(Π。第二酵素胸 或102b可被固定或吸附至工作電極ι〇ι的表面。 工作電極ΗΠ可為可供—酵素咖或職所束缚、同時 2〇保留其活動之任何適當的工作電極ι〇ι，且其中酵素活動導 致產物相較於基材之一改變的氧還、pH、或離子性狀離， 而具有工作電極表面處之氧還狀態的一所導致變化。:作 電極1〇1可包含得自諸如料"夫喃、《吩等適當單體性 早70之-導電聚合性材料1〇3作為導電表面塗層 24 200817520 101可被絲網列印，如發證予德國澤西的感测器科技有限公 司（Sensor-Tech Limited)之國際專利公開案號WQ 03/019171所描述，且可自英國的通用感測器有限公司 (Universal Sensors Ltd.亦即USL)取得。或者，工作電極ίο! 5可包含一非聚合性導電材料103,其可包含石墨、碳膏、金、 鉑或其他適當的導電材料。適當的經絲網列印碳膏電極係 自英國龐帝浦的葛溫特電子材料有限公司（Gwem Electronic Materials Ltd)取得。 對於一電位計式偵測步驟而言係需要參考電極1〇9，可 10 將譬如一甘汞(calomel)或Ag/AgCl參考電極放置在與工作 電極101相同的支撐件上，或者可採用一外部參考電極 109。並且，參考電極109可被包含在可於其中進行步驟(匕） 及(c)的容槽中或包含該容槽，或者可為一用於數個用於進 行步驟(b)及(c)的容槽之共同參考電極1〇9，如同若使用多 15 井板所可能需要之情形。 可能具有用於進行本發明的一方法之任何佈局，諸如 早反應谷裔或胞至、沾-黏格式（dip-stick format)、或多井 板，且可包含整合式電化感測器。 一第二/感測器束缚式酵素l〇2a能夠作用在至少一義 2〇材1〇4上，其亦為一用於相關酵素1〇〇之基材。或者，第二/ 感測為束缚式酵素102b能夠作用在相關酵素1 〇〇作用在義 材104上的一產物105上。第二酵素1〇2a或i〇2b作用在至少 一基材104或產物1〇5上係分別產生工作電極1〇1處的電位 之一變化。隨後可能在感測器100接觸於反應混合物1〇8之 25 200817520 後由偵測器107在任何適當的一或多個時間決定此電位變 化’且其可與原始樣本中之相關酵素量相關。 5 10 15 根據本發明的一方法中，包含原始樣本或其一部分及 可被相關酵素1G G作用於其上之反應混合物丨G 8係畔育—段 所而要的間。為了避賴測器接觸於反應混合物⑽ 期間來自相關酵素⑽的干擾，可在感測器接觸於反應混合 物8之别自反應混合物1〇8移除相關酵素1〇〇。工作電極 1〇1中係固定或吸附有—能夠作用在基材刚上的第二酵素 102a。销測$束縛式酵素黯作用在該至少—基材⑽上 係‘致工作電極1〇1處的電位之一變化。藉由監測身為對於 一所需要時間之時_函數之電位在接觸步驟之後，相對 於經由電傳導線i06b電性連接至偵測器1〇7之參考電極ι〇9 來决疋紅由電傳導線1063電性連接至侦測器術之工作電 極101處的電位之變化。隨後可從身為時間的函數之電位的 ^化來決定原始樣本巾相_素之存在或不存在及/或數 量。束缚至工作電極101之酵素職可能為能夠作用在與相 關酵素相同的基材上之任何酵素，或可能為能夠作用在相 關酵素作用在-基材上的一產物上之任何酵素咖，盆中 該酵素贿或娜導致-或多個產物相較於—或多個基材 20之^變的氧還、pH、或離子性狀態，及工作電極表面處 之制狀態的-所導致變化。此等酵素可能包括孽如但不 限於分解代謝性酵素，諸如碳水化合物_劣化酵素包 普q諸如β-半乳㈣酶、β_葡萄芽酸朴蛋白質分解或 肽分解性酵素、_、薄膜運送蛋白f及核酸酶。 26 200817520 ，、相關酵素可譬如包括分解代謝性酵素，諸如碳水化合_ 名化酵包括糖苦峰(諸如大腸菌相關聯的p-半乳糖皆酶 及/，葡萄荅酸酶）、或流感病毒相關聯的神經胺酸酶、蛋 白質分解或肽分解性酵素、脲酶(與祕〇心心種及部分藍 5綠澡相關聯）、薄膜運送蛋白質及核_，但亦可包括合成 酵素’或歧化酵素/轉移酶，在該例中一或多個基材上受到 作用以產生至p可供-電極束缚柄素祕侧於其上 之產物105。 關酵素1GG及t極束缚式酵素丨咖可為相同酵素 10 (亦即，來自相同來源之相同酵素)，可為來自不同來源之相 關/相同酵素，或可為完全不同的酵素。 相關酵素剛及-電極束料料祕可為完全不同 的酵素。然而，若相關酵素觸及酵素嶋所催化的反應為 可逆式，這些酵素可為相同酵素(亦即，來自相同來源的相 15同酵素）’或為來自不同來源的相關/相同酵素。然而，此情 景中，在感測器接觸於反應混合物1〇8之前將需自反應混合 物卿除實質所有相，素刚(或财相_伽)藉以 獲得有意義的結果。 在相關酵素及電極束缚式酵素繼徘用在相同基材上 2〇之案例中，由於相關酵素將對於藉由電極束缚式酵素咖 的作用使得反應混合物⑽中之可取得基材1〇4量耗盡，受 調查樣本中存在相關酵素將比起樣本中不存在相關=素= 所觀察者而言導致步驟⑷之工作電極⑻處之電位的 小變化。 27 200817520 在電極束収料職仙在相_素仙在至少一 : 上的|物上之賴巾，若受調查樣本包含相關酵 常’步驟(C)所觀察的電位之變化將較大。 Μ至少—基材104可為被相關酵素作用其上且亦可被電 5 酵素搬仙在其上以導虹作電極⑻處相對於 電極1G9之電位的變化之任何-或多個化合物。 盆可破至少一電極束缚式酵素102a或102b水解地作用於 ^藉以導致—氧還、pH或離子性變化(此導致電極束 私=素收緊鄰處之此變化，藉以導致工作電極處的電位 之欠化）之適當基材1〇4係為此技藝所已知，纟可譬如包 括1/臭-4·氯·3-°引°朵-或6_氯冬°引嗓-連結式化合物、螢光黃-連九式化合物、甲基傘形嗣衍生物或螢光素-連結式化合 15 20 言如，-實施例中，至少一基材104可為_被相關酵素 被電極束収酵素黯作用在其上藉以導致工作電極 101處的電位的-變化之糖苦。根據此實施例，兩酵素可皆 為糖料，諸如α•或㈣料麟银果糖料(諸如轉化 酶）及其他，且基材可為一α·或β-吼喃葡糖#，諸如…或 吼喃葡半乳㈣㈣、α•或p_Dtt喃甘露糖苦、 α·或β_葡萄苷酸化物、β_果呋喃糖苷、及其他。 相關酵素亦可為糖苷酶而電極束缚式酵素1〇此 & 酶或氧化_。譬如’相關酵素刚可為卜半乳糖科，基= 104可為β_半乳糖，產物1()5則可為半乳糖且電極束缚^酵 素1〇2b可為卩_半乳糖脫氫酶。或者，相關酵素咖可為二(或 28 200817520 Μ糖料’基材1G4為P伽歸’產物H)5可為葡萄糖 而電極束、縳柄素職可為㈣糖氧化梅。 至工=2:或^可由該技藝熟知的任何適當部件束轉 5 f如，酵素㈣或贿可被動地吸附至電極⑼表面， 或可精由電極101表面、且選用性地包括酵素之官能化被束 縛至電極101藉以能夠使酵素直接束縛至電極。或者，酵素 職或聰係可經由一間隔件分子藉由間接連結被束缚至 電極101，或可藉由-包含一高親和力束缚對之連結系統被 10束缚至電極ιοί，其中此一束縛對的各構件係共輛/束缚至 酵素或電極表面的任一者。一適當高親和對的一範例譬如 包含一鏈菌素生物素束缚對。 若使用一鏈菌素·生物素束缚對來將酵素束缚至電極 ，鏈菌素可被束缚至電極表面，且生物素可譬如藉由酵 15素與-經生物素化炫合終端之重組表示被餘至酵素⑽& 或102b。這可容許酵素職或嶋對於電極ι〇ι之高度特定 性且強固的束缚。特定表面可能不需要官能化藉以能夠束 缚酵素、鏈时，且已發現—聚料表面1()3可容許鍵菌素 的直接束缚或β-半乳糖苦酶的直接束缚而不喪失活動性。 20 I缚至工作電極之酵素量將依據數項因素而定，包括 酵素本身的本質、束缚至電極的模式及電極表面的本質。 一般而t ’酵素量可從每電極約1χ1〇-6單位的酵素活動 (μιηοΐα的所轉換基材每分鐘）改變至每電極約單位， 諸如每電極約lxl〇-5單位，每電極約5χ1〇_5單位，每電極約 29 200817520 1X10單位’或每電極約5χ10·4單位。 亦可包含使不只—型酵素束缚至卫作電極之本發明的 及其感。譬如，—束缚至功電極1G1表面之酵 」〇2係可作用在與一相關酵素相同之基材104上、或相關 5酵素作用在基材上之一產物1〇5上，且一束缚至工作電極表 面之第二酵素係可作用在酵素1〇2作用的一產物上導致工 广电極處的電位之一進一步變化，潛在地導致較大的測定 敏感或者，若一樣本可含有兩或更多種相關酵素，諸 如可此為包含微生物的樣本所發生之情形，兩或多個酵素 10 102可束缚至工作電極應表面，其各者可作用在一亦被一 相關酵素所作用的基材104上，或一相關酵素作用在-基材 上之-產物U)5上。多重相關酵素性活動之偵測的一替代方 式可能係為利用包含可供束缚不同酵素類型之工作電極之 分離的感測器來進行本發明的方法，可容許分離地偵測樣 15 本中的各酵素性活動。 微生物的偵測 20 本發明的方法之另-實施例中，相關酵素1〇〇係與一微 生物或微生物«相關聯，且該转可為—歸制一樣 本中存在該微生物祕生物類型之方法，諸如—用於债測 水樣本中的大㈣、或线樣本巾^毒之方法。 特定的微生物、或微生物類型係在許多案例中於至少 -給定樣本類射與特殊酵素性活動相襲。