TR2024002381A2 - Di̇yabeti̇k hastaliğindan müzdari̇p ki̇şi̇ler i̇çi̇n tam yaralarin i̇yi̇leşti̇ri̇lmesi̇ne olanak sağlayan bi̇r kompozi̇syon - Google Patents

Abstract

Buluş, biyomedikal mühendisliği ve farmakoloji teknik alanına ait olup; bununla sınırlı olmamakla birlikte özellikle diyabetik hastalığından müzdarip kişilerde görülen tam ve kronik yaraların (özellikle ayak bölgesi) iyileşmesine olanak sağlayan bir kompozisyon ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME DIYABETIK HASTALIGIN DAN MÜZDARIP KISILER içiN TAM YARALARIN IYILESTIRILMESINE OLANAK SAGLAYAN BIR KOMPOZISYON TEKNIK ALAN Bulus, biyomedikal mühendisligi ve farmakoloji teknik alanina ait olup; bununla sinirli olmamakla birlikte özellikle diyabetik hastaligindan müzdarip kisilerde görülen tam ve kronik yaralarin (özellikle ayak bölgesi) iyilesmesine olanak saglayan bir kompozisyon ile ilgilidir. ÖNCEKI TEKNIK Diyabet, vücudun kan sekerini (glukoz) düzenleme yeteneginin bozuldugu kronik bir hastaliktir. Pankreas tarafindan üretilen insülin hormonunun yetersizligi veya vücudun insüline karsi dirençli hale gelmesi sonucu ortaya çikmaktadir. Diyabet, pankreasin yeterli insülin üretememesi sorunu olan tip 1 ve insüline karsi duyarliligin azalmasi sorunu olan tip 2 olmak üzere iki ana tipe ayrilmaktadir.

Diyabet, kontrol edilmedigi takdirde göz, böbrek, sinir sistemleri gibi vücudun birçok kisminda ciddi komplikasyonlara yol açabilmektedir. Ayrica diyabet hastaliginin en önemli komplikasyonlarindan biri diyabetik ayak olarak tanimlanmakta ve hastalarin ayaklarinda iyilesmesi güç yaralarin olusmasidir. Diyabetik hastaliklarda görülen yaralar, genellikle kan sekerinin uzun süre yüksek kalmasi sonucunda kan dolasimi ve sinir hasari (nöropati) gibi komplikasyonlarin bir sonucu olarak ortaya çikmaktadir. Bu komplikasyonlar, vücudun yaralari iyilestirme yetenegini azaltmakta ve enfeksiyon riskini arttirmaktadir. Diyabetik yaralar, enfeksiyon, kangren ve hatta ampütasyon riskini artiran ciddi saglik sorunlarina yol açabilmektedir. Bu nedenle, diyabet yönetimi ve ayak bakimi, bu tür yaralarin önlenmesinde hayati önem tasimaktadir.

Ilgili teknik alanda, hastalara söz konusu yaralarin tedavisi için pansuman gerçeklestirimi ve özel yara bakim ürünlerinin kullanilmasi gibi yetersiz tedavi yöntemleri uygulanmaktadir.

Bu tekniklerin yani sira yaralarin iyilestirilmesi için nemli pansuman uygulamasi, arteriye rekonstrüksiyon gibi klinik yaklasimlarin gerçeklestirilmesi, büyük doku kayiplari durumunda kullanilan ksenograft ve greft transfer yöntemlerinin uygulanmasi, debridman isleminin gerçeklestirilmesi gibi yöntemler uygulanmaktadir.

Bu yöntemlerin dezavantajlari arasinda vericiden bulasan hastaliklar, greft dokusunun alindigi bölgede yeni yaralarin olusumu ve cerrahi operasyon gereksinimi yer almaktadir. Bu nedenle, tedavi süresinin kisaltilmasi ve enfeksiyon gibi komplikasyonlarin önlenmesi için yeni terapötik stratejilerin gelistirilmesi büyük önem tasimaktadir.

Dolayisiyla, bilhassa diyabetik hastaliklarinda görülen tam ve kronik yaralarin tedavisinde, inflamatuar yanitlari düzenleyerek ve hizli doku rejenerasyonu saglayarak iyilesme süresini kisaltmayi amaçlayan yeni terapötik stratejilerin gelistirilmesi büyük önem tasimaktadir. Buna yönelik ilgili teknik alanda arastirma ve gelistirme faaliyetlerinin gerçeklestirilmesi zorunluluk haline gelmistir.

BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Bilhassa diyabetik hastaliginda olusan yaralar, kronik ve tam kalinlikta yaralardir.

Tam kalinlikta yaralar, epidermal ve dermal katmanlara ek olarak deri alti yag veya daha derin dokular içermekte ve iyilesmesi yüzeysel/kismi kalinlikta yaralardan daha zor olmaktadir. Bu tip yaralarin iyilesmesi genellikle deri otogreftlerinin veya yapay deri ikamelerinin kullanilmasini gerektirmektedir.

Mevcut teknikteki buna benzer kronik ve tam yaralarin tedavileri, yara kasilmasi, gecikmis damarlanma, skar olusumu, saglikli dokuyla zayif entegrasyon ve yüksek maliyet gibi bir dizi sorunlara sahiptir. Mevcut bulus sahipleri bahsedilen teknik olumsuzluklarin ve çözümsüzlüklerin ortadan kaldirildigi yaranin iyilesmesine olanak saglayan bir kompozisyon ortaya koymaktad Ir.

Bunu saglamak üzere bulusa konu kompozisyonun ideal doku iskelesine sahip olmasi saglanmaktadir. Bunu saglamak üzere ise dogal ekstraselüler matrikse (ECM olarak kisaltilabilmektedir) benzer, hücre yapismasini, çogalmasini ve farklilasmasini destekleyen, yarayi dis enfeksiyonlara karsi koruyan, biyobozunur ve biyouyumlu, gözenekli yapiya sahip ve doku rejenerasyonunu destekleyen bir doku iskelesi ortaya konulmasi hedeflenmektedir.

Mevcut bulusun bir diger hedefi, bahsedilen teknik çözüm ve avantajlari saglayan doku iskelesine immün düzenleyici ve rejeneratif etki saglayarak katki saglayan katki bileseni içeren bir kompozisyon ortaya koymaktir. Bu sayede yara iyilesme özelligi arttirilmis ve destek iskele ile yüksek performans göstererek sürenin azalmasina da olanak saglayan bir kompozisyon eldesi söz konusu olabilmektedir.

