TW200808965A - Use of apoptosis-specific eIF-5A siRNA to down regulate expression of proinflammatory cytokines to treat sepsis - Google Patents

Description

200808965 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於細胞凋亡特異性之真核起始因子（”eIF-5A”）或稱為”細胞凋亡特異性之eIF-5A”或”eIF-5A1 ”之真核 ^ 起始因子，及抗eIF-5Al之siRNA向下調控前發炎性細胞因 子之表現之用途。 * 【先前技術】 細胞凋亡在遺傳上為漸進式細胞事件，其特徵為明確界 定之形態特徵，諸如細胞萎縮、染色質凝聚、核碎裂及膜 鼓泡。Ken*等人（1972) Br. J. Cancer，26，239-257 ; Wyllie 等人（1980) Int· Rev. Cytol·，68, 251-306。其在正常組織發 展及穩定中起重要作用，且認為細胞凋亡程式之缺陷造成 範圍為神經退化性及自體免疫性病症至腫瘤之各種人類病 症。Thompson (1995) Science, 267，1456-1462 ； Mullauer 等人（2001) Mutat. Res，488，211-231。儘管細胞凋亡細胞 φ 之形態特徵已充分表徵，但僅開始闡明調控此過程之分子 途徑。 認為在細胞凋亡中起重要作用之一組蛋白質為稱為卡斯 : 蛋白酶之半胱胺酸蛋白酶之家族，其似乎為多數細胞凋亡 : 途徑所需。Creagh & Martin (2001) Biochem· Soc· Trans， 29，696-701 ; Dales 等人（2001) Leuk. Lymphoma，41，247-253。卡斯蛋白酶藉由使各種細胞蛋白質裂解響應細胞凋 亡刺激而觸發細胞凋亡，其導致典型的細胞凋亡表現，其 包括細胞萎縮、膜鼓泡及DNA碎裂。Chang & Yang (2000) 120842.doc 200808965

Microbiol· Mol. Biol· Rev·，64，821-846 〇

諸如Bax或Bak之前細胞凋亡蛋白質在細胞凋亡途徑中亦 起重要作用，其釋放諸如線粒體細胞色素c之活化卡斯蛋 白酶之分子，藉此經由細胞凋亡促進細胞死亡。Martinou & Green (2001) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol.5 2, 63-67 ； Zou 等人（1997) Cell，90，405-413。諸如Bcl-2之抗細胞凋亡之 蛋白質藉由對抗前細胞凋亡蛋白質Bax及Bak之活性促進細 胞存活。Tsujimoto (1998) Genes Cells，3，697-707 ; Kroemer (1997) Nature Med·，3，614-620。認為Bax:Bcl-2 之比率為決定細胞歸宿之一個途徑；過量之Bax促進細胞 凋亡且過量之Bcl-2促進細胞存活。Salomons等人（1997) Int. J. Cancer, 71, 959-965 ； Wallace-Brodeur & Lowe (1999) Cell Mol. Life Sci·，55, 64·75。 細胞凋亡中涉及之另一種關鍵蛋白質為經腫瘤抑制基因 ρ 5 3編碼之蛋白質。此蛋白質為大概經由向上調控B ax，在 損傷且遺傳上不穩定之細胞中調控細胞生長且誘導細胞凋 亡之轉錄因子。