TW200813226A - Novel human T cell group - Google Patents

Description

200813226 (1) 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明是關於一種新穎之人類τ細胞群，特別是藉由 與骨髓基質細胞一起培養而獲得，且具有細胞毒性及免疫 抑制性之新穎之人類T細胞群。 【先前技術】 # T細胞係擔任對抗種種病原體之生理防禦系統之免疫 系統中重要角色之細胞群之一。τ細胞大致分爲CD4陽性 之輔助T細胞與CD8陽性之細胞毒性T細胞，前者能促 進免疫反應，後者係關於病毒感染細胞及腫瘤細胞之排除 。輔助性T細胞又進一步分成促進細胞性免疫之1型輔助 性細胞及促進體液性免疫之2型輔助性細胞。如此性質不 同之T細胞，巧妙地取得平衡之免疫反應下，能排除病原 體與抵抗感染。 ® 通常，在正常的免疫反應下，生物對本身所產生之自 體抗原有免疫寬容性，排除機制不會啓動。也就是說，自 體反應T細胞係被細胞死亡所誘發或誘發對自體抗原之無 反應性。特別是，調控T細胞與那般抑制機制有所關聯。 調控τ細胞，對於其他τ細胞有抑制作用因而被定義’近 年來，以具有抑制特定免疫反應之機能的細胞群被硏究， 發表了在細胞表面標記及產生細胞激素之種類、免疫抑制 機轉等不同之種種調控T細胞。 調控τ細胞中最被廣泛硏究的有，記載於Sakaguchi -5 - (2) 200813226 S · 「Naturally arising CD4+ regulatory T cells for immunologic self-tolerance and negative control of

immune responses·」Annual Review of Immunology，2004, 22 :53 1 -562.之 CD4陽性 CD25陽性調控性 T細胞（ CD4 + CD25 + Treg )。於今多量之硏究成果中，此細胞顯示 出CD4及CD25陽性，所以可推想CD4及CD25爲調控性 T細胞之標記。又，關於CD4陽性CD25陽性調控性T細 胞，Fontenot J D，Gavin M A, Rudensky A Y. 「Foxp3 programs the development and function of CD4 + CD25 + regulatory T cells.」Nat Im m un ο 1，2 0 0 3，4 (4 ) : 3 3 0 - 3 3 6 .中， 揭示轉錄因子 Forkhead box p3 ( FOXP3)，而 Takahashi T，Tag ami T， Y amazaki S， et al. 「Immunologic s e 1 f -tolerance maintained by CD25 + CD4+ regulatory T cells constitutive!y expressing cytotoxic lymphocyte associated antigen 4·」J Exp Med，2000，192(2):3 03 -3 09·揭示發現了導 致T細胞不反應之細胞毒性T細胞關連抗原-4 ( CTLA-4

Cosmi L，Liotta F，Lazzeri E，Francalanci M，Angeli R， Mazzinghi B， Santarlasci V， Manetti R， Vanini V， Romagnani P， Maggi E，Romagna ni S ? A η n u n z i a t o F . 「

Human CD8 + CD25+ thymocytes share phenotypic and functional features with CD4 + CD25+ regulatory thymocytes·」Blood，2003,102(12):4107-41 14·中，揭示了 含CD 8及CD25陽性標記之具免疫抑制性T細胞。 -6- (3) (3)200813226 另外，有細胞毒性之T細胞方面，以上述之0〇8陽 性細胞毒性Τ細胞係爲人所熟知，該細胞對於標的細胞能 發揮特異性高之細胞毒性。特開2005-24543 0號公報中， 揭示了藉由與腫瘤細胞或腫瘤細胞中特徵之蛋白質共同培 養，使其發揮對該腫瘤細胞之特異之細胞毒性。 又，在造血幹細胞移植已實用化之現在，爲取得足夠 之造血幹細胞，期望有ex vivo細胞培養技術。於造血幹 細胞的培養上，需要與模擬生理環境之骨髓基質細胞共同 培養，可長期培養，但有無具充分支持造血功能之人類骨 髓基質細胞及人類骨髓基質細胞會分泌細胞激素使一部份 之造血幹細胞分化等問題點被指出。使用人類以外之異種 骨髓基質細胞株之臍帶血而來之造血幹細胞之培養方法也 被硏究，如，Ming-jiang Xu，Kohichiro Tsuji，T akahir ο Ueda， Y oh-suke Mukouyama， Takahiko Hara， Feng-Chun Yang， Yasuhiro Ebihara, Sahoko Matsuoka， At sushi Manabe, Akira Kikuchi， M amoru It o 5 At sushi Miy aj ima, and T at suto shi Nakahata 「 Stimulation of Mouse and

Human Primitive Hematopoiesis by Murine Embryonic Aorta-Gonad-Mesonephros-Derived Stromal Cell Lines.」 Blood，1 998,92(6):2032〜2040.中，對於人類臍帶血而來之 CD34 陽性細胞，又於 Yoshihiko Nakamura, Kiyoshi Ando, Jamel Chargui，Hiroshi Kawada，Tadayuki Sato，Takashi Tsuji， Tomomitsu Hotta， and Shunichi Kato 「Ex Vivo

Generation of CD34+ Cells From CD34 " Hematopoietic 200813226 (4)

Cells」Blood 1 999 94(1 2): 4053-4059 中，嘗試對於來自 臍帶血之CD34陰性細胞，藉由與小鼠骨髓基質細胞株共 培養之增殖培養方法。然而，該增殖方法目的是將去除已 分化細胞群之造血幹細胞群，在不分化下使其增殖，又， 因爲免疫抑制及細胞毒性是分化之造血細胞所有，所以可 推測該方法所培養之細胞群無那般活性。 T細胞在免疫系統中扮演重要的角色，但因其不爲人 # 明瞭之處很多，尙未能用於醫藥品上。目前期待於硏究及 醫療用途上能得到新穎之人類T細胞群。 【發明內容】 有鑑於此，本發明之課題在於提供新穎之T細胞群及 取得其之方法。 本發明者們之硏究發現，將由血液採集之單核球細胞 ，在體外與骨髓基質細胞共培養，產生了持續對骨髓基質 ® 細胞有毒害之增殖人類T細胞群。另外，此人類T細胞群 並非只針對爲取得其之共培養用骨髓基質細胞，對於其他 之骨髓基質細胞或部分腫瘤細胞株也發揮了細胞毒性，且 對於活化之人類T細胞也發揮免疫抑制之作用，進一步， 此人類τ細胞群係CD3、CD25、CD28及T細胞抗原受器 a /3 ( TCR α /3 )等之細胞膜抗原幾乎在所有的細胞中皆 爲陽性，CD4陽性CD8陽性之群、CD4陽性CD8弱陽性 之群、CD4陰性CD8陽性之群之三群爲共存，確認其爲無 法直接採自生體之新穎人類Τ細胞群，完成了本發明。 8 - 200813226 (5) 也就是說，藉由本發明提供具有細胞毒性及免疫抑制 兩種活性之新穎之人類T細胞群及取得其之方法，解決前 述之課題。 藉由本發明可取得具有細胞毒性及免疫抑制兩種活性 之人類T細胞群。以此法取得之人類T細胞群係無法由生 物體直接取得之新穎細胞群，可用於硏究用途。又，含此 之醫藥組成物，對於各種癌症、自體免疫疾病及過敏疾病 之治療、緩和於移植時之排斥反應及移植體對宿主之反應 有用。 [實施發明之最好型態] 本發明之人類T細胞群，係將由人血液採集之單核球 細胞，與骨髓基質細胞共培養而得，具有以下特徵： (1) CD3、CD25、CD28 及 TCRa /3 爲陽性、 (2) 由 CD4 陽性 CD8 陽性（CD4 + CD8+)之群、CD4 陽性CD8弱陽性（CD4 + CD8dim )之群及CD4陰性CD8陽 性（CD4XD8+)之群三群所成、 (3 )相對於共同培養之骨髓基質細胞，可發揮細胞 毒性，以及 (4)對於活化之T細胞，發揮免疫抑制之活性。 又，其他方面，本發明之人類T細胞群，在IL-2存 在下，會產生介白素- l〇(IL-10)。 本發明之人類T細胞群係藉由將採自人類血液之單核 球細胞與骨髓基質細胞一起培養而獲得。人類之血液可使 -9- 200813226 (6) 用各種型態之者，如，可利用臍帶血、末稍 就由同一捐贈者可獲得必要量之觀點來看， 或末稍血較爲有利。臍帶血，因近年來臍帶 普及，於告知同意之下變的容易收集。另外 人類T細胞群之取得上，並不需要目前臍帶 ' 的之CD34陽性細胞群，所以亦可利用採取 細胞後，由殘留之臍帶血而來之單核球細胞 φ 明之人類T細胞群中，並不存在有CD34陽 視爲其在採集步驟中消失。另一方面，末稍 贈者上重複採取，再者，由患者採集之末稍 之人類T細胞群之取得方法，取得本發明之 ，可將其再用於同一患者之治療法，也就美 vivo療法之優點。本發明之人類T細胞群， 之血液樣本中取得，但是依捐贈者也有無法 從以前可取得之患者也有不能取得之情形。 # 由人血採取單核球細胞之方法方面，贺