#如，水樣 本中的β·半乳㈣w葡㈣酸_動係與此等樣本中 的大腸菌數呈強烈交又相關。數種病毒亦在其外部塗層 30 200817520 上具有特定酵素。譬如，流感病毒包含作為外塗層蛋白質 之神經胺酸酶。 5 10 15 20 特別是對於此目的，而非本發明的任何方法之目的， 相關酵素100可為β_半乳糖普酶或β_葡萄芽酸酶，且基材⑽ 可分別為β·半乳糖或β_葡萄㈣化物衍生物。此等方法中， 束、專至電極的酵素可為—能夠分別作用在卜半乳糖或卜葡 萄普酸化物衍生物上之酵素跑，或―能·半乳糖 苷酶或β-葡萄普酸酶作用在Ρ_半乳糖或卜葡萄苦酸化物 衍生物或-水物（諸如耗糖_萄祕酸)上之酵素 102b。若該方法絲制大腸菌，相對酵素刚及電極束缚 式酵素102a皆可為β·耗㈣酶或㈣萄純酶且基材 104可為β-半乳糖或(3_葡萄苷酸化物。 b方法中可使用任何適當的卜半乳糖或卜葡萄苷酸 化物基材104，其限制條件在於：其被電極束缚式酵素102a 或獅作_將導致卫作電極處的電位之—變化且亦身 為用於藉由與大腸g相關聯的—相關酵素剛(諸如卜半乳 ㈣酶或β·葡萄《酶)的酵素性作用之適#基材1〇4。適當 基材可譬如包含6.氯m叫半乳吼喃糖苦 、5_漠_4·氣_3H叫半乳吼喃糖* (Blue-gal)、螢光黃專D_半乳吼喃糖苦）、榮光黃單仰· 半乳吼喃㈣、4_甲基傘_仰，ut⑽苷、蔡紛榮 光黃二|D_半乳Μ㈣）、4_三氟甲基轉酮仰-半乳 °比喃㈣、及3,4_環⑽七㈣β-D·半乳ntt喃㈣(s_gal)。 基材104可為5_溴-4-氯如弓卜格連結式糖苦或葡萄苦 31 200817520 酸化物。根據一特定實施例，基材104為5-溴-4-氣-3-吲哚 β-D-半乳吡喃糖苷。 因此，根據本發明的一特定方法，該方法係用於一樣 本中偵測大腸菌，包含： 5 (a)赙育一包含樣本及一含有β-半乳糖或β-葡萄普酸化 物衍生物的基材之反應混合物； (b)在下列兩者任一者中使一電化感測器接觸於包含樣 本之反應混合物： ⑴反應混合物的一選定孵育時間之後或 10 (ii)製備反應混合物之同時或立即之後， 其中該感測器包含一其中固定有一能夠作用在基材上 的酵素或可供該酵素吸附之工作電極；其中該感測器束缚 式酵素作用在基材上係導致該工作電極處的電位之一變 化； 15 (c)下列兩者任一者： ⑴在步驟(b)(i)的該接觸之後偵測該工作電極處的 電位之變化；或 (ii)決定該工作電極處的電位在步驟(b)(ii)的該接觸 之後回到一實質穩態基線值所需要的時間期間；及 20 (d)下列兩者任一者： ⑴步驟（c)所偵測的電位之變化係與下列變化作比 較：對於一不含大腸菌之控制反應混合物所偵測之電位 的變化；對於一已知數量的大腸菌所偵測之電位的變 化；對於電位變化vs.細菌數、或其任何組合之一校準曲 32 200817520 線；或 (11)步驟(C)(ll)所決定的時間期間與下列作比較：對 於一包含一已知大腸菌數的反應混合物使該工作電極的 電位回到一穂態基線值所費的時間期間；或對於該工作 5 電極處的電位回到一穩態基線值所費的時間期間v s ·反應 混合物中的細囷數之一校準曲線；及 (e)使步驟(c)⑴所觀察的電位之變化或步驟⑷⑼所觀 察的時間期間與樣本中的大腸菌之存在或數量產生相關。 步驟(c)(ii)可包含： 10 的該接觸之後該工作電極處的電位回到一 恆定基線值所需要的時間期間。 此悲樣的一實施例中，測定係為一耗盡測定，其中相 較於對於不含細菌或不含酵素的控制樣本所偵測/決定 者’由於細菌相關聯的相關酵素100耗盡藉由一電極束缚式 15酵素102&所催化的反應可取用的基材數量之故，較高大腸 菌數係與所偵測電位的較小變化、或步驟(c)所決定的較短 日守間期間相關聯，且大腸菌被定量或半定量式偵測。 譬如，參照第10圖，本發明的一耗盡測定可包含測定 一已由一未知樣本及基材(諸如X_Gal)作孵育之測試樣本。 2〇 若大腸菌出現在反應混合物中，這些將耗盡反應混合物中 的基材量，且大腸菌的細胞數亦可增加。反應混合物隨後 可利用根據本發明的一感測器作測定，諸如一包含一已吸 附有β -半乳糖苷酶之以聚唤咯為基礎的工作電極之感測 器’其在與感測器接觸之前被選用性地過濾。相對於一參 33 200817520 考電極在工作電極處所觀察的電位隨後係可與對於一正控 制，其包含一不含基材或含有基材及一具有高卜半乳糖苷 酶活動之而接種體的細菌（使得實質全部或全部的基材在 接觸包含反應混合物之本發明的一感測器之前被耗盡）· 一 5負控制反應混合物，其不含細菌（對於給定初始基材濃度之 最大電位差）；或其-組合之反應混合物所觀察者作比較。 隨後可利用對於該感測器或感測器批次所先行製備的一適 當校準曲線使得對於測試及—適#控朗觀察的電位差異 等同於將已出現在初始樣本中之大腸菌細胞的—近似數 10 字。 大腸菌將在廣泛情況中構成問題，特別是諸如處理流 出物及集水區域/河流等水源中尤然。因此，根據一特定實 施例本發明的-方法係用於積測一得自水源的樣本中之 大腸菌。 15 目為水樣本巾很低位準的大腸时時仍可能造成消耗 該水的人類及其他動物之病理狀況，樣本可能在以基材膊 育之前譬如藉由過濾/超過濾被濃縮。 測定條件 叙而a ’本發明的方法中，基材可以-提供最大反 2〇應速率的濃度來提供，以具有最好的敏感度，但亦可採用 次佳的基材濃度。譬如，若使用電位變化的初始斜率而非 基材04或產物之實質完全或完全的耗盡之後電位變化 =制則可知用逼近酵素⑽咖㈣的米氏(黯^㈣ 常數(Km)、或略微更高之_基材濃度藉以確保所制電位 34 200817520 變化逮率之 及束縛至電極的酵素=使用的基材濃度將依據相關酵素 基本酵素參數為已知力學而定’且其如果或一旦 決定及/或可容_料f 、模型贿或計算來 或溶解度亦可為決定所==:基材的成本及/ 素。 用的基材》辰度日守之一項決定因 對於細菌糖苷_，％ u、 "如，已知具有從微莫耳範圍（諸如 約25μΜ)至毫莫耳範圍 ^ ^ 、、- 1啫如約25mM)之廣泛的米氏常數 (m)。為了達成最大的 10 15 20 反應速率，基材濃度應至少約為該 未氏吊數(Km)的3至5倍， 、 且理想上為更局，諸如約10倍之 特定基材的一給定酵紊沾 ， '、、未氏常數或更南。因此，對於端 點電位變化決定，若對a 、 钉於相關酵素100或電極束缚式酵素 102a或102b的一者之最古士 取巧水氏常數為近似ImM，適當基材 濃度可能南達約lGGmM或更高，但基材成本可能需要較低 濃度’諸如約75mM、約5〇福、約4〇碰、約3〇福、約 20mM、約 15mM、約 l〇mM、約 7 5mM、約 5mM、約4mM、 約3mM或甚至更小。若採用接近米氏常數、或較低的基材 濃度，由於基材濃度的小差異可能導致反應速率的大差 異，應小心確保測定之間的基材濃度的一致性。或者，應 在基材批次之間測試適當的標準。 若在感測器接觸於反應混合物之後的設定時間決定工 作電極處的電位之變化（見下文），為了具有最好敏感度，此 等測定中所使用的基材104量應使得電極束缚式酵素102a 可取用的基材104或作用的酵素102b之產物105的數量（及 35 200817520 因此未被相關酵素所轉換之基材量，或相關酵素的作用所 釋放之產物105量）位於對於此基材之電極束缚式酵素的米 氏常數(Km)之約〇至約2至3倍的範圍中。若採用較高的基材 濃度，精確度可能受到妥協，且這亦可能發生於採用很低 5基材濃度（其可能難以精確地複製）及/或對於電極束缚式酵 素之基材飽和曲線在很低基材濃度處非常陡峭（亦即，酵素 為飽和，且因此反應速率為近似最大)之情形。 為了增加偵測一相關酵素性活動之機會，樣本可嬖如 在與基材104孵育之前藉由過濾/超過濾被濃縮。 0 為了在與基材孵育之後消除來自微生物之干擾，反應 混合物108可在步驟⑻之後過濾以從齡物移除微生物以 被施加至感測器。 -般而言，雖然較接近對於相_素刚及電極束縛式 酵素102a或102b活動的最佳溫度之溫度可提供較大測定速 15度或敏就，本發明的-方法中對於步驟⑷或⑻所採用之 溫度並不重要。若作出與其他測定回合之有意義比較，溫 度理想上在不同測定執行之間應為相同，或者應在不同田 度執行適當的標準及/或控制。—旦基本酵素及基材參數= 已知，熟習該技術者可藉由直率程序及模型模擬容易地將 2〇用於進行步驟(a)及(b)之溫度予以最佳化。