Mevcut bulus bir diger yönüyle bu sekilde bir katki malzemesi içerikli ve doku iskelesine sahip bir kompozisyonun üretimi için bir yöntem ortaya koymaktadir.

Bulusta konu edilen yöntem, içerdigi esas islem adimlari ile birlikte özellikle kisa sürelerde ve uygun maliyetlerde doku iskelesi eldesini mümkün kilip; katki malzemesinin elde edilen doku iskelesine yüksek verimlilikle katkilanmasini saglamayi hedeflemektedir.

SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1'de bulusa konu kompozisyon bünyesinde yer alan doku iskelesinin SEM'de çekilmis görüntüsü paylasilmaktadir.

Sekil 2'de doku iskelesindeki PCL/Jelatin çap dagilim grafigi paylasilmaktadir. analizi görüntüleri paylasilmaktadir.

Sekil 4'te negatif yüzey belirteçleri için CD28 (PerCp), CD14 (PE), CD34 (APC), HLA-DR (FlTC) analizi (BD Biosciences, USA) akis sitometri analizi görüntüleri paylasilmaktadir.

Sekil 5-a'da Üç hafta sonra hücreler besiyeri atilarak %10 formaldehit ile fikse edilmistir, Alizarin Red boyama solüsyonu ile boyanarak, osteojenik koloniler ve kalsiyum birikimleri isik mikroskobu altinda görünümü paylasilmaktadir.

Sekil 5-b'de Kondrositlerin nükleusu ve proteoglikanlar mavi boyali ve kondrositler/kartilaj olusumu koyu mavi renkte farklilasan hücreler, isik mikroskobu Sekil 5-c'de 2 hafta sonra, Oil Red 0 Boyama ve hemotoksilen-eosin boyama (Sigma) ile adipositler ve yag damlalari isik mikroskop ile görüntüleri paylasilmaktadir.

Sekil 6'da Floresan isaretlenen eksozomlar 83.4±5.8 MFl olarak isima yogunlugu görünümü paylasilmaktadir.

Sekil 7'de DF-MKH Eksozomlarin FESEM görüntüsü paylasilmaktadir.

Sekil 8'de doku iskelelerine eksozom ekilme islemi sonrasindaki FESEM görüntüleri paylasilmaktadir.

BU LUSUN DETAYLI AÇIKLAMASI Bu detayli açiklamada bulus konusu, yara iyilestirici bir kompozisyon ile ilgili olup, sadece konunun daha iyi anlasilmasina yönelik hiçbir sinirlayici etki olusturmayacak örneklerle açiklanmaktadir.

Bulusa konu kompozisyon, bilhassa yara iyilestirme özelligine sahip olup daha çok kronik ve tam yara olarak degerlendirilen zorlu yaralarin tedavilerinde islev görecek bir yapiya sahip olmasi saglanmaktadir.

Bulus bir diger yönüyle, özellikle tam yara ve kronik yaralara neden oldugu bir hastalik olan diyabetik hastaliklarinin yaralarin da tedavi edilmesini saglayan bir kompozisyon saglanmasi ile ilgilidir. Bu hastaliga özel olarak diyabetik ayak ülseri hastaligi verilmektedir. Fakat bu zorlu hastaligin tedavisinde islev gören bir kompozisyonun, bundan daha kolay iyilesme mekanizmasina sahip yaralarda da tedavi edici olarak kullanilabilecegi açiktir. Ayni zamanda diyabetik ayak ülseri gibi nörapatik ülser ve iskemik ülser yaralarinda da tedavi edici rol oynayabilmektedir.

Bulusa konu kompozisyon bünyesinde bir doku iskelesi içermektedir. Doku iskelesinin sözü edilen yaralarin tedavisinde iyilestirme özelligine sahip olabilmesi için özellikle dogal ekstraselüler matrikse (ECM olarak kisaltilabilmektedir) benzer, hücre yapismasini, çogalmasini ve farklilasmasini destekleyen, yarayi dis enfeksiyonlara karsi koruyan, biyobozunur ve biyouyumlu, gözenekli, doku rejenerasyonunu destekleyen bir yapida olmasi gerekmektedir.

Mevcut bulus sahipleri, kompozisyon eldesinde doku iskelesi olarak jelatin esasli bir yapiyi kullanmaktadir. Jelatin, genellikle sigir derisi ve kemikleri gibi hayvansal kaynaklardan elde edilen, protein tabanli bir maddedir. Suda çözünür bir polipeptid karisimi olan jelatin kolajenden elde edilmektedir. Kolajen, uzun süreli kaynatma islemi ile hidrolize edilerek jelatine dönüstürülebilmektedir. Jelatin, biyouyumlu ve biyobozunur, film ve jel olusturma kabiliyeti yüksek, sicaklik degisimlerine duyarli, hücre büyümesi ve doku rejenerasyonu için uygun ortam saglama gibi özelliklere sahiptir. Bu gibi özelliklere sahip olmasi ile birlikte sekil verilebilirligi kolay, üretim maliyetleri düsük, yüksek verimlilikle hücre büyümesi ve doku rejenerasyonu ortami saglayan bir malzeme eldesini mümkün kilabilmektedir.

Mevcut bulus sahipleri ayrica jelatin esasli doku iskelesine ilave bir bilesen olarak polikaprolakton eklemektedir. Doku iskelesinde yer alan jelatin için yüksek mekanik mukavemet ve yapisal bütünlük saglamak, islenebilirligi arttirmak, hücre dostu yüzey saglama gibi özellikler saglamak veya iyilestirmek üzere polikaprolakton (PCL olarak kisaltilmaktadir) yer almaktadir. PCL, biyouyumlu (vücut tarafindan kabul edilen), biyobozunur (vücutta zamanla çözünebilen), toksik olmayan ve FDA tarafindan onayli bir yari sentetik polimerdir.

PCL ile jelatin bir arada yer alarak doku iskelesi için sinerji etki saglamaktadir. PCL, doku iskelesi ve jelatin için mekanik dayaniklilik ve islenebilirlik saglarken; jelatin doku iskelesi için biyouyumluluk, hücre onarimi ve rejenerasyonu saglamaktadir.

Jelatin ve PCL içeren bir yapida elde edilen doku iskelesi, hidrojel içerikli doku iskelelerine göre daha fazla gözenekli yapiya sahip olabilmektedir. Buna göre doku iskelesi bünyesinde iyilestirici bilesenlerin daha yüksek verimde ve konsantrasyonda yer alabilmesi saglanabilmektedir.