Paque等一般之密度梯度離心法等。採集之 血液細胞用之培養基，如，D-MEM培養基、 基、PRMI1 640培養基等，以常法培養。依 足適宜濃度之牛胎兒血清之培養基。取得本 細胞群，將由血液採集之單核球細胞與骨髓 養之步驟是重要的，由單核球單獨培養及與 以外之細胞共培養是困難的。骨髓基質細胞 胞之培養系中被視爲是必須的細胞’經細胞 血或骨髓液， 以使用臍帶血 血移植技術之 ，於本發明之 血收集主要目 完CD34陽性 。又，於本發 性細胞群，可. 血可在同一捐 血用於本發明 人類細胞群後 :有適用於ex 雖說可由任何 取得之情形及 I 合用 Ficoll- 單核球細胞用 α -MEM培養 期望，可用補 發明之人類T 基質細胞共培 骨髓基質細胞 ，於造血幹細 附著及趨化素 -10- (7) 200813226 的媒介，有使造血幹細胞增殖之能力。骨髓基 ，由取得容易之點來看，使用市售之小鼠骨髓 ，如，ST2 細胞、OP9 細胞、MC3T3-G2/PA6

，依期望亦可使用由小鼠採集之正常骨髓基質 ，也可使用人類骨髓基質細胞等之小鼠以外之 而來之骨髓基質細胞。骨髓基質細胞，於使用 之培養基先播種於培養皿後，經1日至數日之 至皿底聚滿之狀態。於此將單核球細胞，以對 細胞細胞數之0.2〜10倍，而以1〜4倍數目 在5%C02雰圍、37°C培養，骨髓基質細胞之 減少。此現象，係因單核球細胞經與骨髓基質 接觸被刺激，進行分化之結果，出現具有細胞 細胞群，可推測骨髓基質細胞因此被破壞。骨 全部被破壞的話，單核球細胞之增殖會被抑制 髓基質細胞全部被破壞之前，將含單核球細胞 到附著有新鮮之骨髓基質細胞之培養皿是有必 完後，浮游之單核球細胞數開始增加後，間隔 ，依序將浮游細胞以吸管等回收，以到別的附 質細胞之新鮮培養皿。於原來之培養皿中添加 基繼續培養，進一步回收浮游細胞。此作業持 皿中之骨髓基質細胞全部死亡，可有效率回收 。如此，經由持續3〜8週，會出現分化至T 本發明之人類T細胞群之取得，於由血液 質細胞方面 基質細胞株 細胞等，又 細胞。另外 由哺乳動物 前，與適當 培養，培養 於骨髓基質 播種爲佳， 活細胞逐漸 細胞之細胞 毒殺活性之 髓基質細胞 ，因此在骨 之培養基移 要的。遷移 1曰到數曰 著有骨髓基 新鮮的培養 續到原培養 單核球細胞 細胞之細胞 採集之單核 -11 - 200813226 (8) 球細胞中，存在有依賴IL-2之活化T細胞，爲不使彼等 增殖，通常，單核球細胞在不添加細胞激素之條件下培養 ，特別是在無介白素-2 ( IL-2 )存在下培養3〜8週。另外 ，擔心培養基中含IL-2的情況，可藉由使用市售之抗IL-2抗體之ΕΙΑ套組等，測定培養基中之IL-2量，檢測出 IL-2時，於培養基中添加抗IL-2抗體，中和IL-2之活性 也是有利於實施的。 φ 如此取得之本發明之人類Τ細胞群，單獨培養常也只 能維持1週，藉由持續與骨髓基質細胞共培養，可維持1 個月。但是之後的增殖活性漸漸低落，終究會死亡，藉由 在IL-2或介白素-15(IL-15)等之細胞激素存在下培養， 約可持續2個月之增殖培養。又，本發明之人類T細胞群 ，經上述之細胞激素作用而增殖者，其特性（細胞毒性、 免疫抑制活性、細胞膜抗原）多少都會變異，於上述經細 胞激素之增殖培養開始起，通常1個月內，以2週內使用 ® 爲佳。特別是，由末稍血採集之人類T細胞群中，混有由 臍帶血採取所取得之人類T細胞群中沒有的CD4弱陽性 . CD8弱陽性TCRr (5陽性之T細胞，其會因IL-2存在下 之增殖培養而增加其存在之比例。 本發明之人類T細胞群，CD3、CD25、CD28及TCR α冷等之T細胞特徵之細胞膜抗原，因幾乎在全部細胞皆 爲陽性，可推測幾乎係完全之Τ細胞群。又，此人類Τ細 胞群，如不與骨髓基質細胞共培養則無法得到、無病毒感 染、細胞抹片機影像顯示爲正常之淋巴球型態、染色體之 -12- 200813226 Ο) 核型無異常等點，認爲是正常之τ細胞所成之細胞群。 本發明之人類Τ細胞群，本質上由CD4陽性CD 8陰 性之A群、CD4陽性CD8弱陽性之B群及CD4陰性CD8 陽性之C群所成，此等三群之合計佔全體之90%以上， 而以93%以上爲佳。該三群之比例，藉由使用抗CD4抗 體及抗CD8抗體倂用之流式細胞技術法測定，A群爲7.9 〜51.6%、B群爲1.1〜71.7%、C群爲11.8〜79.4%之範 圍內存在。又，培養期間愈長，有B群比例減少、C群比 例增加之傾向。各群之分別採集法，可依必要，藉由使用 抗CD4抗體及抗CD8抗體之一般細胞篩法選進行。 本發明之人類T細胞群，對爲取得其而用於共培養之 骨髓基質細胞發揮細胞毒性。細胞毒殺活性係用後述實施 例4之方法測定。作爲效果細胞（E )之本發明之人類T 細胞群與作爲標靶細胞（T )之骨髓基質細胞之比例（£/丁 )爲1 /1以上，幾乎所有用於取得之骨髓基質細胞會死亡 。又，使用小鼠骨髓基質細胞作爲骨髓基質細胞的情況， 對與用於取得本發明之人類T細胞群之小鼠骨髓基質細胞 株相異之骨髓基質細胞也能發揮細胞毒殺活性。另外，對 於小鼠及人類之腫瘤細胞株而言，也可能發揮細胞毒殺活 性。又，如後述實施例之記載，使用抗CD4抗體及抗CD 8 抗體之細胞篩選法分別採集之三群，對於爲取得而用之小 鼠骨髓基質細胞株S T 2細胞發揮細胞毒殺活性。細胞毒殺 性T細胞，通常爲CD8陽性，於本發明之人類τ細胞群 中CD4陰性CD8陽性之C群，可視爲對應群。另一方面 •13- 200813226 (10) ，本發明之人類T細胞群中之CD4陽性CD8陽性之A群 及CD4陽性CD8弱陽性之B群，並非對應之CD8陽性之 細胞毒殺性T細胞，是新穎之T細胞群之可能性很高。 本發明之人類T細胞群，對於活化之人類T細胞發揮 免疫抑制活性。免疫抑制活性，如，後述實施例8中，於 CD4陽性CD25陽性控制性T細胞中利用於測定免疫抑制 活性之同種混和淋巴球反應法測得。藉由此法，關於本發 明之人類T細胞群與含於其中之A群及C群，測定出高 免疫活性，所以本發明之人類T細胞群，係與CD4陽性 CD25陽性控制性T細胞具有同樣之免疫抑制活性。另外 ，於該末稍血所取得之人類T細胞群中所取得之0〇4弱 陽性CD8弱陽性（CD4dimCD8dim)之群（D群）與其他群 比較，有在細胞毒殺活性上較強、免疫抑制活性較弱之特 徵，另外，因顯示有TCR r 5陽性，所以可認爲是傳統之 細胞毒殺性T細胞。關於此D群，藉由使用抗TCR r 5抗 體之磁氣分離法，可分離、除去。 接著，如後述實施例9，本發明之人類T細胞群，雖 表現出CD4陽性CD25陽性控制性T細胞中之特徵性轉錄 因子FOXP3，其表現量偏少。又，本發明之人類T細胞群 ，藉由抗CD3/CD28抗體處理使細胞不增殖，FOXP3之表 現量也幾乎不增加。又，文獻上，爲取得CD4陽性CD2 5 陽性控制性T細胞，以抗CD 3/CD28抗體處理是必須的。 於取得本發明之人類T細胞群步驟中，因無抗CD3/CD28 抗體處理步驟，可推測傳統之CD4陽性CD25陽性控制性 -14· (11) 200813226 T細胞在本發明之T細胞群取得步驟中未增殖或死亡 不含於本發明之人類Τ細胞群。 在細胞篩選法中分別採集之三群’在任一群 FOXP3之表現，不僅在可肯g含該CD4陽性CD25陽性 性T細胞之CD4陽性CD8弱陽性之B群，在CD4 CD8陽性之A群及CD4陰性CD8陽性之C群中也有 之表現。因此，可認爲本發明之人類T細胞群中’有 統之CD4陽性CD25陽性控制性T細胞不同之控制性 胞。 另外，本發明之人類T細胞群，係如同後實施例 產生IL-10。通常，IL-10爲2型輔助性T細胞及控制 細胞所產生，以抑制1型輔助T細胞及巨噬細胞之活 人熟知。然而，本發明之人類T細胞群中免疫活性之 ，可推測爲經由IL-10而發揮。 由以上可知，本發明之人類T細胞群，係具有細 殺性及免疫抑制活性兩者之人類T細胞群。CD4陽性 陽性之T細胞，以往被認知爲年幼之人類T細胞群， 不知其具有以上之活性。至少，CD4陽性CD8陽性, 群可說爲新穎之人類T細胞群。本發明之人類T細胞 可用於解析免疫機構爲目的之硏究用材料。又，本發 人類T細胞群，因具有免疫抑制活性，可用於因誘導 寬容而可治療之疾病，如，類風濕性關節炎、I型糖 、庫隆氏病等之自體免疫疾病；食物過敏、花粉症、 性皮膚炎等之過敏性疾病；及移植時之排斥反應及移 ，而 皆有 控制 陽性 微弱 溫傳 T細 ，會 性T 性爲 部分 胞毒 CD8 完全 ^ A 群， 明之 免疫 尿病 異位 植體 -15- (12) (12)200813226 對宿主之反應等之醫藥組成物，另外，因其細胞毒殺活性 ，可作爲各種癌症之治療、各種病毒疾病之治療之醫藥組 成物。該組成物中本發明之人類T細胞群之含有量及該組 成物之投用量，考量適用疾患之種類、症狀、投與途徑、 劑型而決定。另外，可與由細胞激素、趨化素、賀爾蒙等 之生理活性物質、抗體、免疫抑制劑、抗癌劑、抗過敏劑 等選出之該疾病治療藥及使本發明之人類T細胞群作用效 果提高之物質合倂使用。 於製造含本發明之人類T細胞群之醫藥組成物時，可 依治療目的及投與途徑等選擇適當的劑型。但是，因希望 於醫藥組成物中之人類T細胞群是活著狀態下投與，通常 ，人類T細胞群與適當之添加劑，懸浮於液體、包埋於膠 體、直接使用，或進一步依期望，封入微膠囊及微脂粒， 藉注射等非經口地投與。再者，可使其浮游於含二甲基亞 碼及甘油之培養基與生理食鹽水中，凍結保存，使用前再 熔解使用。 以下，藉由實施例詳細說明本發明。 【實施方式】 實施例1 由臍帶血取得人類T細胞群 由分娩時切除被告知後同意之孕婦7位（U1〜U7) 之臍帶，採集血液，將其各自以PRMI 1 640培養基稀釋約 爲2倍容積，依常法置於Ficoll-Paque上，離心分離，採 -16- (13) 200813226 取含單核球之層，以生理食鹽水洗淨，採得單核球細胞。 用「CD34 isolation kit」（Miltenyi Biotec 所販售），除去 CD34陽性單核球細胞，採集CD34陰性單核球細胞。將採 取之CD34陰性單核球細胞浮游於補足10% (V/V)牛胎 兒血清之RPMI1 640培養基，事先培養小鼠骨髓基質細胞 株 ST2 細胞（RCB0224，RIKEN BioResource Center )使 其附著於市售6孔微培養皿皿底（每孔之小鼠骨髓基質細 # 胞數爲1〜2xl06個），播種3xl06個。於培養1〜2週後 ，與培養基一起回收浮游細胞，移到附著有新鮮之骨髓基 質細胞之6孔微培養皿，繼續培養。重複適當之回數後， 合計培養3週以上，使表現均一之淋巴球型態之增殖性母 細胞出現，更以與上述同方法，培養1〜2週後，爲純化 母細胞化之細胞，依照常法，採取Ficoll-Paque之Ficoll 層與培養液層之界線附近聚集之細胞，得到人類T細胞群 U1 〜U7。 • 實施例2 細胞膜抗原之分析 以使用人類淋巴球相關抗細胞膜抗原之抗體之流式細 胞技術法，分析實施例1取得之人類T細胞群。以下表1 之抗原的抗體，也就是，小鼠抗CD3抗體（Nichirei biosciences 股份有限公司販賣）、小鼠抗 CD4抗體（ Nichirei biosciences 股份有限公司販賣）、小鼠抗 CD8 α抗體（Beckmancoulter公司製）、小鼠抗CD25抗體（ -17- 200813226 (14)

