TARIFNAME KAGIT TABANLI ELEKTROKIMYASAL AKIS HÜCRESI Bulusun Ilgili Oldugu Teknik Alan Bulus, elektrokimyasal olarak tayin edilebilen türleri içeren örneklerin analizinde kullanilabilecek tek kullanimlik kâgit tabanli elektrotlara uyumlu elektrokimyasal akis hücreleri ile ilgilidir. Mevcut bulus, biyolojik sivilarda miktari belirlenmek istenen maddenin kâgit tabanli elektrokimyasal akis hücresi ve amperometri yöntemiyle yüksek performansli sivi kromatogratî teknigi kullanilarak tayin edilmesine yöneliktir. Bulusla ilgili Teknigin Bilinen Durumu Katekolaminler böbrek üstü bezlerinin iç katmaninda üretilen hormonlar grubudur. Dopamin, epinefrin (adrenalin) ve noradrenalin bu grubun baslica hormonlaridir ve bu hormonlar idrarla atilir. Katekolaminler ve metabolitleri vücutta az ve degisken miktarlarda bulunmakla birlikte stres kosullari sonrasinda ciddi miktarda artis gösterirler. Bu hormonlarin miktarindaki artis, belirli araliklarla tekrarlanan hipertansiyon krizlerine ve siddetli bas agrilarina neden olabilmektedir. Numune olarak plazma kullanildigi durumlarda, mevcut horinon miktarinin, idrar kullanildigi durumlarda ise 24 saatlik dönemdeki idrarla atilan hormon miktarinin ölçümü mümkün olmaktadir. Bu sebeple, model olarak seçilen katekolaminlerin hizli ve hassas olarak tayin edilmeleri yasam bilimleri için Önem arz etmektedir. Bu baglamda, çesitli disiplinler için farkli hedef analitler de bulundugu asikardir. Farkli alanlarda önem arz eden birçok analitin tayini için kullanilabilecek hassasiyette, basit ve hizli bir yöntem gelistirilmesi ihtiyaci göz önünde bulundurulmalidir. Her ne kadar literatürde katekolaminlerin HPLC-UV/GB dedektörlü sistemler kullanilarak analizlerinin yapildigi rapor edilmis olsa da UVIGB dedektörleri ile hiçbir cevap alinamayan ancak elektroaktif gruplara sahip olan analitler için elektrokimyasal ölçüm esasina dayanan sistemler (HPLC-EC), kütle temelli dedektörler veya kirilma indisine dayali ölçüm yöntemleri tercih edilmektedir. Fakat kütle temelli dedektörler çok pahali sistemler olduklari için ve kirilma indisi dedektörleri de kullanim zorlugu, tekrar edilebilirlik sorunlari ve düsük hassasiyetleri sebebiyle tercih edilmemektedir. Ticari olarak gelistirilen ve satisa sunulmus olan elektrokimyasal dedektörlerin bulundugu ancak bu dedektörlerin yüksek maliyetleri ve sinirli kullanimlari yüzünden yaygin olarak tercih edilmedigi bilinmektedir. Bu sebeple, birçok laboratuvarda kolaylikla temin edilebilecek potansiyostat sistemlerine entegre edilebilen bir akis hücresi tasarimi gerekliligi ortaya çikmaktadir. Iyi bir dedektör hücresinin tasimasi gereken özelliklerden bazilari, uzun ölçümlere dayanabilen yüksek kalitede elektrotlarin kullanilmasi, verilen yüksek basinçli akisa karsi sizdirmayan nitelikte olmasi ve analitlerin hassas bir sekilde tayin edilmesine olanak saglamasidir. Bu hususlar göz önünde bulundurularak gelistirilen akis hücresi tasarimlari elbette ki mevcuttur. Bunlara örnek olarak, Sansuk ve arkadaslarinin gelistirdigi akis hücresi ile dopamin tayinini hizli ve seçici bir sekilde yaptiklari görülmektedir. Ancak, bu çalismada kullanilan elektrot sistemi tarafimizdan gelistirilen kâgit elektrotlarin aksine daha maliyetli sistemler olarak görülmektedir. Yine tarafimizca gelistirilen hücre dizayni kolaylikla üç boyutlu yazici kullanilarak, çok düsük maliyetlerle hizli bir sekilde üretilebilecek nitelige sahiptir. Son olarak, model olarak seçtigimiz analit grubu incelendiginde sadece Dopamin degil, dopamin ile birlikte birçok katekolaminin tayininin de hassas ve dogru bir sekilde yapilabilirligi gösterilmistir. Nalewajko ve ekibi ise HPLC sistemine bagladiklari bir akis hücresi ile epinefrin, norepinefrin, dopamin ve L-dopa"nin biyolojik sivilardan kemilüminesans ölçümüne dayali tayinlerini rapor etmislerdir. Biyolojik numunelerin analizi öncesinde ise anal iz süresinin uzamasina sebep olabilecek bir kati faz ekstraksiyon yöntemi ile numune hazirligi yapmislardir. Mevcut bulus ile kiyaslandiginda çok daha kompleks ve maliyetli bir sistem olarak görülen bu akis hücresinin rutin kullanim için uygulanabilirligi yetersiz ve üretilmesi zor görülmektedir. Simdiye kadar gelistirilmis olan elektrokimyasal akis hücreleri gerek üretimleri gerekse kullanilan elektrotlar bakimindan çok basamakli deneysel prosedüre ihtiyaç duymaktadir. Ayrica maliyet açisindan ve gerçek örneklerin analizi açisindan gelistirilmeleri gerekmektedir. Bu yüzden, analitlerin yüksek duyarlilikta analizini mümkün kilan; ayni zamanda pratik kullanima sahip, üretimi kolay, minyatürize edilebilmeye uygun, daha az numune hacmi ile çalismaya elverisli ve hasta basi analizlerde (point of care) kullanilabilecek olan platformlarin gelistirilmesi ihtiyaci bulunmaktadir. Bulusun Amaci Bulus, tek kullanimlik kâgit tabanli elektrotlara adapte edilen akis hücresinin gelistirilmesi ile ilgilidir. Gelistirilen kâgit tabanli elektrokimyasal akis hücresi ile katekolaminlerin tayini amperometri yöntemiyle yüksek performansli sivi kromatografi (HPLC-EC) teknigi kullanilarak gerçeklestirilmistir. Sunulan bulus, biyolojik sivilarda hedef moleküllerin birbiri yaninda tayin edilmesini saglamak amaciyla gelistirilen bir yöntemdir. Gelistirilen