Mevcut bulusa konu kompozisyon bünyesinde yer alan doku iskelesi, tercih edilen bir uygulamada üç boyutlu nanofiber formunda elde edilmesine olanak saglayan üretim yöntemleri elde edilmektedir. Ilgili teknik alanda doku iskelelerinin, özellikle boyutu ve geometrisi belli olmayan diyabetik ülser hastaliginin tedavisi için yüzeysel gözenekli ve hücre infiltrasyonunu/çogalmasini kisitlayan siki istiflenmis iki boyutlu bir yapida olmasi yetersiz teknik çözüm ve avantaj sagladigi tespit edilmistir. Bu yüzden mevcut bulusta, diyabetik ülser gibi düzgün geometriye sahip olmayan tam kalinlikta yaralarin tedavisi için düsük yogunluklu, sikistirilabilir ve kolay sekil alabilir üç boyutlu yapida doku iskeleleri ortaya konulmaktadir. Doku iskelesinin üç boyutlu olmasi sayesinde bünyesinde içerecegi bilesenlerin yara yatagi boyunca daha stabil kalinmasi ve homojen dagilimi tesvik edilerek, infiltrasyon ve dermal onarim/rejenerasyonu saglanabilmektedir.

Bulus sahipleri, bünyesinde PCL ve jelatin içeren doku iskelesinin, hedeflenen teknik çözüm ve avantajlari saglamasi için uygunlugunu belirlemek üzere karakterizasyon çalismalari gerçeklestirmistir.

Sekil 1'de elde edilen doku iskelesinin SEM'de çekilmis görüntüsü paylasilmaktadir. SEM analizleri, ZElS GEMlNl-500 FESEM cihazi ile gerçeklestirilmistir. Analiz, altin kapli örnekler üzerinde ve düsük basinç altinda gerçeklestirilmistir. Doku matrisi olarak elde edilen doku iskelesi fiberlerin çaplari SEM görüntüleri lmageJ (NlH, Bethesda, MD) yazilimi kullanilarak analiz edilmistir.

Görüntüler üzerinden 50 adet nanofiberin çapi ölçülmüs ve ölçümler yazilim yardimiyla analiz edilmistir. Ortalama fiber çaplari, çap dagilim grafikleri ile birlikte gözeneklilik görüntüleri elde edilmistir. PCL/Jelatin çap dagilim grafigi Sekil 2 olarak paylasilmaktadir.

Nanofiber doku iskelelerinin gözenekliligi ve gözenek büyüklügü dagilimlari Micromeritics Marka Autopore IV Model Civa Porozimetresi kullanilarak yapilmistir. Üretilen üç boyutlu doku iskelelerin analizi 3 nm-360 um boyutlara sahip gözenekler için ölçüm alinabilen düsük basinç analizi (0-50 psi) ile yapilmistir.

Testte, civa yüzey gerilimi 485 dyne/cm ve civa ile gözenek duvari arasindaki kontak açisi 130000lmak üzere civa intrüzyon verileri kullanilmistir. Doku iskelesi gözenekleri, basinç 0'dan (büyük gözenekler) 50 psi (nispeten küçük gözenekler) degerine arttirilarak civa ile doldurulmustur. Ölçüm sonucunda basinca karsi numuneye giren civa miktarinin belirlenmesinden sonra malzemenin gözeneklilik, gözenek hacmi dagilimi, gözenek boyutu dagilimi ve yigin yogunlugu ve görünür yogunlugu elde edilmistir. Bulusta konu edilen üç boyutlu PCL/GEL doku iskelesi için ortalama gözenek boyutu 11,8 pm ve gözeneklilik orani %70 bulunmustur.

Bir diger çalisma olarak konu edilen doku matrisinin mekanik mukavemet degerleri test edilmistir.

Ilk olarak elde edilen üç boyutlu PCL/Jelatin içerikli doku iskelesine çekme testi uygulanmistir. Çekme testleri TA lnstruments Q cihazi kullanilarak yapilmistir. Testler, vücut sicakligi olan 37 oC'de ve 0,1N/dk kuvvet uygulanarak gerçeklestirilmistir. Teste tabi tutulan doku iskelesinin çekme seklinde oldugu tespit edilmistir.

Basma testleri TA lnstruments Q cihazi kullanilarak yapilmistir. Testler, vücut sicakligi olan 3706'de ve 0,1N/dk kuvvet uygulanarak gerçeklestirilmistir. Teste tabi tutulan doku iskelesinin basma dayan imi oldugu tespit edilmistir.

Bir diger çalisma olarak konu edilen üç boyutlu PCL/Jelatin doku iskelesi için in vitro biyobozunurluk testi uygulanmistir. Doku iskelelerinin biyobozunurluk özelliklerinin belirlenmesi için baslangiç kuru agirliklari kaydedilerek, her bir örnek için 2 set olmak üzere 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS olarak kisaltilmaktadir) çözeltisi (pH: 7,4) içerisinde 37±0,5°C'de etüvde bekletilmistir. Inkübasyonun 3, 7, 14, 17 ve 21. günlerinde bekletilmis olan doku iskeleleri tampondan alinarak hava pompasi yardimiyla fazla sivi iskelelerden uzaklastirilmistir. Doku iskeleleri, 1 gün boyunca 37±0,5°C'de kurutulmus ve tekrar tartilmistir. Doku iskelelerin ilk ve son agirliklarindaki zamana bagli % kütle kayiplari Formül 1 yardimiyla belirlenmistir.

ILi: agina: H 100 *51: Eagunm a = Formül 1. 21 gün sonunda, üç boyutlu PCL/Jelatin içerikli doku iskelesi yaklasik %90 oraninda biyobozunmaya ugradigi tespit edilmistir.

Bir diger çalisma olarak konu edilen üç boyutlu PCL/Jelatin doku iskelesi için in vitro biyouyumluluk testi uygulanmistir. Hücre izolatlarinda bulunan keratinosit hücre hatti 24 kuyulu kültür plaklarina keratinosit büyüme besiyeri ile süspanse edilerek 1X1O5 hücre/kuyu olarak ekilmistir. Hücreler 24 saat konfluent olana kadar kürtürlenmistir. 24 saat sonra konfluent olan hücrelerin üzerine 1X1cm2 konu edilen doku iskelesi nanofiber yerlestirilerek kültür besiyeri ile birlikte 24 saat, 7 gün ve 14 gün olmak üzere kürtülenmistir. Kültür süresi sonunda hücreler; canli hücreler için CalceinAM (yesil) ve apoptotik hücreler için Ethidium Homodimer-1 “EthD-1” (kirmizi) ile boyanmistir. Görüntüler floresan mikroskopta görüntülenmistir.