B eckmancoulter 公司製）、小鼠抗 CD45RA 抗體 （ B eckmancoulter 公司製）、小鼠抗 CD45RO 抗體 （ Nichirei biosciences股份有限公司販賣）、小鼠抗CD28 抗體（Nichirei biosciences 股份有限公司販賣）、小鼠 抗CD56抗體（Beckmancoulter公司製）、小鼠抗HLA-DR抗體（Nichirei biosciences股份有限公司販賣）、小 鼠抗 T C R α 冷抗體（日本 B e c t ο η，D i c k i n s 〇 n a n d C o m p a n y 製造）、小鼠抗糖皮質素誘發性腫瘤壞死因子受器（GITR )抗體（R & D system公司製）、小鼠抗CD152抗體（ Beckmancoulter公司製）、小鼠抗 CD16抗體（日本 Becton. Dickinson and Company MM )、小鼠抗 C D 5 7 抗 體（日本 Becton，Dickinson and Company 製造），或作爲 陰性對照之 MOPC-21小鼠骨髓瘤 IgG抗體（ICN Corporation)處理被試驗細胞（U1〜U7) 30分鐘，遵循 常法，以結合螢光素異硫氰酸鹽（FITC )或藻紅蛋白（PE )之二次抗體（山羊抗小鼠4〇)處理30分鐘。被試驗 細胞以流式細胞儀分析（商品名『EPICS XL』， Beckmancoulter公司製）。結果如表1所示。又，表中之 「MFI」表示螢光強度之平均値，「％」表示陽性率（被 試驗細胞中，以陰性對照爲基準，閥値以上螢光強度之細 胞數之比例），「-」表示未試驗。 -18- (15) 200813226 表1 細胞膜抗原 U1 U 2 L 13 L 14 L 15 l 16 l 17 % MFI % MFI % MFI % MFI % MFI % MFI % MFI CD3 100 46 100 43 100 39 100 41 100 42 100 16 100 20 CD4 67 3.2 66 4.5 80 9 88 16 80 16 65 5.7 91 21 CDia 99 69 99 95 64 8.1 84 7.1 92 32 94 29 72 6 CD25 99 9.5 93 13 94 19 97 6.7 99 94 98 21 93 23 CD45RA 69 1.4 14 0.5 61 2 CD45RO 81 1.5 42 1.3 61 1.5 CD28 99 8.4 75 6.1 94 6.2 99 7.4 96 13 89 5.1 95 6.3 CD56 1.1 0.2 2.5 0.3 3.5 0.3 HLA-DR 92 7.5 85 9.8 84 7.2 59 1.7 94 36 63 2.3 80 9.1 TCRafl 100 13 99 16 99 12 GITR 76 1.8 72 5.3 47 1.4 80 4.3 CD152 (CTLA-4) 一 一 1.2 0.3 0.4 0.3 0.8 0.2 1J 0.5 3.2 0.4 2.8 0.4 CD16 1.2 0.2 0.7 0.3 1.2 0.3 CD57 1.8 0.2 0.7 0.3 0.8 0.3

