TR2021017505A2 - Enjekte edilebilir kemik greft malzemesi. - Google Patents

Abstract

Mevcut buluşta seramik partikülleri, biyopolimer ve stabilizatör içerikli bir kemik greft malzemesi sunulmaktadır. Söz konusu kemik greft malzemesi seramik partikülleri olarak beta-trikalsiyum fosfat, biyopolimer olarak hiyalüronik asit ve stabilizatör olarak sitrik asit, sitrik asit tuzları ve sitrat iyonları arasından seçilen bir ya da daha fazlası ile birlikte nanokristalin selüloz içermektedir. Mevcut buluşta ilaveten, böyle bir kemik greft malzemesinin temini için bir yöntem sunulmaktadır.

Description

TARIFNAME ENJEKTE EDILEBILIR KEMIK GREFT MALZEMESI Teknik alan Mevcut bulus ortopedi, travmatoloji, dis hekimligi ve maksillofasiyal cerrahide kullanilmak üzere kemik ikameleri ile, özellikle de enjekte edilebilir kemik ikameleri ile ilgilidir. Bulusm arka plani Karmasik sekilli ve çok parçali kiriklar gibi dogal dokunun kendiliginden iyilesebilmesini engelleyen ve ciddi fonksiyonel kayiplara neden olan kemik doku hasarlarinda, rejenerasyonu ve kemik büyümesini desteklemek amaciyla uygulanan yöntemlerden biri kemik greftlemesi, diger adiyla kemik ikamesidir. Kemik greft prosedürleri ve bu prosedürlerde kullanilan greft malzemeleri, travmatoloji, tümör cerrahisi, omurga cerrahisi, enfeksiyon ve revizyon artroplastisinde giderek daha fazla talep görmektedir. Kemik greftleme islemlerinde kullanilan biyomalzemeler; tedavi edilecek canlinin kendisinden elde edilen otojen greftler (otogreftler), ayni türün farkli bireyleri olan donör veya kadavralardan elde edilen allojen greftler (allogreftler), farkli türlerden elde edilen dogal orijinli ksenojen greftler (ksenogreftler) ve dogal kemik dokuyu taklit eden sentetik esasli greftler olmak üzere siniflandirilmaktadir. Dogal kökenli kemik Ikameleri olan otogreft, allogreft ve ksenogreftlerin uygulama asamasinda ve sonrasinda, bazi dezavantajlar ile karsilasilmaktadir. Bu dezavantajlardan baslicalari hasat alanlarinin ve greft materyallerinin yetersizligi, ek cerrahi islem gerekliligi, artan kan kaybi, agri ve iltihap olusumu, hastalik tasinimi riski ve immün sistem tepkileridir. ilaveten, bakteri veya virüs tasinimi riskini azaltmak amaciyla uygulanan dondurma, dondurarak kurutma, isinlama ve demineralizasyon prosesleri gibi ek islemler, söz konusu dogal kökenli greftlerin maliyetini yükseltmektedir. Dogal kökenli greftlerle iliskili bu sorunlarin çözümü amaciyla karsi gelistirilen sentetik greft malzemeleri, kemigin özelliklerini ve füzyonu desteklemek için dokunun inorganik bilesenlerini, fizikokimyasal özelliklerini ve mekanik yapisini taklit etmek üzere tasarlanmaktadir. Sentetik greft malzemeleri, dogal greft malzemelerinde bulunmayan sinirsiz tedarik imkâni, sterilizasyon ve depolama kolayligi gibi önemli avantajlar tasimaktadir. Sentetik greftler; tantalyum, titanyum, demir veya magnezyum gibi metaller, polilaktitler, poliglikolidler, poliüretanlar veya polikaprolaktonlar gibi polimerler, hidroksiapatit, trikalsiyum fosfat veya kalsiyum sülfat biyoseramikler gibi mineraller ve bu minerallerin kombinasyonlarini içerebilecegi gibi, biyoaktif camlar, cam iyonomerler veya alüminyum oksit de içerebilmektedir. Klinik kullanima uygun granül, blok veya putty gibi farkli formlarda beta-trikalsiyum fosfat (ß-TCP) biyoseramik esasli ticari greft malzemeleri mevcut olmakla birlikte, bu yapilarin bazi durumlarda her vakaya uygun olmama, implantasyon zorlugu, ek hazirlama islem gerekliligi, hijyen sorunlari ve enfeksiyon riski gibi dezavantajlari bulunabilmektedir. Kritik boyutlardaki ve karmasik sekilli kemik kusurlarinin tedavisi ortopedi ve travma cerrahisi alanlarinda hala en zorlu sorunlar olarak görülmektedir. Bu nedenle defekt bölgeye minimal invaziv cerrahi prosedürlerle yerlestirilerek kusurun tamamen doldurulmasina olanak saglayan, enfeksiyon riskini azaltan, cerrahi yara izi ve yogun kan kaybini önleyen ürünler oldukça popüler hale gelmistir. Özetle bir enjektör yardimiyla kemik doku kusurlarina dogrudan uygulanabilen biyoemilebilir ve osteokondüktif enjekte edilebilir greft materyallerine olan ilgi her geçen gün artmaktadir. Enjekte edilebilir kemik ikame malzemelerinin uzun yillardir piyasada bulunmasina ragmen bu materyallerin potansiyel uygulamalarda ne zaman, nasil ve hangi kosullarda kullanilabilecegi ve yararli olabileceklerine dair bilgiler hala oldukça sinirlidir. Bu malzemeler çok fazli yapilar olup, aktif faz [kalsiyum fosfat (CaP) esasli biyoseramikler gibi] ve tasiyici sistem (biyopolimerler) içermektedir. Belirtilen is birligi sayesinde cerrahi müdahale sonrasi CaP esasli ürünler zamanla normal kemigin yeniden sekillenmesini taklit eden, hücre destekli bir süreçle dokunun yeniden yapilanmasini saglarken tasiyici faz olarak kullanilan biyopolimerler sayesinde çevre dokunun biyolojik cevabi iyilesmekte ve daha kontrollü biyobozunma davranisi elde edilmektedir. Literatürde ve klinikte elde edilen olumlu sonuçlara ragmen, çok fazli yapilarda siklikla karsilasilan ve enjekte edilebilir kemik dolgu malzemelerinde özellikle uygulama veya depolama sirasinda karsilasilabilen seramik partiküllerin aglomerasyonu (faz ayrismasi) sorununun iyilestirilmesi gereksinimi bulunmaktadir. Örnegin bir çalismada enjeksiyon ile kullanima yönelik olarak sunulan biyoaktif bir CaP malzemenin viskozitesinin enjekte edilebilirlik için çok düsük oldugu ve ayrica, enjeksiyon esnasinda faz ayrismasi meydana geldigi rapor edilmistir (Bosco, J, ve dig., "Rheological properties of an injectable dxdoi.org/. Mevcut enjekte edilebilir greft ürünlerin özellikle depolama ve uygulama