Bold 等人（1997) Surgical Oncology，6, 133-142 ; Ronen等人，1996; Schuler & Green (2001) Biochem. Soc. Trans·，29，684-688 ; Ryan等人（2001) Curr. Opin. Cell Biol” 13，332-337 ; ZSrnig 等人（2001) Biochem. Biophys· Acta，1551，F1-F37。 咸信細胞凋亡途徑之變更在包括癌症之多種疾病過程中 起重要作用。Wyllie等人（1980) 1价.1^¥.€71〇1_，68，251-306 ; Thompson (1995) Science，267，1456-1462 ; Sen & 120842.doc 200808965 D’Incalci (1992) FEBS Letters，307，122-127 ; McDonnell 等人（1995) Seminars in Cancer and Biology，6, 53-60。癌 症發展及進行之研究通常集中在細胞增生上。然而，近 來細胞〉周亡在致瘤中所起重要作用已顯而易見。實際 上，由於細胞凋亡之控制在腫瘤細胞總是以某種方式變 更，因此目萷關於細胞凋亡所瞭解之大部分係使用腫瘤 模型習得。Bold 等人（1997) Surgical 〇neology，6, 133_ 142 ° 細胞激素已亦牽涉於細胞凋亡途徑中。生物系統要求細 胞父互作用以供其之調控，且細胞之間的交聯對話通常包 括大量細胞因子。細胞激素為響應許多不同細胞類型之各 種刺激而產生之介體。細胞激素為可對許多不同細胞類型 施加許多不同作用之多效性分子，而其在調控免疫反應及 造血細胞增生及分化中尤其重要。視特定細胞激素、相對 濃度及其他介體之存在而定，細胞激素對標靶細胞之作用 • 可促進細胞存活、增生、激活、分化或細胞凋亡。 抗細胞激素已普遍用於治療諸如牛皮癖、類風濕性關節 炎、及克隆氏病（Crohn’s disease)之自體免疫病症。前發炎 性細胞激素IL-1及TNF在此等慢性病症之病理學中起大作 用。降低該等2種細胞激素之生物活性的抗細胞激素療法 可長:供治療優點（Dinarello及 Abraham，2002)。 介白素l(IL-l)為介導局部及全身發炎性反應且可與下^^ 在包括血管炎、骨質疏鬆症、神經退化性病症 '糖尿病、 狼瘡腎炎及諸如類風濕性關節炎之自體免疫病症之許多病 120842.doc 200808965 症的發病機制中協同作用之重要細胞激素。近來亦藉由當 注射黑素瘤細胞時，IL-Ιβ基因剔除小鼠對轉移及血管生 成之抗性來證明IL-1 β在腫瘤血管生成及侵襲中之重要性 (Voronov等人，2003) 〇 介白素18(IL-18)為近來發現之il-1家族之成員且其在妗 構、文體及功能上與IL-1相關。由於il- 18能夠誘導干擾 素l(IFN^)、TNF-α及IL-1，因此其為與發炎性及自體免 _ 疫病症有關之中心細胞激素。IL-Ιβ及IL-18皆能夠誘導 TNF-a之產生，TNF-a為已知在心肌缺金期間造成心臟功 能異常之細胞激素（Maekawa等人，2002)。發現藉由與IL_ 18結合蛋白中和來抑制IL_18在表面灌注人類 心房心肌之局部缺血/再灌注模型中降低局部缺血誘導之 心肌功能異常（Dinarello, 2001)。使用小鼠江-18結合蛋白 來中和IL-1 8亦能夠降低IFN々、TNF_a& IL- i p轉錄程度且 在膠原蛋白誘導之關節炎小鼠模型中降低關節損傷⑺⑽心 瞻 等人，2003)。由於在小鼠黑素瘤模型中注射几-丨8結合蛋 白成功地抑制轉移，因此IL_18產生或可用性之降低亦可 吞豆明有盈於控制轉移性癌症（Carrascal等人，2003)。作為 前發炎細胞激素重要性之另一指標，iL-18之血漿含量在 患有k性肝病之患者中升高，且增加之程度與疾病嚴重程 度有相互關係（Ludwiczek等人，2002)。