由表1之結果可知’取得之細胞群，因CD3及TCR α冷約有9 7〜1 0 0 %之陽性率，所以本質上爲T細胞所成 之細胞群，CD25 約 93 〜99%，CD28 約 75 〜99%，HLA-DR約59〜94%之陽性率，推定幾乎全部之Τ細胞被活化 。又，自然殺手Τ細胞中，特徵的細胞膜抗原CD16約 0.7 〜1.2%、CD56 爲 1.1 〜3.5%、CD57 約 0.7 〜1.8% 之 陽性率，因實質上爲陰性，故推測本發明之人類Τ細胞群 中，無以往之自然殺手Τ細胞存在。又，GITR約有47〜 80%之陽性率，具有控制性Τ細胞之特徵。另外’ CD 152 (CTLA-4 )雖然實質上係陰性之結果，但於細胞內，確 認到其表現（表中未表示）。 實施例3 使用抗CD4抗體及抗CD 8抗體之雙重染色分析 遵循常法，將使用藻紅蛋白標記之小鼠抗CD4抗體及 -19- 200813226 (16) 螢光素異硫氰酸鹽標記之小鼠抗CD8抗體（日本Becton， Dickinson and Company製造）於實施例1取得之7種本 發明之人類T細胞群（111〜117)進行雙重染色，藉由與 實施例2相同之方法，進行流式細胞技術分析。又，ui、 U2 ' U3及U5在第1次測定後之1〜2週後再度測定。其 ^ %表2所示。又，上段爲第1次之測定値、下段爲第 2次之測定値。另外，代表例方面，人類Τ細胞群U 3 (第 1 β $流式細胞技術分析之圖如圖1所示。 表2 人類T 細胞群 --- A群（CD4 陽性CD8陽 性） (%) B群（CD4 陽性CD8弱 陽性） (%) C群（CD4 陰性CD8陽 性） (%) 合計 (%) U 1 27J 13.4 59.2 99.7 30.6 32.2 36.0 98.8 U2 45.0 15.8 36.8 97.6 43.7 24.0 31.0 98.7 U3 25.5 49.2 23.8 98.5 51.6 1.1 43.6 96.3 、U4 7.9 68.0 23.3 99.2 U5 21.3 45.4 32.4 99.1 23.7 31.8 42.3 97.8 ._U6 26.5 36.5 347 97J L^U7 14.5 71.7 11.8 98.0 由表2之結果，於試驗之人類τ細胞群中，CD4陽性 CD8陽性之群（Α群）爲7.9〜51.6% ' CD4陽性CD 8弱 陽性（B群）爲1.1〜71.7%、CD4陰性CD8陽性（C群 )爲8〜59.2%，此等之合計爲96%以上。又，發現 -20- 200813226 (17) CD4陰性CD8陰性之細胞幾乎不存在。另外，就算同樣之 人類T細胞群，在1〜2週之培養，3群之比例多少也會 有變化。 實施例4 對小鼠骨髓基質細胞之細胞毒殺性

遵循常法’將由胎齡1 3〜1 6日之C D -1小鼠之胎兒組 織採取之正常小鼠胎兒骨髓基質細胞作爲標的細胞，或市 售之小鼠骨髓基質細胞株 ST2 ( RCB0224，RIKEN BioResource Center ) 、 OP9(RCB 1124 ， RIKEN

BioResource Center)、MC 3 T3 -G2/P A6 (RCB 1 1 2 7，RIKEN BioResource Center)中任一者以4xl04個分別播種於48孔 微量盤，培養一夜後，於此中添加實施例1取得之作爲效 果細胞之人類T細胞群U3，各自爲4xl04個（E/T比= 1/1 ) 、8xl04 個（E/T 比=2/1 ) 、1 ·6χ105 個（E/T 比= 4/1 )播種，於含100U/ml之IL-2、補足10% (ν/ν)牛胎兒 血清之RPMI 1 640培養基共同培養24小時，此作爲被試 驗孔。將各被試驗孔之培養上清液除去，用上述之培養基 清洗2次，除去該孔中之人類T細胞群與剝離之骨髓基質 死細胞。於各孔中添加該培養基 0.4ml，再添力口 ^ AlamarBlue」（和光純藥工業股份有限公司販賣）30/z卜 培養18小時。將培養上清液0.2ml移至96孔之平底微量 盤，以螢光分析儀測定代謝活性（激發波長544nm，檢定 波長5 90nm)。又，對照孔方面，除僅培養標的細胞之各 -21 - (18) (18)200813226 骨髓基質細胞外’準備同樣處理之孔。將細胞毒殺性以下 述公式算出。結果如表3所示。 公式1 細胞毒殺活性（％ ) = { 1 -(被試驗孔之測定値）/ (對 照孔之測定値）}xl00 表3 標的細胞 細胞毒殺活性（％) E/m = 1/1 E/T比 = 2/1 E/T比 = 4/1 ST2細胞 97 100 99 正常小鼠胎兒骨髓基質細胞 8 21 78 OP痛胞 8 18 68 MC3T3-G2/PA6 細胞 14 10 63 由表3之結果可知，本發明之人類T細胞群，相對於 ST2細胞，於E/T比爲1/1時發揮細胞毒殺活性，對於其 他之小鼠骨髓基質細胞也於E/T比爲4/1時發揮細胞毒殺 活性。由此結果，本發明之人類T細胞群對於爲取得其而 用於共培養之小鼠骨髓基質細胞發揮強的細胞毒殺活性， 但因其對於其他之小鼠骨髓基質細胞也發揮細胞毒殺活性 ，所以其係具有細胞特異性低之胞毒殺活性。 實施例5 對於其他細胞之胞毒殺活性 爲調查本發明之人類T細胞群，對於小鼠骨髓基質細 -22- (19) 200813226

