TW200413721A - Compositions and methods for determining the replication capacity of a pathogenic virus - Google Patents

Description

200413721 玫、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明是有關測定病毒複製能力之組合物及方法。組合 物及方法可用於鑑定治療病毒感染之有效藥物療程，及鑑 定及決定可能的治療性化合物之生物效力。 【先前技術】 自1980年早期，即有超過6千萬人口感染人類免疫缺失病 毒（’’HIV’’），即後天免疫缺失症候群（’’AIDS”）之肇因。見 Lucas，2002, Lepr Rev. 73(1):64-71。HIV/AIDS 目前是近撒 哈拉的非洲國家（sub-Saharan Africa)主要死因，且是全世界 第4大殺手。在2001年，據估計全球約有4千萬人口與HIV 同棲。見Norris，2002, Radiol Technol· 73(4):339-363 〇 目前的抗-HIV藥物係針對HIV生命週期不同階段及各樣 HIV複製及/或存活之必要酵素。目前許可應用於AIDS治療 中之藥物，如核苷反轉錄酶抑制劑（”NRTr)，如AZT，ddl， ddC，d4T，3TC，濟而剛（abacavir);核誓酸反轉錄酶抑制 劑，如泰諾福章（tenofovir);非-核嘗反轉錄酶抑制劑 (’’NNRTI")如衛滋（nevirapine)，希寧（efavirenz)，德立維拉 丁（delavirdine)及蛋白酶抑制劑，如服妥美（saquinavir)，諾 億亞（ritonavir)，克滤滿（indinavir)，維拉赛特（nelfinavir)， 安瑞那章（amprenavir)及快利佳（lopinavir)。 抗-病毒藥作用的一個結果是其可在病毒複製上呈現充 份的選擇性壓:力，以選出抗藥突變株（Herrmann et al.，1977, Ann NY Acad Sci 284:632-637)。隨著藥物曝露之增加，在 86537 200413721

複製病毒族群上之選擇壓力也增加，而促使抗藥突變株更 快速脫出。許多蛋白酶抑制劑抗性突變及某些NRTI抗性突 變，已知破壞HIV-1複製能力達各種程度。典型而言，突變 作用可提供對抗病毒藥物之抗性，因而減低突變病毒之複 製能力。如見Nijhuis et al·，2001，Curr Op Infect Diseases 14:23-28，已全文列為本案參考。病毒複製能力之改變極具 臨床重要性，因為其會影響病人對抗-病毒治療之反應。見 上文。然而，NNRTI抗性突變之作用大多未特性化，且常 被認為此NNRTI抗性與受損之病毒複製並無關聯。因此， 在技藝中對於偵測NNRTI抗性病毒複製能力之方法及組合 物是有必要的。 【發明内容】

本發明提出偵測病毒複製能力（也稱為複製適當性 replication fitness)之方法及組合物，如HIV，如非-核嘗反 轉錄酶抑制劑（NNRTI)抗性HI V。方法及組合物之依據是一 列重組病毒載體之分析，其利用含有一個以上反轉錄酶（RT) 胺基酸置換之位置-指令之突變作用所生成。本發明之方法 及組合物可顯著地改善病人之生命品質，係對其主治醫師 提供可用於設計更有效之抗病毒療程之資訊。同時經由無 效藥物之避免，可省去相當多的時間及金錢。 測定複製適當性之方法可適用於其他病毒，包括下列但 不限於：肝DNA病毒屬（如人類B肝病毒），黃病毒屬（如人 類C肝病毒）及疱疹病毒屬（如人類巨細胞病毒）。 本發明進一步是有關測定HIV-1複製適當性之方法，其對 86537 200413721 反轉錄酶抑制劑及蛋白酶抑制劑之藥物易感性呈現出減少 之情況。測定複製適當性之方法可適用於其他類型之HIV-1 複製抑制劑，包括整合，病毒組裝及病毒吸附及進入，但 不限於此。 本發明進一步是有關鑑定蛋白酶或反轉錄酶，可改變複 製適當性之突變作用之方法。

鑑定可改變此中所述之複製適當性之突變之方法，可適 用於HIV-1複製其他組份，包括整合，病毒組裝及病毒吸附 及進入，但不限於此。 本發明進1步是有關定量無複製適當性之蛋白酶或反轉 錄酶上特殊突變作用之方法。定量特殊蛋白酶及反轉錄酶 突變無複製適當性之影響之方法，可適用於HIV-1複製中其 他病毒基因之突變，包括gag，pol及envelope基因，但不限 於此。 本發明進一步是有關有減低之複製適當性之高發病率病 人樣品，及減低之藥物易感性及減低之複製適當性間之一 _ 般相互關係。較特別地，本發明進一步是有關在接受蛋白 酶抑制劑及/或反轉錄酶抑制劑治療病人，適當性減低病毒 之發生。 本發明進一步有關複製適當性減低之病人樣品之發病 率，其中適當性之減低乃因gag聚蛋白質（p55)之蛋白酶處理 修飾改變之故。 本發明進一步是有關可呈現低，中度或正常（野生型）複 製適當性之病人樣品中，蛋白酶突變之發生率。 86537 200413721 本發明進一步是有關在呈現減低的複製能力病毒中，經 常可觀察到的，或單獨的或組合的，蛋白酶突變作用。 本發明也是有關低複製適當性之病人樣品之發生率，其 中適當性之減低乃因反轉錄酶活性改變所致。 本發明是有關在反轉錄病毒藥物治療中失敗病人，其複 製適當性減低之病毒發生率。 本發明進一步有關利用複製適當性測定以引導HIV-1治 療之方法，如，利用複製適當性偵測以引導在抗反轉錄病 g 毒藥物治療中失敗患者之治療，或利用複製適當性測定來 引導新近為mv-i感染患者之治療。利用複製適當性測定來 引導HIV-1治療之方法可適用於其他病毒，包括肝DNA病毒 (如人類B肝病毒），黃病毒（如人類C肝病毒）及癌療病毒（如 人類巨細胞病毒）。 在一方面，本發明提出測定HIV (如HIV-1)是否有增加的 受損複製能力可能性之方法，此方法包括測定為該HIV所編 碼之反轉錄酶是否可呈現與受損之複製力有關之突變，係 · 在該反轉錄酶胺基酸位置98，100，101，103，106，108， 179，181，188，190，225或23 6處，其中該突變之存在表 示HIV有複製力受損增加之可能性，但限制條件為該突變並 #P236L 。 在另一方面，本發明提出偵測HIV (如HIV-1)是否有複製 力受損增加之可能性之方法，此方法包括偵測為該HIV所編 碼之反轉錄酶是否在該反轉錄酶胺基酸序列上呈現出突變 與否，突變選自由 A98G，L100I，K101E，K103N，V106A， 86537 200413721 V106I，V106M，Y181C，Y188A，Y188C，Y188H，Y188L， G190A，G190C，G190E，G190T，G190V，G190Q，G190S 及G190V組成之群中，其中該突變之存在表示HIV有複製力 受損增加之可能性。 在另一方面，本發明提出偵測個體是否有複製力受損增 加可能性之HIV (如HIV-1)之方法，此方法包括測定為該 HIV編碼之反轉錄酶是否在該反轉錄酶胺基酸序列第98， 100，101，103，106，108，179，181，188，190，225< 象 236位置上存在有與複製力受損有關之突變，其中該突變之 存在表示HI V有複製力受損增加之可能性，限制條件為該突 變非P236L。 在另一具體實例中，該方法包括在至少2，3，4，5，6， 7，8，9，10，11或12個胺基酸位置上偵測與複製力受損有 關之突變是否存在。一般而言，方法包括偵測與受損之複 製力有關之上列任一突變組合存在與否。如，偵測至少二 個胺基酸位置之突變存在與否，如胺基酸位置106及181， φ 103 及 190，10-3 及 236，181 及 236，103 及 188，103 及 181， 100及103或98及181。在某些具體實例中，此方法包括偵測 V106A及 Y181C ; K103N及 G109S ; P236L及 K103N ; P236L 及 Y181C ; K103N 及 G190A ; K103N 及 Y181C ; K103N 及 Y188L ; L100I 及 K103N ;或 Y181C 及 A98G 之存在與否。 再者，方法包括偵測在至少三個胺基酸位置上突變存在 與否，如胺基酸位置103，181及236 ; 100，103及190 ;或 103，181及225。在某些具體實例中，此方法包括偵測 86537 -10- 200413721 P236L，K103N及Y181C; L100I，K103N及G190S;或K103N， Y181C及P225H存在與否。 又在另一方面，本發明提出偵測個體是否有複製力受損 增加可能性之HIV (如HIV-1)，此方法包括偵測為該HIV編 碼之反轉錄酶是否在該反轉錄酶之胺基酸序列上有突變之 存在，突變選自由 A98G，L100I，K101E，K103N，V106A， V106I，V106M，Y181C，Y188A，Y188C，Y188H，Y188L， G190A，G190C，G190E，G190T，G190V，G190Q，G190S · 及G190V組成之群，其中該突變之存在表示HIV有複製力受 損增加之可能性。 在一個具體實例中，該突變可提供對非核甞反轉錄酶抑 制劑（’’NNRTI”）之抗性。在另一具體實例中，該人類免疫缺 失病毒是人類免疫缺失病毒1型（HIV-1)。在另一具體實例 中，該NNRTI是衛滋（nevirapine，”NVPn)，德拉維拉丁 (delavirdine，nDLV’’）或希寧（efavirenz，f’EFV’’）。在另一具 體實例中，於該反轉錄酶（"RT")中該突變之存在與否可由籲 序列-特異的寡核苷酸探針與編碼該突變之該人類免疫缺 失病毒之核酸序列雜交而偵測，其中雜交之發生表示該突 變之存在。在另一具體實例中，於RT中該突變之存在可由 偵測編碼該突變之核酸序列而測及。在另一具體實例中， 於RT中該突變之存在與否可由如PCR擴大核酸而測及。在 另一具體實例中，該個體正進行或已進行抗病毒藥物之先 前治療。在一個具體實例中，抗病毒藥是NNRTI。 在另一方面，本發明提供一段在HI V中之分離的寡核甞 86537 -11- 200413721 酸，其編碼部分HIV反轉錄酶且長度在10及40個核苷酸間， 其中包括在該HIV反轉錄酶胺基酸序列第98, 100, 101，103， 106，108，179，181，188，190，225或 236處之突變。其中 突變與對蛋白酶抑制劑之感受性減低有關，限制條件為該突 變並非P236L。 【實施方式】