類似地，il-18及 TNF-a在患有腎病之糖尿病患者之血清中升高（Moriwaki等 人 2 〇 〇 3)。創傷性腦損傷後神經發炎亦由前發炎細胞激 素w V，IL-18結合蛋白對IL-1 8之抑制作用在小鼠腦創傷 120842.doc 200808965 後可增進神經病學之恢復（Yatsiv等人，2002)。 細胞激素TNF家族之成員TNF-α為前發炎細胞激素，其 具有範圍介於對造血細胞之共促有絲分裂作用、誘導發炎 反應、與在許多細胞類型中誘導細胞死亡之多效性 (pleiotropic)作用。TNF-a通常由細菌脂多醣、寄生蟲、病 毒、惡性細胞及細胞激素誘發，且通常有利地用以保護細 胞免於感染及癌症。然而，TNF-a之不當誘發為急性及慢 性發炎所造成之病症諸如自體免疫病症之主要因素，且亦 可造成癌症、AIDS、心臟病及敗血症（由Aggarwal及 Natarajan，1996 ; Sharma 及 Anker，2002回顧）。疾病（亦即 敗血性休克及類風濕性關節炎）以及人類病症（亦即發炎性 腸病及急性移植物對抗宿主疾病）之實驗動物模型已證明 阻斷TNF-α之有利作用（Wallach等人，1999)。抑制TNF-a 對於罹患諸如克隆氏病（van Deventer，1999)及類風濕性關 節炎（Richard-Miceli及Dougados，2001)之自體免疫病症之 患者提供缓解亦有效。亦認為TNF-α促進B淋巴細胞存活 及生長之能力在B細胞慢性淋巴球性白血病（B-CLL)之發病 中居要角，且在B-CLL中T細胞表現之TNF-a之量與腫瘤質 量及疾病階段有正相關性（Bojarska-Junak等人，2002)。介 白素Ιβ(ΙΙ-Ιβ)為已知可誘導TNF-α產生之細胞激素。 eIF-5A之胺基酸序列在物種之間充分保守，且eIF-5A中 亥普酸（hypusine)殘基周圍之胺基酸序列嚴格保守，此暗 示該修飾對於存活可能重要。Park等人（1993) Biofactors， 4，95-104。此假定由以下觀測進一步支持：迄今為止在酵 120842.doc 200808965 母中發現之2種eIF-5A同功異型物之失活，或催化其激活 之第一步驟之DHS基因之失活阻斷細胞分裂。Schnier等人 (1991) Mol. Cell· Biol·，11，3105-3114; Sasaki等人（1996) FEBS Lett·，384，151-154 ; Park等人（1998) J· Biol· Chem·， 273，1677-1683。然而，酵母中eIF-5A蛋白質之耗竭僅導 致總蛋白質合成少量降低，此暗示eIF-5A可為mRNA之特 異子集之轉譯所需而非用於蛋白質綜合合成。Kang等人 (1993)，"Effect of initiation factor eIF-5A depletion on cell proliferation and protein synthesis，"於 Tuite，M·(編輯），

Protein Synthesis and Targeting in Yeast, NATO Series H 中。近期發現結果，即結合eIF-5A之配位體享有高度保守 基元亦支持eIF-5A之重要性。Xu & Chen (2001) J. Biol, Chern·，276，2555-2561。此外，發現所修飾之eIF-5A之亥 普酸殘基為與RNA序列特異性結合所必需，且結合並不提 供保護免於核糖核酸酶。 此外，eIF-5A之細胞内耗竭導致特異性mRNA在核内顯 著積累，此指示eIF-5 A可能負責使mRNA之特異性類別自 核穿梭至細胞質。