TR202016056A1 - UYARILMIŞ PLURİPOTENT KÖK HÜCREDEN FARKLILAŞTIRILAN EPCAM+ ENDODERMAL PROGENİTOR HÜCRELERDEN, UZUN SÜRELİ VE İŞLEVSEL HEPATİK ORGANOİD (eHEPO) KÜLTÜRÜNÜN OLUŞTURULMASI - Google Patents

UYARILMIŞ PLURİPOTENT KÖK HÜCREDEN FARKLILAŞTIRILAN EPCAM+ ENDODERMAL PROGENİTOR HÜCRELERDEN, UZUN SÜRELİ VE İŞLEVSEL HEPATİK ORGANOİD (eHEPO) KÜLTÜRÜNÜN OLUŞTURULMASI

Info

Publication number
TR202016056A1
TR202016056A1 TR2020/16056A TR202016056A TR202016056A1 TR 202016056 A1 TR202016056 A1 TR 202016056A1 TR 2020/16056 A TR2020/16056 A TR 2020/16056A TR 202016056 A TR202016056 A TR 202016056A TR 202016056 A1 TR202016056 A1 TR 202016056A1
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
organoids
cells
epcam
organoid
culture
Prior art date
Application number
TR2020/16056A
Other languages
English (en)
Inventor
Esra Erdal Bağriyanik Şeri̇fe
Akbari Soheil
Tamer Önder Tevfi̇k
Arslan Nur
Original Assignee
Dokuz Eyluel Ueniversitesi Rektoerluegue
Izmir Biyotip Ve Genom Merkezi
Koc Ueniversitesi
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dokuz Eyluel Ueniversitesi Rektoerluegue, Izmir Biyotip Ve Genom Merkezi, Koc Ueniversitesi filed Critical Dokuz Eyluel Ueniversitesi Rektoerluegue
Priority to TR2020/16056A priority Critical patent/TR202016056A1/tr
Priority to PCT/TR2021/050761 priority patent/WO2022075943A1/en
Priority to US18/247,651 priority patent/US20230392122A1/en
Publication of TR202016056A1 publication Critical patent/TR202016056A1/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C12N5/0671—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/407—Liver; Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides or bases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/345—Gastrin; Cholecystokinins [CCK]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/42—Notch; Delta; Jagged; Serrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Buluş, uyarılmış pluripotent kök hücrelerinin (UPKH) laboratuvarda kültür ortamında farklılaştırılmasıyla elde edilen, 3 boyutlu karaciğer organoidleri ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME UYARILMIS PLURIPOTENT KÖK HÜCREDEN FARKLILASTIRILAN EPCAM+ ENDODERMAL PROGENITOR HÜCRELERDEN, UZUN SÜRELI VE ISLEVSEL HEPATIK ORGANOID (eHEPO) KÜLTÜRÜNÜN OLUSTURULMASI Bulusun Ilgili Oldugu Teknik Alan Bulus, uyarilmis pluripotent kök hücrelerinin (UPKH) laboratuvarda kültür ortaminda farklilastirilmasiyla elde edilen 3 boyutlu karaciger organoidleri ile ilgilidir. Bulus ile sitrüllinemi hastaligi tedavisi için planlanacak gen tedavisi ve ilaç kesfi arastirmalarinda kullanilabilen 3 boyutlu hepatik (karaciger) organoidleri olusturulmustur. Bulusla Ilgili Teknigin Bilinen Durumu (Önceki Teknik) Organoid, organ spesifik eriskin kök hücrelerden ya da pluripotent kök hücrelerden laboratuvar kosullarinda olusturulan, mimari ve islevsel olarak organimsi, 3 boyutlu küçük yapilardir. Organoid, embriyo gelisimi sirasinda görülen kendiliginden organize olabilme süreçlerini taklit ederek olusur. Bu ana süreçler: hücrelerin spesifik ayrismalari (cell sorting out) ve hücrenin bulundugunu uzaysal yere bagli olarak gelecekte olabilecegi hücre tipine yönlenmesidir (Lineage committment). karaciger organoidlerin olusturulmasi ile ilgilidir. Pluripotent kök hücrelerinden multipotent endoderm sferoid progenitör hücreleri, sonrasinda elde edilen bu hücrelerden karaciger organoidieri elde edilmektedir. Endoderm hücreleri 8 gün ve 3B hepatic organoid lineage basamagi 47 günde ve islevsel hepatic organoid kültürü de 68 günde elde edilebilmektedir. Tanimlanan organoid kültürü ortami, daha çok büyüme faktörüne ihtiyaç duymakta ve buda maliyeti artirmaktadir. Ek olarak, organoid basamaginda büyüme faktörleri disinda ticari olan HCM (LONZA) ortamina ihtiyaç duyulmaktadir. Bu ortam pahali olmasinin yani sira, ticari oldugu için bilesenlerinin miktari tam bilinmemekte ve alternatifi bulunmamaktadir. Organoid olusturmak için tek hücre ile baslayip 3B sferoid yapilar olusturup daha sonra organoid olusturmak için yeniden tek hücre haline getirip organoid olusturulinaktadir. Bu islemler için hem fazla zaman, ugras ve masraf gerekmektedir. Ayrica ileri pasajda organoidlerin islevsellik ve hücresel içerikleri bilinmemekte ve organoidlerin en fazla 4.5 ay kültür edebildigi belirtilmektedir. Organoid kültürünü olusturmak için heterojen bir popülasyondan yola çikilmaktadir. organoidlerinin elde edilmesi ile ilgilidir. Organoid basamaginda büyüme faktörleri disinda ticari olan HCM (LONZA) ortamina ihtiyaç duyulmaktadir. Bu ortam pahali olmasinin yani sira ticari oldugu için bilesenlerinin miktari tam bilinmemektedir. Ileri pasajda organoidlerin islevsellik ve hücresel içerikleri bakimindan veri bulunmamaktadir. Organoid kültürünü olusturmak için heterojen bir popülasyondan yola çikilinaktadir. Organoid olusturma 28 gün sürmekte ve en fazla 30 gün daha kültüre edilebilmektedir. UPKH temelli organoid olusturma protokollerinde, çesitli büyüme faktörleri ve kimyasallar kullanilmaktadir. Bu süreçte hücrelerin hepsi ayni durumda olmadiklari için farkli sekilde diferansiye olmaktadir. Bir kisim hücre farkli sekilde daha