yöntemde yüksek performansli sivi kromatografi ile hedef moleküller birbirinden ayrilir ve kâgit tabanli elektrokimyasal akis hücresi ile amperometrik tayinleri gerçeklestirilir. HPLC ile UV/GB, fotodiyot dizi, floresans, iletkenlik, kirilma indisi, elektrokimyasal ve kütle dedektörleri gibi çesitli dedektörler kullanilmaktadir. HPLC sistemleri ile kullanilan elektrokimyasal dedektörler yüksek hassasiyetle tayin imkâni sunmaktadir. Fakat klasik elektrokimyasal dedektör sistemlerinde, nispeten daha pahali ve kullanim kolayligi olmayan üç elektrotlu sistemler kullanilir. Bu yüzden düsük maliyetli ve kullanim kolayligi olan dedektör sistemlerinin gelistirilmesi ihtiyaci dogmustur. Sunulan bulusun amaci, tek kullanimlik kâgit tabanli elektrotlara özgü akis hücresi ile hedef moleküllerin tayinini seçici bir sekilde gerçeklestirmektir. Kâgit tabanli elektrotlarin en önemli avantaji maliyetinin düsük olmasi ve hedef moleküle Özgü yüzey modifikasyonlarinin yapilabilmesidir. Bulusu Gösteren Sekillerin Açiklamasi Sekil 1. Kagit tabanli elektrokimyasal akis hücresinin bilesenlerini gösterir Sekil 2. Elektrokimyasal akis hücresinin birinci ana bilesenini gösterir Sekil 3. Elektrokimyasal akis hücresinin birinci ana bilesenin üstten görünümünü gösterir Sekil 4. Elektrokimyasal akis hücresinin birinci ana bilesenin yandan görünümünü gösterir Sekil 5. Elektrokimyasal akis hücresinin birinci ana bilesenin önden görünümünü gösterir Sekil 6. Elektrokimyasal akis hücresinin ikinci ana bilesenini gösterir Sekil 7. Elektrokimyasal akis hücresinin ikinci ana bilesenin üstten görünümünü gösterir Sekil 8. Elektrokimyasal akis hücresinin ikinci ana bilesenin yandan görünümünü gösterir Sekil 9. Kâgit tabanli elektrot üretiminde hidrofobik bariyer olusumunu gösterir Sekil 10. Kâgit tabanli elektrot olusturulmak üzere çalisma, referans ve karsit elektrotlarin nitroselüloz membran yüzeyine baskilanmis halini gösterir Sekil 11. Elektrokimyasal akis hücresinde sizdirmazligi saglamak üzere kullanilan kauçuk contanin seklini gösterir Sekil 12. Örnek olarak çalisilan katekolaminlerin 0,5-20,0 ug/mL konsantrasyon araliginda olusturulan kalibrasyon grafigini gösterir (HPLC-EC ölçümleri RP-C18 kolonu ve % fosfat tamponu (pH 3.8): metanol karisimindan olusan hareketli faz kullanilarak 0,8 mL/dk akis hizinda, +0.5 V potansiyelde gerçeklestirilmistir.) Sekil 13. Örnek olarak çalisilan katekolaminlerin O,5-20,0 üg/mL konsantrasyon araliginda elde edilen amperometrik sinyallerini gösterir. (HPLC-EC ölçümleri RP-C18 kolonu ve %973 (V/V] fosfat tamponu (pH 3.8): metanol karisimindan olusan hareketli faz kullanilarak 0.8 mL/dk akis hizinda, +0.5 V potansiyelde gerçeklestirilmistir.) Sekil 14. Örnek olarak çalisilan katekolaminlerin (a) pH 3.8 fosfat tamponunda, (b) kanda ve (Ci idrarda, 10,0 ug/mL konsantrasyondaki amperometrik sinyallerini gösterir Bulusu Olusturan Unsurlar 1. Ölçüm araciyla baglantiyi kurmak için kullanilan pogo pinlerin yerlestirilecegi kart 2. Ölçüm araciyla baglantiyi kurmak için kullanilan tellerin yerlesecegi kanallar 3. Pogo pinlerin elektrotlarla temasini saglamak için yerlestirilecegi kanallar 4. E Iektrokimyasal akis hücresinin giris portu . Hareketli faz akisinin saglandigi kanallar 6. Conta haznesi 7. Vida delikleri 8. Elektrokimyasal akis hücresinin çikis portu 9. Kâgit tabanli elektrodun yerlestirilecegi hazne Vida yuvalarinin yerlesecegi delikler Nitroselüloz membran (Kâgit tabanli elektrot destek materyali] Hidrofobik mum bariyer Reaksiyon hücresi Vida delikleri Çalisma elektrodu Referans elektrot Karsit elektrot Bakir bant Karbidopa Dopamin Levodopa Norepinefrin Bulusun Detayli Açiklamasi Sunulan bulus, biyolojik numunelerde hedef molekül miktarinin belirlenmesi için gelistirilen bir yöntem olup, hedef molekülü içeren numunenin elektrokimyasal akis hücresi kullanilarak amperometri yöntemiyle birlestirilen HPLC teknigi ile ölçümüne dayalidir. 1. Tanimlamalar Bahsedilen bulusta adi geçen "hedef molekül" terimi, tayin edilebilen, ölçülebilen veya tayin edilebilir sinyal üretimini baslatan bir bilesigi betimler. Hedef moleküller; enzimler, metal iyonlari, toksinler, organik bilesikler, proteinler, peptitler, amino asitler, karbonhidratlar, nükleik asitler, hormonlar, vitaminler, biyolojik sivilarda (kan, idrar, tükürük örnekleri) bulunan küçük moleküller, ilaç etken maddeleri, fenolik bilesikler olabilir. Bu maddelere örnek olarak epinefrin, norepinefrin, dopamin, levodopa, karbidopa, askorbik asit, ürik asit, glikoz, fruktoz, galaktoz, Bulusta adi geçen "numune" terimi hedef molekülü içerdigi düsünülen materyale isaret eder. Numune direkt olarak kaynaktan elde edildigi gibi kullanilabilir veya bir ön isleme tabi tutularak analiz edilebilir. Numune kan, idrar, ter, tükürük, süt, mukus gibi bir biyolojik kaynaktan veya farmasötik preparatlar veya bitki ekstreleri gibi kaynaklardan elde edilmis olabilir. Biyolojik sivilara ek olarak su, gida ürünleri, çevresel örnekler de numune tanimina girebilir. Numuneler kullanilmadan önce, kandan plazma veya serum elde edilmesi, viskoz sivilarin seyreltilmesi veya türevlendirme yapilmasi gibi bir takim ön islemlere tabi tutulabilir. Ön hazirlik islemleri; filtreleme, ön deristirme ve girisim yapan türlerin uzaklastirilmasi islemlerini içerebilir. 