süresinde faz ayrilmasi (seramik partiküllerin aglomerasyonu), ürünün enjekte edilebilirlik özelligini zayiflatmakta ve klinik uygulamada sorunlara yol açmaktadir. Bunun neticesinde de enjekte edilebilir greftin doku tamirine katkisi beklenenden az olmakta ve olusan dokunun mukavemetini düsürmektedir. Gelistirilen enjekte edilebilir biyomalzemenin kullanima hazir olmasi için yapinin stabilitesi oldukça önemlidir. Bu nedenle enjekte edilebilir biyomalzemeler gibi viskoz akiskanlarda çesitli stabilizasyon ajanlariniri kullanimi ve sistem stabilitesine etkileri üzerine çalismalarin gerçeklestirilmesi büyük önem tasimaktadir. CaP esasli enjekte edilebilen kemik greftlerine dair yapilan çalismalarda hücre canliliginin %80'leri asmadigi görülmektedir. Örnegin hücre canliliginin yüksek kabul edildigi bir çalismada hücre canliligi en fazla %86,17 olarak rapor edilmis, burada jel/toz oranina bagli olarak faz ayrismasi gözlendigine ve viskozitenin bilesime göre degiskenlik gösterdigine (dolayisiyla bilesime göre enjekte edilebilirligin bulunmadigi versiyonlarin söz konusu olabilecegine) atif yapilmistir (Sarp, D., "Beta-Trikalsiyum Fosfat Bazli Enjekte Edilebilir Sentetik Greft Materyallerinin Gelistirilmesi", Biyomühendislik Bölümü Yüksek Lisans Tezi, Hacettepe Üniversitesi, Eylül 2018). Benzer sekilde bir diger çalismada hücre canliligi %76 ila Cellulose nanocrystals bionanocomposite hydrogels for tissue engineering applications", Bioconjug durulmustur (Ningsih, H.S., ve dig., "Fabrication, Characterization and In Vitro Cytotoxicity of Mesoporous ß-Tricalcium Phosphate Using the Spray Drying Method", Crystals, 2021, 11, 252, doi: (Boeckel DG, ve dig., "In vitro evaluation of cytotoxicity of hyaluronic acid as an extracellular matrix on CaP esasli enjekte edilebilir kemik dolgu malzemelerinde karsilasilan bir diger sorun ise tipki kemik doku gibi X-isinlarini geçirmesidir. Bu durum dolgu malzemesinin ameliyat sonrasinda görüntülenebilmesini zorlastirmaktadir. Bütün bu bilgiler isiginda enjekte edilebilir kemik greft malzemelerinde birtakim iyilestirmeler yapilmasina gereksinim bulundugu açiktir. Bulusun kisa açiklamasi Mevcut basvurunun temel amaci, teknigin bilinen durumunda anilan sorunlarin giderilmesîdir. Mevcut bulusun diger bir amaci, yüksek stabiliteye sahip, biyouyumlulugu yüksek, biyobozunur, enjekte edilebilir bir kemik greft malzemesinin sunulmasidir. Mevcut bulusun diger bir amaci, ayni anda yüksek biyouyumluluga ve yüksek radyoopasiteye sahip olan, enjekte edilebilir bir kemik greft malzemesinin sunulmasidir. Mevcut bulusun diger bir amaci ise, söz konusu enjekte edilebilir kemik greft malzemesinin üretimi için bir yöntemin sunulmasidir. Mevcut basvuru kapsaminda sunulan kemik greft malzemesi, yüksek stabilitesi sayesinde faz ayrismasi sorununu gidermekte; böylelikle rejeneratif ortopedik cerrahi, dis hekimligi ve maksillofasiyal cerrahi uygulamalarinda dogrudan, sorunsuz olarak kullanilabilmektedir. Ameliyat sirasinda görüntüleme zorlugundan kaynaklanan sorun ise, greft içeriginde radyoopaklastirici katki malzemesi kullanimi ile çözülmektedir. Bulusun ayrintili açiklamasi kisminda sunulan bilgiler isiginda mevcut basvuruda, seramik partikülleri, biyopolimer ve stabilizatör içeren bir bilesime sahip bir kemik greft malzemesi sunulmaktadir. Söz konusu kemik greft malzemesi; seramik partikülleri olarak beta-trikalsiyum fosfat, biyopolimer olarak ise hiyalüronik asit içermektedir. Bulus konusu kemik greft malzemesi stabilizatör olarak sitrik asit, sitrik asit tuzlari, sitrat iyonlari arasindan seçilen bir ya da daha fazlasi ile birlikte nanokristalin selüloz içermektedir. Bulus konusu kemik greft malzemesinin teknik avantajlari söz konusu bilesim sayesinde temin edilmektedir. Söz konusu bilesim, seramik partikülleri, biyopolimer ve stabilizatöre (yani nanokristalin selüloz ile sitrik asit ve/veya bunun türevi olan bir ya da daha fazla bilesigin karisimina) ilaveten, su ve "Örnekler" kisminda deginildigi gibi bir ya da daha fazla sayida yardimci malzeme de içerebilir. Bulus konusu kemik greft malzemesinin tercih edilen bir yapilandirmasi; toplam hiyalüronik asit agirligi esas alindiginda ag. %0,1 ila ag. %0,5 araliginda nanokristalin selüloz içermektedir. Bulus konusu kemik greft malzemesinin tercih edilen bir yapilandirmasinda; söz konusu kemik greft malzemesinin toplam agirligi esas alindiginda, hiyalüronik asit ve nanokristalin selüloz toplam miktarinin beta-trikalsiyum fosfat miktarina orani agirlikça sirasiyla 35:65 ila 65:35 araligindaki bir oranda, daha daha tercihen sirasiyla 50:50 oranindadir. Bulus konusu kemik greft malzemesinin tercih edilen bir yapilandirmasi ilaveten zirkonyum dioksit içermektedir. Bu tarife uyan kemik greft malzemesi tercihen, toplam agirligi esas alindiginda örnegin ag. Mevcut bulusun tercih edilen bir yapilandirmasi biyopolimer olarak 500 kiloDalton'un üzerinde, daha tercihen 750 kiloDalton ila 2 milyon Daltori araliginda, örnegin 1 milyon Dalton molekül agirligina sahip Mevcut bulusun tercih edilen bir yapilandirmasi tercihen; söz konusu kemik greft malzemesinin toplam agirligi esas alindiginda ag. %0,10 ila ag. %O,60 araliginda sitrik asit, sitrik asit tuzlari, sitrat iyonlari arasindan seçilen bir ya da daha fazlasini içermektedir. Sitrik asitin (C5H807) mol kütlesinin (192 g/mol) sitrat (3-) anyonu (C5H507) mol kütlesine (189 g/mol) çok yakin oldugu dikkate alindiginda söz konusu yapilandirma, kemik greft malzemesinin toplam agirligi esas alindiginda ag. %0,10 ila ag. %O,60 araliginda sitrat (3-) anyonuna karsilik gelecek miktarda sitrik asit, sitrik