本發明提出方法及組合物用以發展及利用彼偵測非核甞 反轉錄酶抑制劑（NNRTI)抗性病毒之複製力。方法及組合物 發展之依據是分析一列由位置-指令之突變作用所生成之 重組病毒載體，其中含一個以上反轉錄酶（RT)胺基酸之置 換。本發明之方法及組合物可顯著地改善病人之生命品 質，係對醫師提供可用於設計更有效之抗病毒療程資訊。 同時，由於避免投予無效的藥物，可省去大量時間及金錢。 縮寫 ’’ΝΕΙΓ是核苷反轉錄酶抑制劑之縮窝。 ’’mmir是非核苷反轉錄酶抑制劑之縮窝。 ’’EX’是反轉錄酶之縮寫。 是’’聚合酶連鎖反應’’之縮寫。 針對20個遺傳上編碼之L-胺基酸，此中常用之胺基酸表 示法是傳統的且如下： 胺基酸 單字母縮寫 三字母縮寫 丙胺酸 A Ala 精胺酸 R Arg 天冬醯胺 N Asn 86537 -12- 200413721 天冬胺酸 半胱胺酸 穀胺醯胺 榖胺酸 甘胺酸 組胺酸 異白胺酸 白胺睃 賴胺酸 甲硫胺酸 苯丙胺酸 脯胺酸 絲胺酸 蘇胺酸 色胺酸 酪胺酸 纈胺酸 除非另有所示，當多肽序列 ㊈窝呈現時，序列以c方向 D Asp C Cys Q Gin E Glu G Gly Η His I lie L Leu Κ Lys Μ Met F Phe P Pro S Ser T Thr W Trp Y Tyr V Val 以一系列單字母及/或三 示出，此依一般實務。 字母 在序列中之個別胺基酸此中以觸代表，其中A是序列中 胺基酸之標準單字母符號且N是序列中之位置。突變在此以 表示’其中Al是在參考蛋白質序列中胺基酸標準的單 字母符號，八2是已突變蛋白質序列中胺基酸標準的單字母 符號且N是在胺基酸序列中之位置。例如，G25M突變代表 86537 -13- 200413721 在胺基酸25上由甘胺酸變化成甲硫胺酸。突變在此也可以 NA2表，其中N是胺基酸序列中之位置且a】是在已突變蛋 白質序列中胺基酸之標準單字母符號（如25M，為野生型胺 基酸變化至在胺基酸25上之甲硫胺酸）。另外，突變在此也 可以AW表示，其中、是在參考蛋白質序列中胺基酸之標準 單字母符號且N是胺基酸序列中之位置（如G25代表在胺基 酸25位置上由甘胺酸變化成任一胺基酸此表示法在當所 突變之蛋白質序列或未知或若已突變蛋白質序列中之胺基 酸可為任何胺基酸，除了在參考蛋白質序列所見之外，常 使用。胺基酸位置依蛋白質全長序列為準編號，由該區強 碉突變之衍生處。DNA序列中核甞酸及點突變之表示是類 似的。 為指出核酸而在全文中使用之縮窝，包括特異的核鹼基 序列，是傳統的單字母縮窝。因此，當包括在核酸中，自 然生成之編碼核驗基縮窝如下：腺嗓呤（A)，鳥嗓呤（G)， 胞嘧啶（C)，胸腺嘧啶（T)及尿嘧啶（u)。除非另有所示，以 一系列單字母鐺寫表示之單一標準化核酸序列及雙股序列 之上方股，均以5，—3,方向示出。 如此中所用，以下術語有以下定義： 除非另有所示’ "t.要的突變”指可影響酵素活性位置之 突變，即涉及於酵素-受質複合物中之胺基酸位置，或當病 毒接受抗病毒劑之選擇性壓力時，可在複製先期中重複出 現’或在對抗病毒劑之表型易感性上有大的作用者。 86537 •14- 200413721 、指非主要突變之突變，且其構成較為減低 之易感性，或可彌補由主要突變加諸之整體缺失。 是偵測病毒（如HIV)對特異抗病毒劑之敏 感性之試驗。 是偵測有機體，部份有機體，基因或部 份基因 < 遺傳序列之試驗。此分析經常在HIV中進行，以確 疋某些哭變是否與出現之抗藥性有關。 如此中所用的，’^^資料”為關於如病毒基因型之資 料基因型資料之實例包括病毒，部份病毒，病毒基因， 邵份病毒基因之核甞酸或胺基酸序列，或在病毒核酸或蛋 白質中一個以上核苷酸或胺基酸殘基之本質。 指病毒對特殊藥物之反應。對某藥物有減低或 減少易感性之病毒，具有對藥物增加之抗性或減少之靈敏 性。病毒對某藥物有增加的或加強的易感性，具對藥物增 加之靈敏性或減少之抗性。 病毒對特定藥物之表型易感性是連續的，然而，特別有 用的是明定出陽極，以簡化特殊倍數…變化結果之說明。對 於已收集有充份臨床結果資料之藥物，也可如下地明定出 一個”臨床截止值，，。 床截止值’指抗性開始且敏感性終止之特殊點。其由 藥物易感性水平所定義，在此病人治療之可能性因特殊藥 物顯著增加而失敗。如臨床研究所偵測的，對不同的抗病 毒藥’其截止值是不同的。臨床截止值在臨床試驗上由抗 性及結果數據之評估而決定。藥物易感性（表型）在治療之初 86537 -15- 200413721 即偵測。治療反應在治療過程中於預定時間點上追蹤，如 在病毒負載上之變化。藥物易感性與治療反應互有關聯’ 且臨床截止值由與治療失敗有關之抗性水平所決定（整體 試驗結果之統計分析）。 ”1^’’指抑制濃度。其為病人血中之藥物濃度，或遏止可 致病微生物（如HI V)生殖達η%，於試管内所需要之藥物濃 度。因此，”指病毒抑制為無藥物下所觀察值50%時之 抗病毒藥濃度。’’病人IC5G’’指抑制病人體内病毒複製達50% 所需之藥物濃度，且’’參考用IC5G’f指可抑制參考或野生型病 毒複製達50%所需要之藥物濃度。類似地，”指其中90% 的病毒複製均可被抑制之抗病毒藥濃度。 π倍數變化”是病人病毒藥物易感性對藥物-敏感性參考病 毒之易感性之數字比較。為病人IC5G對藥物-敏感性參考IC50 之比例，即病人IC5G/參考IC5G=倍數變化（"FC")。1.0之倍數 變化表示病人病毒之藥物易感性和藥物-敏感性參考病毒 呈現相同的程度。少於1之倍數變化表示病人病毒之敏感性 更甚於藥物-敏感性參考病毒。大於1之倍數變化表TF病人 病毒易感性低於藥物-敏感性參考病毒。倍數變化等於或大 於臨床截止值，表示病人病毒對藥物反應可能性較低。倍 數變化小於臨床截去值，表示病人病毒對該藥物是敏感的。 若病毒具有如突變之特性時，病毒’’受損複製力有增加之 可能性”，此與受損的複製力互有關係。若病毒族群平均而 言具有受損複製力特性時，和缺乏此特性之另外類似病毒 族群比較下，病毒之特性與受損之複製力是互有關係的。 86537 •16- 200413721 因此，特性存在及受損複製力之間之相互關係勿需是絕對 的，而特性之先決條件對於受損複製力而言也非必要（即該 特性在受損複製力中扮演重要角色）或充份的（即特性單獨 存在即已充份）。 n庠列同質性％”在此可與’’同質性％"、π庠列同一性％’’及 丨，同一性％-，互換使用，並指當利用序列列線程式列成一線 時，二個以上肽序列間之胺基酸序列同一性水平。例如， 此中所用的80%同質性，和由明確算則所決定之80%序列同 一性表示同一事件，且因此在特定序列長度上，特定序列 之同質性有大於80%之序列同一性。序列同一性之水平實 例包括與特定序列有60，70，80，85，90，95，98%以上 之序列同一性，但不限於此。 可用於決定二序列間同一性之電腦程式實例有：BLAST 程式組，如 BLASTN，BLASTX 及 TBLASTX，BLASTP 及 TBLASTN，可公開取自 http’7/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 之 Internet。也見 Altschul et al. 1990, J· Mol. Biol. 215:403-10 (特別參見所發表之預設值，即參數w=4，t=17)及Altschul et al·，1997, Nucleic Acids Res·，25:3389-3402。序列搜尋通常 利用BLASTP程式進行，此當相較於在GenBank Protein Sequences及其他公開資料庫中之胺基酸序列，評估特定胺 基酸時。相對於GenBank Protein Sequences及其他公開資料 庫中之胺基酸序列，於搜尋其核酸序列在所有讀譯架構中 已被轉譯時以BLASTX程式為較佳。BLASTP及BLASTX運 轉時都採用11.0之開放空隙罰分（open gap penalty)及1·0之祐 86537 -17- 200413721 因此，特性存在及受損複製力之間之相互關係勿需是絕對 的，而特性之先決條件對於受損複製力而言也非必要（即該 特性在受損複製力中扮演重要角色）或充份的（即特性單獨 存在即已充份）。 ’’序列同質性％”在此可與"同質性％"、π序列同一性V’及 ，，同一性％π互換使用，並指當利用序列列線程式列成一線 時，二個以上肽序列間之胺基酸序列同一性水平。例如， 此中所用的80%同質性，和由明確算則所決定之80%序列同 一性表示同一事件，且因此在特定序列長度上，特定序列 之同質性有大於80%之序列同一性。序列同一性之水平實 例包括與特定序列有60，70，80，85，90，95，98%以上 之序列同一性，但不限於此。 可用於決定二序列間同一性之電腦程式實例有：blast 程式組，如 BLASTN，BLASTX 及 TBLASTX，BLASTP 及 TBLASTN，可公開取自 http’’//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 之Internet。也見 Altschul et al· 1990, J· Mol· Biol. 215:403-10 (特別參見所發表之預設值’即參數w=4 ’ t=17)及A11schul et al·，1997, Nucleic Acids Res·，25:3389-3402。序列搜尋通常 利用BLASTP程式進行，此當相較於在GenBank Protein Sequences及其他公開資料庫中之胺基酸序列，評估特定胺 基酸時。相對於GenBank Protein Sequences及其他公開資料 庫中之胺基酸序列，於搜尋其核酸序列在所有讀譯架構中 已被轉譯時以BLASTX程式為較佳。BLASTP及BLASTX運 轉時都採用11.0之開放空隙罰分（open gap penalty)及1·〇之拓 86537 -17- 200413721 展变隙罰分（extended gap penalty)及利用 BLOSUM-62 矩 陣。見 Altschul，et al·，1997。 為了決定’’同一性％”，二個以上序列間特定序列之較佳比 對較好採用如CLUSTAL-W程式進行，在Mac Vector 6.5版 本’並有預設參數下操作，包括10.0之開放空隙罰分，0.1 之拓展空隙罰分及BLOSUM 30相似性矩陣。