2. Elektrokimyasal akis hücresi Sunulan bulus, bir kâgit tabanli elektrot (Sekil 10) ve iki ana bilesenden olusan bir akis hücresinin bir araya gelmesiyle olusan elektrokimyasal akis hücresi (Sekil 1) ile ilgilidir. Ilk bilesen (Sekil 2) kanallar yardimiyla (5) elektrot boyunca hareketli faz akisina olanak saglarken, ikinci bilesen (Sekil 6) kâgit tabanli elektrodun yerlestirilecegi bir destek niteligi tasir. Ilk bilesende hareketli faz akisini saglamak üzere giris (4) ve çikis (8) portlari bulunur. Ayrica, kâgit tabanli elektrot ve ölçüm cihazi arasindaki baglantiyi saglamak üzere her üç elektrot (çalisma, referans, karsit elektrotlar) ile temas edebilen üç pogo pin (3) içeren bir kart (1) yer alir. Pogo pinlerle baglantili teller (2) cihaz ile baglantiyi saglar. lletkenligi artirmak için kâgit tabanli elektrotta yer alan çalisma (15), referans (16) ve karsit (17) elektrotlara bakir bant (18) yapistirilir. Ikinci bilesen, kâgit tabanli elektrodun yerlestirilebilecegi bir hazneye (9) sahiptir. Bu iki bilesen arasina kâgit tabanli elektrot ile sizdirmazligi saglamak ve reaksiyon hücresi olusturmak üZEre kullanilan bir conta (19) yerlestirilerek elektrokimyasal akis hücresi hazir hale getirilir. Ilk bilesende ayrica contanin yerlestirilecegi bir hazne (6) bulunur. Kâgit tabanli elektrotla birlestirilen akis hücresi, çalisilan hareketli faz çözeltileri ile büyük oranda çözünmeyen yapidadir. Akis hücresi kimyasal olarak inert, iletken olmayan, fiziksel olarak stabil herhangi bir materyalden üretilebilir. Akis hücresi, bunlarla sinirli olmamakla birlikte; polyester, polikarbonat, polisitren gibi film plastikler, alümina, zirkonyum oksit polidimetil siloksan, magnezyum oksit gibi seramikler ve silikon plaka, plastik cam gibi materyallerden üretilebilir. Elektrokimyasal akis hücresi, numunede bulunabilecek olan hedef molekülün elektrokimyasal olarak tayinine olanak saglayan, çalisma elektrodu (15l, referans elektrot (16) ve karsit elektrot (17) içeren substrata uyumludur. Bahsi geçen bulusta substrat olarak kâgit tabanli elektrot üretilmis ve buna Uyumlu elektrokimyasal akis hücresi tasarlanmistir. Kâgit içerigi, bunlarla sinirli olmamakla birlikte, selüloz, hekza metilen diamin, poli-tetra floroetilen, camsi fiber, tercihen nitroselüloz membran olabilir. Kullanilan kâgit materyalin kalinligi 100,0 ila 1000,0 tim, gözenek boyutu ise 0,02 ila 20,0 pm arasinda degismektedir. Substrat materyali olarak kâgit disinda, perde baskili elektrotlarin hazirlanmasinda kullanilan malzemeler de kullanilabilir. Referans elektrot; (ii numunenin potansiyelini sabitleyen veya numuneye sabit bir potansiyel saglayan bir materyal veya birkaç materyalin karisimindan olusur ve (ii) içerisinde eser miktarda bulunan iletken materyal, cihazin ürettigi potansiyele karsi büyük ölçüde inerttir ve tayin araci ile baglanti kurma yetenegine sahiptir. Sabit potansiyel üretebilen materyaller gümüs/ gümüs klorür/gratit karisimlari, civa/Civa klorür karisimlari, gümüs/ gümüs iyodür karisimlari gibi redoks çiftlerinden olusabilir, fakat bunlarla Sinirli degildir. Kâgit tabanli elektrotlar ve perde baskili elektrotlarda gümüs/gümüs klorür karisimlari tercih edilir. Referans elektrot hazirlamak için kullanilan mürekkep (ink) içerisinde eser miktarda bulunan iletken malzeme, bunlarla sinirli olmamakla birlikte, altin, karbon, nikel, paladyum, rutenyum, rodyum, kalay oksit, indiyum kalay oksit, tercihen karbon gibi maddeler olabilir. Karsit elektrot; (i) cihazin ürettigi potansiyele karsi göreceli olarak inert olan, (ii) elektrokimyasal olarak iletken bir materyalden olusabilir. Bu özelliklere sahip materyaller, bunlarla sinirli olmamakla beraber altin, karbon, nikel, gümüs, paladyum, rutenyum, rodyum, kalay oksit, indiyum kalay oksit tercihen karbon gibi maddelerden olusabilir. Çalisma elektrodu; (i) bir iletken materyal, (ii) hedefmolekülden sinyal alinmasini saglayacak bir materyal ve/Veya (iii) hedef molekülün sinyalini artirmak için kullanilan bir materyalden olusabilir. Iletken materyal, bu maddelerle sinirli olmamakla birlikte, altin, platin, karbon, nikel, gümüs, paladyum, rutenyum, rodyum, kalay oksit, indiyum kalay oksit, tercihen karbondan olusabilir. Sinyal artirmak için kullanilabilecek olan materyal, farkli sekil ve boyutlara sahip altin, paladyum, platin gibi nanopartiküller, karbon nanotüp, grafen, grafit gibi nanomalzemelerden olusabilir. Nanopartiküller çalisma elektrodunun yüzeyine elektrokimyasal indirgenme ya da yüzeye immobilizasyon teknikleri ile tutundurulabilirler. Diger nanomalzemeler, bunlarla sinirli olmamakla birlikte, yüzeyde biriktirme veya immobilizasyon gibi teknikler ile tutundurulabilirler. Conta materyali tipik olarak kimyasal veya elektrokimyasal olarak inert, büyük oranda tutucu olmayan ve suya dayanikli bir malzemeden üretilmis olabilir. Bu özellikleri içeren materyallere örnek olarak, bunlarla sinirli olmamakla birlikte, nitril kauçuk, stiren-butadien kauçuk, hidrojenlenmis nitril kauçuk, etilen propilen dien kauçuk, silikon, floroplastik, pertloroelastomer gibi malzemeler kullanilabilir. Akis hücresinde kullanilacak olan contanin kalinligi büyük