Liu & Tartakoff (1997) Supplement to Molecular Biology of the Cell，8，426a·摘要編號2476，第 37屆美國細胞生物學會年度會議（37th American Society for Cell Biology Annual Meeting)。eIF-5 A在核膜孔相關 之核内纖絲處之積累及其與一般核輸出受體之相互作用 進一步暗示eIF-5A為核質穿梭蛋白質，而非多核糖體之 組份。Rosorius 等人（1999) J. Cell Science，112? 2369- 120842.doc -10- 200808965 2380 ° eIF-5A之第一 eDNA由Smit-McBride等人於1989年自人 類選殖，且自此以後eIF-5A之cDNAs或基因已自包括酵 母、大鼠、雞胚、紫花苜蓿及蕃茄之各種真核生物選殖。 Smit-McBride 等人（1989) J· Biol. Chem·，264，1578-1583 ; Schnier 等人（1991)(酵母）；Sano，Α· (1995)於 Imahori，Μ·等 人（編），Polyamines，Basic and Clinical Aspects 中，VNU Science Press，The Netherlands, 81_88(大鼠）；Rinaudo & Park (1992) FASEB J·，6，A453(雞胚）；Pay 等人（1991) Plant Mol. Biol” 17, 927-929(紫花苜蓿）；Wang 等人（2001) J. Biol· Chem·，276, 17541-17549(蕃茄）。 【發明内容】 本發明係關於細胞凋亡特異性之真核起始因子5 A(eIF-5A)，其稱為”細胞凋亡特異性之eIF-5A"或”eIF-5Al”。本 發明亦係關於經由使用eIF5 A1 siRNAs或反義多核苷酸抑 制細胞凋亡特異性之eIF-5A之表現來活體内（及在活體外 於細胞中）抑制包括人類之個體之前發炎性細胞激素之表 現。投與eIF5Al siRNA及eIF5Al之反義建構體以降低諸如 IL-Ιβ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、TNF-α、IL-3、 IL-6、IL-12(p40)、IL-12(p70)、G-CSF、KC、MIP-la及 RANTES之前發炎性細胞激素之表現，其適用於治療或預 防敗血症及/或出血誘導之休克。 本發明亦提供用於降低前發炎性細胞激素之表現之醫藥 組合物’其包含eIF5 A1 siRNA及醫藥學上可接受之載劑。 120842.doc •11· 200808965 可投與本發明之醫藥組合物以治療或預防包括人類之個體 之敗血症發作。在某些實施例中，該醫藥組合物包含核苷 酸序列 CGG AAU GAC UUC CAG CUG A。 【實施方式】 已分離出真核起始因子5A("eIF-5A")之幾種同功異型物 且提供於公開之資料庫中。此等同功異型物在功能I被認 為冗餘。本發明之發明者已發現一種同功異型物在誘導細 鲁 胞凋亡前才向上調控，其已命名為細胞凋亡特異性之eIF_ 5A或elFjAl。本發明之主題為細胞凋亡特異性之eiF_5A 及向下調控其表現以向下調控前發炎細胞激素之表現。 敗血症為每年引起約210,000例死亡之惡性血管内發炎 之病變。因此，需要附屬療法。敗血症亦稱為全身發炎反 應症候群（"SIRS")。敗血症可由起源於體内任何位置之細 菌感染所引起。敗血症可簡單定義為患者對感染之免疫反 應所引起之臨床病狀範圍，其特徵為全身發炎及凝血。其 • 包括全身發炎反應（SIRS)至器官功能異常至多重器官衰竭 及隶終死亡之全部反應範圍。 