Floresan mikroskopta isima yogunlugu negatif hücre kontrol görüntüsü (nanofiber eklenmeyen hücre kuyusu) Calcein AM boyama ile 24 saatlik kültür kuyusu %100 canlilik olarak kabul edilerek biyomalzeme bulunan kuyulardaki ve esdeger kuyularin 7 gün ve 14 gün kültürlerinin isima yogunluguna kiyaslanmistir. % Canlilik verisi olarak kaydedilmis, tüm kültür kuyulari 3 tekrarli olarak yapilmistir.

Hücre Canlilik Orani: 1. Kontrol Kültür Kuyusu (Keratinosit Hücreler) 24 saat: %100 ± %0 2. PCL/GEL Kültür Kuyusu (Keratinosit Hücreler+PCL/GEL) 24 saat: %97.33 ± 3. Kontrol Kültür Kuyusu (Keratinosit Hücreler) 7 gün: %98.12 ± %0.48 4. PCL/GEL Kültür Kuyusu (Keratinosit Hücreler+PCL/GEL) 7 gün: %94.82 6. PCL/GEL Kültür Kuyusu (Keratinosit Hücreler+PCL/GEL) 14 gün: %90.26 Bir diger çalisma olarak konu edilen üç boyutlu PCL/Jelatin doku iskelesi için sitotoksitite testi uygulanmistir. 1,6 cm çapinda konu edilen doku iskelesi üç kere iskelesi numunesi 2 saat boyunca ultraviyole isiga maruz birakilmistir. In vitro kültür için fibroblast kullanilmistir. 24 kuyulu kültür plaklarina 10x103 hücre ekilerek, Dulbecos Modified Eagle Medium (DMEM olarak kisaltilmaktadir) ile kültürlenmistir.

Fibroblast hücreleri %80 taban yayilimina ulastiginda, tripsin EDTA %0,25 solüsyonu ile kaldirilip hücre sitotoksisite testleri için 24 kuyulu plakalara 1,6 cm'lik nanofiber materyaller yerlestirilerek üzerlerine 10X103 HDF hücreleri DMEM besiyeri ile birlikte ekilerek 3 gün kültürlenmistir. Ayrica deney kontrol için HDF hücreleri tek basina bir kuyu içinde kültürlenmistir. Kültür süresi sonunda DMEM besiyeri atilip yeni DMEM besiyeri eklenmis, MTT solüsyonu (5 ng/L) ile yeni DMEM, her bir kuyuya ilave edilmis, 4 saat boyunca 37°C'de inkübe edilmistir.

Besiyeri atilip, olusan formazani çözmek için 1 umL DMSO ile ilave edilmistir.

Formazan kristalleri çözüldükten sonra, 100 nL'lik alikotlar, numune basina bes tekrar ile 96 kuyulu kültür plagina aktarilmistir. Absorbans, mikroplaka spektrofotometresi kullanilarak 570 nm dalga boyunda ölçülmüstür. Ölçüm sonunda elde edilen absorbans verileri kontrol kuyusu %100 canlilik olarak kabul edilerek diger kuyularla kiyaslanmistir. % Canlilik verileri alttaki gibi elde edilmistir.

Hücre Canlilik Orani: 1. Kontrol Kültür Kuyusu (Fibroblast Hücreler): %100 ± %0.00 2. PCL/GEL Kültür Kuyusu (Fibroblast Hücreler+PCL/GEL): %92.78 ± %122 Bir diger çalisma olarak konu edilen üç boyutlu PCL/Jelatin doku iskelesi için su tutma testi uygulanmistir. Testler için her bir doku iskelesi numunesi, 2 set olmak üzere 1 cm2 boyutlarinda kesilerek, öncelikle kuru iskelelerin agirliklari ölçülmüs daha sonra örnekler 10 mL fosfat tamponlu salin çözeltisi (pH degeri 7,4 olacak 21. günlerinde bekletilmekte olan doku iskeleleri tampondan alinarak fazla sivi hava pompasi yardimiyla iskelelerden uzaklastirilmistir. Daha sonra örneklerin su tutma yüzdelerinin belirlenmesi için yas agirliklari tartilmistir. Doku iskelelerinin kuru ve yas agirliklari kullanilarak zamana bagli % su tutma oranlari formül 2 yardimiyla hesaplanmistir.

Formül 2.

Elde edilen test sonuçlarina göre üç boyutlu PCL ve jelatin içerikli doku iskelelerin yaklasik su tutma degeri %1060'dir.

Bir diger çalisma olarak konu edilen üç boyutlu PCL/Jelatin doku iskelesi için temas açisi ölçüsü uygulanmistir. Temas açisi ölçümü, iskelelerin hidrofilik özelliklerini arastirmak için uygun ve yaygin bir yöntemdir. Temas açisi degeri, doku iskelesinin hidrofilikligi ile ilgili olup; temas açisi degeri ne kadar düsükse, iskelenin hidrofilikligi o kadar yüksek olmaktadir. Doku iskelelerinin yüzey temas açisi ölçümleri, Bio/in Scientific Attension Theta Lite marka cihaz ile test edilmistir. Ölçümler, doku iskelelerinin üzerine yaklasik 10 pL distile su damlatilarak yapilmistir. Üç boyutlu PCL ve jelatin içerikli doku iskeleleri oldukça yüksek hidrofilik özellik göstermis olup; temas açilari en çok 5 saniye içerisinde sifira yaklasmistir.

Bir diger çalisma olarak konu edilen üç boyutlu PCL/Jelatin doku iskelesi için su buhari geçirgenlik testi uygulanmistir. Su buhari geçirgenlik testleri, üç boyutlu PCL/Jelatin içerikli doku iskeleleri için kap metodu kullanilarak gerçeklestirilmistir.