oranda kâgit elektrotta olusturulmak istenen reaksiyon hücresinin hacmine baglidir. Sunulan bulusta 1,0 mm kalinliginda kauçuk conta kullanilir. Yüksek hacimde numune ile çalisilmasi gereken durumlarda conta kalinligi artirilabilir. Reaksiyon hücresinde bulunan numune miktari, substratin araligindadir. Sunulan bulusta elektrokimyasal akis hücresi yalnizca üç elektrotlu sistemler ile sinirli degildir. Iki elektrotlu sistemler (çalisma ve referans/karsit kombine elektrot gibi) ve dahasi kagit tabanli elektrotlar disindaki plastik substratlar (poliamit Vb.) gibi esnek materyaller kullanilarak hazirlanan elektrotlar ile uyumlu olacak sekilde tasarlanabilir. Kâgit tabanli elektrot, hedef molekül ile etkilestiginde tayin edilebilir sinyal üretebilir. Akis hücresi, içerisine yerlestirilen kâgit tabanli elektrot degistirilerek çoklu numune analizinde kullanilabilecegi için tekrar kullanilabilme özelligine sahiptir. Ayrica hedef molekül veya molekülleri içerdigi düsünülen ayni numunenin tekrar eden ölçümleri için ayni kagit tabanli elektrot kullanilabilirken, farkli bir numunenin analizi yapilirken akis hücresi degistirilmeksizin kagit tabanli elektrot degistirilebilir. Sunulan bulusla ilgili kâgit tabanli elektrot, kullanima bagli olarak tek kullanimlik veya tekrar kullanilabilir ve düsük maliyetli olmakla birlikte kullanimi kolaydir. Yararlanilan elektrot materyaline göre sinyal/ gürültü orani artirilabilir ve elektrokimyasal girisimler azaltilabilir. 3. Elektrokimyasal akis hücresi üretimi Akis hücresi, bu maddelerle sinirli olmamakla birlikte, poli(metilmetakrilat) ve polidimetil siloksan gibi malzemelerin lazer kesici ile veya tercihen UV isikta (sunulan bulusta 405 nm) polimerlesen bir polimer reçinenin, 3D yazici kullanilarak stereolitografi teknigi ile tabaka tabaka islenmesiyle üretilebilir. Akis hücresi, elektrokimyasal sinyal üretimini saglamak amaciyla kullanilacak olan substrati içerecek sekilde iki parçadan olusabilir. Sunulan bulusta kullanilan substratin (kâgit tabanli elektrotlarin), 11) hidrOfObik bariyerleri (12), bu tekniklerle sinirli olmamakla birlikte, inkjet yazici, fotolitografi, tercihen mum yazici kullanilarak olusturulabilir ve reaksiyon hücresi (13) hazirlanmis olur. Kâgit tabanli elektrot yüzeyinde çalisma, referans ve karsit elektrotlar, bu yöntemlerle sinirli olmamakla birlikte, sprey boyama yapilarak, fotolitografi veya serigrafi, tercihen kalip kullanilarak hazirlanabilir. Sunulan bulusta kullanilan kalip çalisma, referans ve karsit elektrotlarin seklini içerir ve iletken boya ile boyanarak elektrotlar substrat yüzeyine baskilanir. 4. Tayin ve akis sistemi araçlari Numune içerisinde bulunma ihtimali olan hedef molekülün elektrokimyasal cevabinin saglanacagi tayin araçlari, potansiyostatlar veya potansiyometreler gibi ölçüm araçlari olabilir. Akis hücreleri bu tayin araçlari ile baglanti kurabilecek sekilde tasarlanabilir. Baglanti, bu maddelerle sinirli olmamakla birlikte iletken tel, timsah, kelepçe gibi aparatlar kullanilarak saglanabilir. Akis hücresi, kanallardan numune akisina olanak saglamak üzere akis sistemi araçlariyla uyumlu olmalidir. Kullanilabilecek akis sistemi araçlari, bunlarla sinirli olmamakla birlikte, siringa, siringa pompasi, peristaltik pompa, basinç pompasi, vakum kaynagi, tercihen pistonlu pompa olabilir. . Yüksek Performansli Sivi Kromatogri-Elektrokimyasal Tayin Yöntemi (HPLC-EC) için prosedür Bulusun uygulamasinin bir örnegi, kâgit tabanli elektrotlarin çalisma elektrodu altin nanopartikül ve çok duvarli karbon nanotüp (MWCNT) ile modifiye edildikten sonra bazi katekolaminlerin (karbidopa (C-Dopa) (20), epinefrin (EPI) (21), dopamin (DA) (22), Ievodopa (L-Dopa) (23), norepinefrin (NE) (24)) tayini amperometri yöntemiyle yüksek performansli sivi kromatografi (H P LC-EC) teknigi kullanilarak gerçeklestirilir. Katekolaminlerin kromatografik ayrimi, hareketli faz olarak, 0,1 M sodyum dIhIclrojen fosfat (NaHzPO, 0,1 mM l-heptan sülfonik asit 0,8 mL/dk akis hizinda, sisteme 50,0 uL numune enjeksiyonu yapilarak saglanir. Tüm deneyler oda sicakliginda gerçeklestirilir. HPLC-EC analizi, Ag|AgCl elektroda karsi +0,5 V potansiyel uygulanarak am perometrik i-t egrisi teknigi ile gerçeklestirilir, Ölçüm almadan önce, tampon çözelti kaynakli akimi stabilize etmek amaciyla akis hücresinde bulunan kâgit elektrottan 15 dk boyunca hareketli faz akisi saglanir. Her bir katekolamin için 0,5 ug/mL-20,0 ug/mL araliginda standart çözeltiler hazirlanir. Sisteme enjekte edilerek kalibrasyon grafigi olusturulur ve tayin siniri (LOD) belirlenir. Elde edilen kalibrasyon grafiklerinin denklemleri ve R2 degerleri C-Dopa, EPI, DA, L-Dopa ve NE için sirasiyla asagidaki gibi verilebilir. Örnek olarak kan ve idrar numunelerine üç farkli konsantrasyonda (2,5; 5,0 ve 10,0 ug/mL) her bir katekolamin ilave edilir, santrifüj filtresi ile kan hücreleri ve proteinler ayrilir. Filtrelenen numune HPLC-EC sistemine enjekte edilir. Sunulan bulusun uygulanabilirligini göstermek için bu n u m u nelerdeki hedef moleküllerin geri kazanim degerleri hesaplanabilir. TR TR TR DESCRIPTION PAPER-BASED ELECTROCHEMICAL FLOW CELL Technical Field to which the Invention Relates The invention relates to electrochemical