性胺基酸"指親水性胺某醢，其侧鏈在生理pH值下未 荷電，但有至少一键其中由二個原子共有之電子對為原子 之—緊密握持。遺傳上編碼之極性胺基酸包括Asn (N)，Gin (Q)，Ser (S)及Thr(T)。 "瘦極性胺基酸"指疏水性胺某醢，其側鍵在生理pH值下 未荷電，且所具有之鍵其中由二個原子共有之電子對通常 由一原子各自同寺地握持（即側键是非極性的）。遺傳上編碼 之無極性胺基酸包括 Ala (A)，Gly (G)，lie (I)，Leu (L)，

Met (M)及 Val (V)。 "親水性胺基酸’’指依據 Eisenberg et al·，1984, J· Mol· Biol· · 179:125-142之臂規化守恒疏水性分數，其疏水性少於零之 胺基酸。遺傳上編碼之親水性胺基酸包括Arg (R)，Asn (N)，

Asp (D)，Glu (E)，Gin (Q)，His (Η)，Lys (K)，Ser (S)及 Thr (T)。 n疏水性胺基酸”指依據在Eisenberg et al.，1984，J. Mol. Biol· 179:125-142之常規化守恒疏水性分數，其疏水性大於 零之胺基酸。遺傳上編碼之疏水性胺基酸包括Ala (A)，Gly (G)，lie (I)，Leu (L)，Met (Μ)，Phe (F)，Pro (P)，Trp (W)， 86537 -18 - 200413721

Tyr (Y)及 Val (V)。 ’’酸性胺基酸”指其侧鏈pK值少於7之親水性胺基酸。酸性 胺基酸由於氫離子喪失，因此在生理pH值下通常具負電荷 之侧鏈。遺傳上編碼之酸性胺基酸包括Asp (D)及Glu (E)。 ’’鹼性胺基酸"指側鏈pK值大於7之親水性胺基酸。酸性胺 基酸因加上水合氫離子通常在生理pH值下具正電荷側鏈。 遺傳上編碼之鹼性胺基酸包括Arg (R)，His (H)及Lys (K)。 ’’突變作用”是和參考核酸或蛋白質比較下，左胺某醢序叫$ 或在相當的核酸序列中之變化。本發明之具體實例包括HIV " 蛋白酶或反轉錄酶，其參考蛋白酶或反轉錄酶則分別是出現 在NL4-3 HIV中之蛋白酶或反轉錄酶（GenBank Accession No. AF324493)。雖然肽之胺基酸序列可由如Edman降解作用或 質譜分析直接決定，但通常肽之胺基酸序列係由編碼該肽 之核酸之核苷酸序列所參見。可使用技藝中已知之任何決 定核酸序列之方法，如Maxam-Gilbert定序法（Maxam et al.， 1980, Methods in Enzymology 65:499)，二去氧定序法（Sanger 籲 et al·，1977, Proc. Natl· Acad. Sci· USA 74:5463)或以雜交為 基礎之途徑（如見Maniatis et al·，1989，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY及 Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，NY) o "與抗性有關之突變TRAM”V’是病毒中與病毒對抗病毒 藥易感性減低有關之突變。RAM可見於許多病毒，但不限 於人類免疫缺失病毒（"HIV”）。此突變可見於一個以上之病 86537 -19- 200413721 毒蛋白質中，如在蛋白酶，整合酶，被膜或HIV之反轉錄酶。 RAM係相較於參考株而定義的。本發明具體實例中包括 HIV蛋白酶，參考蛋白酶是出現在NL4-3 HIV中之蛋白酶 (GenBank Accession No. AF324493) 〇 突變株π是其序列相較於參考者有一個以上變化之病 毒，基因或蛋白質。 •’脸；，’’多肽’’及’’蛋白質’’可在全文中互換使用。 ’’參考’’及’’野生型”可在全文中互換使用。 π聚核#酸"，’’篡核苷酸’’及’’核酸’’可在全文中互換使用。 與受損之複製能力有關之突變 本發明提出之核酸及多肽，在HI V反轉錄酶中與對NNRTI 抗性有關及與受損之複製力有關之突變。較好，HI V是人類 免疫缺失病毒1型Γ’Ηΐν-l")。NNRTI之實例包括：衛滋 (nevirapine ("NVP”））、德立維拉丁（delavirdine (’，DLVn))及希 寧（efavirenz (，’EFV，，)）。 在一方面，本發明提出之肽，多肽或蛋白質，在HIV反轉 錄酶中含有與# NNRTI抗性有關及與受損之複製力有關之 突變。本發明之多肽包括肽，多肽及蛋白質，其由這些多 肽所修飾或衍生。在一個具體實例中，多肽包括轉譯後處 理修飾。在另一具體實例中，多肽含一個以上胺基酸類似 物。 在一個具體實例中，本發明提出由HIV反轉錄酶衍生之多 肽，且在選自由 98，100，101，103，106，108，179，181， 188，190，225及236組成之胺基酸位置上含有突變。在一 86537 -20- 200413721 個較特別明確具體實例中，突變選自由A98G，L1001， K101E，K103N，V106A，V106I，V106M，Y181C，Y188A， Y188C，Y188H，Y188L，G190A，G190C，G190E，G190T， G190V，G190Q，G190S 及 G190V 組成之群中。 在另一具體實例中，本發明提出由HIV反轉錄酶衍生之多 肽，且在二個以上胺基酸位置含突變組合。此組合包括： P236L，K103N及 Y181C ; V106A及 Y181C ; K103N及 G190S ; P236L及K103N ; L100I，K103N及G190S ; P236L及Y181C ; · K103N及 G190A ; K103N及 Y188L ; K103N及 Y181C ; L100I 及K103N ; K103N，Y181C及225H ; Y181C及A98G，但不限 於此。 在另一方面，本發明提出聚核苷酸，寡核苷酸或核酸， 其所編碼或關於本發明之多肽或其生物活性部份，包括如 核酸分子相供充作雜交探針，PCR引子或定序引子使用， 以鑑定，分析，突變或擴大本發明之核酸。 核酸可有任何長度。核酸長度可為如，至少2, 3，4, 5， 春 6， 7， 8， 9， 10， 11， 12， 13， 14， 15， 16， 17， 18， 19， 20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32， 33，34，35，36，37，38，39，40，45，50，55，60，65， 70 ， 75 ， 80 ， 85 ， 90 ， 100 ， 110 ， 120 ， 125 ， 150 ， 175 ， 200 ， 250 ， 300 ， 350 ， 375 ， 400 ， 425 ， 450 ， 475或500個 核苷酸。核酸長度可少於如：3，4，5，6，7，8，9，10， η，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23， 24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36， 86537 -21 - 200413721 37，38，39，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85， 90，100，110，120，125，150，175，200，250，300，350， 375 ， 400 ， 425 ， 450 ， 475 ， 500 ， 525 ， 550 ， 575 ， 600 ， 650，700，750，800，850，900，950，1000，1100，1200， 1300，1400，1500，1600，1700，1800，1900，2000，2500， 3000，3500，4000，4500，5000，5500，6000，6500，7000， 7500，8000，8500，9000，9500或 10000個核站酸 ° 在一個 較佳具體實例中，核酸具有的長度及序列適於用於偵測此 中所述之突變，如充作探針或引子。 在另一個具體實例中，本發明提出適合於偵測本發明核 酸序列，充作引子或雜交探針使用之核酸分子。本發明之 核酸分子可僅含編碼本發明全長多肽之核酸序列一部份， 如編碼本發明多肽具生物活性部份之片段，或可充作探針 或引子之片段。探針上可含有一個與之黏附之經標記基 團，如放射性同位素，螢光化合物，酵素或酵素輔因子。 在各種具體實例中，本發明之核酸分子在鹼基部份，糖部 份或構酸骨架上被處理修飾。 發現與受損複製力有關之突變 在另一方面，本發明提出在病毒或其衍生物中發現與受 損複製力有關之突變之方法。 病病才袭品 依據本發明，與受損之複製力有關之突變，可存在於任 何病毒型式中，如動物中可見之任何病毒。在本發明一個 具體實例中，病毒包括已知可感染動物，如狗，_，馬， 86537 -22- 200413721 羊，牛等者。在一個較佳具體實例中，病毒已知可感染靈 長類。在一個甚至較佳具體實例中，病毒已知可感染人類。 人類病毒之實例包括：人類免疫缺失病毒（’’HIV”），單純疱 參病毒，巨細胞病毒，水痘-常狀癌參病毒，其他人類癌奢 病毒，A型流感病毒，呼吸道合胞病毒，A，B及C肝病毒， 鼻病毒及人類乳頭狀瘤病毒。在本發明一個較佳具體實例 中，病毒是HIV。較好，病毒是1型人類免疫缺失病毒 rmv-i”）。前述是某些病毒代表，其中存在有可運用之抗_ 病毒化療法，且代表反轉錄病毒科，疱疹病毒科，正黏病 毒科，副黏病毒科，微小核糖核酸病毒，莫病毒，肺病毒 屬及肝病毒科等病毒科。本發明可以其他病毒感染使用， 因在這些各科内之其他病毒以及在其他病毒科之病毒中生 成之病毒感染，其有或是無目前可供採用之治療。 依據本發明與受損的複製能力-有關之突變，可見於以技 藝中已知獲得病毒樣品之任何方法所得之病毒樣品。此方 法包括自感染有病毒之人類或動物中獲得病毒樣品，或自 _ 病毒培養中獲得病毒樣品，但不限於此。在一個具體實例 中’病毒樣品得自為病毒感染之人類個體。病毒樣品可得 自受感個體身體任一部份，或預期含有病毒之任何分泌 物。此部份之實例包括下列但不限於此：血液，血清，血 漿，痰，淋巴液，精液，陰道黏液及其他體液樣品。在一 個較佳具體實例中，樣品是血液，血液或血漿樣品。 在另一具體實例中，依據本發明與受損之複製力有關之 突變，存在於由培養中所得之病毒内。在某些實例中，培 86537 -23 - 200413721 養物可得自實驗室。在另外的具體實例中，培養物可得自 收集中心，如美國標準菌種收集中心。 在某些具體實例中，依據本發明與受損之複製力有關之 突變存在於病毒衍生物，在一個具體實例中，病毒衍生物 本身非致病性。在另一具體實例中，病毒衍生物是以質體 為基礎之系統，其中質體或為質體所轉感之細胞之複製可 受選擇性壓力之存在與否所影響，如此選出對選擇性壓力 抗性增加之突變。在某些具體實例中，病毒衍生物包括重 點之核酸或蛋白質，如可為抗-病毒療法對準目標之核酸或 蛋白質。在一個具體實例中，重點基因可納入載體内。如 見 U.S. Pat No. 5,837,464 及 6,242，187，及 PCT 案，WO 99/67427，其各自已列為本案參考。在較佳具體實例中，基 因可為指導合成蛋白酶或反轉錄酶者。 在另一具體實例中，勿需使用完整的病毒。反之，可使 用納入載體内之部份病毒。所使用之病毒部分可為抗-病毒 藥所對準目標。 在另一具體實例中，依據本發明與受損的複製能力有關 之突變係存在於遺傳上經修飾之病毒。病毒可利用技藝中 遺傳修飾病毒已知之任何方法遺傳修飾。例如，病毒可在 實驗培養中生長至欲求之世代數目。在一個具體實例中， 未施加選擇壓力（即，病毒未接受治療，而其係有益具特定 特性之病毒之複製），且新突變可經由任意的遺傳漂變累 積。在另一具體實例中，當病毒在培養中生長時，對其施 加選擇壓力（即病毒在有益具一個以上特性之病毒複製之 86537 -24- 200413721 狀況下生長）。在一個具體實例中，選擇性壓力是抗病毒治 療。任何已知之抗病毒治療均可充作選擇壓力使用。在一 個具體實例中，病毒是HI V，且選擇性壓力是NNRTI。在另 一具體實例中，病毒是HIV-1，且選擇性壓力是NNRTI。任 何NNRTI均可用來施加選擇壓力。NNRTI之實例包括NVP， DLV及EFV，但不限於此。在以NNRTI處理於試管内培養之 HIV時，吾等可選擇對NNRTI之抗性有所增加之HIV突變 株。選擇壓力之迫切度可予以操作，以增加或減少未具有 被選出特性之病毒之存活。 在另一方面，依據本發明之與受損的複製力有關之突變 係由突變病毒，病毒基因體或部份病毒基因體而製成。針 對此目的可使用技藝中已知之任何突變方法。在一個具體 實例中，突變形成基本上是任意的。在另一具體實例中， 基本上任意突變形成係將病毒，病毒基因體或部份病毒基 因體曝於突變處理下。在另一具體實例，將編碼抗-病毒療 法標的之病毒蛋白質之基因突變之。基本上任意突變治療 之實例包括如：曝於突變物質下（如溴化乙錠，乙基甲烷磺 酸鹽；乙基亞硝基脲（ENU)等），輻射（如紫外光），轉位子 元件之嵌入及/或移除（如Tn5，TnlO)，或在細胞，細胞萃取 物中複製，或於試管内複製系統，其有增加之突變形成速率 〇 見Russell et al.，1979，Proc. Nat· Acad. Sci. USA 76:5918_ 5922; Russell, W., 1982, Environmental Mutagens and