Testler için cam kaplar yaklasik 70 mL saf su ile doldurulmus ve ilk agirliklari (Wilk) kaydedilmistir. Daha sonra cam kaplarin agizlarina PCL/Jelatin içerikli iskeleler yerlestirilmis ve sabitlenmistir. 24 saat boyunca 37±0,5°C'de etüvde bekletilen cam kaplarin son agirliklari iskelelerin çikarilmasindan sonra tekrar ölçülerek (Wson) kaydedilmistir. Ölçümler üç tekrarli olarak gerçeklestirilmistir. Elde edilen veriler kullanilarak iskelelerin su buhari geçirgenlik hizi (g/m2h) Formül 3 kullanilarak hesaplanmistir.

Formül 3. Üç boyutlu PCL ve Jelatin içerikli doku iskelelerin su buhari geçirgenlik hizi 219,2622 g/m2h olarak bulunmustur. Üç boyutlu PCL ve Jelatin içerikli doku iskelelerinin hava geçirgenlikleri Proser K008 hava geçirgenlik test cihazi kullanilarak yapilmistir. Hava geçirgenlik testleri olarak ölçülmüstür. Hava geçirgenligi ölçümlerinde ortalama 1,56 mm kalinliginda üç boyutlu PCL/Jelatin içerikli doku iskeleleri kullanilmistir. Hava geçirgenlik degeri Yapilan çalismalarda da görülmektedir ki, kronik ve tam yaralarin iyilestirilmesi için tedavi olarak kompozisyon bünyesinde bahsedilen doku iskelesinin eldesinde kaynak olarakjelatin ve PCL malzemelerinin kullanilmasi uygundur.

Bulusa konu kompozisyon bünyesinde, yara iyilestirici en az bir etken madde içermektedir. Bu bulusta etken madde, yara iyilesme sürecini hizlandirmak ve iyilesme performansini gelistirmek üzere kompozisyon bünyesinde yer almaktadir.

Bu bulusta etken madde olarak en az bir mezenkimal kök hücresi yer almaktadir.

Söz konusu mezenkimal kök hücresi en tercih edilen bir uygulamada dental folikül mezenkimal kök hücresidir.

Bu bulusta, dental folikül mezankimal kök hücresi (DF-MKH olarak kisaltilabilmektedir), dis gelisiminin bir parçasi olan dental folikülden elde edilen özel bir kök hücre türüdür. Bu hücreler, mezankimal kök hücrelerin karakteristik özelliklerini tasimakla beraber kendilerini yenileyebilir, farkli hücre türlerine dönüsebilir ve büyük rejeneratif potansiyel tasimaktadir.

DF-MKH bünyesinde mikro RNA, mRNA, TGF-b (transforme edici büyüme faktörü), indolamin , prostaglandin E2 (PGE2), vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve nerve büyüme faktörü (NGF) ve insülün büyüme faktörü (lGF) gibi bilesenler yer almaktadir. Bu bilesenlerin bir arada yer almasi, DF-MKH'leri yara iyilesmesi ve doku rejenerasyonu için etken madde olarak kullanilmasini mümkün kilmaktadir.

Bulusa konu kompozisyon esas olarak DF-MKH eksozomlari ile zenginlestirilmis (katkilanmis) PCL ve Jelatin içerikli üç boyutlu doku iskelesi bilesenlerinden olusmaktadir.

Tercih edilen bir uygulamada DF-MKH bileseni, tibbi olarak elde edilebilmektedir.

Bu sayede kompozisyonuna ait maliyetlerin daha da düsmesi mümkün olabilmektedir.

Bu bulusa, elde edilen DF-MKH'lerin yüzey antijen analizi ve in vitro multipotent farklilasma analizi çalismalari gerçeklestirilmistir.

Ilk olarak elde edilen MKH'lerin kök hücre karakteri tasiyip tasimadiginin analizinin gerçeklestirilebilmesi için hücre pozitif yüzey belirteçleri flow sitometri cihazinda ve farklilasma potansiyelleri stimüle edici besiyerleri ve boyamalar ile gerçeklestirilmistir.

DF-MKH için yüzey belirteçleri, üçüncü pasajdaki hücreler ile akim sitometri cihazina uygun antikorlarla gerçeklestirilmistir. 2><105 hücre, tripsinizasyondan sonra iki kez PBS ile yikanmis, hücreler daha sonra 4 °C'de karanlikta 30 dakika boyunca veya allofikosiyanin (APC) ile konjüge edilmis spesifik bir monoklonal antikor ile inkübe edilmistir. Hücre yüzeyi belirteçleri flow sitometri (BD Accuri C6 Plus, USA) ile analiz edilmistir. Pozitif yüzey belirteçleri için CD29, CD73, CD90, CD105 akis sitometri analizi görüntüleri Sekil 3 olarak paylasilmistir. Negatif yüzey belirteçleri için CD28 (PerCp), CD14 (PE), CD34 (APC), HLA-DR (FlTC) analizi (BD Biosciences, USA) antikorlar kullanilarak yapilmis ve Sekil 4 olarak paylasilmistir.

DF-MKH'larin osteojenik farklilasma özelliginin analizi için teste tabi tutulmasi söz konusudur. DF-MKH'ler, 6-kuyucuklu plaklara (1X105 hücre/kuyu) ekilmis ve 2 ml besiyeri ortami (DMEM/F12) ile konfluent olana kadar kültürlenmistir. DF-MKH'ler, osteojenik indüksiyon ortami (StemProTM, Thermofisher) ile degistirilmistir.

Besiyeri, her 3 günde bir yenilenmistir. Üç hafta sonra hücreler besiyeri atilarak osteojenik koloniler ve kalsiyum birikimleri isik mikroskobu altinda görüntülenmistir ve Sekil 5-a olarak paylasilmistir.

DF-MKH'larin kondrojenik farklilasma özelliginin analizi için teste tabi tutulmasi söz konusudur. 6-kuyulu plaklara ekilen DF-MKH'ler, 3 hafta boyunca kondrojenik indüksiyon ortaminda (StemPro, Thermofisher) kültürlenmistir. Kondrojenik besi ortami her 3 günde bir tazelendi. Tabanda yapisan hücreler %10 formaldehit ile fikse edildi ve Alcian mavisi ile boyandi. Kondrositlerin nükleusu ve proteoglikanlar mavi boyali ve kondrositler/kartilaj olusumu koyu mavi renkte farklilasan hücreler, isik mikroskobu ile görüntülenmistir ve Sekil 5-b paylasilmistir.