asit tuzlari ve sitrat iyonlari arasindan bir ya da daha fazlasini içermektedir. Örnegin söz konusu yapilandirma tercihen, kemik greft malzemesinin toplam agirligi esas alindiginda ag. %0,1O ila ag. %0,60 araliginda sitrat (3-) anyonuna karsilik gelmek üzere ag. %0,10 ile ag. %0,60 araligindaki bir miktarda sitrik asit içermektedir. Sekillerin kisa açiklamasi Sekil 1, mevcut bulus kapsaminda elde edilen kemik greft malzemeleri ile yapilan MTT hücre canliligi (%) çalismasinin sonuçlarini göstermektedir. Bulusun ayrintili açiklamasi Bir sentetik kemik greft malzemesinin yüksek biyouyumluluk, minimal fibrotik reaksiyon ve yeniden modellenme özelliklerine sahip olmasi arzu edilir. Sentetik kemik greft malzemesinin ayrica, hasarli bölgenin ihtiyaçlarina uygun olarak kortikal veya süngerimsi kemigin dayanimina benzer mekanik özelliklere sahip olmasi beklenmektedir. Örnegin, sentetik kemik greftinin gerilmelere karsi dayanim saglayacak ve döngüsel yüklemeler altinda yorulma kirilmalarini önleyecek yeterli toklugu korumak amaciyla, kusurlu kemik bölgesi ile benzer elastiklik modülüne sahip olmasi beklenir. Kalsiyum fosfat (CaP) biyoseramikler (diger bir deyisle, CaP seramikler), memelilerin iskelet dokusunda ve dis yapilarinda dogal olarak bulunmasi, biyouyumlulugu, osteokondüktif ve osteoindüktif özellikleri sebebiyle tercih edilmektedir. Biyolojik proteinlerin biyoaktif özellige sahip CaP seramiklerin yüzeyine adsorpsiyonu, doku iyilesmesi ile yakindan iliskilidir. Radikal fonksiyonel protein gruplari ile CaP seramiklerin sahip oldugu kalsiyum ve fosfat bölgeleri arasindaki yüksek afinite, protein adsorpsiyonunu arttirmaktadir. Çesitli CaP biyoseramikleri arasinda özellikle hidroksiapatit (HAp), trikalsiyum fosfat (TCP) ve bunlarin kompozitleri olan bifazik kalsiyum fosfat (BCP) malzemeler ön plana çikmaktadir. Bununla birlikte, HAp'lerin biyobozunma hizinin TCP'ler ile karsilastirildiginda düsük olmasi, uygulama sonrasi yeni kemik olusumunun yetersiz kalmasina neden olmaktadir. TCP'lerin oi'-TCP, cc-TCP ve ß-TCP (beta-trikalsiyum fosfat) olmak üzere üç polimorfu bulunmaktadir. B- TCP oda sicakliginda kararlidir ve 1200°C'de OL-TCP'ye dönüsmektedir. oi-TCP, ß-TCP ile karsilastirildiginda birim hücre basina daha fazla hacime sahip olmasindan dolayi daha yüksek iç enerjiye sahiptir. Bu durum a-TCP'nin yüksek sicaklik fazi olmasi ile iliskilidir. a-TCP'nin reaktifligi ve biyobozunurlugu, ß-TCP'ye kiyasla daha yüksektir. Bu nedenle oi-TCP, klinik uygulama sonrasi kemik olusumu için yeterli süreyi saglayamamaktadir. HAp ile kiyaslandiginda ise daha gözenekli yapidadir. Bu sayede ß-TCP fizyolojik kosullar altinda HAp'e kiyasla daha hizli emilebilir ve dolayisiyla daha hizli kemik olusumu saglar. Ayrica beta-trikalsiyum fosfat yüksek saflikta ve homojenlikte üretilebilmektedir. Bu avantajinin yani sira biyouyumluluk ve osteokondüktif özelliklerinin üstünlügü, kemik büyümesini ve ayrica osteoblastlarin ve mezensimal hücrelerin baglanmasini, çogalmasini ve farklilasmasini destekleyerek kemik yeniden modellenme mekanizmasinin ilk adimi olan osteoid olusumunu uyarma kabiliyeti tasimasi sayesinde, mevcut bulus kapsaminda ß-TCP diger biyoseramiklere kiyasla öne çikmaktadir. Bütün bu gerekçelerle, mevcut bulus kapsaminda sunulan kemik greft malzemesi beta-trikalsiyum fosfat içermektedir. Kemik greft malzemeleri çesitli üretim ve sinterleme yöntemleri kullanilarak putty (macun), granül veya blok gibi çesitli formlarda elde edilebilir. Ancak bu formlar her defekte uygun olmamakta, implantasyon islemi sirasinda zorluklara yol açabilmekte, ek hazirlik süreci gerektirebilmekte ve hijyen sorunlari gibi bazi dezavantajlara tasiyabilmektedir. Dolayisiyla putty, granül ya da blok formlarindaki greft malzemesinin klinik kullanimi görece sinirlidir. Bu nedenle mevcut bulus kapsaminda sunulan kemik greft malzemesinin, minimal invazif bir ameliyat ile çesitli kemik kusurlarina kolaylikla uygulanabilen ve mevcut dezavantajlarin üstesinden gelebilecegi ön görülen enjekte edilebilir formda sunulmasi tercih edilmektedir. Dolayisiyla mevcut bulusta sunulan kemik greft malzemesinin, enjekte edilebilir bir kemik greft malzemesi (kisaca: IBGM) olarak sunulmasi tercih edilmektedir. Sentetik kemik greft malzemelerinde aktif biyoseramik fazin (diger bir deyisle, biyoseramigin) homojen dagilimini desteklemek üzere tasiyici faz olarak dogal polimerler kullanilabilmektedir. Dogal polimerler yüksek kaynak miktari, düsük immünojenik özellik, biyolojik aktiviteleri destekleme, biyobozunma kabiliyeti veya antimikrobiyallik gibi önemli avantajlara sahip olmakla birlikte; buna karsilik safsizliklar içerme, kontrolsüz bozunma, mekanik mukavemetinin yetersiz olmasi, asidik bozunma ürünleri verme, elastiklik modülünün düsük olmasi veya osteokondüktif özelligin zayif olmasi gibi istenmeyen bazi önemli dezavantajlar da tasiyabilmektedir. Sentetik kemik greft malzemesinde kullanilan dogal polimerlere örnek olarak aljinat, agaroz, kitosan, kolajen, hiyalüronik asit ve selülozik malzemeler gösterilebilir. Doku iyilesmesi ve büyümesi sadece hücre içi gerçeklesen biyolojik bir süreç olmakla kalmayip, ayni zamanda hücre-hücre ve hücre-matris etkilesimlerini de içermektedir. Bu açidan degerlendirildiginde, kemik greft malzemesi kullanilarak gelistirilecek doku iskelesinin hem hücrelerin tutundugu yüzey hem de hücre disi mikro ortam görevi üstlendigi kabul edilebilir. Bu nedenle tasiyici polimerik fazin seçimi, aktif biyoseramik fazin seçimi kadar önemlidir. Kullanilacak biyomalzemenin uygulanacak hasarli dokunun ihtiyaç duyacagi özellikleri en uygun