敗血症為極複雜之一系列事件，仍需進行大量研究以徹 底瞭解患者如何由SIRS進行至敗A性休克。具有敗血性休 克之患者具有兩階段免疫學反應。其最初對感染顯示強勢 發火反應。此極可能歸因於前發炎細胞激素腫瘤壞死因子 (TNF)、IL-1、IL_12、干擾素γ(ΙΡΝ-γ^ΙΕ_6。隨後身體藉 由產生抗發炎細胞激素（1^10)、可溶性抑制劑（TNF受體， IL-1文體II型，&IL-1RA(IL巧之失活形式））來調控此反 120842.doc -12- 200808965 應，其在患者顯示一段免疫抑制期。此種低度免疫反應 (hypo-responsiveness)之持續與醫院感染及死亡風險之增 加相關。 此全身發炎梯級（cascade)係由各種細菌產物啟始。此等 細菌產物諸如：革蘭氏陰性細菌=内毒素、曱醯基肽、外 毋素及蛋白i# ’革蘭氏1%性細囷=外毒素、超級抗原（中毒 性休克症候群毒素（TSST)、鏈球菌致熱原性外毒素 A(SpeA))、腸毒素、溶血素、肽聚糖及脂填壁酸 (lipotechoic acid)，及真菌細胞壁物質，其與宿主巨噬細 胞上之細胞受體結合且活化諸如細胞核因子KB(NFkB)之調 控蛋白。内毒素藉由與幾種受體相互作用而活化調控蛋 白。CD受體在細胞表面上彙集LPS-LPS結合蛋白複合體， 隨後TLR受體將信號轉譯於細胞中。 如上所述，所產生之前發炎性細胞激素為腫瘤壞死因子 (TNF)、介白素1、6及12及干擾素γ(ΙΡΝ-γ)。此等細胞激素 可直接作用以影響器官功能或其可經由次級介體間接作 用。次級介體包括氧化氮、凝血脂素、白三稀、血小板活 化因子、前列腺素及補體。丁^^及乩—丨（以及内毒素）亦可 藉由内皮細胞引起組織因子釋放，導致纖維蛋白沈積及彌 漫性血管内凝血（DIC)。 此等初級及次級介體隨後引起凝結級聯' 補體級聯激活 及前列腺素及白三烯產生。血塊容納於血管中，降低器官 之充沛度且可導致若干器官系統衰竭。凝結級聯之此激活 及時耗竭患者製造血塊之能力，導致Die及ARDS。 120842.doc -13- 200808965 此級聯之累積效應為發炎支配消炎，且凝結支配金纖維 蛋白溶解的不平衡狀態。導致微血管血栓症、灌注不足、 局部缺血及組織損傷。嚴重敗血症、休克及若干器官功能 異常可發生，導致死亡。 〇 b 由於本發明之發明者先前已確定鼻内脂多醣（LPS)活體 内激發後，eIF5Al siRNA(作為裸siRNA鼻内輸送）在細胞 • 系統中降低若干敗血症之潛在介體之產生或表現（例如IL_ φ 1P、™F_a、IL·8、iN0S、TLR-4表現）且在血液中降低數 種前發炎性細胞激素之產生或表現，因此對内毒素血症小 鼠之存活率及細胞激素表現之影響得以研究。參見同在申 請中之美國申請案11/134,445(2005年5月23曰提出申請）、 11/184,982(2005 年 7 月 20 日提出申請）、11/293 391(2〇〇5年 11月28日提出申請）及11/595,990(2006年^月13曰提出申 請）’其以引用的方式全部倂入本文中。

以大腸桿菌（E· C〇li)〇lll:B4 LPS腹膜内（IP)接種BALB/C φ 小鼠，引起93%之對照死亡。動物接受eIF5Al siRNA (N=5)(3’-GCC UUA CUG AAG GUC GAC U-5，）或混雜 RNA 作為對照（N=15)。結合100 pg包含DOTAP之轉染微團，IP : 給與50 pg劑量之eIF5Al siRNA。siRNA-脂質體複合體在 : 投與LPS前及-24小時給藥。進行存活率實驗且在相 似條件下在LPS投與後90分鐘或8小時處死小鼠且抽取血 樣。珠粒基多工夾入免疫檢定將循環細胞激素量化。結果 指示以eIF5Al siRNA治療BALB/C小鼠賦予60%保護 (ρ<0·01)。