對於藉由來自五.⑽的β-半乳㈣*戶斤儐化之反 最佳值溫度被記載為，然而，可採用從約机 至約50°C的溫度諸如約2(TC、22它、24t、26它、28它 3〇t、坑、3(C、机、38t、4吖、机、听、％ 36 200817520 °C、48°C、或50°C、甚至位於此區域外之溫度，但已知來 自的卜半乳糖苷酶在高於3Tt之溫度並不穩定。 對於相關酵素100及感測器束缚式酵素102之最佳值溫 度將未必相同，因此可能需以不同溫度進行步驟0)及卬）。 5 反應環境應具有一位於相關酵素100、感測器束缚式酵 素102、或兩者的pH最佳值的約1至2 PH單位内之pH。然 而，若酵素具有一相對較扁平的pH活動輪廓，較寬廣的ρΗ 可能適用。反應pH亦可影響反應物濃度，且這可為一項決 定因素，且酵素的pH最佳值可能未必提供最佳值反應條 10件。一旦基本酵素及反應物參數為已知，熟習該技術者可 藉由直率的程序及模型模擬容易地進行pH最佳化。 相關酵素100及感測器束缚式酵素102之pH最佳值將未 必相同，因此可能需要在步驟（a)之後調整反應混合物的 pH 〇 15 來自五·的β_半乳糖苷酶具有6.6-8.0的pH，依據基 材及所使用緩衝液而定，在pH 6.0為穩定但在pH 5.0則不穩 定’且在大於pH 9.0的pH值並不穩定。為此，若來自五 的β-半乳糖苷酶出現於反應混合物中，且來自五.Co"的β-半乳糖苷酶束缚至工作電極，則反應環境pH可能為從約 20 pH 5.5至約pH 9_0，諸如從約pH 6.0至約pH 8.0，諸如約pH 6.0，約pH 6.2，約pH 6.4，約pH 6·6，約pH 6.8，約pH 7.0， 約pH 7_2，約pH 7·4，約pH 7_6，約pH 7·8或約pH 8.0。 因此，雖然未必需要，反應混合物可包含一適當緩衝 液以使pH維持在所想要範圍内。適當緩衝液及其濃度係為 37 200817520 該技藝所熟知且可僅藉由例行實驗對於任何給定組的所想 要反應條件由熟習該技術者來決定。 若《亥方法包g肖樣本中存在一微生物相關聯之相 關酵素性活動的制，且步驟⑷包含孵育一包含該樣本及 5 -基材之反應混合物，除神|期陳料樣本中存在报 低的微生物量，反應混合物可能預期發生酸化。這可能將 pH降低至一顯著地低於對於酵素的pH最佳值、或可使工作 電極表面不那麼具有回應性之位準，潛在地降低了感測器 的敏感度。可藉由反應混合物的適當緩衝、避免一或多個 10樣本中的過度細胞數、適當的孵育定時、或其一組合來避 免或限制此效應。 依據被催化反應及酵素而定，本發明的方法亦可能需 要對於相關酵素的活動在孵育媒體中包括一或多個共同因 素或共同基材，或對於第二/感測器束缚式酵素的活動將其 15 包括在或測定媒體中。 亦應考量抑制劑對於相關酵素或第二/感測器束縛式 酵素的活動之潛在效應、或可能以其他方式影響本發明之 感測器的敏感度之因素。 譬如，若相關酵素、第二/感測器束缚式酵素、或兩者 20 為β-半乳糖苷酶，由於這些化合物兩者皆與X-Gal競爭來自 万.Co/i的β-半乳糖苷酶的作用，包括乳糖或異丙基令D_硫 代半乳吡喃糖苷（IPTG)之作用係可能降低留存在反應混合 物中的X-Gal之偵測的敏感度。由於乳糖或iptg時常用來誘 發β-半乳糖苷酶的表示，這可能在本發明的方法包含藉 38 200817520 由β_半乳糠苷酶活動的偵測來偵測大腸菌時構成問題。 為了令用於偵測微生物之使用根據本發明的方法具有更好 的測定敏感度，因此可能偏好不使用乳糖或IPTG來誘發β-半乳糖苷酶。或者，可以低、實質非干擾性濃度使用低位 5 準的此等β-半乳糖苷酶誘發劑，且這可能容許具有較可靠 的結果。 並且，在這些研究過程中，已經發現陰離子性清潔劑 SDS(其可用來滲透化微生物細胞以釋放、或增加相關酵素 的細胞外位準）係與使用束缚有β_半乳糖苷酶之來自英國的

10通用感》則菇有限公司（Universal Sensors Ltd· : USL)以聚口必 略為基礎的感測裔之對於X-Gal的測定敏感度產生干擾。因 為SDS亦為製備感測為的工作電極中之摻雜物，其部分原 因可能由於電荷所致，或者SDS所提供的電荷可能為干擾 1因素。可預期其他離子性清潔劑亦可與此等感測器的敏感 度產生干擾，且因此若將使用聚D必咯則對於微生物細胞的 滲透化而言可能偏好使用非離子性清潔劑。 若測定敏感度並非極為重要，可執行適當控制以顧及 往何抑制劑或干擾物質的效應。 酵素或微生物量之決定 直本發明的方法可包含相關酵素1〇〇的半定量決定及定 ^定。前者案例中’可能μ要精確的基材濃度及溫度， 至;=法可能較適合使用小型且可能為可攜式裝置(甚 又工 /、可依需要選用性地在襯衫或夾克口袋 39 200817520 中孵育。 右忒方法為半定量性，亦可能不

之數值決定及/或與標準或控制的電位變化電位的 低限值變化、或依需要足 M 5 10 15 20 的斜率之比較。 ^、或負結果的電位之變化 〜二者纟:亥方法包含一樣本中之相關酵素的定量决 :不所觀察的電位之變化可能與下列作比較:對： ㈣已：目關酵素之控制反應混合物ι〇8所觀察 =對於一包含一已知相關酵素-量之反應混合物二 相察的電位之變化…對於電位的變化VM目_素10 置之校準曲線，或其任何組合。 工作電極處的電位之變化可能在任何適當的一或多個 時間決定。可分別供電極束缚式酵素咖或娜作用於其 上之基材104或產物105的各個分子之偵測係可能需要—_ 伸的時間量(隨著電極束缚式酵素的基材量被耗盡，反應迷 率減慢，提供一漸近性耗盡曲線）。為此，工作電極101處 ㈣位可在-或多個設定時間決定，且可使用電位的變^ 之實際值或斜率來回溯與樣本中相關酵素1〇〇量產生相 =。此製程由於只需妓-初始反應速率而非容許反應^ 質地繼續進行至均衡或繼續進行至均衡故可顯著地加^ 定時間。 Μ 或者，可在本發明的一電化感測器接觸於一反應現合 物（製備反應混合物之同時或立即之後)及決定工作電極、: 當接觸於一不含基材的反應混合物時之類似的電極處所^ 40 200817520 察的電位回到一穩態基線值（其可能為實質等同於或等同 於對其所先行觀察數值之數值）所需要的時間期間之後連 4丨生或週期性地監測工作電極處的電位。工作電極處的電 位所需要之時間期間隨後可能與一適當控制或標準作比較 5藉以決定一樣本中出現之相關酵素或微生物量。譬如，所 觀察的時間期間可與該工作電極處的電位回到對於一包含 一已知大腸菌數量的反應混合物之一穩態基線值所費的時 間期間作比較。或者，所觀察的時間期間可與一對於一工 作電極處的電位回到—穩態基線值所費時間期間vs·反應混 10合物中的細菌數之校準曲線作比較。由於可容易取得用於 偵測漸近性端點之軟體，此等方法亦可被自動化。 對於一樣本所獲得結果與一適當控制作比較之本發明 的方法中可利用分離的電極來測試一正控制（一不具有基 材、或具有一已知微生物量之控制組)及/或一負控制（一具 15有基材但無微生物之控制組）。然而，為了容許電極之間可 忐的不一致，可使用相同電極來測定樣本及一正控制、一 負控制或兩者。此-方法中，為了降低由於攜載基材或產 物所致之不精確，電極可在讀取之間以一適當媒體作清 洗，或者可以下列次序進行讀取：正控制；樣本；負控制。 2 〇 本發明的方法之特定優點 本發明的方法係由於該等方法的簡單性及相關材料的 堅固性而可叉到自動化。因此，根據一實施例，本發明的 -方法之至；步驟⑼及⑷受到自動化。根據另—實施例， 本發明的-方法之所有步驟皆受到自動化。 41 200817520 本發明可因此提供一自動地獲得諸如一水樣本等樣本 且將將提供至一利用生物感測器來偵測及量化相關酵素性 活動及/或微生物的數量之測定之系統。因此，本發明的方 法可依需要容許新測定及生物感測器之自動佈署，故容兮午 5可在無人照料下執行一自我圍堵式環境監測系統。 並且，由於使用在本發明的方法中之感測器可被絲網 列印，且因此能夠被使用在小測定容器/胞室中，可在諸如 96井板等多井板中進行至少步驟(b)及(c)。 經絲網列印的感測器亦可使用在感測器陣列中以備測 10多重酵素性活動。這可容許偵測藉由微生物之酵素表示的 圖案，而可能容許偵測已經據以培養一微生物之條件，或 容許偵測具有特定酵素表示圖案之微生物。 因此，本發明可容許自動的迅速(〜4至6小時)之少數微 生物的計算，諸如水中的細菌。此短的測定時間係區分出 15本發明的方法與需要一隔夜孵育步驟之現今、產業標準、 以培養為基礎的偵測方法。自動地處理樣本之能力係區分 出本發明與需要操作人員在製程中不同階段操縱測定之其 他以生物感測器為基礎的系統。此外，所採用的中央測定 係為電化式’其利用適應現場條件及無人操作之堅固、便 20宜且可棄的電極，主要係用於環境監測之領域中。此測定 亦為一般性本質且適可用來偵測大量相關酵素性活動、微 生物病原體或指示器微生物，在環境監測及諸如水產業的 領域或臨床診斷等其他的領域中皆然。 本發明的方法之較大速度且特別是關於微生物的谓測 42 200817520 (諸如五及其他大腸菌之環境中的病原體）時係可容許更 迅速地獲得結果’且可使以這些結果為基礎的決策更為有 效。此外’低的測定成本、及取樣程序的自動化將可容許 在一給定時間期間中取得許多樣本。在水監測領域中這將 5旎夠建造出環境事件對於水源污染的效應之一較好的預測 性模型’或例如在水產業領域中早期指示出存在致病生物 藉以能夠作預防性干預。亦可利用本發明的方法來達成 水、廢水、水產業、生物固體等中之其他病原體的監測。 譬如，可監測身為水工業中的主要問題之心及身 10為散佈在水冷卻系統中的重要病原體之狀//α。 本發明亦想見包含本發明的一或多個電化感測器之用 於偵測微生物或微生物類型之裝置。此等裝置中，一或多 個感測可能接觸於、或可接觸於一電位計。電位計可直 接地或經由遠端導通部件與至少一資料收集模組呈導通。 15此外，該裝置可包含、或可接觸於一資料處理模組以使一 或夕個感測器所偵測的電位之一變化定量地或半定量地與 一樣本中的微生物類型或微生物量產生相關。對於微生物 頟型或微生物量之定量決定，處理模組亦可包含用於下列 之資料·有關一樣本中缺乏微生物之電位的變化；有關一 20樣本中存在一已知微生物數量之電位的變化；一有關對於 微生物細胞數量之電位的變化之校準曲線；或其任何組 合，且此模組能夠比較感測器所偵測的電位之一變化與該 貧料以定量或半定量地決定該樣本中之該微生物類型或微 生物量。 43 200817520 5 件 本發明所想見之裝置係包括用於遠端監測一環 如水路)之自動式裝置，或研究室用之部分自動式或完全手 動式裝置’及用於環境監測之囊袋尺寸#置其可包含 至少一或多個感測器、—電位計及資料獲取或資料傳^ 現在將參照下列範例只藉由範例來描述本發明的較佳 形式，且其不被視為以任何方式限制本發明的範圍或精神。 範例 範例1-製備感測器 10 具有經聚嗞咯塗覆工作電極之經絲網列印的電化感測 器係付自通用感測器有限公司（Universal Sensores Ltd.: USL)(Unit 2 Suite，Abbey Barns, Duxford Road，Ickleton，