ileri safhada olurken diger bir kisim hücre farklilasmamis ya daha az farklilasma geçirmis olmaktadir. Bu durum bir heterojen popülasyon olusturmaktadir. Dolayisiyla organoid olusurken farkli potansiyelde hücre ile yola çikilmakta buda sonuçta elde edilen organoid yapisinda endodermden gelisen farkli hücre tipleri ya da progenitörlerinin bulunmasi ihtimalini dogurrnaktadir. Bu nedenlerden dolayi daha kisa sürede elde edilebilen, verimi yüksek, uzun süre kültür edilebilen, daha uzun süreli olarak karaciger fonksiyonlarini tasiyabilen, maliyeti düsük, ticari ortamlara bagimli olinayan organoidlere ihtiyaç duyulmaktadir. Bulusun K da Aç klamasl lve Amaçlari l Mevcut bulus, organoid teknolojisi adi verilen, 3 boyutlu hücre/doku kültürün olusturulmasi ile ilgilidir. Mevcut bulus, uyarilmis pluripotent kök hücrelerin laboratuvar kosullarinda farklilastirilmasi ile elde edilen EpCAM+ endodermal progenitor hücrelerden, fonksiyonel karaciger (hepatik) organoid kültürü olusturmayi kapsamaktadir. Bu kültür, a) yaklasik 14 gün gibi kisa sürede olusmasi, b) 1 yildan fazla süre kültürde saglikli sekilde çogaltilabilmesi, c) ileri pasajlarda dahi, albümin üretme, glikojen depolama, düsük dansiteli lipoproteinin (LDL) hücre içine alimi ve sitokrom p450 enzim aktivitesi gibi spesifik karaciger islevlerini yerine getirmesi bakiinindan diger uyarilmis pluripotent kök hücrelerden (UPKH) elde edilmis hepatik organoidlere göre üstünlüge sahiptir. Bu nedenle, eHEPO adi verilen bu teknoloji, kisiye Özel ilaç taramalari, pre-klinik hepatoksisite analizleri ve hastalik modellemelerinde kullanimda kolaylik saglayacaktir. Bulus kapsaminda farklilasmanin endoderm basamaginda EpCAM pozitif hücreleri ayrimlayarak yalnizca karaciger spesifik hücrelerin olusmasini saglayacak olan homojen bir hücre grubu ile baslanmistir. Bu da elde edilen organoidlerin nereden kaynak aldiklarini ve nasil bir popülasyon olduklarini göstermektedir. Bulus ile endodermden ayrimlanan EpCAM+ hücrelerle organoid olusturulma yüzdesi minimum %35 olup, EpCAM- hücrelerin organoid olusturmadiklari görülmüstür.Teknigin bilinen durumunda tüin endoderm hücreler ile organoid elde edilmesinden dolayi organoid elde etme süresi oldukça uzun olmakta ve kültür uzun süreli devam ettirilememektedir. UPKH hücrelerinde 14 günde hepatik organoid elde edilmektedir. Islevsel karaciger hepatosit benzeri hücreler olusturmak için 10 gün daha farklilasma yapiliyor, yani 25. günün sonunda Albumin sekresyonu, LDL hücre içine alimi, yag biriktirme, glikojen depolama, ilaö detoksitîkasyon enzim aktivitesi gibi karacigere spesifik islevselere sahip hepatosit elde edilmis oluyor. Ek olarak, eHEPO teknolojisi bir nadir karaciger metabolizma hastaligi olan sitrüllinemi'nin modellenmesinde kullanilmis olup, hastaligin insanda görülen fenotipinin tamamen aynisi (karacigerin amonyak eliminasyonunu yapamamasi gibi) kültürde taklit edilebilmistir. Mevcut bulusun amaci pluripotent kök hücrelerden karaciger organoidleri olusturmaktir. Bu bulus, saglikli gönüllülerdcn ve genetik karaciger hastaliklarina sahip bireylerden alinan deri biyopsilerinden karaciger organoidi olusturmayi saglamaktadir. Bulus ile organoidlerin, kisa sürede elde edilebilir olmasi ve uzun süreli kültürlerde halen normal ve hastalik fenotipinde karaciger islevselligini tasiyor olmasi teknigin avantajini olusturmaktadir. Bu teknikle elde edilen organoidlerin, hepatotoksisite ve ilaç taramalarinda kullanim avantajlari bulunmaktadir. Bulus ile Endoderm 5 günde, 3B hepatic organoid lineage 10 günde ve islevsel hepatic organoid 25 günde elde edilebilmektedir. Endoderm kökenli hepaik organoid (eHEPO) kültüründe 48. pasaja kadar yaklasik organoidler 16-18 ay islevselligini kaybetmeksizin kültüre edilebilmektedir. Bulusta EpCAM hücreleri sort edilerek daha saf ve potansiyel bir hücre popülasyon ile baslanidigi için daha verimli bir kültür elde edilebilmektedir. Bulus yönteminde EpCAM + ve EpCAM , hücrelerden organoid olusturmaya çalisilmistir. EpCAM I hücreler organoid olusturmazken EpCAM + hücrelerin %35-40 civarinda organoid olusturmustur. Bulus kapsaminda erken pasajlardan ileri basamaklara kadar organoidlerin karakterizasyonu ve islevselik testleri yapilmistir. Bulus ile HCM gibi ticari ortamlara bagimli olmayan, uzun süre kültür edildiginde hücresel içerigini ve islevselligini koruyabilen organoidler elde edilmektedir. Organoid olustururken daha saf ve etkin hücre olan EpCAM ayrimlanarak organoid olusturulmustur. Bu durum da organoid olusumunun daha hizli ve etkili bir sekilde olmasini saglamaktadir. Ek olarak, bu yöntem bir üre siklusu hastaligi olan sitrüllineminin modellenmesinde kullanilmistir. Iki sitrüllinemi hastasindan alinmis olan deri fibroblastlarindan elde edilen UPKH"lerden olusturulan organoidlerde hastalik fenotipini taklit eder sekilde amonyak eliminasyonunun yapilamadigi gözlemlenmistir. Bulusu Aç klayaii Sekillerin Tan Iiilar D Sekil 1: UPKH kaynakli EpCAM (+) progenitör hücrelerden organoid olusturulmasi. A) Organoid kültürünü olusturma protokolü bu semada Özetlenmistir. B) OCT3/4 (pluripotent), FOXA2, SOX17 ve EpCAM (endoderm) markerlarin