flow cells compatible with disposable paper-based electrodes that can be used in the analysis of samples containing electrochemically detectable species. The present invention is aimed at the determination of the substance to be quantified in biological liquids using high-performance liquid chromatography technique with paper-based electrochemical flow cell and amperometry method. State of the Art Regarding the Invention Catecholamines are a group of hormones produced in the inner layer of the adrenal glands. Dopamine, epinephrine (adrenaline) and noradrenaline are the main hormones of this group, and these hormones are excreted in the urine. Although catecholamines and their metabolites are found in small and variable amounts in the body, they increase significantly after stress conditions. The increase in the amount of these hormones can cause hypertension crises and severe headaches that are repeated at certain intervals. When plasma is used as a sample, it is possible to measure the amount of hormone present, and when urine is used, it is possible to measure the amount of hormone excreted in urine in a 24-hour period. For this reason, rapid and sensitive determination of catecholamines selected as models is important for life sciences. In this context, it is obvious that there are different target analytes for various disciplines. The need to develop a simple and rapid method with sensitivity that can be used for the determination of many analytes that are important in different fields should be taken into consideration. Although it has been reported in the literature that catecholamines are analyzed using systems with HPLC-UV/GB detectors, systems based on electrochemical measurement (HPLC-EC), mass-based detectors or refractive index-based methods are used for analytes that do not receive any response with UVIGB detectors but have electroactive groups. measurement methods are preferred. However, mass-based detectors are not preferred because they are very expensive systems and refractive index detectors are not preferred due to their difficulty in use, repeatability problems and low sensitivity. It is known that there are commercially developed and commercially available electrochemical detectors, but these detectors are not widely preferred due to their high costs and limited use. For this reason, there is a need to design a flow cell that can be integrated into potentiostat systems that can be easily obtained in many laboratories. Some of the features that a good detector cell should have are the use of high quality electrodes that can withstand long measurements, be leak-proof against the high pressure flow given, and enable the sensitive determination of analytes. Of course, there are flow cell designs developed taking these issues into consideration. As an example, it can be seen that Sansuk and his colleagues can determine dopamine quickly and selectively with the flow cell they developed. However, the electrode system used in this study is seen as more costly systems, unlike the paper electrodes developed by us. Again, the cell design developed by us has the quality to be produced quickly and at very low costs, using a three-dimensional printer. Finally, when the analyte group we chose as a model is examined, it has been shown that the determination of not only Dopamine but also many catecholamines along with dopamine can be made sensitively and accurately. Nalewajko and his team reported the determination of epinephrine, norepinephrine, dopamine and L-dopa from biological fluids based on chemiluminescence measurement with a flow cell they connected to the HPLC system. Before the analysis of biological samples, sample preparation was made with a solid phase extraction method, which may prolong the anal scar duration. The applicability of this flow cell, which is seen as a much more complex and costly system compared to the current invention, is insufficient for routine use and difficult to produce. The electrochemical flow cells developed so far require a multi-step experimental procedure in terms of both their production and the electrodes used. In addition, the cost is high. Therefore, they need to be developed in terms of analysis of real samples, which enable the analysis of analytes with high sensitivity, are also practical to use, easy to produce, suitable for miniaturization, suitable for working with less sample volume, and can be used in point-of-care analyses. There is a need to develop platforms. Purpose of the Invention The invention relates to the development of a flow cell adapted to disposable paper-based electrodes. The determination of catecholamines with the developed paper-based electrochemical flow cell was carried out using high-performance liquid chromatography (HPLC-EC) technique with amperometry method. The presented invention is a method developed to enable the determination of target molecules next to each other in biological fluids. In the developed method, target molecules are separated from each other by high-performance liquid chromatography and amperometric determinations are performed with a paper-based electrochemical flow cell. Various detectors such as UV/GB, photodiode