DF-MKH'larin adipojenik farklilasma özelliginin analizi için teste tabi tutulmasi söz konusudur. DF-MKH'ler adipojenik farklilastirma ortaminda; hazir temin edilen adipojenik stimülasyon ortami (StemProTM, Thermofisher) ile kültürlenmistir. 2 hafta sonra, Oil Red 0 Boyama ve hemotoksilen-eosin boyama (Sigma) ile adipositler ve yag damlalari isik mikroskop ile görüntülenmis ve Sekil 5-c olarak paylasilmistir.

DF-MKH ekzozomlarinin izolasyonu ve karakterizasyonu için DF-MKH'ler, %80-85 konfluensiye ulastiktan sonra, kültür ortami %10 eksozom içermeyen FBS ilave edilmis DMEM/F12 ile degistirilmistir akabinde hücreler 48 saat kültürlenmistir.

Toplanan kültür süpernatantlari 3000g devirde 15 dk santrifüjlenerek hücre debrisinden ayrilmistir. Elde edilen üst sivi ExoQuick-TC eksozom izolasyon kiti (EXOTC50A, SBl System Biosciences, Kanada) kullanilarak üreticinin protokolüne uygun olarak izole edilmis, nihai eksozomlar protein ölçüm kiti ile analiz edilmistir.

Eksozom izolasyon protokolüne göre, 3000 g devirde 15 dk santrifüjlenen kültür üst sivisi ExoQuick solüsyonu ile karistirilarak +4°C'de 30 dakika 10.000 rpm devirde santrifüjlenmistir. Süpernatant atilmis, dipte kalan eksozom peleti protein ölçüm kiti ile ölçülmüstür. Her 200 pg eksozom 200 pL PBS içinde -80 °C'de kullanima kadar stoklanmistir. Eksozomlarda spesifik belirteçler olarak kabul edilen yüzey belirteçlerinin analizi için flow sitometrik yöntemlerle analiz edilmistir. Bu belirteçler; tetraspanins (CD9, CD63) ve eksozomlarda yaygin olarak bulunan saperonlar (Hsp90) flow sitometri cihazinda analizi yapilmistir. Eksozom izolasyonu sonrasi elde edilen veziküllerin çapi ve morfolojisi FESEM ile görüntülenmistir.

Eksozom protein konsantrasyonun belirlenmesi için izole edilen eksozomlarin bicinchoninic acid (BCA) (Thermoscientific, Katalog No: 23225) protein test kiti ile analiz edilmesi söz konusudur. Her 200 pg eksozom/200uL PBS içerigi bir ependorf tüpte -80 oC'de stoklanmistir. Protein ölçümünden önce, PBS içinde yeniden süspanse edilen eksozomlar, esit hacimde RlPA tamponu ve EDTA'siz Proteaz Inhibitörü eklenerek eksozomlar yikima ugratilmistir, oda sicakliginda 5 dakika inkübe edilmistir. Ölçüm yapilan eksozomlar ultra saf suda 1:10 oraninda seyreltilerek, absorbans 562 nm'de okunmustur. Elde edilen veriler pg/mL olarak kaydedilmistir. Her 2 milyon MKH kültüründen ortalama 220-280 ng eksozom elde edilmistir.

Eksozomlarin takibine yönelik floresan isaretlenmesi için bulusa konu üç boyutlu PCL/Jelatin içerikli doku iskelelerine yerlestirilecek eksozomlarin yara iyilesme sürecini degerlendirmek amaciyla uygulanacak doku alaninda takibi (migrasyonu ve lokalizasyonu) için membran florasan isaretleme yapilmistir. Eksozomlar Exoglow Membrane Labeling Red Kit (465 nm excitation/635 nm emission) kullanilarak isaretlenmistir. Isaretleme için üreticinin protokolü su sekilde uygulanmistir; her 50-100 pg eksozom için 12 pL reaksiyon tampon solüsyonu ile 2 pL isaretleme solüsyonu karistirilarak eksozomlar ile birlikte 30 dakika oda sicakligi ve karanlikta inkübe edilmis ve 10.000 rpm devirde 10 dakika santrifüjledikten sonra süpernatant atilip dipteki eksozom peleti fosfat tampon solüsyon ile dilüe edilmistir. Floresan isaretlenen eksozomlar flow sitometri cihazinda analiz edilmistir. Flow sitometride FL3 kanalinda (488-620 nm) isima yapan popülasyon MFl (mean fluorescence indeX) veya yüzde (%) degerleri kaydedilmistir. Floresan isaretlenen eksozomlar 83.4±5.8 MFl olarak isima yogunluguna sahip oldugu gözlenmistir ve Sekil 6 olarak paylasilmistir.

Bu bulusta ayrica kompozisyonun eldesi için bir yöntem sunulmaktadir. Bu bulusta ilk olarak üç boyutlu doku iskelesinin eldesi için elektroegirme yöntemi kullanilmaktadir. Buna uygun olarak doku iskelesini meydana getiren jelatin ve PCL hammaddelerinin yer aldigi bir bilesimin eldesi söz konusudur.

PCL/Jelatin polimer çözeltisinin hazirlanmasi Tercih edilen bir uygulamada trifloroetanol (TFE olarak kisaltilmaktadir) içerisinde daha öncesinde belirlenen poli(e-kaprolakton) ve jelatin çözeltisi hazirlanmistir. Bu çözelti içerisinde tercih edilen bir uygulamada agirlikça 1:1 olacak sekilde PCL:Jelatin yer almaktadir.

Elde edilen bu çözelti, 10 ila 36 saat arasinda bir süre boyunca karistirilarak elde edilmektedir. Bu islem tercih edilen bir uygulamada oda sicakliginda gerçeklestirilmektedir.

Elde Edilen PCL/Jelatin Polimer Çözeltisinin Elektroegirme Sistemine Eklenmesi Ve Doku iskelesinin Eldesi Bir önceki islem adiminda elde edilen çözelti ilk olarak kör uçlu bir igne ile enjektöre transfer edilip, elektroegirme cihaziyla entegre enjektör pompasina yerlestirilmektedir.

Polimer çözeltisi, elektroegirme cihazinda 10 ila 20 kV voltaj uygulanarak ve 0,4 ila 0,5 ml/sa hizda toplayici üzerinde biriktirilmektedir.

Küresel çanak toplayici ile toplanan nano boyutlarda üç boyutlu doku iskelesi elde edilebilmektedir.

Bulusta konu edilen kompozisyon eldesi için bir önceki islem adimlarinda elde edilen doku iskelesine DF-MKH eksozomlarinin katkilanmasi gerçeklestirilmektedir.