Cambridge CB 10 1SX United Kingdom)。 感測器自其保護包覆物移除且加熱至150°C兩分鐘。 15 所有後續步驟係在一96井聚丙烯微板之井中進行。 酵素對於工作電極之直接、被動式吸附

感測器浸於一包含一所想要酵素濃度之適當容積的溶 液中一段充分時間期間以容許所想要酵素量束缚至工作電 極。鐾如，為了製備適合偵測一反應混合物中的X-Gal之感 20 測器，感測器可浸於16〇 Μ之〇·1Μ石粦酸鹽緩衝液(PH7.3)中 的6U/ml β_半乳糠苷酶中一段位於1分鐘至1小時或更大的 範圍之時間（譬如，Κ25、Κ5、1/75、2、2·25、2·5、2·75、 3、3 5、4、4.5、5小時或更大）。感測器可浸於160 W之〇·1Μ 磷酸鹽缓衝液(ρΗ7.3)中的6U/ml Ρ-半乳糠苷酶中譬如約 44 200817520 2^3^4^5^7.8^9M0^11^12M3>14M5>16^17^ 18、19、20、21'22、23、24、25、26、27、28、29、3〇、 3卜 32、33、34、35、40、45、50、55或58分鐘。 感測器隨後被清洗以移除未束縛的酵素。上述特定範例 5中，清洗可能包含使感測器浸於三份的叫喊酸鹽緩衝液。 感測1§此時可易於立即使用、或覆蓋有一保護塗層（諸 如ArraygUardTM，或後塗覆(Postdating)緩衝液，得自^洲 昆士蘭湯斯維爾的輟普拜爾（Tr〇pBi〇))以供儲存。 酵素經由一鏈菌素生物素連結被束缚至工作電極 10 感測器浸於一包含在蔗糖緩衝液中處於80 pg/ml的鏈 菌素（Sigma ; Cat No· S0677)之適當容積的溶液中。對於各 1 mm2的工作電極需要7μ1的鏈菌素溶液。 鏈菌素溶液隨後乾燥於電極（37°C/3小時最小值）上且 感測器隨後被清洗以移除未束缚的鏈菌素。 15 經生物素共軛的P-半乳糖苷酶(Sigma; Cat No. G5025) 溶解於一處於1 mg/ml的專屬酵素穩定化溶液中 (Stabilzym，瑟蒙地公司（Surm〇dics心)）。此物料在pBs_ 7·〇)中進-步稀釋以提供所想要的酵素濃度，且其7μΐ以移 液官移至經清洗之塗覆有鏈菌素的電極上。經生物素化卜 2〇半乳糖苦酶被特定地定向且藉由生物素分子與對於此分子 的特定受體之交互作用被束缚在聚料電極上的鏈菌素 上感測杰卩通後被清洗以移除未束缚的酵素。經擷取的酵 素(β-半礼糖芽酶，或任何診斷性細菌酵素)隨後乾燥於感測 ⑽小時37〇上’且可制性地施加及乾燥—保護層的微 45 200817520 陣列塗層（諸如Array guard™，或後塗覆(Postcoating)緩衝 液，得自TropBio,澳洲昆士蘭湯斯維爾）。感測器然後儲存 在4°C直到使用為止。 酵素經由抗體附接被束缚至工作電極 5 抗體亦可藉由在一適當緩衝液（諸如填酸鹽緩衝的鹽 水pH 7.4)中將充分容積的抗體溶液（濃度被實證式決定）以 移液管移動而被施加至感測器表面（譬如，對於碳電極為3〇 uL且對於聚哒咯電極為3μί)。 感測器隨後在3 7 °C被乾燥直到幾乎乾燥為止（諸如約 10 15分鐘），然後可選用性地施加30μί或3uL的保護溶液（嬖 如，TropBio後塗覆緩衝液），且感測器被完全地乾燥及儲存 於4°C、脫水。 緊接在使用之前，若已施加一保護層，感測器則可被 緩衝液清洗以移除保護層。 15 酵素溶液隨後可以移液管被移至工作電極上，或電極 浸於酵素溶液中。一孵育期間容許藉由抗體來擷取酵素之 後，感測器可被沖洗以移除未束缚的抗體。 感測器可立即用於如上述般地測定一基材，或藉由浸 於基材溶液中，其中譬如在USL聚哆咯感測器之案例中藉 2〇由一USL讀取、或在諸如碳電極等其他電極之案例中利用 一宅伏特計來收集資料。 右抗體將藉由諸如鏈菌素/生物素等特定連結被附接 至感測器，鏈菌素可由該技藝已知的任何適當方法施加至 包極。譬如，為了使鏈菌素連結至USL聚吆咯感測器，可 46 200817520 如USL技術手冊所描述來進行此作用。 鏈菌素的一溶液（譬如，0.005M磷酸鹽緩衝液pH8〇中 的一 10%嚴糖溶液中之8(WmL)可放置在工作電極表面上 (譬如，對於碳電極為3〇μί，對於USL聚嗞咯電極為^l) 5且在37 C乾燥4小時。感測器隨後可儲存於4它。 經製備的感測器隨後可在PBS中清洗，且一經生物素 化抗體的/谷液係共扼至被施加至工作電極的相關酵素（譬 如，對於碳電極為3(^L或對於USL聚哒咯電極為3μί如前 述）’或感測器浸於經生物素化抗體酵素溶液中，且孵育一 10期間以容許鏈菌素與抗體上的生物素終端之交互作用。 作一沖洗以移除未束缚抗體之後，感測器將使用於測 定中如上述。 可利用該技藝所知的任何專屬套組或方法使抗體被生 物素化。 15範例2 —用於偵測基材且因此包括酵素性活動之感測器及方 法的發展 感測器範例1如所描述般地製備，其中瓦⑺"p_半乳糖 苷酶直接地(被動地吸附）或經由一鏈菌素_生物素連結而被 束缚至工作電極。施加至感测器之β_半乳糖苷酶的濃度依 20 需要而變動。 感測為、被固持在用於測置個別感測器的電位之裝置 (英國 Unit 2 Suite 2, Abbey Bams，Duxford R0ad，Ickleton， Cambridge CB 10 1SX之USL所製造）的個別通路中。總共 12個感測器可被固持在此裝置中，故能夠具有6組的控制及 47 200817520 測試讀數。各感測器係設置於一96井聚丙烯板的一井中。 來自各感測器之電性輸出係利用U s L提供的專屬軟體被測 量及顯示。 基於評估範例1所描述方法製備的感測器效能之目 5的’各者係浸於所想要濃度的2x酵母生長媒體中之X-Gal (5-演-4-氯-叫卜朵半乳糖）中（依需要稀釋於2\酵母胰化 蛋白中之50mg/mL X-Gal物流溶液）。生長媒體中之X-Gal 的濃度依需要而變動。 第一系列的實驗中，利用從2pg/mL至10μ§/ηιΙ^β_半乳 10糖苷酶濃度來調查在製備期間施加至感測器之不同濃度的 β-半乳糖苷酶之效應。在感測器浸於5(^g/mL X-Gal之後監 測各pg/mL處理之工作電極處所觀察的電位之變化。結果顯 示於第3圖中。 另一系列的實驗中，相較於β-半乳糖苷酶經由一鏈菌 15素·生物素連結被束缚至感測器之情形，調查β-半乳糖苷酶 藉由直接/被動吸附被束缚至感測器之效應。結果顯示於第 4Α及4Β圖中··第4Α圖提供浸於包含5(^g/mL X-Gal的2χ酵 母胰化蛋白生長媒體中三分鐘之後位於各電極處的電位之 柱狀圖（對於各β-半乳糖苷酶束缚方法/處理一式二份）。第 20 4Β圖顯示對於第4Α圖所代表資料所獲得之原始電位線 跡；第4B圖中的經充填三角形代表唯一的鏈菌素_生物素樣 本’而中空符號代表〇pg/mL X-Gal控制；其餘(經充填)符號 代表經直接束缚/被動吸附的樣本。結果顯示β_半乳糖苦酶 可藉由被動吸附被直接地束缚至經聚吆咯塗覆的感測器， 48 200817520 相較於β半乳糖♦酶藉由一鏈菌素_生物素連結被束缚至感 測為之情形並無顯著的活動損失。

第4Α及4Β圖所提供的結果亦顯示當一包含丨75^g/mL β-半乳糖普酶之溶液在其製備期間施加至感測器時，電極 5幾乎被β_半乳糖苷酶所飽和。 一後續系列的實驗中，進一步調查藉由β_半乳糖苷酶 的感測為飽和，施加至感測器之溶液中的β_半乳糖苷酶在 其製備期間係變動於〇至100單位/mL。第5圖顯示，藉由一 新批次的β-半乳糖苷酶（未經生物素化），塗覆緩衝液中只 10需要6U/mL來提供最大值輸出。此數字亦顯示，β—半乳糖苷 酶實質地未受到儲存於乾冰上三天所影響。 利用6U/mL β-半乳糖苷酶製備的電極係具有近似 8χ10_5單位/電極的活動（每分鐘/電極所轉換的gmoles基 材，工作電極表面積=〜1.3mm)。 15 下一系列的實驗中，對於經界定媒體(EZRich媒體-F.C.