sekilde saglamasi ve konak doku tarafindan minimum tepki ile karsilanacak yüksek biyouyumluluga sahip olmasi gerekmektedir. Bu nedenle dogal dokuda bulunan bilesenlerin sentetik esasli ürün olarak tercih edilmesi büyük önem tasimaktadir. Hiyalüronik asit (diger adiyla hiyalüronan, kisaca HAj; hücre disi matrisin ana bilesenlerinden olup sülfatlanmamis bir glikozaminoglikandir. %100 biyobozunma özelligine sahip olan HA, eklem kikirdaklarindaki hücreler tarafindan salgilanmakta olup, tüm bag dokularinda ve eklemlerin sinoviyal sivisinda bulunmaktadir. Birçok hücresel aktivitede dogal olarak görev almasi nedeniyle HA polimerik tasiyici faz olarak kullanildiginda, biyolojik yapiya benzer bir ortam saglamasi nedeniyle büyük önem tasimaktadir. Bununla birlikte HA tasiyici faz olarak kullanildiginda, aktif faz ile kemik doku arasindaki adezyonu da arttirmaktadir. HA, özellikle kemik iyilesmesinde görev alacak mezensimal hücrelerin göçü, adezyonu, çogalmasi ve farklilasmasinda rol oynamaktadir. Dogal kemik dokusunda bulunan kolajen, mükemmel biyouyumluluk, osteoblast tutunmasini ve farklilasmasini destekleme, besin transferini kolaylastiran yari geçirgenlik, kontrollü biyobozunurluk ve asit bozunma ürünlerine sahip olmama gibi üstün özelliklere sahiptir. Ancak kolajen, makrofajlarin ve polimorfonükleer lökositlerin enzimatik aktivitesine bagli olarak hizli bir biyolojik bozunma sergilemektedir. Ayrica, kolajenin mekanik özellikleri nispeten zayiftir, dolayisiyla osteokondüktiflik davranisi da görece zayiftir. Bu nedenle HA, mevcut bulus kapsaminda tasiyici biyopolimer olarak kolajene kiyasla tercih edilmektedir. HA'nin glikozaminoglikan zinciri negatif yüklü oldugundan, katyonlari ve suyu çekerek büyük hacimlere sisme özelligi (hidrofilik özellik) sergilemektedir. Bu nedenle HA, yüksek bir su tutma kapasitesi sergiler, bu sayede hücre hareketinden kaynaklanan sikistirma kuvvetlerine direnci yüksektir; böylelikle HA, hücreler göç ederken doku seklini korur. Mevcut bulusun tercih edilen bir yapilandirmasinda sunulan sentetik kemik greft malzemesi biyopolimer olarak, 500 kiloDalton'un üzerinde, daha tercihen 750 kiloDalton ila 2 milyon Dalton araliginda, örnegin 1 milyon Dalton molekül agirligina sahip HA içermektedir. Mevcut basvuru kapsaminda söz konusu 1 milyon Dalton civarindaki molekül agirligi mertebesi, yüksek bir molekül agirligina karsilik geldigi yönünde degerlendirilmektedir. Yüksek molekül agirlikli HA, ideal bir sentetik kemik doku ikame malzemesinden beklenen osteokondüktif Özelligi karsiladigi, kemik rezorpsiyonununda rol alan osteoklast hücrelerinin farklilasmasini önledigi ve kemik olusumunu hizlandirdigi yönünde degerlendirilmektedir. Mevcut basvuru kapsaminda enjekte edilebilir kemik greft malzemesinin kullaniminda, enjeksiyonun en az miktarda kuwetle gerçeklestirilebilmesi ve malzemenin enjeksiyona izin verecek ölçüde düsük bir viskoziteye sahip olmasi tercih edilmektedir. Bu dogrultuda, basvuruya konu olan kemik greft malzemesinin enjekte edilebilirligini iyilestirmek amaciyla reolojik özelliklerin uygun sekilde ayarlanmasinin yararli oldugu degerlendirilmistir. Bununla birlikte enjekte edilebilir kemik greft malzemesinin, depolama sonrasinda bir ara islem gerektirmeksizin kullanima hazir olabilmesi dogrultusunda, depolama stabilitesinin önem tasidigi düsünülmektedir. Depolama stabilitesinin düsük oldugu durumda, boyunca depolama raf ömrü içerisinde, kemik greft malzemesinin içerdigi kati parçaciklar çökebilmektedir. Bu durum, enjekte edilebilirlik özelligini zayiflatmakta ve cerrahi uygulamalari zorlastirmaktadir. Depolama stabilitesinin düsük oldugu durumlarda enjekte edilebilir kemik greft malzemesinin doku tamirine katkisi beklenilenden az olmakta, yeni olusan dokunun mekanik özellikleri beklentileri karsilamamaktadir. Ayrica, kalsiyum fosfat seramik içerikli bir enjekte edilebilir kemik greft malzemesinin reolojik özelliklerinin, mineral fazin, yüksek hücre geçirgenligi sayesinde dokuya baglanmasi üzerinde etkili oldugu düsünülmektedir. Bu nedenle enjekte edilebilir kemik greft malzemesinden beklenen viskozitede, söz konusu kemik greft malzemesinin içerigindeki kati partiküllerin çökelme (sedimentasyon) egilimi önemli bir parametre olup, bu dogrultuda stabilizasyonun saglanmasi (yani depolama stabilitesinin temin edilmesi) önem tasimaktadir. Organik bir karboksilîk asit olan ve biyolojik dokularda da önemli islevlere sahip sitrik asit (CA), bunun türevleri olan CA tuzlari (sitratlar) ve memelilerin kemik dokularinda da bagli olarak bulunan sitrat iyonlari, kemikteki apatit nanokristallerin kristal kalinlasmalarini kontrol ederek biyomineralizasyon mekanizmasini düzenlemekte ve stabilizasyon saglamaktadir. CA (ve yukarida deginilen türevleri), hayvanlar ve bitkiler aleminde bolca bulunmasi, mükemmel biyouyumlulugu, ayarlanabilir mekanik özellikleri, kontrol edilebilir bozunma davranisi, toksik olmamasi, suda çözünürlügü ve ucuz olmasi nedenleriyle in vitro ve in vivo kosullarda basariyla uygulanabilecek biyomalzemelerde kullanima uygun görülmekte, doku rejenerasyonu uygulamasi kapsaminda kullanilmasi açisindan basvuruya konu olan kemik greft malzemesinde stabilizatör olarak tercih edilmektedir. Mevcut bulusa konu olan enjekte edilebilir kemik greft malzemesi içerisinde stabilize edici ajan olarak kullanildiginda sitrat iyonlari, kalsiyum iyonlarina baglanarak CaP biyoseramikler üzerine güçlü bir sekilde absorbe olabilme kabiliyetine sahiptir. Yapisinda yüksek miktarda karboksil gruplari içeren CA molekülleri, kendilerini TCP (burada, ß-TCP) parçaciklarinin etrafini sararak yüzeye