farkli basamaklardaki ifadelerinin immünoiloresans görüntüleri (20)( büyütme) (üst panel). Akis sitometri yöntemi ile EpCAM ve CXCR4 proteinlerin 5. gündeki ifadeleri. Endoderm farklilasma verimliligi üç farkli saglikli UPKH (WTl, WT2, WT3) EpCAM ve CXCR4 açisindan denenmistir (alt panel). C) Akis sitometri analizleri R-spol"in EpCAM (+) hücre sayisinin artmasina neden oldugunu göstermektedir. Deneyler üç farkli saglikli UPKH ile tekrarlanmistir (üst panel). R-spol"in UPKH kaynakli endoderm hücre morfolojisindeki etkisi. DIC görüntüleri; Differential interference contrast (alt panel). Sekil 2: eHEPO organoidlerin olusturulmasi. A) EpCAM+ ve EpCAM- hücrelerin organoid olusturma potansiyelleri. Olusan organoidlerin farkli zamanlarda faz kontrast mikroskop ile elde edilen görüntüleri. "p" pasaj numarasini ifade etmektedir. B) Endoderm kaynakli saglikli organoidlerin farkli pasajlarda (p6, p21 ve p48) Ekspansiyon ortami (EM) ortamindaki fenotipik karakterizasyonlari. C) EpCAM, HNF4a ve 201 proteinlerinin konfokal görüntüleri. Hücre çekirdekleri DAPI ile boyanmistir. plO organoidlerde EpCAM\HNF4ci ve ZO-l tüm yapi boyanmistir. Diger boyamalar frozen kesitlerinde yapilmistir. D) AFP ve CK18 organoidlerde immünohistokimyasal yöntem ile boyanmistir. H&E (hematoxylin/eosin) boyamasini ifade etmektedir. E) GSEA plot farklilasma sürecinde gen ekspresyonlarinin degisimini göstermektedir. Normalized enrichment scores (NES) and FDR q-values her gen listi için analizlenmistir. Sekil 3: eHEPO organoidlerin olgun hepatositlere In vitro farklilasmasi. A) Differensiasyon ortaini (DM)"da kültüre edilen organoidlerde CK18, E-Cadherin, AlAT, 201 ve ALB proteinlerinin konfokal görüntüleri. Hücre çekirdekleri DAPI ile boyaninistir. plO grupta organoidlerin tüm yapilari CKIS, E-CAD/AIAT ve ZO-l/ALB boyanmis, diger kosullar frozen kesitlerinde boyaninistir. B) Organoidlerde ALB, CKl9 ve E-cadherin proteinlerin immüohistokimyasal görüntüleri. C) eHEPO°larin tarainali elektron mikroskop ile çekilen görüntüleri. Ok isareti apoptotik hücreler ve multiveziküler yapilar ile göstermektedir (üst panel). Beyaz yuvarlak ve ok hücre baglantilari ve apikal villuslari göstermektedir (alt panel). D) Organoidlerde albümin ekspresyonunu izlemek için lentiviral albümin promotör-GFP reporter sistem yapilmistir. Isik mikroskop ve Iloresan mikroskop ile pALB-GFP reporterü tasiyan UPKH"lerin farklilasma basamaklarinin görüntüleri. Akis sitometri organoidlerin içerisindeki ALB+ hücrelerinin sayisini göstermektedir. E) GSEA plot EM ve DM arasindaki genlerin farkli ekspresyonlarini göstermektedir. Normalized enrichment scores (NES) ve FDR q-values karacigere özgün genler için analizlenmistir. F) Isi haritasi EM ve DM ile ilintili genlerin ifadelerini göstermektedir. G) qPCR EM, DM organoidlerin ve karaciger dokusundaki genlerin analizi. EM/DM ve doku/EM arasinda fold change yapilmistir (3 farkli biyolojik tekrar için 4 teknik replika yapilmistir). (%50.05). Sekil 4: eHEPO organoidlerin In vitro islevsellik testleri. Saglikli organoidlerin farkli pasajlarda (p6, p23, p48) EM ve DM kosullarindaki albümin salinimi ELIZA yöntem ile analizi. Veriler üç farkli deneyin ortalamasi ngALB/gün/milyon hücre seklinde edilmistir. C) LDL alimi p10 ve p48 pasajlarinda farklilasmanin 14. gününde immünofloresan görüntüleri. D) Glikojen depolamasi plO ve p48 pasajlarinda farklilasmanin 14. gününde PAS boyama görüntüleri. EM negatif kontrol olarak kullanilmistir. E) DMN ilaci ile NGS fare karacigerlerine hasar verildikten sonra, organoid transplante edilen karacigerlerden elde edilen kesitlerde iminünohistokimyasal boyama görüntüleri. GFP+ ve ALB+ hücrelerin varligi hepatositlerin fare karacigerine engraft oldugunu göstermektedir. (*p50.05; **p50.01; Sekil 5: Sitrüllineini (CTLN) hastalardan UPKH"lerin olusturulmasi ve karakterizasyonu. A) Saglikli, CTLNl ve CTLN2 UPKH"lerin morfololojik görüntüleri. B) Saglikli bireylerden ve hastalardan elden edilen Iibroblast ve UPKH"lerde ASSl geninin 15. ekzonundaki mutasyonlarin dizi analizi. C) Epizomal yeniden programlama vektörlerinin PCR ile entegrasyon analizleri. D) Saglikli. CTLNl ve CTLNZ UPKH"lerin kariyotip analizleri. E) UPKH°lerin NANOG, OCT4 ve SSEA immünofliresan görüntüleri. Hücre çekirdekleri Hoechst ile boyanmistir (Skala: 100 um). F) pluripotent genlerinin mRNA düzeyindeki ifade analizleri. G) Saglikli ve CTLNlUPKH'lerde GFP ve ASS] "in asiri ifadesinin western blot ile analizleri. H) CTLN] ve CTLN2 UPKHllerin SCID farelerde teratoma analizleri (Skala, 100 um). Sekil 6: eHEPOs ile sitrüllineini hastaligin modellenmesi. A) CTLN organoidlerin isik mikroskop görüntüleri. B) CTLN organoidlerde HNF40L, CKIS, ZO-l, CK19 ve ALB immünotloresan boyamalari. Hücre çekirdekleri DAPI ile boyanmistir. C) CTLN-GFP ve CTLN-ASS-O/E organoidlerin in vitro islevsellik testleri. Albumin salgilanmasi CTLNl-GFP ve CTLNl-ASS-O/E organoidlerde p p10`da CTLNl-GFP ve CTLNl-ASS-O/E organoidlerde PAS ve LDL ile analizleri. E) Saglikli ve CTLN UPKH. endoderm ve organoidlerin isi haritasi. F) Saglikli ve hasta kaynakli olgun eHEPO"larda asiri ifade edilen GFP (kontrol) ya