Neidhardt，P.L.Bloch，及D.F.Smith (1974)“腸桿菌之培養媒 體”，J Bacteriol. 119(3) ： 736-747 ； http : //www. genome.wisc.edu/resources/protocols/TekNova.htm) 中之一範圍的X-Gal濃度(0-100pg/mL)之6 U/mLp-半乳糖芽 2〇 酶感測器獲得一校準曲線。結果顯示於第6圖中（資料顯示 為以lOOpg/mL X-Gal所達成的全尺度偏向之％)，其顯示這 些條件下從約2.5pg/mL至約85pg/mL X-Gal範圍中之這些 電極的良好敏感度。 另一系列的實驗中，調查β-半乳糖苷酶塗覆/束缚時間 49 200817520 對於所產生感測器的所產生敏感度之效應。使用非生物素 化卜半乳糖苷酶、及直接/被動吸附來將β_半乳糖苷酶束缚 至感測器。如第7Α及7圖所示，1〇分鐘的塗覆時間足以可靠 地以β-半乳糖苷酶來飽和電極表面。 5 另一實驗中，調查用以將β-半乳糖苷酶塗覆在感測器 上之方法的可重覆性(β_半乳糖苷酶藉由鏈菌素-生物素連 結被束缚至感測器）。將7.5pg/mL經生物素化β-半乳糖苷酶 如範例1所述施加至11感測器且隨後浸於包含5(^g/mL X-Gal之2x酵母胰化蛋白生長媒體中。第8A及8B圖所示的 10 結果顯示β -半乳糖苷酶塗覆程序(鏈菌素-生物素連結方法） 之很好的可重覆性，特別如所有η感測器的均值/平均數之 小標準差柱、及對於各感測器的電位變化之原始資料線跡 所示（第8Β圖）。 另一系列的實驗中，調查當感測器用來順序性讀取樣本 15 時之基材攜載的效應。如第9Α及9Β圖結果所示，基材攜載可 在所獲得讀數中導入顯著的誤差，特別是當一感測器從一具 有高基材濃度之樣本移至具有低基材濃度者時尤然。 這些研究的過程中：

-決定感測器上之β-半乳糖苷酶的飽和濃度一施加至工作 20 電極的溶液中之β-半乳糖苷酶的濃度可被削減至6U/mL 同時仍留有全尺度之電位的變化； -決定出無基材控制上之X_Gal的最小可偵測濃度，使用經 β-半乳糖苷酶飽和的感測器，可偵測低於〇e5pg/mL之 X_Gal濃度； 50 200817520 將β七1糖__在電極上之π方法，經由-键囷素-生物素束缚對之連結及被動吸附來提供經聚咕 洛塗覆的讀魏之㈣難的縣； 、 亦孑估％疋化酵素之方法，酵素可乾燥於感測器表面且 5儲存於一保4層（諸如後塗覆(Postcoating)緩衝液，得自 澳州比士蘭湯斯維爾的丁哪此)底下處於代至少數 日β·半祕芽酶亦顯示為可抵抗儲存於乾冰上三天； -以遇來自個別感測器的偏差輸出之部分問題，可能由於 感測器表面的不-致塗覆或聚料的電化沉積，其導致 1〇 Μ器輸ώ的變異性增高，降低了敏感度及可重覆性。 範例3-可供束缚β_葡萄㈣酶或卜糖㈣之感測器 感測器如範例1所述製備，其中來自杏仁之Ε —·的β· 葡萄普酸酶或β·糖苦酶直接地束缚/吸附至工作電極。施加 至感測器之酵素的濃度依需要而變動。 15 感測器被固持在一用以測量個別感測器電位之裝置 (英國 Unit 2 Suite 2, Abbey Barns，Duxford R0ad，Ickleton，

CambridgeCB 10 1SX的USL所製造）的個別通路中。此裝置 中可固持總共12個感測器，其能夠有6組的控制及測試讀 數。各感測器設置於一96井聚丙烯板的一井中。利用uSL 20提供的專屬軟體來測量及顯示來自各感測器的電性輸出。 對於评估如範例1所述方法製備之感測器的效能之目 的，β-葡萄苷酸酶感測器浸於以所想要濃度溶解於2义酵母 胰化蛋白生長媒體中的X-GlcA(5_溴-4-氯_3-⑸哚_p-D_葡萄 苷酸化物）中，且β-葡萄糖苷感測器浸在以所想要濃度溶解 51 200817520 於2χ酵母胰化蛋白生長媒體中的x_Glc(5-溴-4-氯朵 -β-D-糖苷）中。 弟10A圖所示的結果顯示來自又_(^八被β_葡萄苦酸 酶的耗盡之初步結果。隨著束缚至感測器的酵素濃度降低 5而觀察到信號減小，但輸出/敏感度不如β-半乳糖苷酶一 樣咼。藉由一特定交互作用之酵素在感測器上的定向應可 將其改良。 由於可以β-糖苷酶濃度減小來看出信號的差異，第1〇Β 圖所示的結果係指示出感測器亦可藉由使β_糖苷酶與其束 10缚來運作。這些初步實驗的結果並不理想，但對於酵素濃 度、定向及測定條件之進一步運作應可改良結果。 範例4 -樣本中之酵素活動的電化偵測 第11圖中提供根據本發明之用於偵測酵素性活動之方 法背後原理的示意圖（以經分泌或細胞表面細菌性酵素來 15 示範）。 對於一控制測量，一感測器浸於400μί之不含基材(控 制）的溶液中，且三分鐘之後，感測器的輸出讀取90s，其中 具有一初始l〇s OmV電位自調器鉗(potentiostat clamp)。位 於90s的讀數為“基線”讀數。 20 如下獲得一“測試”讀數： 一包含初始基材濃度H]”及含有相關酵素的樣本之 反應混合物（但其他則與“基線”讀數者為相同之組成物）係 孵育一設定時間量。一感測器隨後浸於40μί的反應混合 物，其已被選用性地過慮或作其他處理以移除或去活化酵 52 200817520 素，且三分鐘之後，感測器的輸出讀取90s，其中具有一$ 始lOsOmV電位自調器钳。位於9〇s的讀數為“測試”讀數仞 . 輸出表示如下： “測試基線差異” 5 為了量化“測試”樣本中被酵素所耗盡且以此差異作代 ， 表之基材量，該差異可與利用如下述的一或多個標準判別 • 式所製備之一標準曲線作比較，其中自各“標準”讀數減☆ 基線讀數。 " : 適當“標準”可藉由將已知量的基材溶解於與“基線，，判 1〇別式所使用者為相同組成物之一溶液中或藉由孵育一或多 個包含已知酵素活動量及一初始基材濃度[Si]之溶液歷時 與對於“測試’’樣本所用者相同的設定時間期間來製備。一 感測器隨後浸於“標準，，反應混合物中，其已被選用性地過 濾、或作其他處理以移除或去活化酵素且，三分鐘之後，感 15測器的輸出讀取90s，其中有一初始l〇s 〇mv電位自調器 ' 鉗。位於90s的讀數為“標準，，讀數。 、· 若使用單一已知酵素活動作為一“標準”，測試樣本中 的酵素活動可被計算為： ” '、貝,1古六、"一”美錄” ^?票_"-"1:線"χ標準樣本中的酵素性活動量 2〇 若已使用單一已知濃度的基材作為一“標準，，，留在樣 本中的基材量可被計算為： «穌㈣錄量或濃度 53 200817520 藉由將所耗盡基材莫耳數除以原始反應混合物孵育時 間的長度，該量/濃度及原始出現於反應混合物中的量/濃度 之間的差異可能隨後等於所耗費基材的莫耳數，且隨後等 於酵素性活動量（譬如，莫耳/分鐘，或更一般來說微莫耳/ 5分鐘）。施加一其中製備基材濃度相對於“標準，，-“基線，，值的 一校準曲線、且留在測試樣本中的基材量相對於此曲線被 讀取之類似程序。 範例5-樣本中之諸如大腸菌等細菌的電化偵測 感測器如範例1所述製備，其中尺卜半乳糖苷酶 10直接地(被動地吸附）或經由一鏈菌素-生物素連結被束缚至 工作電極。施加至感測器之β-半乳糖苷酶濃度係依需要 而變動。 感測器被固持在一用以測量個別感測器的電位之裝置 (由英國的 Unit 2 Suite 2, Abbey Bams，Duxford R0ad， 15 Ickleton，Cambridge CB 10 1SX的USL所製造）的個別通路 中。此裝置中可固持總共12個感測器，其能夠具有6組的控 制及測試讀數。各感測器設置於一96井聚丙烯板的_井 中。利用USL提供的專屬軟體來測量及顯示來自各感測器 的電性輸出。 20 為了偵測測試樣本中細菌的存在，樣本在37°C於包含 50pg/mLX-Gal(5•溴-4-氣-3-吲哚-β-半乳糖）之2χ酵母胰化 蛋白生長媒體中孵育2至7小時之間。這在5mL聚丙烯小瓶 中以225 rpm搖晃進行以曝氣。一份隨後在— l 微量離 心管中被離心以移除細菌細胞（12,〇〇〇g，2分鐘）且如下利用 54 200817520 本發明的一感測器對於殘留物或未耗盡χ—Gal的存在作浮 表測試： -將感測器浸於400μί的2x酵母胰化蛋白細菌生長媒體中 (正控制，代表X-Gal的總耗盡） 5 --等待3分鐘。 -讀取90s，其中具有一初始l〇s OmV電位自調器钳。 -90s的讀數為“基線”讀數。 -將感測器移至400μί的經過濾耗盡基材(2YT+5〇pg/mL開 始濃度的X-Gal) 10 -等待3分鐘。 -讀取90s ’其中具有初始l〇s OmV鉗。 -90s的讀數為“耗盡”讀數。 -將感測器移至負控制（現今使用2YT+50(Ig/mL，較低的濃 度應可改良敏感度） 15 -等待3分鐘。 -讀取段3及7。 -最後讀數為“最大值”。 