array, fluorescence, conductivity, refractive index, electrochemical and mass detectors are used with HPLC. Electrochemical detectors used with HPLC systems offer high sensitivity determination. However, in classical electrochemical detector systems, three-electrode systems are used, which are relatively more expensive and not easy to use. Therefore, there is a need to develop low-cost and easy-to-use detector systems. The aim of the presented invention is to selectively perform the determination of target molecules with the flow cell specific to disposable paper-based electrodes. The most important advantage of paper-based electrodes is their low cost and the ability to make surface modifications specific to the target molecule. Description of Figures Showing the Invention Figure 1. Shows the components of the paper-based electrochemical flow cell Figure 2. Shows the first main component of the electrochemical flow cell Figure 3. Shows the top view of the first main component of the electrochemical flow cell Figure 4. Shows the side view of the first main component of the electrochemical flow cell Figure 5 Figure 6. Shows the front view of the first main component of the electrochemical flow cell. Figure 6. Shows the second main component of the electrochemical flow cell. Figure 7. Shows the top view of the second main component of the electrochemical flow cell. Figure 8. Shows the side view of the second main component of the electrochemical flow cell. Figure 9. Paper-based electrode It shows the formation of a hydrophobic barrier in production. Figure 10. It shows the working, reference and counter electrodes printed on the nitrocellulose membrane surface to create a paper-based electrode. Shows the calibration graph created in the concentration range of 20.0 ug/mL (HPLC-EC measurements were carried out at a flow rate of 0.8 mL/min, at a potential of +0.5 V, using a RP-C18 column and a mobile phase consisting of a mixture of % phosphate buffer (pH 3.8): methanol .) Figure 13. As an example, it shows the amperometric signals of the catecholamines studied in the concentration range of 0.5-20.0 ug/mL. (HPLC-EC measurements were carried out using an RP-C18 column and a mobile phase consisting of a mixture of 973% (V/V] phosphate buffer (pH 3.8): methanol, at a flow rate of 0.8 mL/min, at a potential of +0.5 V.) Figure 14. Sample sample It shows the amperometric signals of catecholamines at a concentration of 10.0 ug/mL in (a) pH 3.8 phosphate buffer, (b) blood and (Ci urine) Elements of the Invention 1. Card on which the pogo pins used to establish the connection with the measurement tool will be placed 2. To establish the connection with the measurement tool Channels where the wires used will be placed 3. Channels where the Pogo pins will be placed to ensure contact with the electrodes 4. E Entrance port of the electrochemical flow cell Channels where the mobile phase flow is provided 6. Gasket chamber 7. Screw holes 8. Output port of the electrochemical flow cell 9. Chamber where the paper-based electrode will be placed Holes where screw slots will be placed Nitrocellulose membrane (Paper-based electrode support material] Hydrophobic wax barrier Reaction cell Screw holes Working electrode Reference electrode Counter electrode Copper tape Carbidopa Dopamine Levodopa Norepinephrine Detailed Description of the Invention The presented invention is a method developed to determine the amount of target molecules in biological samples. It is based on the measurement of the sample containing the target molecule by the HPLC technique combined with the amperometry method using an electrochemical flow cell. 1. Definitions The term "target molecule" mentioned in the said invention describes a compound that initiates the production of a detectable, measurable or detectable signal. Target molecules; These may be enzymes, metal ions, toxins, organic compounds, proteins, peptides, amino acids, carbohydrates, nucleic acids, hormones, vitamins, small molecules found in biological fluids (blood, urine, saliva samples), drug active ingredients, and phenolic compounds. Examples of these substances are epinephrine, norepinephrine, dopamine, levodopa, carbidopa, ascorbic acid, uric acid, glucose, fructose, galactose. The term "sample" mentioned in the invention refers to the material thought to contain the target molecule. The sample can be used directly from the source or analyzed after pre-treatment. The sample may be obtained from a biological source such as blood, urine, sweat, saliva, milk, mucus, or from sources such as pharmaceutical preparations or plant extracts. In addition to biological fluids, water, food products, and environmental samples may also fall within the definition of sample. Before use, samples may be subjected to a number of pre-treatments, such as obtaining plasma or serum from blood, diluting viscous liquids or derivatization. Preliminary preparation procedures; may include filtration, pre-concentration and removal of interfering species. 