negatif yük kazandirmakta, böylece kati partiküller arasinda itme kuvvetlerine sebep olmaktadir. Bu sayede CA molekülleri ß-TCP partiküllerinin hareket yeteneklerini arttirarak kemik greft malzemesinin enjekte edilebilirligini gelistirmekte, böylece klinik kullanimi kolaylastirmaktadir. Dolayisiyla mevcut basvuru kapsaminda sunulan enjekte edilebilir sentetik kemik greft malzemesi sitrik asit, sitrik asit tuzlari ve sitrat iyonlarindan olusan liste içerisinden bir ya da daha fazla sayida stabilizatör içermektedir. Mevcut bulusa konu olan kemik greft malzemesinin Zeta potansiyel ve tane boyutu ölçümlerinden yola çikildiginda, enjekte edilebilirlik açisindan reolojik özelliklerin iyilestirilmesi için nanokristalin selüloz (NCC) kullanilmistir. NCC; asit hidroliz prosesi ile dogal selülozdan izole edilen kristalin nanopartiküllerdir. NCC partikülleri, sahip olduklari yüksek yüzey alani/hacim orani sayesinde hücre baglanmasini, göçünü, çogalmasini, osteokondüksiyonu ve kemik büyümesini desteklemektedir. H-AC_A vezveya türevleri ile NCC'nin birlikte kullanimi, NCC içermeyen bilesime kiyasla görece düzenli, bozulmaya karsi görece dirençli, görece yüksek yapisal bütünlüge sahip ve hücresel aktiviteleri destekleyici bir biyokompozit yapiyi (burada, enjekte edilebilir kemik greft malzemesi) mümkün kilmaktadir. Bu durumun, mikroçevresel materyallerin NCC'nin sülfat gruplari ile potansiyel etkisimlerinin bir sonucu oldugu düsünülmektedir. NCC ayrica, yüzeyinde bulundurdugu negatif yüklü sülfat iyonlarinin varligi sayesinde elektrostatik itme kuvvetleri yoluyla sulu süspansiyonda yüksek stabilite saglamakta ve uniform dagilma özelligine katkida bulunmaktadir. NCC, CA'ya kiyasla daha fazla reaktif gruba sahiptir. Yüksek yüzey alanina sahip olmasi açisindan NCC nanoyapisinin, baglanma kabiliyetine katkida bulundugu degerlendirilmistir. Bu nedenle, NCC'nin mevcut bulus konusu enjekte edilebilir kemik grefti içerisinde CA'nin sagladigi stabilizasyona katki sundugu degerlendirilmistir. Dolayisiyla mevcut basvuru kapsaminda sunulan enjekte edilebilir sentetik kemik greft malzemesi ilaveten stabilizatör olarak NCC içermektedir. Mevcut bulusa konu olan kemikgreft malzemesinin tercih edilen bir yapilandirmasi, uygulama esnasinda görüntüleme kolayligi saglamasi açisindan ilaveten bir ya da daha fazla sayida radyoopaklastirici ajan içermektedir. Günümüzde biyomalzemeler alaninda kullanima uygun radyoopaklastirici malzemelere örnek olarak zirkonyum oksit (ZrOZ) ve baryum sülfat (BaSO4) verilebilir. Ancak BaSD4, makrofaj- osteoklast farklilasmasini arttirarak kemik rezorpsiyonunu hizlandirmakta olup, osteoliz ile iliskili oldugu degerlendirilmistir. Bu nedenle mevcut basvuruya konu olan kemik greft malzemesinin tercih edilen bir yapilandirmasi radyoopaklastirici ajan olarak ilaveten ZrO; içermektedir. Yukarida verilen bilgiler uyarinca mevcut bulusta ilaveten, seramik partikülleri, biyopolimer ve stabilizatör içerikli bir kemik greft malzemesinin hazirlanmasi için bir yöntem sunulmaktadir. Yöntem, seramik partikülleri olarak beta-trikalsiyum fosfat, biyopolimer olarak hiyalüronik asit ve stabilizatör olarak sitrik asit, sitrik asit tuzlari ve sitrat iyonlari arasindan seçilen bir ya da daha fazlasi ile birlikte nanokristalin selülozun bir karisiminin hazirlanmasini içermektedir. Yöntem tercihen asagidaki adimlari içermektedir: a) bir hiyalüronik asit tuzunun sulu ortamda jel haline getirilmesi suretiyle bir hiyalüronik asitjeli temin edilmesi; b) (a) adiminda temin edilen hiyalüronik asit jel içerisine nanokristalin selüloz ilave edilmesi suretiyle bir hiyalüronik asit/ nanokristalin selüloz jeli temin edilmesi; c) (b) adiminda temin edilen hiyalüronik asit/ nanokristalin selülozjelinin, beta-trikalsiyum fosfat ile bir karisiminin hazirlanmasi; cl) (c) adiminda hazirlanan karisimin içerisine sitrik asit, sitrik asit tuzlari ve sitrat iyonlari arasindan seçilen bir ya da daha fazlasinin ilave edilmesi. Yöntemin (a) adiminda hiyalüronik asit tuzu olarak sodyum hiyalüronat kullanilmaktadir. Zira sodyum hiyalüronatin molekül agirligi potasyum hiyalüronat gibi diger hiyalüronik tuzlarinin molekül agirliklarina kiyasla daha düsük oldugu için, özellikle penetrasyon hizi açisindan üstünlük tasimaktadir. Bu nedenle hiyalüronat tuzlari arasinda sodyum hiyalüranatin, enjekte edilebilir kemik greft malzemesi hazirlanmasinda kullanilmak üzere en iyi seçenek oldugu kanisina ulasilmistir. Yöntemin (a) adiminda kullanilan sodyum hiyalüronat miktari tercihen, her 100 mL su basina 0,5 gram ila 1,5 gram araliginda olup, tercihen 1 gram mertebesindedir (örnegin, 1 gram). Yöntemin (b) adiminda kullanilan nanokristalin selüloz miktari tercihen, elde edilen hiyalüronik asit /nanokristalin selüloz jelinin toplam agirligi esasina göre ag. %0,1 ila ag. %0,5 araligindadir. Yöntemin (c) adiminda kullanilan hiyalüronik asit/ nanokristalin selüloz jelinin beta-trikalsiyum Yöntemin (cl) adimi tercihen, (c) adiminda hazirlanan karisimin içerisine, söz konusu karisimin toplam agirligi esasina göre ag. %0,10 ila ag. %O,60 araliginda sitrik asit ilave edilmek suretiyle gerçeklestirilmektedir. Bulus konusu yöntem tercihen, ortaya çikan kemik greft malzemesinin toplam agirligi esas alindiginda ag. %1 ila ag. %5 araliginda zirkonyum dioksit içerecegi sekilde zirkonyum dioksit ilave edilmesine yönelik bir adim içermektedir. ÖRNEKLER Asagidaki deneysel çalismalar, mevcut basvuruya konu olan rejeneratif enjekte edilebilir kemik greft malzemesinin hazirlanmasi için örnek teskil etmektedir. Sunulan örnekler, koruma kapsaminin sinirlandirmasi amacini