Carcinogens: Proceedings of the Third International

Conference on Environmental Mutagens。精藝者明白，雖然 86537 25- 200413721 這些突變方法各自基本上是任意的，但在分子層次’其各 自有其本身較佳之標的。 在另一方面，利用位置-指令之突變進行與受損之複製力 有關之突變。技藝中已知之任何位置-指令之突變形成方法

均可使用（如見 Maniatis et al.，1989，Molecular Cloning: A

Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY and Ausubel et al·，1989，Current Protocols in Molecular Biology，

Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，NY)。 位置指令之突變形成可針對，如特殊之基因或基因體區， 基因或基因體區之特殊邵份，或在基因或基因體區域内— 個或少有之特殊核苷酸。在一個具體實例中，位置指令之 突變形成是指向病毒基因體區，基因，基因片段或以_個 以上準則為基礎之核甞酸。在一個具體實例中，基因或基 因部份接受位置指令之突變形成，因為其編碼之蛋白質係 已知或類似抗_病毒治療之標的，如編碼HIV反轉錄酶之基 因。在另一具體實例中，選出部份基因，或基因内一或— 些核甞酸行位置-指令之突變作用。在一個具體實例中，欲 被突變之核苷酸編碼已知或疑似可與抗病毒化合物交互作 用之胺基酸殘基。在另一具體實例中，欲被突變之核替酸 編碼已知或疑似在有受損之複製力之病毒株中被突變之胺 基酸殘基。在另外之具體實例中，被突變之核嘗酸其所編 碼之胺基酸殘基在蛋白質一級序列中係鄰接或接近已知咬 疑似可與抗病毒化合物交互作用，或已知或疑似在具受損 之複製力之病毒株中被突變之殘基。在另一具體實例中， 86537 -26- 200413721 經突變之核甞酸其所編碼之胺基酸殘基，在蛋白質之二 級，三級或四級結構中鄰接或接近已知或疑似可與抗病毒 化合物交互作用，或已知或疑似在具受損之複製力之病毒 株中被突變之殘基。在另一具體實例中，經突變之核嘗酸 其編碼之胺基酸殘基在或接近蛋白質中已經或疑似可與抗 病毒化合物結合之活性位置。如見Sarkar and Sommer，1990, Biotechniques，8:404-407 〇 偵測病毒中突變之存在與否 依據本發明病毒中與受損之複製力有關之突變，其存在 與否可以技藝中偵測突變之任何已知方法測知。突變可在 編碼有特殊蛋白質之病毒基因中，或在蛋白質本身中被測 及，即在蛋白質之胺基酸序列中。 在一個具體實例中，突變是在病毒基因體中。此突變可 在如：編碼病毒蛋白質之基因，在編碼病毒蛋白質之基因 之順式或反式作用調控序列中，在基因間序列或插入子序 列。突變可影響病毒結構，功能，複製或環境任一方面， 其改變對抗病毒治療之易感性。在一個具體實例中，突變 是在編碼病毒蛋白質之基因中，且此蛋白質似抗病毒治療 之標的。 在病毒内之突變可利用各種技術測及。病毒DNA或RNA 可充作此分析技術之起點，且依據精藝者熟知的可被分離。 在特異核酸序列，如在病毒基因之特定區域，中偵測突 變可以各種方法完成，包括下列但不限於此：以對偶基因-特異之限制内切酶截切為基礎之限制片段長度多形性偵測 86537 -27- 200413721