2. Electrochemical flow cell The presented invention is related to the electrochemical flow cell (Figure 1), which is formed by combining a paper-based electrode (Figure 10) and a flow cell consisting of two main components. While the first component (Figure 2) allows mobile phase flow through the electrode (5) with the help of channels, the second component (Figure 6) serves as a support on which the paper-based electrode can be placed. The first component has input (4) and output (8) ports to ensure mobile phase flow. Additionally, there is a board (1) containing three pogo pins (3) that can contact all three electrodes (working, reference, counter electrodes) to ensure the connection between the paper-based electrode and the measuring device. Wires (2) connected to pogo pins provide connection to the device. To increase conductivity, copper tape (18) is adhered to the working (15), reference (16) and counter (17) electrodes in the paper-based electrode. The second component has a chamber (9) into which the paper-based electrode can be placed. The electrochemical flow cell is made ready by placing a gasket (19) used to seal the paper-based electrode and create a reaction cell between these two components. The first component also includes a chamber (6) where the gasket will be placed. The flow cell combined with the paper-based electrode is largely insoluble with the mobile phase solutions studied. The flow cell can be manufactured from any chemically inert, non-conductive, physically stable material. Although the reflection cell is not limited to these; It can be produced from film plastics such as polyester, polycarbonate, polystyrene, ceramics such as alumina, zirconium oxide, polydimethyl siloxane, magnesium oxide, and materials such as silicon plate and plastic glass. The electrochemical flow cell is compatible with the substrate containing the working electrode (15l), reference electrode (16) and counter electrode (17), which allows the electrochemical determination of the target molecule that may be present in the sample. In the aforementioned invention, a paper-based electrode was produced as the substrate and a compatible electrochemical flow cell. The paper content may be, but is not limited to, cellulose, hexa methylene diamine, poly-tetra fluoroethylene, glassy fiber, preferably nitrocellulose membrane. The thickness of the paper material used is 100.0 to 1000.0 tim and the pore size is 0.02 to 20 tim. It varies between 0 pm. Apart from paper, materials used in the preparation of screen printed electrodes can also be used as the substrate material. Reference electrode consists of (ii) a material or a mixture of several materials that fixes the potential of the sample or provides a constant potential to the sample, and (ii) contains trace amounts of The conductive material is largely inert to the potential generated by the device and is capable of coupling with the detection instrument. Materials capable of producing constant potential may consist of redox couples such as, but are not limited to, silver/silver chloride/gratite mixtures, mercury/Mercuric chloride mixtures, silver/silver iodide mixtures. Silver/silver chloride mixtures are preferred in paper-based electrodes and screen-printed electrodes. The conductive material contained in trace amounts in the ink used to prepare the reference electrode can be, but is not limited to, substances such as gold, carbon, nickel, palladium, ruthenium, rhodium, tin oxide, indium tin oxide, preferably carbon. Anti-electrode; It may consist of a material that is (i) relatively inert to the potential generated by the device, (ii) electrochemically conductive. Materials with these properties may consist of, but are not limited to, substances such as gold, carbon, nickel, silver, palladium, ruthenium, rhodium, tin oxide, indium tin oxide, preferably carbon. Working electrode; It may consist of (i) a conductive material, (ii) a material that will enable signal reception from the target molecule and/or (iii) a material used to increase the signal of the target molecule. The conductive material may consist of, but is not limited to, gold, platinum, carbon, nickel, silver, palladium, ruthenium, rhodium, tin oxide, indium tin oxide, preferably carbon. The material that can be used to increase the signal may consist of nanoparticles such as gold, palladium and platinum with different shapes and sizes, and nanomaterials such as carbon nanotubes, graphene and graphite. Nanoparticles can be attached to the surface of the working electrode by electrochemical reduction or surface immobilization techniques. Other nanomaterials can be attached via techniques such as, but not limited to, surface deposition or immobilization. The gasket material may typically be manufactured from a material that is chemically or electrochemically inert, substantially nonretentive, and water resistant. Examples of materials containing these properties include, but are not limited to, materials such as nitrile rubber, styrene-butadiene rubber, hydrogenated nitrile rubber, ethylene propylene diene rubber, silicone, fluoroplastic, perchloroelastomer. The thickness of the gasket to be used in the flow cell largely depends on the volume of the reaction cell desired to be created in the paper electrode. In the presented invention, a 1.0 mm thick rubber gasket