Bu islem adimlari asagidaki gibidir.

Elektroegirme Yönteminin Uygulanmasi Ile Elde Edilen Doku Iskele/erine Ekim Öncesi Ön Hazirlik Islemlerinin Uygulanmasi Bir önceki islem adiminda elde edilen doku iskeleleri daha öncesinde belirlenen ebatlara indirilmektedir. Tercih edilen bir uygulamada bu doku iskeleleri plakalar halinde kesilmektedir.

Belirlendigi haliyle ebatlara indirilen doku iskeleleri, sterilizasyon islemlerine tabi tutulmaktadir. Bunun için doku iskeleleri, etanol veya benzeri temizleyici ile muamele edildikten sonra bir tampon çözelti ile yikanmaktadir.

Tercih edilen bir uygulamada sözü edilen yikama islemi sonrasi UV isinlarina tabi tutularak doku iskeleleri inkübe edilmektedir. Tercihen bu islemlerin süresi, doku iskelelerinin her iki yüzüne de en az 30 dakika olacak sekildedir.

Akabinde doku iskeleleri, bir kültür ortaminda bekletilmektedir. Bu islem ise en az saat boyunca gerçeklestirilmektedir. PCL/Jelatin doku iskelesinin her 10 mm2 alanina 200 mikrogram DF-MKH eksozomu olacak sekilde 200 mikrolitre fosfat tampon solüsyon (PBS) içinde hazirlanarak eklenmistir.

Bu islem adimlarinin uygulanmasi ile elde edilen sterilizasyon islemleri tamamlanan doku iskeleleri, eksozom tutulumunun saglanmasi için fosfat esasli tampon çözeltisi içerisinde bir gece boyunca inkübe edilmektedir. Inkübasyon sicakligi 37 °C olup, tercihen %5'lik CO2 inkübatör ile gerçeklestirilmektedir.

Doku Iskele/erine DF-MKH eksozomlarinin Eki/mesi Izole edilen DF-MKH eksozomlari, daha öncesinde elde edilen doku iskelelere 200 pg eksozom/200 pL PBS olacak sekilde 48 kuyulu plaklarda inoküle edilmistir ve 24 saat 3706'de, %5 002 inkübatör içerisinde bekletilmistir.

Akabinde tercih edilen bir uygulamada, doku iskelesine ekilen DF-MKH eksozomlar salinim testi için 3 ayri set halinde 3'er tekrarli olarak ekildikten sonra 3706'de inkübe edilmektedir. 7.,14.,21. gün sonunda (doku iskelelerinin bozunma süresi temel alinarak), kuyucuklarin içindeki solüsyon çekilerek, önce protein izolasyonu RlPA solüsyonu ve proteaz inhibitörü kullanilarak yapilmakta, ardindan BCA protein konsantrasyon kiti ile protein miktari hesaplanmaktadir. Sonuçta biyobozunurlugun hedeflendigi 21 gün sonunda ve 7. ve 14. gün sonunda ekilen eksozom miktarinin % salinim miktari belirlenmektedir. Hesaplama yapilirken bir adet DF-MKH eksozomsuz doku iskelesi ve bir adet 200 119 sadece DF-MKH'ler ayri ayri kontrol materyal olarak kullanilmistir. DF-MKH eksozomlarin 21. gün deney süresi sonunda pozitif belirteçleri flow sitometri cihazinda analiz edilmektedir. Bulusta bahse konu doku iskelelerinden salinan DF-MKH eksozomlarin karakterizasyon sonuçlari Tablo 1 'de paylasilmaktadir.

Elde edilen sonuçlar ( asagida verilmistir; 7.gün 14.gün 21 .gün Eksozom pozitif belirteçleri (% ifadesi) Eksozomun salim yapildigi Doku Iskelesi CD9 CD63 CD81 HSP90 Tablo 1. DF-MKH eksozom karakterizasyon sonuçlari Doku Iskele/ere Eki/mis Eksozomlarin Karakterizasyonu Öncelikle kültür ortami, doku iskelelerinin bulundugu gözlerden uzaklastirilmis ve doku iskeleleri PBS ile iki defa yikanmistir. Daha sonra, DF-MKH eksozomlar 0,1 M Dulbecco PBS içerisinde hazirlanmis hacimce %2,5'lik glutaraldehit ile sabitlenmistir. Doku iskeleleri, çesitli alkol serilerinden geçirildikten sonra (hacimce havada kurutulmustur.

Eksozom ekilmis doku iskelelerinin yüzey morfolojileri, kültürün 7. gününde ZElSS GEMlNl-500 FESEM cihazi ile yapilmistir. Analiz altin kapli örnekler üzerinde ve düsük basinç altinda gerçeklestirilmistir. Doku iskelelerine, eksozom ekilme islemi öncesinde alinan FESEM görüntüsü Sekil 1'de verilmistir. DF-MKH Eksozomlarin FESEM görüntüsü Sekil 7'de, doku iskelelerine eksozom ekilme islemi sonrasindaki FESEM görüntüleri ise Sekil 8'de verilmistir.

Bulusta konu edilen kompozisyon, dental folikül mezenkimal kök hücre eksozomlari katkilandirilmis üç boyutlu PCL ve Jelatin içerikli doku iskelesi içeren bir yapinin tümüdür. Bu kompozisyona dahil olan bilesenlerin her biri biyobozunur ve biyouyumlu malzemelerden imal edilmektedir.

Bulusa konu kompozisyonda doku iskelesi malzemesi olarak kullanima uygun PCL ve Jelatin bilesenleri, sekil verilebilirligi yüksek ve mekanik özellikleri hedeflenen degerlerde olmasini saglamaktadir.

Kompozisyon bünyesinde yer alan DF-MKH eksozomlari bünyesinde mikro RNA, mRNA ve protein içeriginin yani sira yüksek miktarda transforme edici büyüme faktörü (TGF-b), indolamindioksijenaz (lDO), hepatosit büyüme faktörü (HGF), prostaglandin E2 (PGE2), vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), nerve growth factor (NGF), insülin growth factor (lGF) gibi parakrin faktörleri sayesinde yara iyilesme sürecini hizlandirmakta ve rejenerasyonunu saglamaktadir.