(Kan and Dozy，1978，Lancet ii:910-912)，誤配-修補偵測 (Faham and Cox，1995，Genome Res 5:474-482)，MutS蛋白質 之結合（Wagner et al·，1995, Nucl Acids Res 23:3944-3948)， 變性-梯度凝膠電泳（Fisher et al·，1983, Proc. Natl· Acad· Sci. U.S.A. 80:1579-83)，單股構型-多形性偵測（Oritaetal·，1983, Genomics 5:874-879)，在誤配驗基對上之RNAase解離（Myers etal·，1985, Science 230:1242)，異形雙螺旋鏈DNA之化學性 (Cotton et al·，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:4397-4401)或酵素性（Youil et al.，1995，Proc. Natl. Acad· Sci. U.S.A. 92:87-91)解離，以寡核甞酸-特異之引子伸展為基礎 之方法（Syvanen et al·，1990，Genomics 8:684_692)，遺傳位 元分析法（Nikiforov et al·，1994，Nucl Acids Res 22:4167-417 5)，寡核嘗酸連結分析法（Landegren et al·，1988，Science 241:1077)，寡核苷酸-特異的連結連鎖反應（’’LCR’’）(Bairany， 1991，Proc· Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:189-193)，gap-LCR (Abravaya et al·，1995，Nucl Acids Res 23:675-682)，利用技 藝中已知之標準步騾行放射活性或螢光DNA定序及肽核酸 (PNA)分析法（Orum et al·，1993，Nucl. Acids Res 21:5332_ 5336; Thiede et al·，1996, Nucl. Acids. Res· 24:983-984) o 此外，病毒DNA或RNA可用於雜交或擴大分析中，以偵 測涉及基因結構之失常，包括點突變，嵌入，刪除及基因 體重排。此分析可包括下列，但不限於此：南方分析 (Southern，1975, J· Mol. Biol· 98:503-517)，單股構型多形性 分析（SSCP)(Orita et al·，1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86537 -28- 200413721 86:2766-2770)及 PCR 分析（U.S. Patent Nos. 4,683,202 ； 4,683，195 ; 4,800，159 ;及 4,965，188 ; PCR Strategies，1995 Innis et al. (eds·)，Academic Press，Inc·) o 用於偵測基因·特異的突變的此種診斷方法涉及如：接觸 及培育病毒核酸及一或多種經標記之核酸試劑，包括重組 體DNA分子，經選殖之基因或其簡併之變型，在有益於這 些試劑與其互補序列特異回冷之條件下。較好，這些核酸 試劑之長度至少15至30個核甞酸。培育後，所有未回冷的 核酸自核酸分子雜交體中移出。再摘測已雜交之核酸之存 在，此係若存在有任何此分子時而言。利用此偵測流程， 病毒之核酸可固化至固態載體上，如膜或塑質表面，如微滴 定盤或聚苯乙烯珠粒，在此例子中，於培育後，可容易地 移去上述未回冷且經標記核酸試劑。再利用精藝者熟知之 標準技術，對留下的已回冷且經標記之核酸試劑完成偵測 分析。核酸試劑已回冷之基因序列，其回冷型式可與正常 基因序列中所預期的比較，以決定該基因突變是否存在。 "ί貞測基因特異性核酸分子另外的診斷方法可涉及其擴大 作用，如PCR (U.S. Pat· Nos. 4,683,202; 4,683，195 ; 4,800,159 ;及 4,965，188 ; PCR Strategies，1995 Innis et al. (eds·)， Academic Press，Inc·)，利用精藝者熟知之技術再偵測已擴 大分子。所生成之經擴大序列，再與僅含正常套數個別基 因且經擴大之核酸所預期的比較，以決定基因突變是否存 在。 另外，核酸可以技藝中已知之任何定序方法定序。如， 86537 •29- 200413721 病毒DNA以Sanger et al.之二去氧方法定序（Sanger et al·， 1977，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463，進一步述於 Messing et al.，1981，Nuc. Acids Res. 9:309)或 Maxam et al. 之方法（Maxam et al·，1980，Methods in Enzymology 65:499)。也見 Maniatis et al·所述之技術，（Maniatis et al.， 1989，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory，NY and Ausubel et al·，1989，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates · and Wiley Interscience, NY) ° 直接拮抗病毒基因產物之抗體，即病毒蛋白質或病毒肽 片段，也可用來偵測病毒蛋白質中之突變。另外，重點之 病毒蛋白質或肽片段可以技藝中已知之任何定序方法定 序，以生成重點蛋白質之胺基酸序列。此方法之一實例是 Edman降解法，其可用來定序小的蛋白質或多肽。較大的蛋 白質可先以技藝中已知之化學或酵素試劑解離，如溴化 氰，經胺，胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶，再以Edman降解法定 鲁 序。 突#病毒表型易感性之偵測 技藝中已知之任何方法均可用於決定突變病毒或病毒族 群對抗病毒治療之表型易感性。如見U.S. Pat. Nos. 5,837,464及6,242，187，已全文列為本案參考。在某些具體 實例中，進行表型之分析，即病毒對特定抗病毒劑之易感 性與無突變之參考病毒易感性比較。此為藥物易感性之直 接且定量測度，且可以技藝中已知之任何方法進行，以決 86537 -30- 200413721 定出病毒對抗病毒劑之易感性。此方法之實例包括，在參 考病毒對照下決定ic5G值計之倍數變化。表型測試是測度於 藥物抑制劑存在下，特異病毒株於試管内生長之能力。當 抑制病毒活性需較多的藥物時，相對於抑制參考病毒所需 之藥量，表示病毒較不易感受特殊藥物。 在一個具體實例中，進行表型分析並用來估計出藥物對 病毒株之IC5〇或IC90值。分析結果可以各病毒株按IC5〇或IC90 計之倍數變化，相較於對藥物易感受之對照株或來自相同 · 病人之先前病毒株而表示。由於病毒直接曝於各應用之抗 病毒藥物下，結果可與治療反應直接連接。例如，若病人 病毒對特定藥物顯出抗性，則將藥物自病人之療程中避免 或省略，使醫師所設計之治療計劃可長時期有效。 在另一具體實例中，表型分析利用重組病毒分析法 (’’RVAs”）進行。RVAs使用之病毒儲品係由病毒載體及由病 人病毒擴大之病毒基因序列間行同質重組而生成。在某些 具體實例中，病毒載體是HIV載體且病毒基因序列是蛋白酶參 及/或反轉錄酶序列。 在一個較佳具體實例中，表型分析利用phenosensetm (ViroLogic Inc·，South San Francisco, CA)進行。見Petropoulos et al.，2000, Antimicrob. Agents Chemother· 44:920-928 ; U.S. Patent Nos. 5,837,464及6,242，187。PHENOSENSE™是一種 表型分析，其達到表型試驗之益處並克服先前分析之缺 點。由於分析已自動化，PHENOSENSE™在受控之條件下 通常可提供較高之生產量。所得之結果是一種分析，其可 86537 -31- 200413721 正確地明定出病人HIV分離物對目前所有可運用之抗反轉 錄病毒藥物之易感性概況，並可在取樣係約10至約15天 内，將結果直接傳遞給醫師。PHENOSENSE™是正確的， 且可在僅一輪病毒複製下獲得結果，由是省去病毒次族群 之選擇。結果是定量的，可測度不同程度之藥物易感性’ 且是靈敏的-即試驗可在病毒負載約500套/毫升之血樣中進 行，且在病毒族群總數濃度不到10%或以下偵測某些抗藥 性病毒少數族群。再者，結果是可再現的，且在所進行之 分析約95%中，依藥物而定，可變化不到約1.4-2.5倍。 PHENOSENSETM可用於經擴大之病毒基因序列中之核 酸。如上文所討論的，含病毒之樣品可為受病毒感染之人 類或動物樣品，或得自病毒細胞培養物之樣品。在一個具 體實例中，病毒樣品包括經遺傳修飾之實驗室株。 抗性試驗載體（"RTV")可利用技藝中將基因序列納入載 體之任何已知方法，由經擴大之病毒基因序列納入具複製 缺陷之病毒載體中構築而成。在一個具體實例中，使用限 制酶及傳統選殖方法。見Maniatis et al.，1989，Molecular