da ASSl-O/E amonyak detoksifikasyon kapasitesi ölçümü. Deney üç kere tekrarlanmis ve ug/gün/million hücre seklinde sunulmustur (*p50.05; Sekil 7: Ortamdaki üre seviyesi ölçüm sonuçlari. Bulus uyarilmis pluripotent kök hücrelerinden (UPKH) 3 boyutlu hepatik organoidlerinin üretim yöntemi; o UPKH°lerin Activin A , Wnt3a. ve R-spol faktörleri içeren ortamda definitif endoderme farklilastirilmasi, o EpCAM+ endoderm hücresinin miktarini arttirmak için UPKH"den farklilastirma sirasinda 5ng/inl R-spo 1 eklenmesi, - Floresansla aktive edilmis hücre ayirma (FACS) yöntemi ile EpCAM + endodermal progenitör hücrelerinin ayrimlanmasi, o Ayrimlanan EpCAM + endoderrnal progenitör hücrelerinin 3B matrijel içerisinde o Matrijel katilastiginda retinoik asit içermeyen 1% N2 ve 1% B2? ile 1.25mM N- asetilsistein, lOnM gastrin ve 50ng/ml EGF, 10% RSPOl hücre kültürü ortami, lOOng/ml FGF 10, 25ng/ml HGF, lOmM Nikotinamid, 5uM A8301, lOuM FSK eklenen DMEM/F12 içeren kültür ortaminin ekleninesi, bu basamagin sadece ilk 3 gününde kültür ortamina 25ng/ml Noggin ve 30% Wnt CM ve lOuM Y27632 eklenmesi, o Organoidlerin islevsel hepatosite farklilasmasi için ortamin retinoik asit içermeyen eklenen gelistirilmis hücre kültür ortami DMEM/FIZ içeren farklilastirma ortami ile degistirilmesi Ilk olarak, UPKl-Her 5 gün boyunca 100 ng/mL Activin A , 50 ng/mL Wnt3a, ve 5 ng/mL R- spolfaktörleri içeren ortaini ile Definitif Endoderme farklilastirilmistir (Sekil 1A). Definitif Endoderm gelisim sürecinde Karacigerin parankimal hücrelerinin köken aldigi spesifik germ tabakasidir. Morfolojik degisikligin yani sira, UPK hücreleri farklilasmadan önce pluripotent belirteçi olan OCT3/4 ifade ederken, endoderm olustuktan sonra yani 5. günün sonunda bu genin ekspresyonunun azaldigi, ancak SOX17 , FOXA2 ve EpCAM gibi genlerin ifadesinin arttigi immunoiloresan boyamalar ile gösterildi. Ek olarak, akis sitometri analizleri popülasyonun % 65'inin CXCR4 +/EpCAM + oldugunu ortaya çikardi. Özellikle, üç bagimsiz UPKH hattindan (WTl, WTZ ve WT3) türetilen CXCR4+/EpCAM+ endodermal hücrelerin yüzdeleri bagimsiz farklilasmalardan sonra birbirinden önemli ölçüde farkli olmadiklari protokolün endodermal indüksiyon adiminin tekrarlanabilirligini göstermektedir (Sekil IB). Çalismanin bu asamasinda, daha fazla EpCAM+ endoderm hücresi elde etmek için farklilastirma ortami modifiye edildi. Bunun için, Wnt sinyal yolagi agonisti ve kök hücrelerin büyümesinde önemli rolü oldugu bilinen Sng/ml R-spol endoderin ortamina eklendi. Bu modifikasyon EpCAM oranini anlamli bir sekilde artirirken hücrelerin morfolojilerini negaif sekilde etkilememektedir (Sekil 1C). Sonuç olarak, bu protokol UPKH"leri 2 boyutlu kosullarda, daha fazla EpCAM + endoderm hücrelerine farklilasmasini saglamaktadir. Daha sonra UPKHilerin 2 boyutlu farklilasmanin sonunda elde edilen EpCAM+ hücreler yetiskin karacigerden organoidleri kültüre eden ortamda, tloresansla aktive edilmis hücre ayirma (FACS) ile ayrimlanip EpCAM + veya EpCAM- endodermal progenitör hücreleri kosullarinda kültür edildi. UPKH"1erden tetiklenmis endoderm hücre süspansiyonlari, canli hücre sayisinin belirlenmesi amaciyla tripan mavisi ile sayildiktan sonra hücreler ayrimlama tamponu (1XPBS, lmM EDTA, 25mM HEPES pH 7.0, 1% PES, 0.2um filtreden geçirilir ve oraninda anti-CD-FITC ile 10 dk 4°C,de inkübe edildi. Yikamalarin ardindan pellet ayrimlama tamponu ile 1x106 hücre/lml olacak sekilde çözülüp flow sitometrik yöntem ile ayrimlandi. Ayrimlanan hücreler santrifüjlenip, elde edilen hücre pelleti inatrijel ile resüspanse edildikten sonra "insan karaciger organoid kültürü" protokolüne göre kültüre Kültüre edildikten 14 gün sonra 100 um'den daha genis organoidler skorlandi. Hücreler 48 kuyulu (yapisma özelligi olmayan) hücre kültür kaplarina 3000-10000 hücre/kuyu olacak sekilde matrijel içerisinde ekildi. Matrijel katilastiginda EM (expansion medium/çogaltma ve idame ortami) kültür ortami eklendi. EM kültür ortami, retinoik asit içermeyen 1% N2 ve 1% hücre kültürü ortami (eV-yapimi), lOOng/ml FGF 10, 25ng/m1 HGF, 10mM Nikotinamid, 5uM A830l, lOuM F SK eklenen Advanced DMEM/FlTden olusmaktadir. Ilk 3 gün kültür ortamina; 25ng/ml Noggin ve 30% Wnt CM ve lOuM Y27632 eklendi. Daha sonra ortam; Noggin, Wnt ve Y27632 içermeyen kültür ortami ile devam edildi. 10-14 gün sonra Organoidler matrije17den uzaklastirilip, mekanik olarak parçalara ayrilip ve taze matriks içine yapildi. Hans Clevers ve ekibi tarafindan eriskin insan karaciger organoidleri yapiminda ilk kez tanimlanan, gelistirme ortami içerisinde (EM) büyütülen EpCAM (+) hücreler, yaklasik üçüncü günden itibaren organoid olusturmaya baslamis olup, 1 1. günün sonunda çaplari 100 pm°nin üstündeki organoidler skorlanmistir. EpCAM (-) hücrelerle yapilan denemelerde ise, bu hücrelerin organoid olusturma yetenegine sahip olmadiklari gözlenmistirKaraciger organoidleri, 7-10 gün boyunca, 25ng/ml BMP7 içeren hücre kültürü ortaminda yukarida anlatildigi sekilde hazirlanan kültür kosullarinda tutuldu. Daha sonra kültürler pasajlanip ve ayni ortam ile 2-4 gün daha idame ettirildi. Ardindan ortam DM (Differentiation medium/farklilastirma ortami) ile degistirildi. Bu ortam retinoik asit içermeyen 1% N2 ve 1% 10uM DAPT, 25ng/ml BMP7 ve 30uM Dexamethasone eklenen gelistirilmis hücre kültür ortami DMEM/F12 "den olusmaktadir. Bu süreç 10-14 gün boyunca 2-3 günde bir degistirilerek yapildi. Sonuç olarak, mevcut bulusta endoderm farklilastirma ortaminda modifikasyon yapilarak daha fazla EpCAM (+) endoderm hücrelerin olusmasi saglanmistir. Ek olarak bu EpCAM (+) hücrelerin ayrimlanmasi daha saf bir popülasyon ve buna bagli olarak da çok hizli ve etkili bir organoid olusturma yöntemi saglamistir. Ayrica bu yöntem kullanilarak elde edilen karaciger organoidleri 48 pasajdan daha uzun süreli kültürde kalinis ve ileri kültürlerinde dahi karaciger islevlerini kaybetmemislerdir. 