is used. In cases where it is necessary to work with high volumes of samples, the gasket thickness can be increased. The amount of sample in the reaction cell is within the range of the substrate. In the presented invention, the electrochemical flow cell is not limited to three-electrode systems. It can be designed to be compatible with two-electrode systems (such as working and reference/counter combined electrodes) and electrodes prepared using flexible materials such as plastic substrates (polyamide, etc.) other than paper-based electrodes. The paper-based electrode can produce detectable signal when interacting with the target molecule. The flow cell has the feature of reusability as it can be used in multiple sample analysis by changing the paper-based electrode placed inside. Additionally, the same paper-based electrode can be used for repeated measurements of the same sample thought to contain the target molecule or molecules, while when analyzing a different sample, the paper-based electrode can be changed without changing the flow cell. The paper-based electrode of the presented invention is disposable or reusable depending on the use and is easy to use while being low-cost. Depending on the electrode material used, the signal/noise ratio can be increased and electrochemical interference can be reduced. 3. Electrochemical flow cell production Flow cell, although not limited to these materials, is made of materials such as poly(methylmethacrylate) and polydimethyl siloxane, using a laser cutter or preferably a polymer resin polymerized in UV light (405 nm in the presented invention), layer by layer using stereolithography technique using a 3D printer. can be produced by processing. The flow cell may consist of two parts, including the substrate to be used to produce electrochemical signals. The hydrophobic barriers (12) of the substrate (paper-based electrodes) used in the present invention, 11) can be created using an inkjet printer, photolithography, preferably a wax printer, although not limited to these techniques, and the reaction cell (13) is prepared. Working, reference and counter electrodes on the paper-based electrode surface can be prepared by spray painting, photolithography or screen printing, preferably using stencils, although these methods are not limited to these methods. The mold used in the presented invention contains the shape of the working, reference and counter electrodes, and the electrodes are printed on the substrate surface by painting them with conductive paint. 4. Detection and flow system tools. Determination tools that provide the electrochemical response of the target molecule that may be present in the sample may be measurement tools such as potentiostats or potentiometers. Flow cells can be designed to interface with these detection instruments. Although the connection is not limited to these materials, it can be achieved using devices such as conductive wire, crocodile, and clamps. The flow cell must be compatible with the flow system instrumentation to allow sample flow through the channels. Flow system means that may be used include, but are not limited to, a syringe, syringe pump, peristaltic pump, pressure pump, vacuum source, preferably a piston pump. . Procedure for High Performance Liquid Chromatography-Electrochemical Determination Method (HPLC-EC) An example of the application of the invention is the detection of some catecholamines (carbidopa (C-Dopa) (20) after the working electrode of paper-based electrodes is modified with gold nanoparticle and multi-walled carbon nanotube (MWCNT). ), determination of epinephrine (EPI) (21), dopamine (DA) (22), Ievodopa (L-Dopa) (23), norepinephrine (NE) (24)) by amperometry method using high performance liquid chromatography (H P LC-EC) technique. It is carried out using . Chromatographic separation of catecholamines is achieved by injecting 50.0 uL sample into the system with 0.1 M sodium dihydrogen phosphate (Na Hz PO , 0.1 mM l-heptane sulfonic acid) as the mobile phase, at a flow rate of 0.8 mL/min. All experiments were carried out at room temperature. HPLC-EC analysis is performed with am perometric i-t curve technique by applying +0.5 V potential against the Ag|AgCl electrode. Before taking measurements, mobile phase flow is provided through the paper electrode in the flow cell for 15 minutes in order to stabilize the buffer solution-induced current. Standard solutions are prepared in the range of 0.5 ug/mL-20.0 ug/mL for each catecholamine. By injecting it into the system, a calibration chart is created and the limit of detection (LOD) is determined. The equations and R2 values of the resulting calibration charts are used for C-Dopa, EPI , DA, L-Dopa and NE can be given as follows, respectively: For example, each catecholamine is added to blood and urine samples at three different concentrations (2.5, 5.0 and 10.0 ug/mL), and the blood cells are filtered through a centrifugal filter. and proteins are separated. The filtered sample is injected into the HPLC-EC system. To demonstrate the applicability of the presented invention, the recovery values of the target molecules in these samples can be calculated.TR TR TR