Cloning: A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor

Laboratory，NY and Ausubel et al·，1989，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，NY。在一個較佳具體實例中，使用Apal及PinAI 限制酶。較好，複製缺陷之病毒載體是指示用基因病毒載 體（nIGVV'f)。在一個較佳具體實例中，病毒載體含有可偵 測RTV複製之工具。較好病毒載體含有蟲螢光素酶表現匣。 86537 32· 200413721 分析之進行係先以RTV DNA及可表現另一反轉錄酶被膜 蛋白質之質體，如親兩性齧齒類白血病病毒（MLV)先轉感於 宿主細胞。於轉感後，病毒粒子可回收並用來感染新鮮的 標的細胞。病毒複製單一輪之完成，可由含於載體内之複 製偵測工具測及。在一個較佳具體實例中，單一輪病毒複 製之完成可造成蟲螢光素酶之產製。可在轉感步驟或感染 步驟時加入連續濃度之抗病毒劑。 對抗病毒劑之易感性可由比較抗病毒劑存在及不存在時 g 之載體複製而知，例如，對抗病毒劑之易感性可由抗病毒 劑存在及不存在下，蟲螢光素活性之比較而知。在抗病毒 劑存在下，易感之病毒可產生低水平之蟲螢光素酶活性， 而低易感性病毒產生較高水平之蟲螢光素酶活性。 在較佳具體實例中，使用PHENOSENSE™評估HIV-1對抗 -病毒藥之表型易感性。較好，抗病毒藥是NNRTI。在較佳 具體實例中，參考病毒株是HIV NL4-3或HXB-2株。 在一個具體實例中，自血漿樣品中萃取出病毒核酸，如 _ HIV-1 RNA，且其片段或整個病毒基因再利用如PCR之方法 擴大之，但不限於此方法，如見Hertogs et al.，1998， Antimicrob Agents Chemother 42(2):269-76。在一個實例中， 一段2.2-kb含有完整HIV-1 PR-及RT-編碼序列之片段，利用 有巢式反轉錄作用-PCR擴大。經擴大的核酸匯集物，如 PR-RT-編碼序列，再與其中大多數PR (密碼子10至99)及RT (密碼子1至482)序列已刪去之pGEMT3SPRT質體共轉感至 宿主細胞，如CD4+ T淋巴細胞（MT4)。同質重組作用可產生 86537 -33- 200413721 含有病毒編碼序列之嵌合病毒，如由血漿中HIV-l RNA所 衍生之PR-及RT·編碼序列。嵌合病毒對於目前對準轉感基 因產物之所有可運用之抗病毒劑之易感性（此轉感基因產 物如proRT及/或PR抑制劑）可利用技藝中已知之任何細胞 存活力分析予以決定。例如，可在有高的樣品產量下，於 自動化系統中使用以MT4細胞-3-(4,5-二曱基嘧唑-2-基）-2，5 -二苯基四鋰化溴-為基礎之細胞存活力分析法。對所有 抗病毒劑抗性之概況，如RT及PR抑制劑，可在單一PR-RT-抗病毒圖中圖TF。 可使用精藝者已知之評估病毒對抗病毒藥表型易感性之 其他分析法。如見，Shi and Mellors，1997, Antimicrob Agents Chemother. 41(12):2781-85; Gervaix et al.? 1997, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 94(9):4653_8; Race et al.，1999，AIDS 13:2061-2068，已全文列為本案參考。 在另一具體實例中，病毒對抗病毒治療之易感性，可由 在抗病毒治療存在下，其標的活性之分析而決定。在一個 具體實例中，病毒是HIV，抗-病毒治療是蛋白酶抑制劑， 且抗病毒治療之標的是HIV蛋白酶。如見U.S. Pat. Nos. 5,436，131，6，103,462，已全文列為本案參考。 突變與受損之複製能力之相互關係 技藝中已知之任何方法均可用來決定突變作用是否與受 損之複製力互有關係。在一個具體實例中，以P值來決定相 互關係之統計意義，如此P值愈小，測定愈有意義。較好P 值小於0.05。又較好P值小於0.01。P值可以精藝者已知之任 86537 -34- 200413721 何方法計算。在一個具體實例中，P值可利用Fisher’s Exact Test估算，如見 David Freedman，Robert Pisani & Roger Purves， 1980, Statistics，W. W. Norton，New York 〇 偵測受損之複製力 在另一具體實例中，本發明提出偵測病毒中受損之複製力 之方法。可利用上述任何適合方法鑑定與受損之複製力有關 之突變。病毒中與受損複製力有關之突變，其存在可以技藝 中已知之任何方法摘測，如上述。病毒中存在有與受損之複 · 製力有關之突變，顯示病毒有受損複製力之可能性增加。在 一個具體實例中，病毒是人類免疫缺失病毒（HIV)。在另一 具體實例中，病毒是人類免疫缺失病毒1型（HIV-1)，在另一 具體實例中，抗病毒治療是NNRTTI。 在另一具體實例中，本發明提出決定HIV是否有受損複製 力增加之可能性之方法，此方法包括偵該HIV之RT中是否 存在有與受損複製力有關之突變，係在該RT胺基酸序列之 第98 ， 100 ， 101 ， 103 ， 106 ， 108 ， 179 ， 181 ， 188 ， 190 ， φ 225或236位置上，其中突變之存在顯示HIV有受損之複製力 增加之可能性。在另一具體實例中，突變並非P236L。 在另一具體實例中，本發明提出測定HIV是否有受損的複 製力可能性增加之方法，此方法包括偵測HIV之RT中，與受 損複製力有關之突變存在與否，突變選自下列包括A98G ’ L100I，K101E，K103N，V106A，V106I，V106M，Y181C， Y188A，Y188C，Y188H，Y188L，G190A，G190C，G190E ’ G190T，G190V，G190Q，G190S及G190V，其中該突變之存 86537 -35- 200413721 在表示HIV具有受損複製力增加之可能性。 在另一具體實例中，本發明提出決定來自個體之HI V是否 有複製力受損增加之可能性之方法，此方法包括偵測該HIV 之RT中是否存在有與受損複製力有關之突變，係在該RT胺 基酸序列之第 98、100、101、103、106、108、179、181、 188、190、22 5或23 6位置上，其中突變之後在顯示HIV之複 製力受損有增加之可能性。在另一具體實例中，突變並非 P236L 〇 在另一具體實例中，本發明提出測定來自個體之HI V是否 有複製力受損增加之可能性之方法，此方法包括偵測該HI V RT中是否有與受損複製力有關之突變存在，突變選自下列 包括 A98G、L100I、K101E、K103N、V106A、V106I、V106M、 Y181C、Y188A、Y188C、Y188H、Y188L、G190A、G190C、 G190E、G190T、G190V、G190Q、G190S及G190V，其中該 突變之存在顯示HIV有複製力受損增加之可能性。 實例 實例1 :利用抗阻試驗載體偵測複製通性 此實例提出可正確且再現比偵測HIV-1複製適當性之方法 及組合物。偵測複製適當性之方法適用於其它病毒，包括肝 DNA病毒（如人類B肝病毒），黃病毒（如人類C肝病毒）及癌療 病毒（如人類巨細胞病毒）。此實例進一步提出偵測HIV-1複製 適當性之方法，其對反轉錄酶抑制劑及蛋白酶抑制劑呈現減 少之藥物易感性。偵測複製適當性之方法適用於HIV-1複製 其他抑制劑類型，包括整合，病毒組裝及病毒黏附及進入。 86537 -36- 200413721 複製適當性試驗可利用US Pat· No· 5,837,464 (國際專利 案No. WO 97/27319)所述之表型藥物易感性及抗阻試驗來 進行，其已以全文列為本案參考。 相當於HIV蛋白酶及反轉錄酶編碼區之病人-衍生之片 段，或是由存在於HIV-感染個體血清中病毒粒子所分離之 病毒RNA經反轉錄·聚合酶連鎖反應方法（RT-PCR)擴大之 病人-衍生片段，或是由抗性試驗載體DNA之親代純系經位 置-指令之突變作用所製成之野生型HIV-1突變株。抗性試 驗載體，當用來評估複製適當性時也稱為’’適當性試驗載體” 。病毒RNA利用標準步騾分離（如RNAGENTStm Total RNA Isolation System，Promega，Madison WI or RNAzol，Tel-Test， Friendswood, TX)。RT-PCR策略分成二個步驟。反轉錄病毒 之反轉錄酶（如Moloney MuLV反轉錄酶（Roche Molecular Systems，Inc·，Branchburg，NJ)或禽成髓細胞性白血病病毒 (AMV)反轉錄酶，（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)) 用於將病毒RNA拷貝成cDNA。cDNA再利用對熱穩定之 DNA聚合酶擴大（如 Taq (Roche Molecular Systems，Inc·， Branchburg，NJ)，Tth (Roche Molecular Systems，Inc.， Branchburg，NJ)，PRIMEZYME™ (分離自 Thermus brockianus， Biometra，Gottingen，Germany))或熱穩定性聚合酶之組合， 如在”長PCR”進行中所述（Barnes，W.M·，1994，Proc. Natl· Acad· Sci·，USA 91，2216-20)(如 Expand High Fidelity PCR System (Taq + Pwo)5 (Boehringer Mannheim. Indianapolis, IN) 或 GENEAMP XLTM PCR套組（Tth + Vent)，（Roche Molecular 86537 -37- 200413721