1 hafta kadar kisa bir sürede, EpCAM + endodermal hücreleri yetiskin kök hücreden türetilen karaciger organoidlerine benzer 3 boyutlu içi bos yapilar olustururken, EpCAM - hücreleri bu yetenekten yoksundu. EpCAM + türetilmis organoidleri kültürlerken, yuvarlak sekilli organoid morfolojiye sahip, yaklasik 100 nm çapinda, farkli kenarlara sahip yapilar gözlenmistir (Sekil 2A). Özellikle, organoid kültürler her 7-10 günde bir 1:5 oraninda pasajlandi ve ileri pasajlarda fenotipik özelliklerde ve farklilasma kapasitesinde herhangi bir kayip olmadan (pasaj 30) 12 ay boyunca kültürlenebildiler. EM Ortami kosullari altinda kültürlenen EpCAM + endoderm hücre türevi organoidlerin stabilitesini belirlemek için, farkli zaman noktalarinda (p6, 21 ve 48) akis sitometrisi ile farkli belirteçler (AFP +, HNF4a +, FOXAZ +, EpCAM + ve CK19 +) analizlendi. EpCAM ve FOXAZ (endoderm belirteçleri), a- fetoprotein (AFP) (fetal karaciger belirteci) ve hepatosit nükleer faktör 4a (HNF4a) (hepatik belirteç) ifade eden alt popülasyonlarin yüzdeleri, genç ve yasli organoidler dahil olmak üzere farkli geçislerde önemli ölçüde degismedigi saptandi. EM kosullari altinda yasli organoidlerde CK19 (hepatoblast/kolanjiyosit belirteci) ekspresyonunun azaldigi saptandi (Sekil 2B). Bu bulgular, EM'nin uzun vadede organoid kültüründe progenitör hücrelerin stabil statüsünü korudugunu destekledi. Yapisal organizasyonla ilgili olarak, erken pasajdaki organoidler, siki bir sekilde kendi kendine organize olinus duktal benzeri yapilari çevreleyen CK19 + hücreleri, hepatoblast ve/veya safra kanali progenitör özelliklerine sahip hücrelerin bu yapilarda kaldigini gösterir. Ileri pasaj organoidleri için, CK19 + hücreleri daha çok organoid ve duktal spesifik lokasyonlarda esit olarak dagildigi saptandi. Ek olarak, EpCAM + hücrelerin, organoidlerde hala mevcut olmasi erken ve geç pasajlardan, karacigerin öncü hücrelerinin kaliciligini gösterir. Özellikle, HNF4a boyamasi, organoidlerin, sirasiyla erken ve geç pasajlarin hepatik soyuna yöneldigini gösterdi. Ayrica hem erken hem de ileri pasaj organoidleri, benzer bir modelde ZO-l eksprese eden kübik/Çok yüzlü epitel hücrelerine sahiptir ve siki baglantilar yoluyla hücre-hücre etkilesimlerinin varligina dair kanit saglar (Sekil 2C). Organoidlerin daha ileri immünohistokimyasal analizi, CK18 + ve AFP + hücrelerinin, epitel gelisiminde gözlendigi gibi sahte epitel yapilari olusturdugunu gösterdi (Sekil 2D). Hematoksilen-eozin boyamasi, sahte (pseudostratified) epitel ve duktal benzeri yapi dahil olmak üzere tipik yapisal organizasyonun uzun vadeli organoidlerde de (48. Pasajda) degismedigini gösterdi (Sekil 2D). eHEPO"larin küresel farklilasmasini anlamak için, EM kosullarinda kültürlenen UPKl-l'lerin, endodermal progenitörlerin ve organoidlerin RNA sekanslainasi gerçeklestirildi ve tam transkriptom düzeyinde kiinliklerinin tarafsiz bir karakterizasyonunu gerçeklestirildi. Gen seti zenginlestirme analizi (GSEA), gastrulasyon, endoderrn olusumu ve endoderrn gelisiminin gen setlerinin iPSC'lerden endoderin indüksiyonu üzerine oldukça zengin oldugunu gösterdi. Tersine, pluripotency ile iliskili genler ayni asamada asagi regüle edildi (Sekil 2E). EM indüksiyonu üzerine, endoderm spesifik genler asagi regüle edildi ve karacigere özgü gen setleri indüklendi (Sekil 2E). Birlikte ele alindiginda, bu veriler, bu protokolün hepatik farklilasmanin asamali gelisim sürecini simüle ettigini göstermektedir. Ortaya çikan hepatik hücrelerin olgunlasmasini daha da ileri götürmek için, organoidleri farklilastirma ortaminda (DM) 10-14 gün boyunca kültürlendi ve karacigere özgü genlerin ekspresyonunu ve immün-boyama yoluyla yapisal organizasyonu analiz edildi. Burada, CKlS, ZO-l, E-CAD, CK19, ALB ve AlAT için DM kosullarinda hem erken geçis (plO) hem de geç geçis (p48) organoidlerde immün boyama gerçeklestirdi. Tüm farklilasmis organoidler benzer sekilde tipik polar yapiya sahip ALB + ve CKlS + hepatositlerinden olusmakta ve ZO-l ekspresyonu, apikal ve bazolateral alanlari ayiran siki baglantilarin varligini göstermektedir. Ayrica, E-CAD boyama paterni karaciger epitelini göstermektedir. ALB ve AlAT boyamasi, geç pasajlarda bile ifade edilen hepatosit olgunlasmasi için kanit saglamaktadir. Bu arada, özellikle lümen benzeri yapilar etrafinda CK19 + hücrelerinin varligi, farklilasmis organoidlerde kolanjiyosit benzeri ve/Veya