tasimamaktadir. Örnekler içerisinde yer verilen seramik partikülleri (ß-TCP), biyopolimer (hiyalüronik asit) ve stabilizatör daha fazla bilesenin karisimi, örnegin NCC ile CA karisimi], bulus ile elde edilen teknik etkilerin tamamini temin eden bir tasarimdir. Bir önceki cümlede ya da bagimsiz istemde anilan maddeleri içeren bütün, mevcut basvuru baglaminda "bilesim" kavramina karsilik gelmektedir. Söz konusu bilesim ilaveten, radyoopaklastirici ajan (Zr02) içerdiginde yine bulusun temel amaçlarina destek olmakta, bulus baglamini desteklemektedir. Bulus konusu kemik greft malzemesi yukarida "bilesim" olarak anilan içerige ilaveten, Örnek 1'de örneklendigi üzere çesitli baska madde ya da karisimlari, bunlarin kalintilarini ya da olasi tepkime ürünlerini içerebilmekte olup, bunlar bulus için zaruri unsurlar teskil etmemektedir. Örneklerde deginilen enjekte edilebilir kemik greft malzemesi, toplam agirliginin her 100 grami esas alindiginda hazirlanmistir. ÖRNEK 1: Hiyalüronik Asit Jellerin Hazirlanmasi (HA jel sentezi) HA jel piyasadan temin edilebilir. Üretilmesi için örnek bir yöntem asagida sunulmustur. i) HA jel sentezi için örnegin fosfat tamponlu salin çözeltisi hazirlanmis (örnegin 0,5 M derisimde); bu dogrultuda örnegin, kullanilmistir. Bunun için fosfat tamponlu salin tozu, (örn. 250 mL'lik bir beher içerisinde mekanik karistirma altinda) örnegin 100 mL ultrasaf suya ilave edilmistir. ii) (i) adiminda elde edilen karisimin üzerine örnegin 0,1-0,2 g NaCl (burada, ag. %99 saflikta) ve örnegin ilave edilerek karistirilmistir (homojen çözelti elde edilene kadar, örnegin mekanik karistiricida). iii) (ii) adiminda elde edilen karisimin üzerine sodyum hiyalüronat tozu (örnegin, 1 g) kontrollü olarak ilave edilmis, bu esnada karistirma islemi sürdürülmüstür. Sonrasinda karistirmaya son verilerek karisim yaslandirilir (örnegin 30 dakika boyunca). Böylelikle, bulus konusu yöntemin (a) adimi uyarinca bir hiyalüronik asitjeli (kisaca HAjel) elde edilmistir. ÖRNEK 2: HA/NCC iel karisimin hazirlanmasi NCC piyasadan temin edilebilir ve HAjel ile karistirilmak suretiyle NCC içeren HAjel (HA/NCC jel) elde edilebilir. Söz konusu karistirma isleminin bir örnegi asagida sunulmustur. Tercihen nihai HA/NCCjelin toplam agirligi esas alindiginda %0,1 ila %0,5 (ag.) araligindaki bir derisimde NCC içeren HA/NCCjel (NCC takviyeli tasiyici faz sistemi olarak da adlandirilabilir) hazirlanmasi amaciyla, HA jelden (örnegin, Örnek 1'in sonunda elde edilen HA jelden) alinan numuneler üzerine NCC ilave edilmistir. Bu yolla, her 10 mL HA jel basina örnegin 0,01 g ila 0,05 g araliginda NCC ilavesi ile söz konusu derisim araliginda HA/NCC jel temin edilebilmektedir. Örnegin, söz konusu karisimin her 10 mL HA jele karsilik gelen kismi birer santrifüj tüpü içerisine alinarak, bunlarin üzerine söz konusu miktarlarda NCC ilave edilerek, HA ve NCC içeren numuneler hazirlanarak karistirma islemine tabi tutulabilir, böylelikle HA/NCC jeller elde edilebilir. Söz konusu karistirma islemi, örnegin bir vorteks cihazi kullanilarak, genel görünüm itibariyle homojen görünümlü bir yapi elde edilene kadar gerçeklestirilebilir. Elde edilen HA/NCC jeller hazirlanarak enjektörlere aktarilabilir. Bu örnek çalismada, HA/NCC jelin toplam agirligi esasina göre ag. %0,1, ag. %0,3 ve ag. %0,5 NCC içeren HA/NCCjel örnekleri hazirlanmistir. Böylelikle, bulus konusu yöntemin (b) adimi uyarinca hiyalüronik asit/ nanokristalin selüloz jeli örnekleri temin edilmistir. ÖRNEK 3: HA/NCC ielden yola çikilarak eniekte edilebilir greft elde edilmesi Mevcut basvuruya konu olan kemik greft malzemesi, HA ve NCC içeren tasiyici jelin yani sira, biyoseramik tozu olarak ß-TCP, ve CA içermekte, burada CA ve NCC birlikte stabilizatör ya da deflokülasyon ajani olarak görev yapmaktadir. Tercih edilen bir yapilandirmada kemik greft malzemesi, radyoopaklastirici ajan olarak ZI'Oz içermektedir. ß-TCP piyasadan temin edilebildigi gibi, Iaboratuarda da üretilebilmektedir. Mevcut basvuruya konu olan enjekte edilebilir greftin hazirlanmasi için; Örnek 2'de açiklanan HA/NCCjel ile ß-TCP, agirlikça sirasiyla Böylelikle, bulus konusu yöntemin (c) adimi uyarinca bir karisim hazirlanabilmektedir. Söz konusu karisimin içerisine ilaveten, enjekte edilebilir greftin toplam agirligi esas alindiginda ag. %0,10 ila ag. %O,60 araliginda CA içerecegi sekilde sitrik asit ilave edilmistir. Söz konusu sitrik asit ilavesi, bulus konusu yöntemin (d) adimi kapsamindadir. Yöntemin tercih edilen bir uygulamasinda söz konusu karisimin içerisine ilaveten, enjekte edilebilir greftin toplam agirligi esas alindiginda örnegin ag. %1 ila ag. %5 araliginda ZrOz içerecegi sekilde ZrOz ilave edilmistir. Söz konusu ilave etme adimlari kontrollü olarak, örnegin kuvvetli titresim altinda vorteks kullanilarak genel görünüm itibariyle homojen bir yapi elde edilene dek uygulanan bir karistirma islemi ile gerçeklestirilebilir. Söz konusu ilave etme adimlarinin tamamlanmasinin ardindan örnegin, yogun bir karistirma islemi uygulanabilir: mevcut Örnek 3 kapsaminda söz konusu yogun karistirma islemi bir Speed Mixer cihazi kullanilarak, örnegin 2000 rpm gibi yüksek bir devirde, örnegin 5 dakika süreyle uygulanabilir. Örnek 3'te anilan malzemelerin birbiriyle karistirilmasi sonucunda enjekte edilebilir kemik greft malzemesi elde edilmektedir. Elde edilen kemik greft malzemesi, örnegin enjektörler içerisine aktarilarakdepolanabilmektedir. ÖRNEK 4: Eniekte edilebilir greftin karakterizasyonu Örnek 3'te elde edilen enjekte edilebilir greft ile ilgili tane boyutu (örn. NCC'nin ve ß-TCP'nin ortalama tane boyutlari) ve zeta