輸出表示為· (最大值-基材K經耗盡-基線> “差異，， 20 差異《最大值-基線)xl00=身為全尺度偏向（FSD)的％之 輸出的下降 結果亦可以電位代表·原始或經調整(與一適當控制組 作比較）。 亦可在相同測定條件下相對於對於已知濃度的細菌所 55 200817520 獲付結果來讀取結果藉以在生長媒體中醉育之前估計存在 於樣本中之細菌細胞的初始接種體。 第12至17圖所示的結果係顯示利用五C0/z·株ATCC 11775或野型株365的孵育時間之如上述對於不同初始接種 5體所進行的實驗之結果，且亦顯示初始接種體尺寸及細胞 增殖對於感測器之細菌偵測的敏感度之效應。 利用一其上可經由一鏈菌素_生物素連結供β_半乳糖苷 酶束缚之感測器來獲得第12圖所示的資料，利用可供β-半 乳糖苷酶被動吸附之感測器來獲得其餘資料。 10 部分實驗中觀察到高負控制讀數，突顯出若想要定量 測定則需要進行適當控制。 達成的最高敏感度係位於500μί的湯液中之500及1000 對數期五.co//之間，但在反應混合物孵育5小時之後已經達 成低達約100細胞的偵測。 15 進一步工作顯示出，至少對於已供一 β-半乳糖苷酶 (6U/mL)溶液施加之USL聚嗞咯電極，敏感度在約2.5pg/mL 至約60-85pg/mL的範圍中為最大（譬如請見第6圖）。為此， 若目標細菌具有高的預期濃度，可使用高於50(Ig/mL的 X-Gal濃度，諸如100吨/11^的又-〇&卜若目標細菌具有低的 20預期遭度，5〇gg/mL的X-Gal可為更適當的開始濃度。 進一步工作亦已顯示，若包含此等細菌的樣本以用於 誘發β-半乳糖苷酶表示之IPTG作預處理則對於大腸菌的伯 測將達成較均勻結果。因此，5μΜΙΡΤΘ可被包括在樣本媒 體及負控制媒體中，以誘發β-半乳糖苷酶活動而不顯著壓 56 200817520 抑來自感測器的信號(請見範例6，如下）。 第18圖顯示對於進入包含5μΜ IPTG及1〇〇或6(^g/mL 的2x酵母胰化蛋白生長媒體中之細菌的一給定接種體之經 正常化％下降的差異。與第6圖一致，非線性線在60|Ig/mL 5 X-Gal所接種細菌之較低初始接種體比起lOOpg/mL X-Gal 中提供更大的％下降，但隨著初始細菌接種體增加，配合 線將對於lOOpg/mLX-Gal線變得較陡峭。 範例6-干擾因素 此處所描述的實驗中，如範例1所描述地製備包含束縛 /及附至工作電極的β-半乳糖普酶之感測器，且如範例2所描 述取得測量。所有反應混合物係由包含 酵母胰化蛋白生長媒體、及如下述的額外物質所構成。 第19圖顯示pH變化對於感測器的敏感度之效應。若讓 培養留待生長大於4小時左右，媒體的pH可下降最高達到 lpH單位或更多，這對於感測器輸出具有小效應，如同從培 養後往後尖凸最高達到5 〇 pg/mL X-Gal的一總耗盡樣本所 獲得之降低信號所見（相較於對於其中沒有細菌細胞的尖 凸狀樣本所達成之回應）。 生長/測定媒體的較好緩衝、或一經界定媒體、或小於 4小時的培養時間可移除此問題。 第20圖顯示一檢查SDS的效應、一細菌的電位滲透器 (^曰加視F半乳糖苷酶活動/細胞）及聚σ必洛中之一用以更 改包極電位的摻雜物且減小來自感測器的整體信號之實驗 的結果。雖然生長/測定媒體中的ImM SDS確實降低了敏感 57 200817520 度，所觀察的電位之變化(相較於1 mM SDS正控制）仍與初 始接種體尺寸成正比。 第21及22圖顯示反應混合物中存在乳糖及IPTG(分別） 對於X-Gal偵測之效應。資料顯示，乳糖及IPTG以一濃度因 5 變性方式影響感測器輸出。由於乳糖及IPTG係為用於β-半 乳糖苷酶的基材且因此預期與X-Gal競爭酵素的活性部位 故其為預期外的情形。由於這些化合物可用來誘發大腸菌 中β-半乳糖苷酶的表示以增強稀釋樣本中之其偵測，乳糖 及IPTG的存在可能是偵測大腸菌之一項議題。 10 第22圖顯示對於兩分離的實驗之結果，一者測試 10mM、5mM、2.5mM、1.25mM及0.625mM濃度的IPTG對 於X-Gal (50pg/mL)的偵測之效應，另一者測試ImM、 0.5mM、0.25mM、0.125mM及0.062mM濃度的 IPTG對於 X_Gal(50pg/mL)的偵測之效應。 15 範例7-對於大腸菌存在之水樣本的測試 獲得一代表性水樣本’其被選用性地次分取樣 (sub-sampled)、及濃縮，如果且依需要，然後混合於包含 所想要濃度的基材之一等容積的雙重強度(2x濃度）細菌生 長媒體以形成一反應混合物。這可為一原始媒體、一選擇 20 性媒體或一經界定媒體，以產生基材（現今為X-Gal {5-溴-4-氯-3-吲哚β-半乳吼喃糖苷}但可使用藉由β_半乳外b喃糖苷 酶的新陳代謝提供一電化信號之任何基材）的迅速生長及 新陳代謝。 反應混合物在37°C孵育一可依據使用需求（亦即，測定 58 200817520 的敏感度將隨著培養時程增加而增高）作調整之時間期間 (諸如〜L5小時）。一不含細菌之負控制（或一含有已知細菌 數之控制）或兩者係在相同條件下孵育。 可能隨後域例4或範例5所描述之一方法來決定測試 5及控制培養皆被過濾以移除細菌且反應混合物中之大腸菌 數(孵育開始時）。 其他相關酵素或微生物之偵測 β_半乳糖苷酶/X-Gal:可對於一給定濃度產生一較大信 號之β-半乳糖苷酶利用不同基材來改用用以在對於水中大 1〇腸菌的所提出測定中從電化感測器產生信號之酵素/基材 系統。酵素本身可由其他種特定酵素所取代，亦即葡萄 4酉文酶特別疋對於五· C0/z·及一病原體的任何其他酵素診斷 或在曝露於其基材時產生一電性信號之指示器種，其可在 一重組系統中被表示以將其生物素化而容許經鏈菌素塗覆 15 的感測器上之特定固定作用。 範例8-束缚至以碳為基礎的電極/感測器之酵素 碳膏電極（型C10903P1及C2000802P2)係購自葛溫特電 子材料有限公司（Gwent Electronic Materials Ltd，Monmouth House，Mamhilad Park，Pontypool，NP4 〇HZ，United 20 Kingdom)。 β-半乳糖苷酶 感測器係塗覆0·1Μ磷酸鹽緩衝液pH 7.3中之6U/mL β-半乳糖苷酶、或單獨的磷酸鹽緩衝液pH 7.3(控制組）。將 30pL的任一溶液直接地施加至工作電極，且在室溫孵育一 59 200817520 小時。藉由移液管來移動緩衝液且隨後立即將其移除，隨 後以200μΙ^|酸鹽緩衝液清洗感測器。 感測器隨後藉由將2〇〇μί的各測試溶液以移液管移至 電極上來測試包含順序性施加至電極之增加濃度的X-Gal 5 之2x酵母胰化蛋白（2YT)湯液之回應，而確保參考電極之覆 蓋。在施加樣本之後60秒以一毫伏特計來取得讀數。 感測器以包含下個[較高]X-Gal濃度的2YT湯液沖 洗’然後將200pL的該2YT X-Gal樣本施加至感測器且如前 測量。 10 第23A及23B圖顯示對於給定X-Gal濃度（〇· 1 〇(^g/mL) 之對於各碳膏電極類型所達成之回應。 脲酶 感測器藉由將30μί之0.2M磷酸鹽緩衝液pH 71中的 295U/mL脲酶、0.2M磷酸鹽緩衝液pH 7.1中的29.5U/mL腺 15酶、或單獨的磷酸鹽緩衝液PH7.1 (控制）直接施加至工作 電極而被塗覆，且在RT孵育1小時。感測器藉由移液管將 200μί的構酸鹽緩衝液移動於其上然後立即予以移除而被 該緩衝液清洗。 感測裔隨後藉由將200μΙ^的各測試溶液以移液管移至 電極上來測試包含順序性施加至電極之增加濃度的腺 (O-lOmg/mL脲)之緩衝液的樣本之回應，而確保參考電極之 覆蓋。在施加樣本之後60秒以一毫伏特計來取得讀數。 感測器隨後以下個[較高脲濃度]樣本沖洗，然後將 20C^L的該樣本施加至感測器且如前作測量。 200817520 第24A及24B圖顯示對於給定脲濃度0mg/mL)之對 於各碳貧電極類型所達成之回應，其中包含三個不同脲_ 濃度。 將"T瞭解雖然此處已以示範性質描述本發明的一特定 5實施例，可作出不同修改而不脫離由申請專利範圍所界定 之本發明的精神與範圍。 【圖式4簡罕^软^明】 第1圖提供本發明的一方法中之一電極束缚式酵素的 作用模式之示意圖，其中酵素被動地吸附至電極的表面。 