在治療之情況下，IL-Ιβ在90分鐘時自5909下降 120842.doc •14- 200808965 為658 pg/mL且在8小時時自2478下降為1032 pg/mL。治療 亦將TNF-α在90分鐘時自33649降至3696 pg/mL，且在8小 時時自1272降至901。在治療之情況下，MIP-la亦在90分 鐘時自10499下降至3475 pg/mL且在8小時時自680下降至 413 pg/mL。在8小時時，治療將IFN-γ自142降低至86 pg/mL 且將 IL-12(p40)自 46570 降低至 14261 pg/mL。在治療 之情況下，消炎細胞激素IL-10在90分鐘時自719增加至 898 pg/mL。此等研究展示以siRNA乾向發炎性介體賦予内 毒素血症小鼠以保護，且表明此在治療敗血症患者中可為 適用之方法。 除上述敗血症模型外，發明者亦開發一種用於研究出血 性休克之新穎鼠類模型。在此模型中，藉由心臟穿刺經60 秒時間（在曱氧氟烷麻醉下）抽出30%之計算血容量（0·55 ml)將雄性小鼠C-57BL/6J(8-12週齡）誘導為出血休克。放 血後1 h收集肺，且在含有20 mM HEPES(pH 7.4)、20 mM 甘油磷酸鹽、20 mM焦磷酸鈉、0·2 mM Na3V04、2 mM EDTA、20 mM 氟化鈉、10 mM 苯甲脒、1 mM DTT、20 ng/ml亮抑蛋白酶肽、0.4 mM Pefabloc SC及 0.01% Triton X-100之1 ml冰冷萃取緩衝液中勻漿。在4°C在14,000 g將 勻漿物離心15 min。收集上清液且以二辛可寧酸檢定測定 蛋白質濃度。所得上清液用於藉由ECL(液相ELISA)根據 製造商之建議測定TNF、IL-1及IL-6。最終結果表示為皮 克細胞激素蛋白質/毫克蛋白質。 在另一出血性模型中，發明者展示提供eIF5A siRNA之 120842.doc -15- 200808965 情況下，其可降低TNFa及IL-Ιβ之表現。在出血前24小時 以50 pg eF5Al siRNA處理雄性i.p.誘導之5隻小鼠C-57BL/6J。在對照中，出血前24小時以50 pg混雜siRNA處 理雄性i.p·誘導之5隻小鼠C-57BL/6J。藉由心臟穿刺經60 秒時間（在甲氧氟烷麻醉下）抽出0.55 mL來發展出血休克。 圖21展示在誘導出血休克之前投與siRNA藉由降低11-1 β及 TNF-a之表現提供保護優點。 因此，本發明之一實施例提供用於活體内降低個體之前 發炎性細胞激素之表現的方法.，其包含向該個體投與 eIF5Al siRNA，由此eIF5Al siRNA降低前發炎性細胞激素 之表現。個體可為包括人類之任何動物。 前發炎性細胞激素為與發炎級聯有關之任何細胞激素， 諸如 IL-Ιβ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、TNF-a、 IL-3、IL-6、IL-12(p40)、IL-12(p70)、G-CSF、KC、MIP-la 及 RANTES。圖 1-18 及 21-22 展示以 eIF5Al siRNA 治療使 得與未接受eIF5Al siRNA之動物相比前發炎性細胞激素之 量降低。 如上所示，發明者證明當前發炎性細胞激素表現降低時 eIF5 A siRNA賦予内毒素血症小鼠以保護。因此，本發明 之一實施例亦提供藉由向個體投與eIF5Al siRNA治療該個 體之敗血症之方法，由此投與eIF5Al siRNA降低elF5Aj之 表現且使得前發炎性細胞激素之表現降低。降低之表現专、 謂與未經eIF5Al siRNA或其他eIF5Al反義構建體治療之個 體之蛋白質之表現程度或量相比，降低特定蛋白質之表現 120842.doc -16 - 200808965 以及降低其含量。 