potansiyeli degerleri, ilgili teknik alanda kabul görmüs olan yöntemlerle yöntemleriyle, morfolojik özellikleri ise SEM ile belirlenmistir. Örnek 3'te elde edilen greftin enjekte edilebilirlik özelliklerinin belirlenmesi amaciyla reometrik ve viskozimetrik ölçümler yapilmistir. Söz konusu greftin biyouyumluluk durumunun test edilmesi amaciyla hücre kültürü çalismasi (ISO 10993-5) yapilmistir. Isinlarin saçilma davranisina bagli Zeta tane boyutlari, partiküllerin yüzey yükleriyle iliskili Zeta potansiyelleri ve polidispersite degerleri Malvern ZSP-Zeta Sizer cihazi kullanilarak belirlenmistir. Numune hazirlama prosedürü kapsaminda ultrasaf su kullanilarak bir süspansiyon hazirlanmistir. Söz konusu süspansiyon içerisinde yer alan enjekte edilebilir kemik greft malzemesi konsantrasyonu, süspansiyonun toplam agirligi esas alindiginda agirlikça %0,3 olacak sekilde hazirlanmistir. Süspansiyonun türdes dagitilmasina yönelik olarak ultrasonik karistirma tercih edilmistir. Enjekte edilebilir kemik greft malzemesinin sahip oldugu fonksiyonel gruplarin tespiti amaciyla ölçüm araligi 650 cm'1 ile 4000 cm'1 dalga boyunda olan ve yüksek çözünürlükte spektrum eldesine olanak taniyan Perkin Elmer Spectrum 100 FTIR cihazi ile analiz gerçeklestirilmistir; numune hazirlama protokolü kapsaminda 'er mL jel ve 5'er mg kurutulmus kemik greft malzemesi numunesi karakterize edilmistir. Mevcut basvuru baglaminda viskozite kavrami (ri); bir akiskanin akma direncini yani malzemenin kuvvet altinda deformasyona karsi direnme kabiliyetini tanimlamaktadir. Enjekte edilebilir akiskan bir malzemeye kayma gerilimi uygulandiginda deformasyon meydana gelmektedir. Kayma hizindaki degisime bagli olarak, örnegin kayma hizindaki artisla beraber viskozite degerlerinde azalma meydana geliyorsa bu tür akiskanlar psödoplastik sivilar olarak ifade edilmekte olup, kayma incelmesi veya kalinlasmasi davranisi üssel matematiksel modellemeler (Power Law Equation) ile hesaplanmaktadir. Sunulan bulus kapsaminda gelistirilen enjekte edilebilir akiskan ürünün reolojik özellikleri reometre (Anton Paar, MCR 302) ile karakterize edilmistir. Reolojik davranis; uygulanan kayma hizinin birfonksiyonu olarak 0 ila 100 s*L araliginda viskozitede meydana gelen degisimler ölçülerek belirlenmistir. Mevcut basvuru baglaminda gelistirilen enjekte edilebilir kemik greft malzemesinin bozulma davranisi ve isil kararliligini belirlemek amaciyla yas ve 37°C'de düsük vakum kosullarinda elde edilen kuru numunelere TGA karakterizasyon sicaklikta oda kosullari altinda gerçeklestirilmistir. Bu karakterizasyon çalismalarinin sonucu olarak asagidaki bulgulara ulasilmistir: - HA, CA ve NCC'nin mevcut basvuruda anilan bilesim oranlarinda bir arada bulunmasi, greft içerisinde ß-TCP aglomerasyonunu önleyerek greftin stabilitesini beklenmedik ölçüde yükseltmistir. Uzun depolama sürelerinde dahi, greft içerisinde faz ayrismasi gözlenmemistir. - ß-TCP'ye yönelik ICP-MS kantitatif tayini sonucunda, eser elementlere ait tanimlanan maksimum degerlerin altinda oldugu belirlenmistir. - Reometrik ve viskozimetrik ölçümlerin sonucunda, Örnek 3'te elde edilen greftlerin kayma incelmesi davranisi sergiledigi ve enjekte edilebilir greft malzemesi olarak kullanima uygun reolojik davranis gösterdigi saptanmistir. - MTT in vitro sitotoksisite/hücre canliligi testi sonucunda, hücre canliligi %97] olarak belirlenmistir. Bulusa ait in vitro biyouyumluluk çalismalari kapsaminda enjekte edilebilir ürünün sitotoksik etkisi (MTT- degerlendirilmesi- bölüm 5: Vücut disi sitotoksisite deneyleri) uygun olarak belirlenmistir. Ilgili standarda göre hücre canliliginda %30'dan fazla meydana gelen kayiplar sitotoksik etki olarak kabul edilmektedir. Sekil 1, mevcut bulus kapsaminda elde edilen kemik greft malzemeleri ile yapilan MTI' hücre canliligi (%) çalismasinin sonuçlarini göstermektedir. Yapilan denemelerde elde edilen hücre canliligi (%) degerleri, standardin belirttigi minimum deger olan %70'in üzerinde olmakla kalmayip, ilgili teknik alanda yüksek kabul edilen %80'li degerlerin çok üzerindedir (%97,7). Dolayisiyla bulus konusu kemik greft malzemesinin biyouyumlulugu, bilinen teknige kiyasla açik farkla yüksek bir basariya karsilik gelmektedir. Söz konusu biyouyumluluk performansinin yani sira bulus konusu kemik greft malzemesinin enjekte edilebilirlik, depolama stabilitesi, doku tamiri (kemik olusumu) performansi açisindan da avantajli olan optimal bir tasarima/bilesime sahip oldugu kanisina ulasilmistir. Dolayisiyla mevcut basvuru kapsaminda sunulan kemik greft malzemesinin yukarida açiklanan her bir versiyonu, sözü edilen bilesen kombinasyonlari sayesinde - dogrudan klinik kullanimla minimal invazif ameliyat yoluyla hasarli bölgeye uygulanmak için uygun, - açik farkla yüksek biyouyumluluga sahip, - aglomerasyona karsi stabilitesi yüksek (faz ayrismasi göstermeyen), - enjeksiyon için uygun viskoziteye sahip (n<1 kayma incelmesi), - teknigin bilinen durumunda anilan problemlerin her birine optimal çözümler sunan bir ürüne karsilik gelmektedir. TR TR TR TR

Claims (1)