胞以外之細胞，能否發揮細胞毒殺活性’進行以下實驗。 也就是說，將標的細胞之小鼠膀胱癌細胞 MBT_2 ( RCB0544，RIKEN BioResource Center )、小鼠黑色素瘤 細胞 B16 細胞（RCB1283，RIKEN BioResource Center) 、正常人類皮膚纖維芽細胞NHDF細胞（倉敷紡績股份有 限公司販賣）、人類子宮頸癌惡性瘤 HeLa細胞（ RCB0007，RIKEN BioResource Center)、人類表皮惡性 瘤 A431 細胞（RCB02 02，RIKEN BioResource Center)、 人類皮膚惡性黑色素瘤G361細胞（ATCC CRL-1 424 )、 人類大腸癌之 WiDr 細胞（JRCB0224，Human Science Research Resources Bank)之任一者，使浮游於補足10% (v/v)牛胎兒血清之RPMI1 640培養基，將此於96孔平底 微培養皿中，於每1孔播種4χ 1 〇4個。於此用與實施例4 同樣之方法，於各自之標的細胞中將實施例1取得之人類 Τ細胞群U3以Ε/Τ比爲1/1〜4/1播種，與實施例4同樣 方法，測定細胞毒殺活性。結果如表4所示。 -23- (20)200813226 表4 標的細胞 細胞毒殺活性（％) E/T比 =1/1 E/T比 = 2/1 E/T比 = 4/1 MBT-2 (小鼠癌細胞） 6 10 40 B16 (小鼠癌細胞） 7 8 11 NHDF (人類正常細胞） 2 2 3 HeLa (人類癌細胞） 4 6 8 A431 (人類癌細胞） 0 2 22 G361 (人類癌細胞） 14 17 33 WiDr (人類癌細胞） 0 0 92 由表4之結果可知，本發明之人類T細胞群，對 何標的細胞，Ε/Τ比=2/1時，只能發揮17%以下之 毒殺活性，而對於小鼠癌細胞MB Τ-2細胞及人類癌 WiDr細胞、G361細胞及A431細胞，E/T比=4/1時 揮22〜92 %之細胞毒殺活性。另外，對於小鼠癌細胞 細胞及人類癌細胞HeLa細胞及人類正常細胞NHDF， 比=4/ 1時，僅發揮1 1 %以下之細胞毒殺活性。由實 4與5之結果，可知本發明之人類T細胞群，具有低 胞特異性之細胞毒殺活性。 實施例6 以CD4及CD8爲指標之分群 爲討論以往所知之CD4陽性CD25陽性控制性T 及CD8陽性細胞毒殺性T細胞與本發明之人類1細 之相異點，藉由以CD4及CD8爲指標之細胞分別法 於任 細胞 細胞 可發 B 1 6 E/T 施例 的細 細胞 胞群 ，進 -24- 200813226 (21) 行族群分離。也就是說，將實施例1取得之人類T細胞群 U3於IL-2存在下與ST2細胞共同培養2週，使其增殖後 ，依常法以FicoU-Paque純化，使細胞於含2mM乙撐二 胺四醋酸及0.5%(w/v)牛胎兒血清白蛋白之磷酸緩衝液（ ρΗ7·4)中，使以細胞濃度6.7x1 07個/ml浮游。遵常法， 添加等量但相對於該細胞懸浮液中細胞爲過量之藻紅蛋白 標記抗CD4抗體與螢光素異硫氰酸鹽標記抗CD8抗體， 再於冰上靜置30分鐘。於此中，更添加20倍量之該磷酸 緩衝液，藉離心分離多餘之抗體，再度添加該磷酸緩衝液 ，調製成細胞懸浮濃度爲2.0x1 07個/ml之細胞懸浮液。 此中’依常法，將 7.4 X 107個細胞以細胞分選儀『 F A C S A r i a』（日本 B e e t ο η，D i c k i n s ο n a n d C o m p a n y 製造 )來分選細胞時，分別採選出，CD4陽性CD8陽性之A 群爲0·7χ107個（純度97.9%) 、CD4陽性CD8弱陽性之 Β群爲1 ·1χ1〇7個（純度99.4% ) 、CD4陰性CD8陽性之 C群爲1 .9x1 07個（純度99.6% )。又CD4陰性CD8陰性 之細胞比例極少，無法分別採取。 實施例7 於各群之細胞毒殺活性 於實施例1所得之人類Τ細胞群U3作爲效果細胞， 或將於實施例6分別採取之3群，使用ST2細胞爲標的細 胞以外’與實施例4相同方法進行實驗，求得細胞毒殺活 性（％ )。結果如表5所示。 -25- (22) (22)200813226 表5 細且 S毒殺活性（％) ΕΛ 比=0.5, E/T 比=1/1 E/Γ 比=2/1 人類T細胞 群U3 35.4 土 7.9 64.5 ± 9.2 84.7 ± 5.9 A群（CD4 陽性CD8陽 性） 55.0 ± 8.0 81.1 ±1.0 84.2 ± 1.0 B群（CD4 陽性CD8弱 陽性） 29.3 ±7.3 43.2 ± 11.7 69.2 土 3.0 C群（CD4 陰性CD8陽 性） 63.6 ±1.6 81.8 土 1.0 82.1 ±1.3 由表5之結果可知，任一群皆對ST2細胞發揮細胞毒 殺活性。特別是A與C群之細胞毒殺活性高，B群則稍微 偏低。一般，細胞毒殺活性爲CD4陰性CD8陽性T細胞 的特徵之一，但此結果，於本發明之人類T細胞群中之細 胞毒殺活性，顯示並非全來自以CD 8陽性細胞毒殺性T 細胞爲首之CD4陰性CD8陽性之T細胞。 實施例8 免疫抑制活性的測定 藉由常法之同種混和淋巴球反應法，測定由實施例1 取得之人類τ細胞群U 3、或實施例6中分別採集之3群 的免疫抑制活性。 CD4陽性CD25陰性T細胞之反應細胞以下述之方法 採集。由常法之Ficoll-Paque法採取人末梢血而來之單核 -26- (23) 200813226 球細胞，於此，用與抗CD25單株抗體結合之Magnetic Micro beads (Miltenyi Biotec 公司販賣）除去 CD25 陽性 細胞，採得CD 25陰性細胞，進一步以結合抗CD4單株抗 體結合之 Magnetic Micro beads (Miltenyi Biotec 公司販 賣）由該CD25陰性細胞，採得CD4陽性細胞。