10將被偵測的相關酵素以虛線顯示於一箱中以顯示酵素在感 測器與反應混合物接觸時可能未實際出現於反應混合物中 之事實； 第2圖提供對於增加濃度的β-半乳糖苷酶G-iOpg/mL) 浸於2x酵母胰化蛋白生長媒體中之一恆定濃度的5_溴_4_氯 15 _3_吲哚β·半乳吡喃糖苷（X-Gal-50pg/mL)之電極的飽和之 本發明的一工作電極與一參考電極之間的電位差隨著時間 之一圖形； 第3圖提供本發明的一工作電極與一參考電極之間的 電位差隨著時間之圖形，其中：第3A圖一 1000ng/mL β-半 20 乳糖苷酶施加至電極且浸於2χ酵母胰化蛋白生長媒體中之 增加濃度的5-漠-4-氣-3-吲哚β-半乳吡喃糖苷 (X-Gal-1.5-100pg/mL);第 3Β 圖-i〇〇〇ng/mL β-半乳糖苷酶 施加至電極且浸於2χ酵母胰化蛋白生長媒體中之2倍稀釋 的5-溴-4-氣-3_吲哚p_D_半乳吡喃糖苷 61 200817520 (X-Gal_5(M).625^/mL);第冗圖·則就p半乳糖普酶施 加至電極且浸於2x酵母胰化蛋白生長媒體中之減小濃度的 5-漢-4-氯-3-十朵β-D-半乳听喃糖普(x_GaM㈣吨就）；及 第3D圖-7500ng/mL β-半乳糖苦酶施加至電極且浸於2講 5母胰化蛋白生長媒體中之減小濃度的5务心氯_3令朵卜D_ 半乳吡喃糖苷（X-Gal-10_0pg/mL)。 第4圖顯示本發明的一工作電極與一參考電極之間的 電位差之結果，其中工作電極包含藉由不同部件或以不同 數里加加至電極之生物素化β_半乳糖苷酶，如下·· 10 7500ng/mL生物素化β·半乳糖苷酶經由束缚至電極表面的 鏈菌素施加至電極；7500ng/mL生物素化β-半乳糖苷酶被動 地束縛至電極表面；7500ng/mL生物素化β-半乳糖苷酶被動 地束缚至電極表面；3250ng/mL生物素化β-半乳糖苷酶被動 地束缚至電極表面；175〇ng/mL生物素化β-半乳糖苷酶被動 15地束缚至電極表面；浸於2χ酵母胰化蛋白生長媒體中之 5(^g/mL的5-溴-4-氯-3-吲哚β-D·半乳吡喃糖苷中。第4Α圖 以柱狀圖形式提供結果而第4B圖提供電位變化隨著時間之 原始資料(經鏈菌素束缚之β_半乳糖苷酶結果係以經充填三 角形代表，而未充填符號代表〇pg/mLX-Gal控制組）； 20 第5圖提供一柱狀圖，顯示製備工作電極之後或製備工 作電極前β-半乳糖苷酶在乾冰上作三天儲存之後當浸於 5(^g/mL X_Gal中時不同濃度的未經生物素化β-半乳糖苷 酶施加（直接地，被動地)至工作電極之結果； 第6圖顯示對於塗覆有6U/mL β-半乳糖苷酶且曝露於 62 200817520 一範圍的X-Gal濃度（經界定媒體中介於l〇〇(^G/mL至 OpG/mL)之經絲網列印聚嗞哈感測器的感測器校準圖形。各 柱係代表一式三份的讀數，附有誤差柱。輸出係表示為全 尺度偏向中的％下降；

5 第7圖顯示以30U/mL β-半乳糖苷酶對於浸入50pg/mL X-Gal中時之電極所記錄的電位差之增加時間量（相對於一 參考電極）之孵育工作電極的結果。第7A圖為顯示浸於 5(^g/mL X-Gal中近似3分鐘之後對於各電極之所記錄的電 位差（一式二份的讀數，附有誤差柱）之柱狀圖，而第7B圖 10提供在自其取得最大讀數之工作電極浸於5(^g/mL X-Gal 中之後隨著時間經過之電位差的第一組讀數之原始資料； 第8圖顯示一對於在2χ酵母胰化蛋白生長媒體中浸於 5(^g/mL X-Gal中之根據本發明的1丨感測器之可重覆性研 究的結果，已藉由將一包含7.5pg/mL經生物素化β_半乳糖 I5苷酶的溶液施加至工作電極一小時來製備感測器。第8Α 圖顯示浸於gg/mL X-Gal中之後近似3分鐘對於各電極之經 正常化電位差(相對於〇 pg/mL X_Gal控制）的柱狀圖，而第 8B圖提供工作電極浸於5〇 pg/mL x_Gal中之後隨著時間經 過對於電位差之原始資料； 20 冑9圖顯示基材的繼續存在(㈣y叫對於根據本發 明的感測n賴得賴之精確度之效應。圖為對於六 [減小]濃度的X-Gal (黑柱）所決定的電位差（mv)之柱狀 圖，其後電極固持件被倒置然後以相反次序來測定六 濃度(影線狀柱）。第犯圖顯示對於各對感測器由於基材繼 63 200817520 續存在所導入之誤差； 第ίο圖顯示對於包含β_葡萄苷酸酶（第10A圖）或包含卜 葡萄糖苷酶（苐10B圖）之本發明的感測器之所獲得的結果； 第11圖提供根據本發明的細菌偵測測定之示意圖。基 5材顯示為經充填二角形而細菌細胞顯示為具有一管腔之卵 形； 第12圖提供一圖形，其顯示5-溴-4_氣-3-0引哚β-D-半乳 吼喃糖苷的細菌耗盡導致較低的感測器輸出：全程採用 15pg/mL 5-溴-4-氣_3•吲哚β-D-半乳吡喃糖苦，其中有 10 0-5xl06五.cW細胞(ATCC 11775)及一“無基材，，控制組； 第13A及13B圖顯示以（及因此藉由下列之混合物中 X-Gal的耗盡）減小初始接種體的五·μ// ATCC 11775的反應 混合物孵育之後對於X-Gal之反應混合物的測定所獲得的 結果，結果被顯示為全尺度偏向的％降低(相對於〇細菌細胞 15 控制）。第13A圖-1·2χ107至1·2χ105細胞/mL歷時三小時。第 13B圖-3·7χ105至3·7χ102細胞/mL歷時五小時。反應混合物 中之X_Gal的初始濃度為2x酵母胰化蛋白生長媒體中之 50pg/mL ; 第14A及14B圖顯示包含（且因此藉由下列之混合物中 20 X_Gal的耗盡）增加初始接種體的尺ATCC 11775之反應 混合物孵育之後（以包含β-半乳糖苷酶之根據本發明的感測 器）對於X-Gal之反應混合物的測定所獲得的結果。在包含 50pg/mL X-Gal之2x酵母胰化蛋白生長媒體的初始接種之 後2小時後直到6小時為土每小時採取樣本。結果提供為所 64 200817520 觀察之％電位差降低(相對於〇細菌細胞控制）。第14B圖的資 料代表對於各初始接種體之一式二份的結果； 、 第15A至15C圖顯示對於浸於5〇|Llg/mL x_Gal中4小時 之後如根據本發明的感測器（包含束缚至工作電極之卜半乳 5糖苦酶)所決定從所觀察的％電位差降低(相對於〇細菌細胞 控制）來決定初始樣本細胞濃度(對於五·⑺"ATCC 11775)所 獲得的校準曲線； 第16圖顯示在包含5(^g/mL的2χ酵母胰化蛋白生長媒 體中孵育4小時之後以一式二份的減小初始接種體的野型 1〇株365之反應混合物孵育之後對於X-Gal之反應混合物的測 定（藉由包含β-半乳糖苷酶之根據本發明的感測器）所獲得 的結果。以所觀察的％電位差降低(相對於〇細菌細胞控制） 來提供結果。 第17圖顯示在包含50pg/mL X-Gal的2χ酵母胰化蛋白 15生長媒體中5小日守解月之後以（及因此藉由下列之混合物中 X-Gal的耗盡）一式二份之野型株365的初始接種體的系列 稀釋之反應混合物的孵育之後對於X_Gali反應混合物的 測定（藉由包含β-半乳糖苷酶之根據本發明的感測器）所獲 得的結果。結果提供為所觀察的％電位差降低(相對於〇細菌 20細胞控制）。第16圖亦顯示五小時孵育之培養中的培養i (40,000cfu/mL初始接種體）及4 (40cfu/mL初始接種體）中的 細胞數； 第18圖顯示對於進入包含用來作為基材之5μΜ IpT(J 及100或60pg/mL X-Gal的2x酵母胰化蛋白生長媒體中之一 65 200817520 給定接種體之經正常化％感測器輸出下降的差異； 第19圖顯示使用包含束缚至工作電極的β_半乳糠苷 酶之根據本發明的感測器之細胞培養期間的pH減小對於 X-Gal測定所獲得讀數的敏感度之效應； 5 第20圖顯示使用包含束縛至工作電極的β-半乳糖苷 酶之根據本發明的感測器之1 mM十二烷基硫酸鈉（SDS)對 於X-Gal測定所獲得讀數的敏感度之效應； 第21圖顯示使用包含束缚至工作電極的β_半乳糖苷 酶之根據本發明的感測器之反應混合物中出現的乳糖對於 10 X-Gal測定所獲得讀數的敏感度之效應； 第22圖顯示使用包含束縛至工作電極的β_半乳糖苷 酶之根據本發明的感測器之反應混合物中出現的異丙基 -β-D-硫代半乳吡喃糖苷（IPTg)對於X-Gal測定所獲得讀數 的敏感度之效應； 15 第23A及23B圖顯示使用兩型的經絲網列印碳膏電極 來測量X-gal濃度，其中β_半乳糖苷酶以6U/mL及〇u/mL被 吸附至感測器表面。以一毫伏特計來讀取輸出。 第24A及24B圖顯示使用兩型的經絲網列印碳膏電極 來測量脲濃度，使用以所顯示三種濃度吸附至感測器表面 20 之脲酶。以一毫伏特計來讀取輸出。 【主要元件符號說明】 101···工作電極 103…導電聚合性材料 102a，102b…第二/感測器束缚 104…基材 式酵素 105…產物 66 200817520 106a，106b…電傳導線 1〇8· 107···偵測器 1〇9· •反應混合物 •參考電極 67

Claims (1)