1.Istemler Seramik partikülleri, biyopolimer ve stabilizatör içerikli bir kemik greft malzemesi olup; seramik partikülleri olarak beta-trikalsiyum fosfat, biyopolimer olarak hiyalüronik asit ve stabilizatör olarak sitrik asit, sitrik asit tuzlari ve sitrat iyonlari arasindan seçilen bir ya da daha fazlasi ile birlikte nanokristalin selüloz içermesidir. lstem 1'e göre kemik greft malzemesi olup; toplam hiyalüronik asit agirligi esas alindiginda nanokristalin selüloz miktarinin ag. %0,1 ila ag. %O,5 araliginda olmasidir. lstem 1 ya da Z'den herhangi birine göre kemik greft malzemesi olup; söz konusu kemik greft malzemesinin toplam agirligi esas alindiginda, hiyalüronik asit ve nanokristalin selüloz toplam miktarinin beta-trikalsiyum fosfat miktarina oraninin agirlikça sirasiyla 35:65 ila 65:35 araliginda olmasidir. lstem 3'e göre kemik greft malzemesi olup; söz konusu kemik greft malzemesinin toplam agirligi esas alindiginda, hiyalüronik asit ve nanokristalin selüloz toplam miktarinin beta-trikalsiyum fosfat miktarina oraninin agirlikça sirasiyla 40:60 ila 60:40 araliginda olmasidir. lstem 3 ya da 4'ten herhangi birine göre kemik greft malzemesi olup; söz konusu kemik greft malzemesinin toplam agirligi esas alindiginda, hiyalüronik asit ve nanokristalin selüloz toplam miktarinin beta-trikalsiyum fosfat miktarina oraninin agirlikça sirasiyla 45:55 ila 55:45 araligindaki bir oranda olmasidir. lstem 3 ila 5'ten herhangi birine göre kemik greft malzemesi olup; söz konusu kemik greft malzemesinin toplam agirligi esas alindiginda, hiyalüronik asit ve nanokristalin selüloz toplam miktarinin beta-trikalsiyum fosfat miktarina oraninin agirlikça sirasiyla 50:50 oraninda olmasidir. lstem 1 ila 6'dan herhangi birine göre kemik greft malzemesi olup, zirkonyum dioksit içermesidir. lstem 1 ila 7'den herhangi birine göre kemik greft malzemesi olup; söz konusu kemik greft malzemesinin toplam agirligi esas alindiginda ag. %1 ila ag. %5 araliginda zirkonyum dioksit içermesidir. lstem 1 ila 8'den herhangi birine göre kemik greft malzemesi olup; biyopolimer olarak 500 kiloDalton degerinin üzerinde molekül agirligina sahip hiyalüronik asit içermesidir. lstem 9'a göre kemik greft malzemesi olup, biyopolimer olarak 750 kiloDalton ila 2 milyon Dalton araliginda molekül agirligina sahip hiyalüronik asit içermesidir. lstem 10'e göre kemik greft malzemesi olup, biyopolimer olarak 1 milyon Dalton molekül agirligina sahip hiyalüronik asit içermesidir. lstem 1 ila 11'den herhangi birine göre kemik greft malzemesi olup; söz konusu kemik greft malzemesinin toplam agirligi esas alindiginda ag. %010 ila ag. %0,60 araliginda sitrat (3-) anyonuna karsilik gelecek miktarda sitrik asit, sitrik asit tuzlari, sitrat iyonlari arasindan seçilen bir ya da daha fazlasini içermesidir. 13. istem 12'ye göre kemik greft malzemesi olup; söz konusu kemik greft malzemesinin toplam agirligi esas alindiginda ag. %0,10 ila ag. %0,60 araliginda sitrik asit içermesidir. Seramik partikülleri, biyopolimer ve stabilizatör içerikli bir kemik greft malzemesinin hazirlanmasi için bir yöntem olup; seramik partikülleri olarak beta-trikalsiyum fosfat, biyopolimer olarak hiyalüronik asit ve stabilizatör olarak sitrik asit, sitrik asit tuzlari ve sitrat iyonlari arasindan seçilen bir ya da daha fazlasi ile birlikte nanokristalin selülozun bir karisiminin hazirlanmasini içermesidir. Istem 14'e göre yöntem olup, asagidaki adimlari içermesidir: a) sodyum hiyalüranatin sulu ortamda jel haline getirilmesi suretiyle bir hiyalüronik asitjeli temin edilmesi; b) (a) adiminda temin edilen hiyalüronik asit jel içerisine nanokristalin selüloz ilave edilmesi suretiyle bir hiyalüronik asit/ nanokristalin selüloz jeli temin edilmesi; c) (b) adiminda temin edilen hiyalüronik asit/ nanokristalin selülozjelinin, beta-trikalsiyum fosfat ile bir karisiminin hazirlanmasi; d) (c) adiminda hazirlanan karisimin içerisine sitrik asit, sitrik asit tuzlari ve sitrat iyonlari arasindan seçilen bir ya da daha fazlasinin ilave edilmesi. Istem 15'e göre yöntem olup, (a) adiminda kullanilan sodyum hiyalüronatin, her 100 mL su basina 0,5 gram ila 1,5 gram araligindaki bir miktarda olmasidir. istem 15 ya da 16'dan herhangi birine göre yöntem olup, (b) adiminda kullanilan nanokristalin selüloz miktarinin, elde edilen hiyalüronik asit/ nanokristalin selüloz jelinin toplam agirligi esasina göre ag. %0,1 ila ag. %0,5 araliginda olmasidir. istem 15 ila 17'den herhangi birine göre yöntem olup, (c) adiminda kullanilan hiyalüronik asit/ nanokristalin selüloz jelinin beta-trikalsiyum fosfata agirlikça oraninin 35:65 ila 65:35 araliginda olmasidir. istem 18'e göre yöntem olup, (c) adiminda kullanilan hiyalüronik asit/ nanokristalin selüloz jelinin beta-trikalsiyum fosfata agirlikça oraninin 40:60 ila 60:40 araliginda olmasidir. istem 18 ya da 19'dan herhangi birine göre yöntem olup, (c) adiminda kullanilan hiyalüronik asit/ nanokristalin selüloz jelinin beta-trikalsiyum fosfata agirlikça oraninin 45:55 ila 55:45 araliginda olmasidir. Istem 19 ila 21'den herhangi birine göre yöntem olup, (c) adiminda kullanilan hiyalüronik asit/ nanokristalin selüloz jelinin beta-trikalsiyum fosfata agirlikça oraninin 50:50 olmasidir. istem 15 ila 22'den herhangi birine göre yöntem olup (01) adiminin, (c) adiminda hazirlanan karisimin içerisine, söz konusu karisimin toplam agirligi esasina göre ag. %0,10 ila ag. %0,60 araliginda sitrat (3-) anyonu derisimine karsilik gelecek miktarda sitrik asit, sitrik asit tuzlari ve sitrat iyonlari arasindan bir ya da daha fazlasinin ilave edilmesi suretiyle gerçeklestirilmesidir. 23. lstem 22'ye göre yöntem olup (d) adiminin, (c) adiminda hazirlanan karisimin içerisine, söz konusu karisimin toplam agirligi esasina göre ag. %Ü,1O ila ag. %Ü,60 araliginda bir derisime karsilik gelecek miktarda miktarda sitrik asit ilave edilmesi suretiyle gerçeklestirilmesidir. 24. lstem 14 ila 23'ten herhangi birine göre yöntem olup, ortaya çikan kemik greft malzemesinin toplam 5 agirligi esas alindiginda ag. %1 ila ag. %5 araliginda zirkonyum dioksit içerecegi sekilde zirkonyum dioksit ilave edilmesini içermesidir. TR TR TR TR