以下述方法採取刺激細胞之樹狀細胞。由臍帶血，以 結合抗 CD14 單株抗體之 Magnetic Micro beads ( Miltenyi Biotec公司販賣）採集CD14陽性細胞，在顆粒球巨噬細 胞聚落刺激因子（GM-CSF)及介白素- 4(IL-4)之存在下 ’培養1〜2週後，採取樹狀細胞，將其於脂多糖下培養2 曰，於使用同種混和淋巴球反應法之前，依常法以 Mitomycin C 處理。 將該反應細胞以IxlO5個及刺激細胞以5xl03個，分 別播種於微培養皿之孔中，於此將實施例1取得之人類T 細胞群或實施例6中分別採集之3群各自以1 X 1 〇5個播種 ，培養7日。培養結束之1 6小時前，於培養基中添加適 量3H-Thymidine，作爲被試驗孔。依常法測定 Thymidine之攝取量，依下述式2，求得免疫抑制活性。 又’準備對照孔，其除了不添加人類T細胞群，其餘做相 同處理。結果如表6所示。 式2 免疫抑制活性（％ ) = (1_(被試驗孔之3Η-Τ1ιγιηί(Ηι^之攝 取里（cpm)/(封照孔之3H_Thymidine之攝取量（cpm))xl00 -27- (24)200813226 表6 免疫抑制活性（¼) 人類T細胞群U3 99.6 A群（CD4陽性CD8陽性） 99.6 B群（CD4陽性CD8弱陽性） 99.5 C群（CD4陰性CD8陽性） 99.6 如表6之結果可明白，本發明之人類T細胞群及 全部具有免疫抑制活性。此結果，不僅已知之CD4 CD25陽性控制性Τ細胞與細胞膜抗原相同之Β群， 胞膜抗原不同之Α及C群也具有免疫抑制活性。本發 人類T細胞中之免疫抑制活性，顯示其全部並非皆爲 陽性CD25陽性控制性T細胞爲首之CD4陽性CD8 性之T細胞而來。 實施例9 FOXP3之表現解析 ’ 轉錄因子FOXP3以CD4陽性CD25陽性控制性 * 胞中特徵性之轉錄因子爲人熟知。以下實驗係比較本 之人類T細胞群與CD4陽性CD25陽性控制性T細 FOXP3之表現狀況。 CD4陽性CD25陽性控制性T細胞之準備 以 Godfrey等方法（『Blood』、105卷、750 3群 陽性 連紐 明之 CD4 弱陽 T細 發明 胞中 758 -28- (25) (25)200813226 頁’ 2005年），準備CD4陽性CD25陽性控制性T細胞 。也就是’將實施例1採集之由臍帶血來之C D 3 4陰性單 核球細胞’使浮游於1 0 % ( ν/ν )補足牛胎兒血清之 RPMI 1 640培養基，將其先放入預先附著有抗CD3/CD28 抗體之微培養皿（每孔以100/ζ1之5//g/ml抗CD3抗體 及抗CD28抗體處理孔），培養3日。進一步，添加 50U/ml之IL-2培養！〜2週，依常法，使用抗CD4抗體 及抗CD25抗體’用雙重染色以流式細胞儀分析，顯示約 95%之細胞爲CD4陽性CD25陽性。將此作爲CD4陽性 CD25陽性控制性T細胞式樣，供給至以下實驗。 RT-PCR法分析FOXP3之表現 比較上述調製成之CD4陽性CD25陽性控制性T細胞 式樣與實施例1取得之人類T細胞群中之FOXP3的表現 量。也就是，由此等細胞，各自使用『Rneasy Kit』 (QIAGEN製造）調製全RNA，再以其爲模版，經反轉錄酶 合成第1模版cDNA。將所得之cDNAlng爲模版，使用序 列表中具有序列編號1及2之寡核苷酸序列之寡核苷酸序 列引子以常法之PCR法進行特異性增幅。得到之PCR產 物以常法，經膠體電泳分離，以E t h i d i U m b r 〇 m i d e染色處 理，調查FOXP3之特性性增幅片段（409bp、3 04bp )之 色帶。結果如圖2所示。又FOXP3具有剪接不同之2種 蛋白質（Genbank NM-0 1 4009 及 DQ0 1 0327 )，本例中， 出現40 9bp及3 04bp之增幅斷片2個片段。又，關於CD4 -29- 200813226 (26) 陽性CD25陽性控制性T細胞，培養於附著抗CD3抗體及 抗CD28抗體之微培養皿中亦顯示如此。 如圖2所示之各行片段濃淡，可比較FOXP3mRNA之 表現量。『1』之行爲CD4陽性CD25陽性控制性T細胞 中，F OXP 3 mRN A之表現量，如上述Godfrey等之文獻記 載，以抗CD3/28抗體處理可進一步增加表現量（『2』之 行）。另外，本發明之人類T細胞群（『3』之行），中 F0XP3mRNA之表現量比CD4陽性CD25陽性控制性T細 胞少，而雖無表示出數據，本發明之人類T細胞群以抗 CD3/28抗體處理，F0XP3之表現量幾乎無增加。此結果 顯示，本發明之人類T細胞群係與CD4陽性CD25陽性控 制性T細胞同樣有F0XP3之表現，但表現量較少。 由西方轉印法分析F0XP3之表現 由實施例1取得之人類T細胞群U3、或實施例6分 別取得之3群中，分別取用同數目之細胞，於此分別以含 有 4.6 % (w/v)硫酸十二酯鈉（SDS)、 125mM tri- HCl(pH6.8)、20%(w/v)甘油、1_4M々-氫硫基乙醇之水溶 液處理，作爲細胞抽出物，將此供給至常法之10% SDS聚 丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE )。依常法，將電泳後之 膠體，轉印至硝化纖維素膜，再將所得之硝化纖維素膜以 羊之抗人類F0XP3抗體（Abeam pic.)處理，再以2次抗 體之過氧化酶標示抗羊抗體（DAC OR公司製造）處理。 將所得之經抗體處理之硝化纖維素膜以化學發光檢出試藥 -30- (27) (27)200813226 組（商品名『SuperSignal West Pico』PIERCE公司製造） ，藉由化學冷光之化學發光，將FOXP3之片段染色。結 果如圖3所示。 圖3中，『4』之行係人類T細胞群U3、『5』之行 係該A群、『6』之行係該B群、『7』之行係該C群之 西方轉印法結果。此結果可明白知FOXP3，不僅在與CD4 陽性CD25陽性控制性T細胞有相同細胞膜抗原之B群， 在細胞膜抗原相異之A與C群亦有表現。此結果支持實施 例8之結果，本發明之人類T細胞群之免疫抑制活性與 CD4陰性CD25陽性控制性T細胞同樣地，係與FOXP3之 表現高度相關，顯示出在A與C群中亦有CD4陽性CD 2 5 陽性控制性T細胞般之細胞。 實施例1 〇 因細胞激素或絲裂原之增生性 本發明之人類T細胞群在單獨培養時無增殖性。於此 ，經抗CD3/CD28抗體處理，爲調查於各種細胞激素或絲 裂原處理之增殖性，做以下之實驗。將實施例1取得之人 類T細胞群U3、或實施例9所調製之CD4陽性CD25陽 性控制性T細胞樣品，各自以每孔4x 1 04個播種於96孔 微量培養皿之孔中，於此，各自添加抗CD3/CD28抗體、 IL - 2、IL 1 5、IL - 4、IL - 7、植物血凝素（Ρ Η A )、美洲商 陸（PWM )、刀豆素A ( ConA )後，培養5日。對照孔方 面，準備有將人類T細胞群單獨培養之孔。依常法，測定 -31 - 200813226 (28) 各孔之3H-Thymidine之攝取量。細胞增殖評估方法，係 以對照中3H-Thymidine之攝取量（cpm)表示。結果如表7 所示。

表7 處理 細胞增殖活性(cpm) —^ 人類T細胞群 (U3) CD4陽性CD 25陽性控制 性T細胞 無處理 830 760 ^ 抗CD3/CD28抗體 810 670 抗CD3/CD28 抗體+IL-2 10U/ml 6,700 810 ^ IL一 2 10U/ml 1,300 780 IL一 2 100U/ml 2,900 860 IL一 15 10ng/ml 2,600 810 IL-15 100ng/ml 6,200 620 IL-4 10ng/ml 520 560 IL-7 lOng/ml 410 440 植物血凝素（PHA〉Swg/ml 440 390 美洲商陸（PWM) 5Mg/ml 520 370 刀丑素A (ConA) 5/i gy/ml 370 490 由表7結果可知，本發明之人類T細胞群，以抗 CD3/CD28抗體處理並無增殖。因此，可推測與已知之控 制性T細胞同樣地對抗原刺激不反應（免疫不反應）狀態 。然而’本發明之人類T細胞群與已知之控制性τ細胞相 異，於IL-2或IL-15處理下增殖，於抗CD3/CD28抗體及 IL-2之處理下有明顯增殖性。此結果，顯示本發明之人類 T細胞群’係具有與已知之控制性τ細胞不同性質之細胞 群。進一步，本發明之人類T細胞群，不因T細胞增殖因 子’ IL-4、IL-7等之細胞激素、絲裂原等而增殖，具有與 -32- (29) (29)

200813226 一般T細胞相異之特性。 實施例11 IL-10之產生 將實施例1所取得之本發明之人類τ細胞群U3 爲細胞濃度2χ105個/m卜添加100U/ml之IL-2，各 種lml於24孔微量培養皿或抗CD 3/CD28抗體結合, ?L微量培養皿之孔中，培養1 6小時。又，將本發明 類 T細胞群 U3調至爲細胞濃度 3 X 1〇5個/ml， 100U/ml之IL-2，再將此各自2ml送入已培養成滿佈 之ST2細胞之6孔微量培養皿，培養40小時。將此 由離心分離，採取上清液，以使用抗IL-10抗體之分 組（eBioscience· Inc.)測定IL_ 1 0之濃度。結果如表 不 ° 表8 培養條件 IL-10產生量 (ng/ml) IL-2存在下、單獨培養16小時 0.017 IL-2存在下、抗CD3/CD28抗體結合孔中單獨培養16 小時 4.3 IL-2存在下、與ST2共培養40小時 4.6 由表8結果可知，本發明之人類T細胞群，在 存在下產生IL-10，另外藉由與骨髓基質細胞共培養 1 〇之產量明顯增加。又，就算於單獨培養系中，IL- 調至 自播 之24 之人 添加 狀態 等藉 析套 8所 IL-2 ，IL- 2存 -33- (30) 200813226 在下，藉由抗 CD3/CD28抗體刺激，IL-10之產量明顯增 加。IL-1 0主要爲擔任免疫抑制之細胞激素，於T細胞中 第2型輔助T細胞所產生，可抑制1型輔助T細胞產生 IFN_ r等細胞激素、或抑制巨噬細胞產生IL-1等炎性細 胞激素。而本發明之人類T細胞群，可發揮藉由IL-10之 產生所媒介之免疫抑制活性。 # 實施例1 2 由末梢血取得人類T細胞群 將由18名健康人取得之末梢血各自以無FCS 2RPMI 培養基2倍稀釋，以常法之Ficoll-Paque法採集單核球細 胞。將此於該培養基中調製成細胞濃度lxl 〇6個/ml，如同 實施例1，以每孔3ml播種於小鼠骨髓基質細胞ST2滿佈 培養之6孔微培養皿中，同實施例1般共培養4〜5週。 將出現母細胞化之細胞以F i c ο 11 - P a q u e法純化，成功的由 ® 4名健康者之末梢血取得人類T細胞群P1〜P5。又，P2 及P3爲來自同一人之血液的人類T細胞群。 實施例1 3 細胞膜抗原之分析 以實施例2相同方法，分析實施例12中取得之人類 T細胞群P1〜P 5之細胞膜抗原。又，所使用之小鼠抗 TCR r 5抗體係爲 T cell Science公司製造。結果如表 9 所示。括號內數値表示I L - 2存在下與S T 2細胞共培養9〜 -34- (31) 200813226 14日增殖培養後測定之數値（P3未在IL-2存在下培養） ，『_』表示未進行測定。 細胞膜抗原 PI (IL-2) P2 (丨L-2) P3 P4 (IL-2) P5(IL-2) CD3 99.6(99. 5) 99.8(99.5) 99.9 98.6(99.9) 99. 9(99.8) CD4 91.1(28.7) 一㈠ 48.3 一㈠ 一㈠ CD8a 96.1 (97.8) 一㈠ 95.5 -(-) -㈠ CD25 98.0(71.1) 92.7(82.6) 91.2 77.7(47.9) 92.7(51.9) CD45RA 46.0(86. 1) 2.0(13.5) 33.9 12.1(55.4) 8,4(21.7) CD45R0 64.0(36. 9) 30.2(14.5) 11.8 1.0(0.53) 1.6(3.3) CD2A 99.8(99. 5) 98. 1 (88.7) 94.9 94.5(76.5) 98.4(91.9) CD56 1.6(6.4) 1.1(3.1) — 一㈠ 一㈠ HLA-DR 96.3(99.4) 61.1(55.8) 59.6 78.1 (62.7) 88.3(96.8) ΚΚαβ 98.3(86. 1) 99.2(97. 2) 99.5 90. 5(93. 6) 99.2(99.1) TCRY6 6.9(23.0) 0.8(0.7) 0.6 1.32(2.68) 0.80.6) GITR 76.5(54.2) 64.0(69.4) 55.4 一㈠ 一㈠ CD152 (CTLA-4) 1.3(1.2) -(-) 0.9 一㈠ 一㈠ CDt6 3.1(1.0) 5.4(2.4) 一 -(-) -㈠ CD57 1.3(2.0) 6.2(6.6) — 一㈠ 一㈠