本發明之另一實施例進一步提供預防包括人類之個體之 出血性休克的方法，其包含投與eIF5Al siRNA或反義多核 苷酸以降低IL-Ιβ及/或TNF-α之表現。 可使用抑制eIF5Al表現之任何eIF5Al siRNA。術語，，抑 • 制π亦意謂降低。一例示性eIF5Al siRNA包含以下序列： ^ CGG AAU GAC UUC CAG CUG A。同在申請中之美國申 請案11/134,445(2005年5月23日提出申請）、 _ 11/184,982(2005年7月20日提出申請）、11/293,3 91(2005年 11月28曰提出申請）及11/595,990(2006年11月13曰提出申 請）（其以引用的方式全部倂入本文中）提供已用以在其他細 ， 胞類型中抑制eIF5Al表現且亦展示抑制前發炎性細胞激素 之表現之其他例示性eIF5Al siRNAs及其他反義構建體。 給定eIF51A序列熟習此項技術者可設計其他eiF5Al siRNA，且其在無過多實驗之情況下可易於測試siRNA抑 φ 制表現之能力。圖22-27提供eIF5Al·、例示性eIF5Al siRNA及反義構建體之序列。 本發明亦提供包含上述eIF-5 A1 siRNA或反義多核皆酸 : 之適用於降低前發炎性細胞激素表現之醫藥組合物。該組 , 合物可包含eIF5Al siRNA或反義多核苷酸及醫藥學上可接 受之載劑。公眾可易於獲得諸如媒劑、佐劑、載劑或稀釋 劑之醫藥學上可接受之賦形劑。此外，公眾可易於獲得諸 如pH調節劑及缓衝劑、張力調節劑、穩定劑、濕潤劑及其 類似物之醫藥學上可接受之助劑。 120842.doc -17- 200808965 通常由接受者之年齡、體重及病狀或疾病之嚴重程度來 確定如上所述之eIF5A1 siRNA或eIF5A1反義核苷酸之有效 量。可每日給藥一或多次，或不太頻繁給藥。應注意本發 明並不侷限於本文中所述之任何劑量。 醫藥組合物可製備成以任何適用於個體之病狀之方法投 與的藥劑’該等方法例如經口、非經腸（包括皮下、肌肉 内及靜脈内）、直腸、經皮、經頰或經鼻，或醫藥組合物 可作為液體溶液輸送至眼睛。 # siRNA或反義構建體可作為，’裸”siRNA或反義核苷酸輸 送’或可袤入（例如）藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備之 微膠囊（分別為例如羥基甲基纖維素或明膠微膠囊及聚（曱 基丙烯酸甲酯）微膠囊）、膠狀藥物輸送系統（例如脂質體、 白蛋白微球體、微乳液、奈米_顆粒及奈米膠囊）或巨乳液 中。該等技術揭示於 Remington，s Pharmacemical

Sciences，第 16版，〇s〇l，Α·編（1980)中。 ⑩ 反義多核苷酸及/或siRNA可在化學上修飾。修飾可增強 其耐核酸酶性且可增強其進入細胞之能力。例如，可使用 硫代磷酸酯募核苷酸。其他脫氧核苷酸類似物包括膦酸甲 _、磷醯胺脂、二硫代磷酸酯、N3T5、磷醯胺脂及寡核糖 核苷酸硫代磷酸酯及其2，_〇·烷基類似物，及2，·〇_甲基核 糖核酸膦酸甲酯。 或者可使用混合骨架寡核苷酸（MB0)。ΜΒΟ含有硫代碟 酸酯寡脫氧核苷酸之片段及經修飾之募脫氧或募核糖核苷 酸之適當放置的片段。MB〇具有硫代磷酸酯鍵之片段及盆 120842.doc -18 - 200808965 他修飾處理之寡核苷酸之其他片段，諸如膦酸甲酯，其為 非離子性的且極耐核酸酶或2’-0-烷基寡核糖核苷酸。 【圖式簡單說明】 圖1展示siRNA抗eIF-5Al對前發炎性細胞激素之作用之 影響。圖1展示siRNA抗eIF-5Al導致IL-Ιβ之表現降低。 " 圖2展示siRNA抗eIF-5Al導致IL-2之表現降低。 ’ 圖3展示siRNA抗eIF-5Al導致IL-4之表現降低。 圖4展示siRNA抗eIF-5Al導致IL-5之表現降低。 w 圖5展示siRNA抗eIF-5Al導致IL_10之表現降低。 圖6展示siRNA抗eIF-5Al導致GM-CSF之表現增加。 圖7展示siRNA抗eIF-5Al導致IFN-γ之表現降低。 圖8展示siRNA抗eIF-5Al導致TNF-α之表現降低。 圖9展示siRNA抗eIF-5Al導致IL-lcx之表現增加。 圖10展示siRNA抗eIF-5Al導致IL-3之表現降低。 圖11展示siRNA抗eIF-5Al導致IL-6之表現降低。 φ 圖12展示siRNA抗eIF_5Al導致IL-12(p40)之表現降低。 圖13展示siRNA抗eIF-5Al導致IL-12(p70)之表現降低。 圖14展示siRNA抗eIF-5Al導致IL-17之表現增加。 ； 圖15展示siRNA抗eIF-5Al導致G-CSF之表現降低。 s 圖16展示siRNA抗eIF-5Al導致KC之表現降低。 圖17展示siRNA抗eIF-5Al導致ΜΙΡ-1α之表現降低。 圖18展示siRNA抗eIF-5Al導致RANTES之表現降低。 圖19提供eIF-5Al siRNA構建體。 圖20展示肺出血後1小時心臟穿刺及放血之作用。IL-1 β 120842.doc -19- 200808965 表現顯著增加。 圖21展示誘導出血性休克之前投與eIF5Al siRNA導致II-1B及TNF-α之表現降低。 圖22提供相對於eIF5A2比對之人類eIF5Al之核苷酸序 列。 圖23提供相對於eIF5A2比對之人類eIF5Al之胺基酸序 列。 圖24提供具有例示性反義募核苷酸之人類eIF5Al之核苷 酸序列。 圖25提供具有例示性反義寡核苷酸之人類eIF5Al之核苷 酸序列。 圖26A及B提供具有例示性siRNA之人類eIF5 A1之核苷酸 序歹1J。 圖27提供具有例示性siRNA之人類eIF5Al之核苷酸序 列0

120842.doc -20-

Claims (1)

1. 200808965 十、申請專利範圍： I · 一種用於降低個體之活體内前發炎細胞激素之表現的方 法，其包含向該個體投與eIF5Al siRNA，由此該eIF5Al siRNA降低該個體之前發炎細胞激素的表現。 2.如請求項1之方法，其中該個體為人類。 ' 3.如請求項1之方法，其中該前發炎細胞激素係選自由以 ： 下組成之群：11^10、11^2、11^4、11^5、11^1〇、1?^[· γ、TNF-α、IL-3、IL-6、IL-12(p40)、IL-12(p70)、G-• CSF、KC、MIP-la及 RANTES。 4·如請求項1之方法，其中該前發炎細胞激素為TNF-α。 5. 如請求項1之方法，其中該前發炎細胞激素為11-6。 6. 如請求項1之方法，其中該前發炎細胞激素為KC。 7. 如請求項1之方法，其中該前發炎細胞激素為MIP-Ια。 8. 如請求項1之方法，其中該降低前發炎細胞激素之表現 進一步提供敗血症之治療。 ^ 9.如請求項1之方法，其中該eIF5Al siRNA包含序列CGG AAU GAC UUC CAG CUG A。 10. —種用於降低前發炎細胞激素之表現之醫藥組合物，其 、 包含eIF5 A siRNA及醫藥學上可接受之載劑。 II ·如請求項11之組合物，其中該siRNA包含核苷酸序列 CGG AAU GAC UUC CAG CUG A 〇 12_ —種用於預防個體之出血性休克之方法，其包含投與 eIF5Al siRNA或elFAl反義多核苷酸以降低個體之IL-Ιβ 及/或TNF-α之表現，藉此預防出血性休克。 120842.doc