progenitör hücre popülasyonunun varligini göstermektedir (Sekil 3A). Daha ileri immünohistokimyasal analizler organoidlerin hem ALB + hem de CK19 + hücrelerine sahip oldugunu ortaya çikardi, bu da sirasiyla duktal benzeri yapidaki olgun hepatositleri ve kolanjiyositleri göstermektedir. Ayrica, E-CAD + hücreleri, irhepatosit benzeri bir fenotipi yansitan poligonal epiteloid yapilari temsil etmektedir (Sekil 3B). Organoidlerin ultrastrüktürel analizi, apikal ve bazolateral polariteye sahip bir canli hücre tabakasinin ve apoptotik ve multivesiküler cisimlerin kalintisini içeren bir lümen alanin varligini gösterdi. Hücreler arasindaki baglanti kompleksi, lümeni çevreleyen epitel hücrelerinin özelligi ile tanimlanmistir (Sekil SC). UPKHslerden eHEPO'larin olgunlasmasini daha fazla karakterize etmek için bir albümin-GFP reporter sistemi gelistirildi. GFP ekspresyonunu yürüten bir albümin güçlendirici/promotör, iki flanking insulator elementi arasinda bir lentiviral omurgaya klonlandi ve hiUPKH'lere entegre edilerek, UPKH'lerin organoidlerde olgun hepatositlere gerçek zamanli farklilasinasinin izlenmesi saglandi. Reporter tasiyan UPKHslerden organoid olsturuldu ve DM kültür kosullarinda 5 gün sonra GFP pozitif hale geldikleri saptandi (Sekil 3D). Tek bir UPKH reporter hattindan baslayarak üç bagimsiz farklilasmadan olusturulan organoidlerin içindeki bir dizi ALB + hücresi analiz edildi. ALB + hücrelerinin sayisinda önemli bir farklilik rastlanmadi (Sekil 3D). Bu veriler organoidlerin farklilasmalarinin basarili oldugunu göstermektedir. Organoidlerin farklilasma durumunun ayrintili bir degerlendirmesi için, DM indüksiyonundan sonra global ekspresyon profilleri olusturuldu. Organoidlerin farklilasma durumunun ayrintili bir degerlendirmesi için, DM indüksiyonundan sonra global ekspresyon profilleri olusturuldu. GSEA analizi, karacigere özgü genlerin DM kosullarinda yüksek düzeyde yukari regüle edildigini gösterdi (normallestirilmis zenginlestirme skoru [NES] 1.81, yanlis kesif orani [FDR] q degeri : 0). Bu bulgu, karacigere özgü genlerin, EM kosullariyla karsilastirildiginda DM kosullarinda daha fazla yukari regüle edildigi hipotezini desteklemektedir (Sekil 3E). Glikoz homeostazi (DCXR, IGFBP4, PGMl), lipid metabolizmasi (RXRA, GHR, SODl, APOC3, APOB, APOAl, LPlNl) ve glukoneogenez (PPPlR3B, GBEl) dahil olmak üzere karaciger fonksiyonunun farkli yönlerinde yer alan anahtar enzimlerin ve reseptörlerin çogu DM kültürü üzerine indüklendi (Sekil 3F). RNA dizileme verilerinin qPCR ile dogrulamasi, organoidlerde ALB, AlAT, CYP3A7 ve CYP3A4 gibi olgun hepatosit belirteçlerinin yukari düzenlenmesini ve endoderm asamasi belirteci EpCAM'in asagi düzenlenmesini dogrulamistir ancak organoidlerin gene ifadeleri yetiskin insan karaciger dokusuyla karsilastirildiginda daha düsük bir seviyeye sahip olduklarini göstermektedir (Sekil 3G). DM'deki olgun eHEPO'lari farkli pasajlarda ortama önemli miktarda albümin salgiladiklari gösterildi, bu da hepatosit islevselliginin göstergesi olarak bilinmektedir. Ancak DM kosullarinda salgilanan albümin düzeyi, kültürdeki organoid yasina bagli olarak kademeli olarak azalmistir (Sekil 4A). Farklilasmanin ardindan organoidler ayrica CYP alimi ve glikojen depolanmasi gibi olgun hepatosit fonksiyonlari kazandilar (Sekil 4B4D). Geç pasajdaki eHEPO'lar (p48), erken pasajlardaki organoidlere benzer sekilde, LDL alimi ve glikojen depolanmasi gibi karaciger fonksiyonlarini hala sergilemistir (Sekil 4C ve 4D). Farklilasmis organoidlerin in-vivo kosullarda özelliklerini test etmek için hücre enjeksiyon denemeleri yapildi ve ilk olarak GFP vektörü tasiyan saglikli bir UPKH hücresi olsturuldu. Daha sonra bu UPKH°lerden organoidler elde edildi. Fare karacigerlerine hücre enjeksiyonu yapilmadan önce immun sistemi baskilanmis NSG farelerine akut karaciger hasarina neden olmak için 14 gün boyunca dimetilnitrozamin (DMN) ilaci veildi. Son olarak, 2 milyon eHEPO hücresi hasarli karacigeri olan farelere intrasplenik olarak enjekte edildi, böylece transplantasyondan 32 gün sonra insan hücrelerinin yerlesimini, GFP ve insana özgü albüinin antikorlar ile ayri ayri immüno boyanmasi ile gösterildi (Sekil 4E). Insan ALB + hücreleri, interlobüler damarlarin etrafina ve parankim boyunca yerlesmis oldugu saptandi. Bu sonuçlar, eHEPO kültürlerinden elde edilen olgun, fonksiyonel hepatositlerin fare karacigerine engraft olma yetenegine sahip oldugunu göstermektedir. Daha sonra eHEPO sisteminin hastalik modellemesi için kullanilip kullanilamayacagi arastirildi. Bu amaçla, yenidogan hiperamonyemisi ile basvuran ve klinik olarak klasik sitrülinemi tip 1 (CTLNl) tanisi almis iki hastadan UPKH hatlari olusturuldu. CTLNl, ASS] genindeki mutasyonlara bagli olarak argininosüksinat sentetaz (ASS) enzimindeki bozukluklarin neden oldugu otozomal resesif bir üre döngüsü bozuklugudur. Hastaya özel UPKH'ler yüzey destegi olmaksizin (feeder-free) büyütüldü ve tipik pluripotent morfolojisi gösterdi (Sekil 5A). ASSl'in tüm kodlama eksonlarinin PCR amplifikasyon ve dizilemesi, klasik sitrülinemide en yaygin mutasyonlardan biri olan ekson 15'te hem hastalarin