由表9結果知，本發明之人類T細胞群P1〜P5，因 CD3及TCRa冷之陽性率在90%以上，本質上爲T細胞 所組成之細胞群，因其 CD25、CD28、HLA-DR之陽性率 相對較高，認爲所含之T細胞幾乎全部活化。又，自然殺 手T細胞之特徵細胞膜抗原CD16、CD56及CD57方面幾 乎爲陰性，所以認爲此細胞群中，不含有傳統之自然殺手 T細胞。又，具有GITR陽性率約50%以上之控制性T細 胞之特徵。另外，表中雖未表示，發現於細胞中有CD 152 (CTLA-4 )之表現。由以上結果與實施例2之表2的結 果’可推論由末梢血取得之人類T細胞群與臍帶血取得之 人類T細胞群，在細胞膜抗原方面有相同之特徵。 另外，末梢血取得之人類T細胞群，如在IL - 2存在 -35- (32) 200813226 下繼續培養，CD25之陽性率有變低之傾向。CD25爲IL-2 受體，藉由與IL-2結合與負調控有關。又，IL-2存在下 培養，人類T細胞群P1〜P4之TCR r 6之陽性率有變高 之傾向。 實施例1 4 以抗CD4抗體及抗CD8抗體做雙重染色分析 • 如同實施例3，將實施例12取得之人類T細胞群P1 〜P5進行雙重染色。結果如表10所示。又，P1及P4方 面’係爲測定日不同之2次測定値。又，括號內數値表示 IL-2存在下與ST2細胞共培養9〜14日增殖培養後測定之 數値（P3未在IL-2存在下培養）。 表1 0 A類τ細胞團 A群 (CD4 陽性 CD8 陽性)(％) B群 (CD4 陽性 CD8 弱陽性)(％) C群 (CD4 陰性 CD8 陽性)(％) 合計(％) P1 13.2 46.1 36· 7 96.0 2曰後 10.3 37.6 45.6 93.5 (IL-2) (6.4) (6.7) (65.8) (78.9) P2 21.2 32.0 46.3 99· 5 (IL-2) (29.1) (20·0) (49.6) 08.7) P3 19.0 26.7 51.8 97.5 P4 11.5 30.3 54.6 96.4 4曰後 1M 15.3 71.9 98.3 ^llL-2) (15· 4) (9.7) (67.2) (92.3) P5 13.6 6.6 79· 4 99.6 (IL-2) (10· 6) (1.1) (87.4) (99.1)

如表1 0之結果，於試驗之人類T細胞群p 1〜P5中， A群佔10.3〜21.2%、B群佔6.6〜46.1%、C群佔36.7〜 •36- 200813226 (33) 79.4%，此等之合計在93.5%以上。又，pi及p4中，與 臍帶血取得之人類T細胞群相異，混有c D 4弱陽性c D 8 弱陽性之細胞群，該細胞群於IL-2存在下培養，有增加 之傾向。典型的例子方面，關於P 1之細胞流式分析圖如 圖4所不。經CD4、CD8及TCRt*6之三重染色法的細胞 流式分析圖如圖5所示，由其結果可知，該顯示CD4弱陽 性CD8弱陽性之細胞群係爲顯示TCR r (5陽性之細胞群 實施例1 5 細胞毒殺活性 關於本發明之人類T細胞群P1，使用商品名『抗 TCRr Microbead Kit』 （Miltenyi Biotec 販賣）將 D 群之細胞群除去後，與實施例4及實施例5同樣，分析對 於小鼠骨髓基質細胞、人正常細胞、人癌細胞，於E/T比 爲4/1或8/1時是否發揮細胞毒殺活性。細胞株方面，使 用ST2細胞、NHDF細胞、ZR-75-1細胞（人類乳癌細胞 來源：RCB1 906，RIKEN BioResource Center ) 、MKN45

細胞（人類胃癌細胞來源·· RCB1001 ， RIKEN

BioResource Center) 、G361 細胞、LoVo 細胞（人類大腸 癌來源細胞：RCB1639，RIKEN BioResource Center)、 COLO 320DM細胞（人類大腸癌：ATCC CCL-220 )、及 WiDr細胞。結果如表1 1所示。又，表1 1中『-』表示未 測定。 -37- (34) 200813226 表1 1 標的細胞 細胞毒殺活性(％) E/T 比=4/1 E/T 比=8/1 ST2(小鼠骨髓基質細胞） 88·1 ±2·0 95.4±1.1 NHDF(人類正常細胞） 2.5±2.2 -0.6 ±8.6 ZR-75-1认類癌細胞） 一 50.8 ±15.8 MKN45认類癌細胞） — 59.4±6.5 G361(人類癌細胞） 54.2±13.8 86.8 ±2.3 LoVo(人類癌細胞） — 63.9±22.4 COLO 320DM认類癌細胞） 一 77.5土15.5 WiDr(人類癌細胞） 51·3±1·9 87.0±7.3

由表1 1可知，人類τ細胞群P1於E/T比4/1或8/1 時，顯示對小鼠骨髓基質細胞及人類癌細胞有細胞毒殺活 性，對於人類正常細胞NHDF細胞，就算於E/T比爲8/1 也無細胞毒殺活性。由此結果，明白由末梢血取得之人類 T細胞群與由臍帶血取得之人類T細胞群同樣地，對正常 細胞無細胞毒殺活性，對癌細胞具有特異性低之細胞毒殺 活性。 實施例1 6 以CD4及CD 8爲指標分群之各群之細胞毒殺活性 將實施例12取得之人類T細胞群P1，於IL-2之存在 下與ST2細胞共培養2週，使其增殖後，與實施例6同樣 -38- (35) 200813226 地進行分群時，由6 · 5 x 1 07個細胞中分別採集了 A群3 · 〇 x 1〇6 個（純度 97.1%) 、：8群 4·6χ106 個（純度 94·6%)、 C群1 ·7χ107個（純度99.3 % ) 、D群（CD4弱陽性CD8 弱陽性）6.1 xlO6個（純度91.2% )之四群。關於此等， 與實施例7同樣地，求得細胞毒殺活性（％ )。結果如表 1 2所示。 表1 2 細胞毒殺活性(％) E/T 比=0.5/1 Ε/Τ 比=1/1 Ε/Τ 比=2/1 人類T細胞集團Π 67·0±2·9 86·5±0·9 90·2±0·8 A群(CD4陽性 CD8陽性） 45·7±4·4 68.2±4.6 81·5±4·6 B群(CD4陽性 CD嫋陽性） 9.5±17.3 37·3 土 3·5 55·7±1·7 C群(CD4陰性 cmmm 57·4±4·2 77·0±0·3 86·7±2·2 D群(CD4弱陽性 CD8弱陽性） 61.1 ±5.0 86.3 ±0.6 90.6 ±1.2