1. 200817520 十、申請專利範圍： 1. 一種用於偵測一樣本中的一相關酵素量之方法，包含： (a) 孵育一包含該樣本及可被該酵素作用於其上的 至少一基材之反應混合物； (b) 在下列任一者中使一電化感測器接觸於該包含 該樣本之反應混合物： (i) 該反應混合物的一選定孵育時間之後或 (ii) 與製備該反應混合物同時或立即之後， 其中該感測器包含一其中已固定一第二酵素或可 供其固定之工作電極，其中該第二酵素能夠作用在一選 自該至少一基材及一導因於該相關酵素作用在該至少 一基材上之產物的一或多者之物質上；其中該第二酵素 作用在該至少一基材或產物上係導致該工作電極處的 電位之一變化； (c) 下列任一者： ⑴偵測在步驟(b)(i)中的該接觸後之該工作電極 處的電位之變化；或 (ii)決定在步驟(b)(ii)中的該接觸之後該工作電極 處的電位回到一實質穩態基線值所需要的時間期 間；及 (d) 從在步驟（c)(i)所偵測的電位之變化或在步驟 (c)(ii)所決定之時間期間來決定該樣本中之相關酵素 量。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該相關酵素及該第 68 200817520 二酵素皆能夠作用在該相同基材上，且其中該相關酵素 存在於該反應混合物中係導致比起缺乏該酵素所觀察 者而言在步驟(C)中所觀察之電位的一較小變化或較小 時間期間。 3. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該相關酵素係與 一微生物或微生物類型相關聯。 4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該微生物或微生物 類型包含大腸菌。 5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其中該相關 酵素為一β-半乳糖普酶或一β-葡萄普酸酶，且該基材 分別為一β-半乳糖或β-葡萄苷酸化物衍生物。 6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該相關酵素為一β-半乳糖苷酶。 7. 如申請專利範圍第5或6項之方法，其中該第二酵素為一 β-半乳糖苷酶。 8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之方法，其中該至少 一基材為一 5-溴-4-氯-3-，哚或一 5-溴_6-氯-3-叫|哚連結 式化合物。 9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該基材為一 5-溴-4-氣-3-叫丨哚β-連結式糖苷或葡萄苷酸化物。 10. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該基材為5-溴_4-氯 -3-吲哚β-D-半乳吡喃糖苷。 11. 如申請專利範圍第1至10項中任一項之方法，其中該樣 本衍生自一水源且該相關酵素與一微生物或微生物類 69 200817520 型相關聯。 12. 如申請專利範圍第1至11項中任一項之方法，其中該反 應混合物在步驟⑻之後被過濾以自該混合物移除相關 酵素或細菌或相關酵素及細菌以被施加至該感測器。 13. —種用於偵測一樣本中的大腸菌之方法，包含： (a) 將育一包含該樣本及一包含一 β-半乳糖或β-葡 萄苷酸化物衍生物的基材之反應混合物； (b) 下列任一者中使一電化感測器接觸於該包含該 樣本之反應混合物： (i) 該反應混合物的一選定孵育時間之後或 (ii) 與製備該反應混合物同時或立即之後，其中 該感測器包含一其中已固定一酵素或可供其固定之 工作電極，其中該酵素能夠作用在該基材上；其中該 感測器束縛式酵素作用在該基材上係導致該工作電 極處的電位之一變化； (c) 下列任一者： ⑴偵測在步驟(b)(i)中的該接觸後之該工作電極 處的電位之變化；或 (ii)決定在步驟(b)(ii)中的該接觸之後該工作電極 處的電位回到一實質穩態基線值所需要的時間期間； (d) 下列任一者： (i)在步驟（c)(i)所彳貞測的電位之變化與下列作比 較：對於一不含大腸菌之控制反應混合物所偵測的電 位之變化；對於一已知大腸菌數所偵測的電位之變 70 200817520 化；一對於電位的變化vs.細菌數之校準曲線；或其任 何組合；或 (ii)將步驟（c)(ii)所決定的時間期間與下歹ij作比 較：對於一包含一已知大腸菌數的反應混合物使該工 作電極處的電位回到一穩態基線值所費的時間期 間；或一對於該工作電極處的電位回到一穩態基線值 所費的時間期間VS.反應混合物中的細菌數之校準曲 線；及 (e)從步驟(c)(i)所觀察之電位的變化或步驟(c)(ii)所 觀察之時間期間來決定該樣本中的大腸菌量。 14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該酵素為一β-半乳 糖苦酶或一 β-葡萄苦酸酶。 15. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該基材為一5_溴-4-氯-3-巧哚β-連結式糖苷或葡萄苷酸化物。 16. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該基材為5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳吼喃糖苷。 17. —種電化感測器，其包令—其中已固定一酵素或已供該 酵素固定之工作電極，其中該酵素： ⑴能夠作用在一基材上，該基材係為其能夠被一相 關酵素作用在其上；或 (ii)其能夠作用在一導因於一相關酵素作用在一基 材上的產物上之一者；其中該相關酵素與一微生物或微 生物類型相關聯；其中該電極固定式酵素作用在該基材 或產物上係導致該工作電極處的電位之一變化。 71 200817520 18. 如申請專利範圍第17項之感測器，其中該相關酵素及該 電極固定式酵素皆能夠作用在該基材上。 19. 如申請專利範圍第18項之感測器，其中該電極固定式酵 素能夠作用在一β-半乳糖或β-葡萄苷酸化物衍生物上。 20. 如申請專利範圍第19項之感測器，其中該電極固定式酵 素係為一 β-半乳糖香酶或一 β-葡萄皆酸酶。 21. —種電化感測器，其包含一其中已固定一酵素或已供該 酵素固定之工作電極，其中該酵素能夠作用在一β_半乳 糖或β-匍詞誓酸化物衍生物上以產生該工作電極處的 電位之一變化。 22. 如申請專利範圍第21項之感測器，其中該酵素為一 β-半 乳糖苦酶或一 β-葡萄苦酸酶。 23. 如申請專利範圍第22項之感測器，其包含聚吆咯或一聚 吆咯塗層作為一導電材料。 24. 如申請專利範圍第23項之感測器，其包含一直接地吸附 至該聚嗞咯之β-半乳糖苷酶。 25. —種用於偵測一樣本中的一微生物或一微生物類型的 數量之裝置，該裝置包含接觸於或可接觸於一電位計之 至少一根據申請專利範圍第17至22項中任一項之電化 感測器。 26. —種用於债測一樣本中的一相關酵素量之方法，包含： (a) 孵育一包含該樣本及可被該酵素作用於其上的 至少一基材之反應混合物； (b) 使一第二酵素接觸於該反應混合物，其中該第二 72 200817520 酵素能夠作用在一選自該至少一基材及一導因於該相 關酵素作用在該至少一基材上之產物的一或多者之物 質上且其中該第二酵素作用在該至少一基材或產物上 係導致一工作電極處的電位之一變化；及 (C)該接觸之後一或多次债測該工作電極處的電位 及從所偵測的一或多個電位來決定該樣本中的相關酵 素量。 27· —種用於偵測一樣本中的一相關酵素的數量之方法，包 含： /匕 (幻衅育一包含該樣本及可被該酵素作用於其上的 至少一基材之反應混合物； (b)使一電化感測器及一第二酵素接觸於反應混合 物，其中該感測器包含-已在其中固㈣第二酵素^ 該第二酵素與其固定之工作電極，其中該第二酵素能夠 作用在-選自該至少-基材及一導因於該相關酵素作 用在該至少一基材上之產物的一或多者之物質上；其中 該第二酵素作用在該至少一基材或產物上係導致該工 作電極處的電位之一變化；及 ⑷在該接觸t後-或多次偵測該工作電極處的電 位及從該-或多個所價測電位決定出該樣本中的相關 酵素數量。 28· —種用於偵測一樣本中的大腸菌之方法，包含·· ⑻以-包含-β-半乳糖或_卜葡萄㈣化物衍生 物的基材在一反應混合物中孵育該樣本； 73 200817520 (b) 使一酵素接觸於該反應混合物，其中該酵素能夠 作用在該基材上，且其中該酵素作用在該基材上係導致 一工作電極處的電位之一變化；及 (c) 在該接觸之後一或多次偵測該工作電極處的電 位及從該一或多個所债測電位來決定該樣本中的細菌 數。 29. —種用於偵測一樣本中的大腸菌之方法，包含： (a) 以一包含一 β-半乳糖或β-葡萄苦酸化物衍生物 的基材在一反應混合物中孵育該樣本； (b) 使一感測器及一酵素接觸於該反應混合物，其中 該感測器包含一已在其中固定該酵素或已供該酵素固 定之工作電極，其中該酵素能夠作用在該基材上，且其 中該酵素作用在該基材上係導致該工作電極處的電位 之一變化；及 (c) 在該接觸之後一或多次彳貞測該工作電極處的電 位及從該一或多個所偵測電位來決定該樣本中的細菌 數0 74