fibroblastlarinin hem de UPKH'lerinde homozigot G390R mutasyonlari barindirdigini gösterdi (Sekil SB). Olusturulan UPKH hatlari, genomik DNA PCR (Sekil SC) ile gösterildigi gibi epizomal vektör dizilerinden yoksundu. Her hastadan alinan bir UPKH klonu, kromozomal G bandi ile daha da analiz edildi ve normal bir karyotipe sahip oldugu onaylandi (Sekil 5D). CTLN UPKH'ler, pluripotensi belirteçleri olan OCT4, NANOG ve SSEA-4 için pozitifti (Sekil SE). RT-PCR analizleri, hastadan türetilen UPKH'lerde OCT4, SOX2, NANOG ve LIN28 mRNA'nin yüksek bir ekspresyonunu gösterdi, ancak orijinal dermal fibroblastlarda göstermedi (Sekil SF). Beklendigi gibi, ASSl protein ekspresyonu saglikli donörden türetilmis UPKH'lerde tespit edildi, ancak hastaya özel UPKH'lerde tespit edilemedi (Sekil 5G). Son olarak, her iki CTLN- UPKH çizgisi, üç gerrn katmaninin tamamindan türetilen hücreleri içeren iyi farklilasmis teratomlar olusturdu (Sekil SH). Birlikte ele alindiginda, bu veriler sitrülinemili hasta kaynakli UPKH'lerin pluripotensini dogrulamaktadir. Yukarida açiklanan protokolü takiben, kültürde 6 aydan fazla süreyle geçirilebilen CTLN organoidleri basariyla olusturuldu (Sekil 6A). CTLN ve vahsi tip organoidlerin dahili yapisal organizasyona göre karsilastirilmasi, her ikisinin de vektöre sahip oldugunu ortaya çikardi. Buna paralel olarak, hastadan türetilen UPKH'ler, kontrol olarak CTLN-GFP organoidleri üretmek için bos bir GFP vektörü ile transduce edildiler. eHEPO klonlarinin fenotipik karakterizasyonlari için, HNF4a, ZO-l, ALB, CK18 ve CK19'un immünfloresans boyamasi, saglikli donörden türetilmis organoidler ve CTLN organoidleri arasinda benzer bir model / yapiya sahip olduklarini gösterdi (Sekil 68). CTLN-GFP ve CTLN-ASSl-O/E organoidlerinin hepatik olgunlasma etkinligini anlamak için, vahsi tip organoidler (saglikli donörlerden) için tanimlanan karaciger fonksiyonlari kullanildi. Her iki eHEPO klonu için, DM aracili olgunlasma, albümin sekresyonunda önemli bir artisa neden oldu ve albümin seviyeleri birbiriyle karsilastirilabilirdi (Sekil 6C). Ayrica, CTLN-GFP ve CTLN-ASSl-O/E eHEPO'lar, DM kosullarinda LDL aliini ve glikojen depolama kapasitesine sahipti (Sekil 6D).Hastadan türetilen kültürlerin RNA dizilemesi ve tam transkriptomlarin Pearson korelasyonunun k-oitalamalarinin kümelenmesi, organoidlerin daha az farklilasmis hücre tiplerinden net bir sekilde ayrildigini gösterdi (Sekil 6E). UPKH'ler ve endodermal hücreler moleküler kimlik bakimindan benzer olsa da, yine de ayri ayri kümelenmisler, bu da hücre tiplerinin uygun sekilde ayirt edildigini göstermektedir (Sekil 615). En önemlisi, hastadan türetilen hücreler, saglikli einsallerinden neredeyse ayirt edilemezdi. Saglikli ve CTLN hastadan türetilmis organoidlerin DM kültürleri hemen hemen aynidir (FDR <0.0l olan iki gen), bu da CTLN hastaligina özgü mutasyonun hastadan türetilen hücrelerin farklilasma kapasitesini etkilemedigini gösterir. ASSl mutasyonu hastalarda amonyak birikimine neden olur ve üreagenezi azaltir. Daha sonra bu fenotipleri hastadan türetilen eHEPO'larda incelendi ve vahsi tip ASSl'in yeniden ekspresyonunun, hepatik organoid modelindeki hastalikla iliskili fenotipleri kurtarip kurtaramayacagini soruldu. Saglikli donörden türetilen organoid'ler, CTLN hasta organoidleri ile karsilastirildiginda önemli ölçüde daha az amonyaga sahipken, CTLN organoidlerinde vahsi tip ASSl'in yeniden ekspresyonu bu kusuru kurtardi (Sekil 6F). Buna paralel olarak, ortamdaki üre seviyeleri de ölçüldü ve CTLNl-GFP organoidlerinin saglikli organoidlere kiyasla daha düsük üre üretim kapasitesine sahip oldugunu ve önemli olarak ASSl asiri ekspresyonunun bu fenotipi kismen kurtardigi gözlemlendi (Sekil 7). Birlikte ele alindiginda, bu veriler, hepatik organoidlerin üre döngüsü ile iliskili hastalik fenotipini yansittigini ve eHEPO modelinde gen islevinin restorasyonunun gerçek]estirilebilecegini göstermektedir. TR TR TR TR

Claims (2)

ISTEMLER
1. UyarJInS pluripotent kök hücrelerinden (UPKH) 3 boyutlu hepatik organoidlerinin üretim yöntemi olup özelligi; UPKH°lerin Activin A , Wnt3a, ve R-spol faktörleri içeren ortamda definitif endoderme farkl Iast Elnas D EpCAM+ endoderm hücresinin miktariiî arttî'mak için UPKH'den farki last nma s nas nda Sng/ml R-SpO l eklenmesi, Floresansla aktive edilmis hücre ay rana (FACS) yöntemi ile EpCAM + endodermal progenitör hücrelerinin ayrEhlanmas Ç Ayrînlanan EpCAM + endodermal progenitör hücrelerinin 3B matrijel edilmesi, Matrijel katIastIg'Iida retinoik asit içermeyen 1% N2 ve 1% B27 ile 1.25mM N-asetilsistein, lOnM gastrin ve SOng/ml EGF, 10% RSPOl hücre kültürü ortam: lOOng/ml FGF 10, 25ng/ml HGF, lOmM Nikotinamid, SuM A8301, lOuM FSK eklenen DMEM/F12 içeren kültür ortami& eklenmesi, bu basamagm sadece ilk 3 gününde kültür ortamia 25ng/ml Noggin ve 30% Wnt CM ve lOuM Y27632 eklenmesi, Organoidlerin islevsel hepatosite farkllasmasE için ortam& retinoik asit içermeyen 1% N2 ve 1% B27 ile, lOnM gastrin ve 50ng/ml EGF, lOOng/ml 30uM Dexamethasene eklenen gelistirilmis hücre kültür ortamJDMEM/FIZ içeren farkl last rrma ortami ile degistirilmesi islem ad mlar n içermesidir.