由表12結果可知，本發明之人類Τ細胞群Ρ 1，與含 於其中之全部群，對於ST2細胞發揮了細胞毒殺活性，特 別是Α群與C群之細胞毒殺活性很強。此結果，藉由臍帶 血取得之人類T細胞群與實施例7之表5結果可說是幾乎 相同。又，由末梢血取得P1中，特有之D群之細胞群的 細胞毒殺活性較其他群強，因TCR r (5爲陽性，可推論爲 傳統之細胞毒殺活性T細胞。 實施例1 7 -39- (36) (36)200813226 免疫抑制活性之測定 與實施例8相同地，測定人類T細胞群p 1或實施例 1 6中所分別採集之4群的免疫抑制活性。又，人類T細 胞群P1，係使用於IL-2存在下與ST2細胞共培養2週增 殖後之細胞。結果如表1 3所不。 表1 3 免疫抑制活性(％) 人類T細胞集團P1 68.8 A群（CD4陽性CD8陽性） 76.4 B群（CD4陽性CD8弱陽性） 22.6 C群（CD4陰性CD8陽性） 74.5 D群（CD4弱陽性CD8弱陽性） 15.2 由表13之結果可知，由末梢血取得之人類T細胞群 P1比臍帶血所取得之人類T細胞群，其免疫抑制活性稍 低，特別是B群有免疫抑制活性弱之傾向。8群之細胞群 ，易在藉由細胞分選法分選細胞中受到傷害，可推論爲因 此而活性低。考量此，可說由末梢血取得之人類T細胞群 與臍帶血所取得之人類T細胞群，顯示具有幾乎相同之免 疫抑制活性。又，P1中所特有之D群，其免疫抑制活性 爲各群中最弱者，係爲傳統之細胞毒殺性T細胞，與實施 例1 6之結果一致。 實施例1 8 -40- (37) 200813226 藉由細胞激素之增殖 與實施例1 0相同方式進行，關於由末梢血取得之人 類τ細胞群P1，藉由抗CD3/CD28抗體及/或各種細胞激 素處理是否顯不細胞增殖，以3H-Thymidine之攝取量 (cpm)測定。又，人類T細胞群P1，係使用於IL-2存在下 與ST2細胞共培養2週增殖後之細胞。結果如表1 4所示

表1 4 處理 細胞增殖活性(_ 無處理 1,700±830 抗CD3/CD28抗體 4,200±420 抗 CD3/CD28 抗體+1L-2 10U/ml 41,000± 1,800 IL-2 10U/mI 6,300±420 IL-2 100U/ml 26,000± 1,800 IL-15 10ng/m! 7,400±900 IL-15 lOOng/ml 67,000± 1,000 IL-4 10ng/ml 4,100±1f700 IL-7 10ng/ml 6,000±610 由表14結果可知，由末梢血取得之人類T細胞群p 1 ，藉由IL-2、IL-15、或抗CD3/CD28抗體與IL-2之處理 ，顯示顯著之增殖性，與臍帶血取得之人類T細胞群（實 施例10之表7)有同樣之特性。然而，與由臍帶血取得之 人類T細胞群不同的是，藉抗CD3/CD28抗體處理而增殖 ’其含有未完全成爲不反應狀況之細胞及經T細胞增殖因 子IL-4或IL-7而增殖之細胞。 -41 - 200813226 (38) 實施例1 9 經RT-PCR分析FOXP3之表現 與實施例9同樣地，調製由末梢血取得之人類T細胞 群P1〜P5之mRNA，調查FOXP3之mRNA之表現狀況。 結果，本發明之人類T細胞群P1〜P5雖表現FOXP3，但 比臍帶血取得之人類T細胞群表現之FOXP3量少。此結 果，支持由末梢血取得之人類T細胞群比臍帶血取得之人 類T細胞群之免疫抑制活性弱。 實施例2 0 IL-10之產生 與實施例1 1同樣地，關於由末梢血取得之人類T細 胞群P 1方面，測定於各種培養條件下IL -1 〇之產生量。 又，人類T細胞群P 1，係使用於IL · 2存在下與s T 2細胞 共培養2週增殖後之細胞。結果如表1 5所示。 表 15 培養條件 IL-10產生量 (ng/ml) IL-2存在下、單獨培養16小時 0.0034 IL-2存在下、抗CD3/CD28抗體結合孔中單獨培養16 小時 2.4 IL-2存在下、與ST2共培養40小時 1.0 由表15可知，本發明之人類τ細胞群P1，於IL-2存 -42- (39) (39)200813226 在下產生IL-10時，更藉由與骨髓基質細胞共培養，顯著 增加IL-10之產生量。又，就算於單獨培養系中，IL-2存 在下經抗.CD3/CD28抗體刺激，IL-10之產生量顯著增加 。此結果與實施例1 1之表8之結果比較，由末梢血取得 之人類T細胞群與臍帶血取得之人類T細胞群相較，其 IL-10之產生能力稍微差。 [產業上的利用性] 如上所述，本發明之人類T細胞群，係爲具有細胞毒 殺活性與免疫抑制活性兩者之新穎之人類T細胞群，藉由 免疫抑制活性，於自體免疫疾病、過敏性疾病等之治療、 移植治療，或藉由細胞毒殺活性，在癌症治療領域上係有 用的。 【圖式簡單說明】 圖1 :本發明之人類T細胞群U3之CD4及CD8之表 現分佈之流式細胞儀分析圖。 圖2 :本發明之人類T細胞群U3與CD4陽性CD25 陽性T細胞中FOXP3之RT-PCR分析結果圖。 圖3 :本發明之人類T細胞群U3與各群中FOXP3之 西方轉印分析結果圖。 圖4:本發明之人類T細胞群P1之CD4及CD8之表 現分佈之流式細胞儀分析圖。 圖5 :本發明之人類T細胞群P1之TCRr δ之表現 -43- (40) (40)200813226 分佈之流式細胞儀分析圖。 【主要元件符號說明】 1 : CD4陽性CD25陽性控制性T細胞 2 :經抗CD3/CD28抗體處理之CD4陽性CD25陽性 控制性T細胞 3 :人類T細胞群U3 4 :人類T細胞群U3 5 :人類T細胞群U3中之A群 6 :人類T細胞群U3中之B群 7 :人類T細胞群U3中之C群

-44-

Claims (1)

1. (1) (1)200813226 十、申請專利範圍 1 · 一種人類τ細胞群，藉由將採自人類血液之單核球 細胞與骨髓基質細胞一起培養而獲得，且具有下述之特徵 (1 ) CD3、CD25、CD28及T細胞抗原受體α Θ爲陽 性、 (2 )本質上由〇04陽性008陽性丁細胞、004陽性 CD8弱陽性Τ細胞及CD4陰性008陽性丁細胞之三群所 成、 (3 )相對於共同培養之骨髓基質細胞’可發揮細胞 毒性，以及 (4)對於活化之Τ細胞，發揮免疫抑制之活性。 2 ·如申請專利範圍第1項之人類Τ細胞群，其可產生 介白素-10。 3 .如申請專利範圍第1項或第2項之人類Τ細胞群’ 其中人類血液爲臍帶血或末稍血。 4 .如申請專利範圍第1項或第2項之人類τ細胞群’ 其中骨髓基質細胞爲小鼠骨髓基質細胞。 5 . —種醫藥組成物，其特徵係含有如申請專利範圍第 1項或第2項之人類Τ細胞群。 -45- 200813226 WQ1136. txt SEQENCE LISTING <110> Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo <120〉Novel human T cell grc^p <130> W01136 <160〉 2 <210> 1 <211> 20 <212> DNA

   <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for human F0XP3 mRNA (Genbank Code NM_014009 or DQ010327) <400> I gcacccaaag cclcagacct <210> 2 <211〉 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223> PCR primer for human F0XP3 mRNA (Genbank Code NM_014009 or DQ010327) <400〉 2 gctccctgga cacccattcc 200813226 七、指定代表圖： (一） 、本案指定代表圖為：無 (二） 、本代表圖之元件代表符號簡單說明：無

   八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學 式：無