Doku iskelesi, üç boyutlu ve gözenekli bir yapiya sahip olarak hem yara tabakasinin iyilesmesine yönelik yatak pozisyonunu iyi aIabiImekte hem de etken maddelerinin salinim verimliliginin arttirilmasina olanak saglayan yapi sahip olabilmektedir. Diyabetik ülser gibi düzgün geometriye sahip olmayan tam kalinlikta ve kronik yaralarin tedavisi için düsük yogunluklu, sikistirilabilir ve kolay sekil alan pamuk benzeri üç boyutlu doku iskelesi saglanabilmektedir. Üç boyutlu doku iskelelerin, DF-MKH eksozomlarin yara yatagi boyunca daha stabil kalmasini ve homojen dagilimini tesvik eder, DF-MKH eksozom infiltrasyonu ve dermal onarim/rejenerasyon için gelistirilmis bir sentetik dermal matris olarak görev yapmaktadir.

Bulusta konu edilen kompozisyon, yara örtüleri gibi sadece yarayi örtmek ve dis enfeksiyona karsi fiziksel bir bariyer saglamakla kalmamakta ayni zamanda hem dermal fibroblastlar için hem de keratinositler için destek saglayarak deri dokusu olusumunu saglamaktadir.

Bulusta sözü edildigi üzere doku iskelesinin elektroegirme yöntemi ile elde edilmesi tek basamakta, uygun maliyetlerde üretimi söz konusu iken bu doku iskelesi gözenekli ve üç boyutlu olabilmektedir. Ayrica MKH'lerde tibbi atiklardan saglanabilmektedir. Düsük maliyetli hammaddeler kullanilarak katma degeri yüksek teknolojik bir ürün gelistirilerek ve düsük maliyetli bir tedavi önerilebilmektedir.

Bulusun koruma kapsami ekte verilen istemlerde belirtilmis olup kesinlikle bu detayli anlatimda örnekleme amaciyla anlatilanlarla sinirli tutulamaz. Zira teknikte uzman bir kisinin, bulusun ana temasindan ayrilmadan yukarida anlatilanlar isiginda benzer yapilanmalar ortaya koyabilecegi açiktir.

Claims (1)

1. STEMLER . Bulus, bilhassa diyabetik hastaligindan müzdarip kisilerde görülen tam ve kronik yaralarin tedavisinde kullanim için bir kompozisyon olup; bünyesinde, - hücre yapismasini, çogalmasini ve farklilasmasini destekleyen ve enfeksiyonlara karsi koruyan üç boyutlu ve gözenekli bir doku iskelesi ve - doku iskelesine katkilanmis, yara iyilesme sürecini hizlandirmak ve iyilesme performansini gelistirmek üzere etken madde olarak en az bir mezenkimal kök hücre eksozomu içermesi, - söz konusu doku iskelesi bünyesinde jelatin ve polikaprolakton içermesi ile karakterize edilmesidir. . Istem 1'e uygun bir kompozisyon olup özelligi; söz konusu doku iskelesi bünyesinde agirlikça 1:1 oraninda PCL:Jelatin içermesidir. . Önceki istemlerden birine uygun bir kompozisyon olup özelligi; söz konusu mezenkimal kök hücre olarak dental folikül mezenkimal kök hücre içermesidir. . Istem 3'e uygun bir kompozisyon olup özelligi; tibbi atik dislerden elde edilen mezenkimal kök hücreleri olmasi. . Bulus, bünyesinde bir doku iskelesi ve en az bir mezenkimal kök hücre eksozomu içeren bir kompozisyonun eldesi için bir yöntem olup özelligi; asagidaki esas islem adimlarini içermesidir: - PCL ve jelatin içeren polimer çözeltisinin hazirlanmasi, - elde edilen PCL ve jelatin içerikli polimer çözeltisinin elektroegirme cihazinda gerçeklestirilen islemler ile üç boyutlu ve gözenekli olacak sekilde doku iskelesi olarak eldesi, - elde edilen doku iskelesine dislerden izole edilen mezenkimal kök hücre eksozomlarinin ekilmesi ve DF-MKH eksozomlari ile katkilanmis doku iskelesinin eldesi. Istem 1'e uygun bir yöntem olup özelligi; sözü edilen polimer çözeltisi bünyesinde agirlikça 1:1 oraninda PCL:Jelatin içermesidir. Istem 5 veya Istem 6'ya uygun bir yöntem olup özelligi; polimer çözeltisinin hazirlanmasi için asagidaki islem adimlarinin gerçeklestirilmesidir: - TFE içerisinde agirlikça 1:1 oraninda poli(e-kaprolakton) ve jelatinin eklenmesi ve 10 ila 36 saat araliginda bir süre boyunca homojen çözelti eldesi için karistirilmasi. Istem 7'ye uygun bir yöntem olup özelligi; sözü edilen karistirma isleminin oda sicakliginda gerçeklestirilmesidir. .Istem 5-8'den birine uygun bir yöntem olup özelligi; sözü edilen elektroegirme islem adimi, elde edilen polimer çözeltisinin 10 ila 20 kV araliginda bir degerde islem görmesi ile gerçeklestirilmesidir. 10.Istem 5-9'dan birine uygun bir yöntem olup özelligi; elektroegirme islem adimi, elde edilen polimer çözeltisinin 0,4 ila 0,5 ml/sa araliginda bir hiz degerinde toplayici üzerinde biriktirilmesi ile gerçeklestirilmesidir. Istem 5-10'dan birine uygun bir yöntem olup özelligi; elektroegirme islemi sonrasinda elde edilen doku iskelelerine ekim öncesi ön hazirlik islemlerinin gerçeklestirilmesidir: - doku iskelelerinin daha öncesinde belirlenen ebatlara indirilmesi, - UV islemlerine tabi tutarak inkübasyon islemlerinin gerçeklestirilmesi - kültür ortaminda bekletilmesi ile sterilizasyon islemlerinin tamamlanmasi - steril edilen doku iskelelerinin %5'lik CO2 inkübatör ile inkübe edilmesi. 12.Istem 5-11'den birine uygun bir yöntem olup özelligi; mezenkimal kök hücre eksozomlarinindoku iskelelerine ekilmesi islemi asagidaki islem adimlarini içermesidir: - DF-MKH eksozomlarinin, hacimce 1:1 olacak sekilde tampon çözeltisine eklenmesi ile karisim eldesi, - elde edilen karisimin doku iskelelerine inoküle edilmesi, - inoküle isleminin gerçeklestirildigi doku iskelelerinin %5 002 inkübatör içerisinde inkübe edilmesi.