Systems，Inc.，Branchburg, NJ)) 〇 PCR引子經設計可將Apal及Agel確認位置引入PCR產物 分別的二端。 納有”受試’’病人-衍生片段之適當性試驗載體，如U.S. Pat-No. 5,837,464 (見圖 1)所述 般構築 ，其 中以由RT-PCR製備之 I·5 kB經擴大DNA產物，以病毒RNA為模板，及寡核嘗酸 PCR6 (#1)，PDSApa (#2)及PDSAge (#3)為引子，繼之以 Apai 及Agel或同切口限制内切酶PinAl水解。為了確保相當於所 生成之適當測試載體之質體DNA含有在給定病人血^中且 代表性之HI V病毒類似種樣品’於是將在構築特定適#丨生試 驗載體中所得的許多（>1〇〇)獨立E. C〇li轉形子 眠采·在起， 以用於製備質體DNA。 編碼親兩性MuLV 4070A env基因 產物之組裝表現载體 可在適當性試驗載體宿主細胞中’產製可有效感染人續才巧 的細胞之適當性載體病毒粒子。除了 env以外，絶挪&丄 A外’編碼所有 基因之適當性試驗載體，可用來轉感組裝宿主細胞曰、 轉感，其宿主細胞即稱為適當性試驗载體為ά & 1自土、、田胞）。編碼 親兩性MuLV 4070A env基因產物之組裝表現載骨# . 性試驗載體一起在適當性試驗載體宿主細胎+ 、、肥甲屋製出具感 染性之假性適當性試驗載體病毒粒子。 適當性試驗以適當性試驗載體進行，Α 4，丨m z ，、甲利用組裝宿主 及由人類胚腎細胞株2 9 3組成之標的宿主細胞。 適當性試驗以利用二種宿主細胞型式之適當性試驗載體 來進行。適當性試驗載體病毒粒子由第—稀pa ^ 吊種佰王細胞產製 86537 -38 - 200413721 (適當性試驗載體宿主細胞），其由適當性試驗載體及組裝表 現載體轉感於組裝宿主細胞而製備。適當性試驗載體病毒 粒子再用於感染第二宿主細胞（標的宿主細胞），其中並偵測 指示基因之表現（見圖1)。 構築含有具功能之蟲螢光素酶基因匣之適當性試驗載 體’再以適當性試驗載體DNA轉感宿主細胞。適當性試驗 載體含有由病人-衍生之反轉錄酶及蛋白酶DNA序列，其編 碼的蛋白質或易感於或可抗阻抗反轉錄病毒藥，如核菩反 轉錄酶抑制劑，非核甞反轉錄酶抑制劑及蛋白酶抑制劑。 在被感染細胞中所測及之蟲勞光素酶活性含量，可作為 ”感染力”，”複製力”或”複製適當性”之直接測定，即病毒可 完成單一輪複製之能力。相對適當性評估是將由病人衍生 病毒所產生之蟲螢光素酶活性含量，與由HiV-1分子純系， 如NL4-3或HXB2衍生之已明確之參考病毒（野生型）所產生 之蟲螢光素酶活性含量比較而言。以佔參考株之百分率表 示出適當性測量值，如參考株之25%，50%，75%，100%或 125% (圖 2，3，5，6及7)。 宿主細胞種於10公分直徑之皿内，並在塗佈一天後以適 當性試驗載體質體DNA及被膜表現載體轉感，轉感作用利 用磷酸鈣共沈澱步騾完成。含有DNA沈澱物之細胞培養基 於轉感作用後，1至24小時更換新的培養基。於轉感之後i 至4天’回收含有適當性試驗載體病毒粒子之細胞培養基， 於-80°C下儲存前先通過0.45-毫米濾膜。以EIa方法，如廠 商指示般（SIAC ; Frederick，MD)決定在已回收之細胞培養 86537 -39- 200413721 基中HIV核殼蛋白質（p24)水平。在感染前，標的細胞（293 及293/T)塗伟在細胞培養基上。對照組感染是以空白轉感 (無DNA)之細胞培養基，或利用無被膜表現質體之適當性 試驗載體質體DNA所轉感之培養基來進行。於感染1至3天 以上才移出培養基，並在各孔洞中加入細胞溶解緩衝溶液 (Promega)。分析溶胞產物中之蟲螢光素酶活性。另外，細 胞溶解，而蟲螢光素酶之測定可在勿需吸取出各孔洞培養 基下，直接加入Steady-Glo (Promega)試劑而進行。 實例2 :偵測有RT活性缺陷病毒之複製適當性 此實例中提出鑑定可改變複製適當性之反轉錄酶突變之 方法及組合物。鑑定可改變複製適當性之方法，可適用於 HIV-1複製之其他組份，包括整合，病毒組裝及病毒黏附及 進入，但不限於此。此實例也提出，特異突變反轉錄酶在複 製適當性上影響力之定量方法。定量特異突變反轉錄酶在複 製適當性上影響力之工具及方法，可適用於HIV-1複製中所 涉及之其他病毒基因之突變，包括gag，pol及被膜基因，但 不限於此。 適當性試驗載體依實例1所述地構築。衍自病人樣品之適 當性試驗載體或衍自適當性試驗載體匯集物之純系，或經位 置指令之突變而含有特異突變之經遺傳操作之適當性試驗 載體，均在適當性分析中測試以正確且定量地決定相較於明 確之參考標準品之相對適當性。進一步檢查病人樣品中，與 所觀察之相對適當性互有關係之反轉錄酶活性增加或減少。 病人HI V樣品之反轉錄酶活性:反轉錄酶活性可以任何廣 86537 -40- 200413721 泛使用之分析步騾測定，包括下列但不限於此：同聚合延伸 用法（如寡dT :聚rC)，或以分子信號燈或5’核酸外切酶活性 為基礎之即時聚PCR (Lie and Petropoulos, 1996)。在本發明 一個具體實例中，將病人病毒之適合性與參考病毒作比 較，以決定出相對適當性，再與未曝於反轉錄酶抑制劑藥 物之”野生型”病毒比較。在另一具體實例中，病人病毒之 適當性與相同病人不同時間點收集之病毒比較，如在開始 治療前，改變藥物治療之前或後，或在疾病過程之病毒學 (RNA套數），免疫學（CD4 T_細胞）或臨床（機會感染）變化之 前或後。 病人HIV樣品之基因型分析：適當性試驗載體DNAs，或 是匯集物或純系，均可以如上述之任何基因定型方法分 析。在本發明一個具體實例中，病人HIV樣品序列利用病毒 RNA純化，RT/PCR及ABI連續終結子自動化定序決定。所 決定之序列再與存在於資料庫之參考序列比較，或與病人 在治療前可得到之樣品（若可行的話）比較。針對與參考或治 _ 療前序列有異者再檢查其基因型，並與所觀察到之適當性 互成關係。 位置指令之突變株之適當性分析：經觀察與適當性變化 互成關係之基因型變化，可由適當性載體之構築中評估， 此載體在明確之野生型（對藥物易感染）遺傳背景下含有特 異的突變。突變可單獨及/或組合以其他突變而引入，其被 視為可調控病毒之適當性。突變經由廣泛已知之位置指令 突變方法任一者引入適當性試驗載體内。在本發明一個具 86537 -41 - 200413721 體實例中，使用用於位置指令突變之百萬-引子PCR方法。 含有特異突變或突變群之適當性試驗載體，再利用實例1所 述之適當性分析測試，且適當性再與無特異突變之遺傳明 確野生型（藥物易感受的）適當性試驗受體比較。在適當性中 所觀察到之變化，可歸因於引入抗性試驗載體内之特異突 變。 在本發明許多相關具體實例中，構築適當性試驗載體， 其在反轉錄酶中含有位置指令之突變，造成在位置98 (A98G)，100 (L100I)，101 (K101E)，103 (K103N)，106 (V106A，V106I，V106M)，181 (Y181C，Y188A，Y188C， Y188H，Y188L)或 190 (G190A，G190S，G190C，G190E， G190V，G190T，G190Q)上之胺基酸置換，因而展現不同量 之反轉錄酶活性，再針對適當性測試之（圖2，3，4，5，6， 7及8)。適當性結果發展出特異反轉錄酶胺基酸置換及適當 性間之相互關係。數據證明，在相同位置之不同突變，對 於複製力有顯著不同的影響。圖3示出V106I及V106M與 V106A比較下，前二者有相當高之複製力。在位置190上不 同突變間所觀察到之差異特別醒目，由幾乎無法測及到大 於野生型80%以上之範圍。這些複製力上之差異，於突變 病毒株於NNRTIs存在下複製時也可表現出來，如圖8所示。 圖4明示如上述進行之複製力測定，所得的結果和利用複 製競爭分析結果一致。 也構築含有多重突變1之病毒，並如圖2所述地試驗。圖7 示出單突變株及含有單突變組合之雙突變株複製力比較， 86537 -42- 200413721 且示出具突變組合之病毒株，其複製力差於具任一單獨突 變之病毒株。 也構築含有第190位置突變及L74V突變之突變株’如圖5 所示。雖然L74V突變不會影響在190位置上是野生型之病 毒株之複製力。但其確可增加大多數其他第19〇位置突變者 之複製力。 會例3 :分柝病人樣品以鑑定與抗性有關之突變 此實例說明分析病人樣品以鑑定與NNRTI抗性有關之突 變之方法。也說明K101P，K103R及V179D以及K103R及 V179D之組合為新的NNRTI•抗性突變。 為了決定HIV-1株反轉錄酶（RT)序列及其對NNRTIs易感 性間之相互關係，對一組18,〇34個樣品進行基因型及表現型 分析。經由單一變化及組合相互關係分析，鑑定在無明確 NNRTI突變下具NNRTI抗性之樣品。有8,673個樣品在第 100，181，188，190或227位置上無突變，在RT中也無下列 任一突變：A98G，K101E，K103N/S，V106A/M，P225H， M230L或P236L，但對一種或以上的NNRTIs仍有易感性高度 之減低情形。在8,673個樣品中，有146個樣品在對至少一種 NNRTI易感性上可呈現出5倍以上之減低情形。 鑑定RT上所有的胺基酸位置，其中至少二個樣品在單一 混合型式中有一種突變（即無突變及野生型之混合）。所鑑定 之胺基酸位置及殘基為： P4，E6，K20，T27，V35，T39，M41，K43，E44，S48， K49，150，V60，A62，K64，D67，S68，T69，K70，L74， 86537 -43 - 200413721 V75，F77，R83，D86，V90，194，A98，K101，Q102，K103， K104，V106，V108，Y115，F116，V118，D121，K122， D123，1135，E138，T139，1142，Q151，A158，C162，T165， K166，1167，E169，K173，Q174，P176，D177，1178，V179， M184，V189，E194，G196，Q197，T200，1202，E203，Q207， H208，L210，R211，F214，T215，D218，K219，H221，L228， D237，K238，P243，V245，E248，D250，1257，A272，K275， V276，R277，Q278，K281，L283，R284，T286，A288，E29卜 V292，V293，P294及E297。 再決定於上述各位置之胺基酸，並對於存在於一種以上 樣品中之任何胺基酸予以分別分析，利用Statview軟體（SAS Institute，Cary，NC，USA)進行相互關係分析，以決定與各 NNRTI連續倍數變化（FC)或與二分法之倍數變化（FC>10)互 有關係之胺基酸突變。