2. 3 boyutlu hepatik organoid olup özelligi; Istem 1 °e uygun yöntein ile elde edilmesidir.
TR2020/16056A 2020-10-08 2020-10-08 UYARILMIŞ PLURİPOTENT KÖK HÜCREDEN FARKLILAŞTIRILAN EPCAM+ ENDODERMAL PROGENİTOR HÜCRELERDEN, UZUN SÜRELİ VE İŞLEVSEL HEPATİK ORGANOİD (eHEPO) KÜLTÜRÜNÜN OLUŞTURULMASI TR202016056A1 (tr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TR2020/16056A TR202016056A1 (tr) 2020-10-08 2020-10-08 UYARILMIŞ PLURİPOTENT KÖK HÜCREDEN FARKLILAŞTIRILAN EPCAM+ ENDODERMAL PROGENİTOR HÜCRELERDEN, UZUN SÜRELİ VE İŞLEVSEL HEPATİK ORGANOİD (eHEPO) KÜLTÜRÜNÜN OLUŞTURULMASI
PCT/TR2021/050761 WO2022075943A1 (en) 2020-10-08 2021-08-02 Long-term and functional culture of hepatic organoids (ehepo) derived from epcam+ endodermal progenitor cells differentiated from induced pluripotent stem cells
US18/247,651 US20230392122A1 (en) 2020-10-08 2021-08-02 LONG-TERM AND FUNCTIONAL CULTURE OF HEPATIC ORGANOIDS (eHEPO) DERIVED FROM EPCAM+ ENDODERMAL PROGENITOR CELLS DIFFERENTIATED FROM INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TR2020/16056A TR202016056A1 (tr) 2020-10-08 2020-10-08 UYARILMIŞ PLURİPOTENT KÖK HÜCREDEN FARKLILAŞTIRILAN EPCAM+ ENDODERMAL PROGENİTOR HÜCRELERDEN, UZUN SÜRELİ VE İŞLEVSEL HEPATİK ORGANOİD (eHEPO) KÜLTÜRÜNÜN OLUŞTURULMASI

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR202016056A1 true TR202016056A1 (tr) 2022-04-21

Family

ID=81125652

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2020/16056A TR202016056A1 (tr) 2020-10-08 2020-10-08 UYARILMIŞ PLURİPOTENT KÖK HÜCREDEN FARKLILAŞTIRILAN EPCAM+ ENDODERMAL PROGENİTOR HÜCRELERDEN, UZUN SÜRELİ VE İŞLEVSEL HEPATİK ORGANOİD (eHEPO) KÜLTÜRÜNÜN OLUŞTURULMASI

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20230392122A1 (tr)
TR (1) TR202016056A1 (tr)
WO (1) WO2022075943A1 (tr)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115386535B (zh) * 2022-10-26 2023-02-03 天津外泌体科技有限公司 多谱系肝类器官模型及基于该模型的药物肝毒评价方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022075943A1 (en) 2022-04-14
US20230392122A1 (en) 2023-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7208870B2 (ja) 多能性幹細胞から肝細胞及び胆管細胞を作製する方法
Leibel et al. Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy
JP2017012159A (ja) 多能性幹細胞から誘導した細胞を精製するための方法
US20050032207A1 (en) Method for isolating, culturing and differentiating intestinal stem cells for therapeutic use
Lam et al. Directed differentiation of pluripotent stem cells to kidney cells
Plaza Reyes et al. Identification of cell surface markers and establishment of monolayer differentiation to retinal pigment epithelial cells
AU2009200078A1 (en) Use of islet 1 as a marker for isolating or generating stem cells
AU2012211793A1 (en) Highly functional liver cells derived from pluripotent stem cells, method for producing same, and method for testing metabolism/toxicity of drug
CN107787363B (zh) 真正的胰腺祖细胞的分离
KR20230004690A (ko) 시험관 내에서 흉선 세포를 생성하는 방법
US20230392122A1 (en) LONG-TERM AND FUNCTIONAL CULTURE OF HEPATIC ORGANOIDS (eHEPO) DERIVED FROM EPCAM+ ENDODERMAL PROGENITOR CELLS DIFFERENTIATED FROM INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS
Jiang et al. Reconstitution of mammary epithelial morphogenesis by murine embryonic stem cells undergoing hematopoietic stem cell differentiation
Lord et al. Regulation of spermatogonial stem cell maintenance and self-renewal
Shen et al. Long-term culture and transplantation of spermatogonial stem cells from BALB/c mice
Hills et al. Functional recovery from human induced pluripotent stem cell-derived dopamine neuron grafts is dependent on neurite outgrowth
Mao et al. Characterization, isolation, and culture of spermatogonial stem cells in Macaca fascicularis
Kong et al. Tissues derived from reprogrammed Wharton’s jelly stem cells of the umbilical cord as a platform to study gestational diabetes mellitus
Tanaka Generation of the organotypic kidney structure by integrating pluripotent stem cell-derived renal stroma
Low Generation of vascularized 3-dimensional (3D) kidney organoids from human pluripotent stem cells
JP2013201943A (ja) 成熟肝細胞の製造方法
Ryosaka et al. Ureteric bud structures generated from human iPSCs
WO2006077899A1 (ja) Ｏｃｔ４を発現する細胞を含む細胞群、その取得方法及びその培養方法
Douagi et al. Identification of cell surface markers and establishment of monolayer differentiation to retinal pigment epithelial cells
Onder et al. Soheil Akbari, Gülben Gürhan Sevinç, 3, 10 Nevin Ersoy, 4 Onur Basak, 5, 6 Kubra Kaplan, Kenan Sevinç, 3 Erkin Ozel, 3 Berke Sengun, 3 Eray Enustun, 3 Burcu Ozcimen, 3 Alper Bagriyanik, Nur Arslan
Wong Bone Marrow Stem Cell-mediated Airway Epithelial Regeneration