在146個分析樣品中，最抗阻NNRTIs之樣品數據（即衛滋 (NVP)，德立維拉丁（DLV)及希寧（EFV)之RT突變，FC)，示 於表1。觀察NVP，DLV及EFV之最大FC值分別是>400_， >250-及>144-倍。如圖9及10及表1所說明的，具最高FC之 樣品，在第101位置上含有一個脯胺酸置換（n=l〇，NVP， DLV及EFV倍數變化中值分別為355-，26-及26-倍），或103R 及179D之組合（n=13，NVP，DLV及EFV倍數變化中值分別 為12-，24_及17-倍），101P所有樣品中，以及除了 2個外所 有的103R/179D樣品，也有與核甞RT抑制劑（NRTI)抗性有關 之突變。在無101P或103R/179D之樣品中，NVP，DLV及EFV 86537 -44- 200413721 之最大FC分別是41-，67-及15-倍。與所有三種NNRTIs易感 性減低有關之突變（和101P，103R/179D或NRTI-相關之突變 無關）包括 101Q，1061，135T，166R，179D，1891，245T， 272S及297T。在某些樣品中，與減低之抗性或增加之敏感 性有令人驚謗之相互關係，及對NNRTIs可能的高易感性， 也可見於第245及138位置。 分析無NNRTI抗性之樣品可證實，K101P，K103R/V179D 及其他被鑑知為NNRTI-抗性突變，與對NNRTIs易感性減低 間之相互關係。共分析526個無NNRTI抗性之樣品。這些樣 品之NNRTI倍數變化均介於1及2之間，顯示無NNRTI抗性。 526個樣品之基因型分析示出，被鑑知為NNRTI-抗性突變之 突變中無一者存在於任一樣品中，證實NNRTI-抗性突變確 實與對NNRTIs易感性減低有關。 此中所示之所有參考’均以全文列為本案參考。 此中示出之實例，確實及預言性的，僅為本發明之具體 實例，且不欲以任何方式限制本發明。 86537 •45 - 200413721 Q102K, Κ103ΚΛΕΙ, V108I, D123E, C162S, K173K>TE, D177D/E, V179V/D, Q207E, R211K, E248V, | A272P, R277R/K, V292I 1 p h% S ! 2 ί K 丨w 1 o ：S CO ·—· s < p k s < j rfsi I So ii 1 δ w 0 1 1 0 1 1 § 1 1 K64K/R, Q102K, K103IMI, V118I, K122A, D123E, C162S, E169D, V179D, T200A, F214L, V254V/I, A272P, R277K, T286A, A288A/S, V293I g£ δ| <«/0 IgS δ I §2 W I S < 1 k — ：o VO 8 •r u» ^ ti 5g dS ssg 口 u> Η 9 S W Η a r c 1 s — £ < O <J gb； |i§ k| -<> II P K： & G户 s K13K/N, M41L, K43Q, E44D, D67N, L74V, I94L, K101P, Q102K, V118I, K122E, D123E, I135T, N137N/S, C162S, M184V, T200A, E203K, Q207E, L210W, T215Y, D218E, K219N, K223Q, L228H, Q242H, R277K, T286T/A ^1 u» v〇 < H i==»S tdP is Is O 52 .H H-4 o S η S if — r S 0 is b 1 o os s s < d ：< δ < § § Uj 5 K.64K/N, D67N, T69T/N, K70R, K101P, C162S, I178M, R211K, K219Q, H221Y, K238T, V245E, R277K §1 00 *— IS Ii Ij OO 二 a- l| sc CG < K20R, M41L, K43E, E44D, D67N, L74I, A98S, K101P, Q102K, VI181, D123E, C162S, D177E, Ι178ΙΛ., M184V, G196G/E, E203E/K, Q207E, H208Y, R211K, T215Y, D218E, K219Q, L228H, V245E, R277K, T286A, E297K fcS 1 W sS 00 · 另s 00 s 1 ο VO S δ >—a P s 1— 户 B a 1 I _ 1 fc 圖 Η m ύ _ I 11.3 11.6 14.6 19.1 65.7 400.0 400.0 172.9 196.8 311.5 400.0 400.0 400.0 400.0 1 i 議 15.6 22.6 26.4 33.2 64.4 250.0 250.0 35.4 29.6 48.5 250.0 19.6 23.4 121.1 § 1 1 1 11.6 i 10,9 19.4 18.0 42.5 142.5 67.3 22.0 29.3 40Λ | 144.6 700.0 20.6 70.3 i β斜阼兮丨俞^NRTIFC^^lo 炒藓和-iHRTiIS^^ 珈鉍诨嫜鶴i炒NNRTH♦嫜m-xb 86537 46- 200413721 1 〇 S 产 ο δ α 1 Ό — 一 1 1 s b J-i δ :5 s HH K20R, K49R, D67N, T69N, K70K/R, K101H, Q102K, D123E, I135T, C162S, D177E, M184V, V189V/U195I/V，G196E· E203K* K219Q,肪瓜謂1艮 L283I, V293L 咖7^ L303L/R 75 δ HH 月 Π S CO 1 2 p b S W δ l«* F g ΛΛ 5 v〇 ΠΡ < p Ss u» 声 0 1 k — 1 d 1 51 s ! 2 ! S § § K20R, K32K/R, M41L, K43K/E, D67D/G, S68S/G, L74I, V75V/A, Q102K, K103R, VI18VA, Ϊ135Μ, C162S, Κ166ΚΛΓ, 11781^1, V179D, M184V, V189I, T200A, m〇SWY9 L210W, R21 IK, T215Y, R277K, R284K, T286A, V293I ϊί 巧 ί° Ε feS .Η ^ i矣 <α §§ .Η η S < 一 丨护 ! 3 ! Σ b — 3 m 00 > δ 貝 5 安 ο i ο S VI § δ s 1—J V60I, Q102K, I135T, I142V, C162S, T165L, M184V, T200A, Q207E, R21 IK, A272S, L283I, T286A, E297K II 翡 II ^ N-4 s户 I D a 0 1 < — k — s < gi is II p> •So 2S N>* Ln S n S CO H S r w os § H-l 2 S — 1 2 ^ K> U\ K gl p Sp SQ 2其 Ό ^ wr -j s 25 S <2 si δ w K20R, M41L, K43E, E44A, D67S, T69SCT, L74V, R83K, A98S, K101P, Q102K, VI181, K122E, D123E, I135T, C162D/G, K166R, D177D/N, I178M, V179V/I, G196E, T200A, L210W, R21 IK, Γ215Υ, V245E, A272P, R277K, K281K/R, V293I, E297K III sl| 喊; i|| ti |gg 11 P _ IP la 〇 S yx 'h 5 HHI 00 r < 1 Q S S 1 δ 二 X/l s β Νϊ i s U1 55 p 1< as κί ^ II gs >〇 II OO S s pmA s < b 0 1 β 1 o 〇 00 00 II si ^ r· H 1 2 a — .H n S CO b 1 δ CO 3 -W CO § [S3 »-* u» a\ H Is ts §ss ε s P ϋ — ΰ .w o S w b ! 1 C S :g M < R o > 3S 户π δ δ SS |Ι §2 §§ 〆《/! w * ^ Ο δ C0 W 1 u> 户 Ο < 1 i 2 :1 B s 鼸 _ 醒 1 _ 1 1 I Η Μ Μ 圍 Μ 圏 _ 1 m I Κ-» ►-» bs N> Ο 一 N> δ I 1 v〇 v〇 Lh 一 lo I i — bo b\ u> i 1 fO U) •u i Os Ih S k> b H·* o b Η·» Ο ι^> 1 ^ν, 轉 • ί*:· & ;,:：Γ* >-t. ^<1 議 s fei 診二1 _i tei tm mm ON 2 •一 K \〇 KJ s〇 to K) H-* 丨私 1 N〇 u> t vo — 〇> ΐ» bo lh N> •私 On 4w! b η-* 〇 一 bo po p ! 〇〇 j 1 b 丨 1 Lh Ia -J bo ! »—» 00 g 一 — 口 1 1 — •私 JO b I 1 讕 86537 47- 200413721 86537 48- 200413721 【圖式簡單說明】 圖1示出複製能力分析法之圖解表示。 圖2示出综合存在有突變及突變對及複製力之間相互關 係之列線圖。 圖3示出综合重組病毒複製力之列線圖，其在反轉錄酶中 相同位置上含有不同的胺基酸置換。 圖4示出利用複製力分析法所得之複製力測度與利用複 製競爭分析法所得之測度一致之曲線圖。 圖5示出證明L74V可部份恢復含有G190突變之重組病毒 受損之複製力之列線圖。 圖6示出由病人衍生之病毒之複製力，此病毒含有有害的 G19 0突變。 圖7示出K103N及其他NNRTI突變之作用是幾乎加成的列 線圖。 圖8示出說明對於反轉錄酶中在相同胺基酸位置不同置 換突變，其中藥物濃度及複製力間相互關係之曲線圖。圖 8 A說明對於反轉錄酶中在相同胺基酸位置不同置換突變， 其中德立維拉丁及複製力間相互關係之曲線圖。圖8B遝明 對於反轉綠酶中在相同胺基酸位置不同置換突變，其中希 寧及複製力間相互關係之曲線圖。圖8 C說明對於反轉錄酶 中在相關胺基酸位置不同置換突變，其中衛滋及複製力間 相互關係之曲線圖。 圖9示出在K101P不存在（白框）及存在（灰框）中NNRTI易 感性分佈之圖。 86537 -49- 200413721 圖10示出說明在K103R+V179D不存在（白框）或存在（灰框） 中，NNRTI易感性分佈之圖。 86537 50-

Claims (1)

1. 200413721 拾、申請專利範圍： 1. 一種測定人類免疫缺失病毒（’’HIV”）是否有受損的複製能 力增加之可能性之方法，此方法包括偵測該HIV反轉錄酶 中與受損的複製力有關之突變存在與否，其係在該反轉 錄酶胺基酸位置之第98，100，101，103，106，108，179， 181，188，190，225或236位置上，其中突變之存在顯示 HIV有受損的複製能力增加之可能性，限制條件為該突變 #P236L。 φ 2. 一種測定HIV是否有受損的複製能力增加之可能性之方 法，此方法包括偵測該HIV反轉錄酶中突變之存在與否， 突變選自由該反轉錄酶胺基酸序列之A98G，L100I， K101E，K103N，V106A，V106I，V106M，Y181C，Y188A， Y188C，Y188H，Y188L，G190A，G190C，G190E，G190T， G190V，G190Q，G190S及G190V組成之群，其中該突變 之存在顯示HIV有受損之複製能力增加之可能性。 3. —種測定個體是否有受損的複製能力增加之可能性之 籲 HIV之方法，此方法包括偵測該HIV反轉錄酶中與受損複 製力有關之突變存在與否，該突變係在反轉錄酶胺基酸 序列之第 98，100，101，103，106，108，179，181，188， 190，225或236位置，其中該突變之存在顯示HIV有受損 複製力增加之可能性，限制條件為該突變非P236L。 4. 一種測定個體是否有受損的複製能力增加之可能性之 HIV之方法，此方法包括偵測該HIV反轉錄酶中突變之存 在與否，突變選自由該反轉錄酶胺基酸序列之A 9 8 G， 86537.doc 200413721 L100I，K101E，K103N，V106A，V106I，V106M，Y181C， Y188A，Y188C，Y188H，Y188L，G190A，G190C，G190E， G190T，G190V，G190Q，G190S 及 G190V組成之群，其中 遠突變之存在顯示HIV有受損之複製能力增加之可能性。 5 ·根據申請專利範圍第1，2，3或4項之方法，其中該突變 才疋供對非核芬反轉錄酶抑制劑之抗性。 6·根據申請專利範圍第1，2，3或4項之方法，其中該人類 免疫缺失病毒是人類免疫缺失病毒！型（HIv_ 1)。 馨 '根據申請專利範圍第5項之方法，其中該非核甞反轉錄酶 抑制劑是衛滋（nevirapine)，德立維拉丁（delavirdine)或希 寧（efavirenz) 〇 8.根據申請專利範圍第卜2, 3或4項之方法，其中在該反 轉錄酶中該錢之存在與H由使序㈣異之寡核#酸 k針與編碼孩突變之人類免疫缺失病毒核酸序列雜交而 偵測，其中雜叉之發生顯示該 根據中請專糊第丨，2,3或方法^中在反轉φ 5 -每中汶大夂之存在與否可由偵測編碼該突變之核酸序 列而知。 10. 11. 根據申請專利範圍第3或4項之方法，其中個體正進行或 已進行非核苷反轉錄酶抑制劑之前處理。 根據申請專利範圍第1，2， 包括在至少2, 3, 4, 5, 6 基酸位置上偵測與受損複製 12. 3或4項之方法，其中該方法 ，7，8，9，10，11 或 12個胺 力有關之突變存在與否。 一段編碼HIV中部 刀HIV反轉錄酶且長度在10及40個核 86537.doc 200413721 苷酸間之分離的寡核苷酸，其在該HIV之反轉錄酶胺基酸 序列第 98 ， 100 ， 101 ， 103 ， 106 ， 108 ， 179 ， 18卜 188 ， 19〇，225或23 6位置上含有突變，其中的突變與對蛋白酶 抑制劑易感性減低有關，限制條件為該突變非Ρ236[。 86537.doc