TR201809744T4 - Multipotent hücreler kullanılarak doku onarımı. - Google Patents

Abstract

Buluş, tıp bilimi alanı, özellikle canlı, tercihen insan dokusundaki kusurların onarımına yönelik teknoloji ile ilgilidir. Mevcut buluş, multipotent hücrelerin farklılaşmasının indüklenmesine yönelik söz konusu yöntemin konsepti kullanılarak bir insan veya hayvan hastadaki doku kusurunun onarılmasına yönelik bir yöntemin yanı sıra multipotent hücrelerin, istenen bir hücre tipine farklılaştırılmasının indüklenmesine yönelik bir yöntemi sağlar. Buluş ayrıca, bir doku kusurunun onarılmasına yönelik yöntemin gerçekleştirilmesine yönenelik bir kit ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME MULTIPOTENT HÜCRELER KULLANILARAK DOKU ONARIMI Bulus, tip bilimi alani, özellikle canli, tercihen insan dokusundaki kusurlarin onarimina yönelik teknoloji ile ilgilidir.

Primer hücreler, bir organizmadaki çesitli spesifik doku tiplerinde bulunan oldukça özel hale getirilmis hücrelerdir. Bunlar, söz konusu dokunun islevini sürdürülmesi, onarilmasi ve desteklenmesine dahil edilir.

Canli dokuda bir kusurun ortaya çiktigi çogu durumda, birkaç iç veya dis reaksiyon tetiklenir. Hasarli dokuda bulunan primer hücreler, kusurun etrafina gizlenecek olan spesifik büyüme ve diger faktörleri üretebilir. Bu, hala yasayabilen hücrelerin proliferasyonunu tetiklemeyi hedefler, böylece kusur kapanabilir. Daha sonra, gerekli olmasi halinde, hücreler, tamamen islevsel özel dokuyu üretmek ve korumak için gereken hücre tipine farklilastirilabilir.

Birçok durumda, bununla birlikte, vücudun onarim reaksiyonu, islevsel bir dokuya yol açmaz veya tam olarak yol açmaz. Bu, kusurun boyutu, onarim islevini desteklemek üzere kusurlu bölgedeki primer hücrelerin yetersiz bulunmasi veya multipotent hücrelerden inflüks eksikligi gibi çesitli nedenlerden dolayi olabilir, bunlar gereken hücre tipine örnegin kan akisi ile farklilastirilabilir.

Eklem kikirdagi, sinoviyal birlesme yerlerinin uzun kemiklerinin uçlarini kaplar ve yaklasik olarak %30 hücre disi matris proteini ve yaklasik olarak %70 sudan olusur. Kondrositler, normal eklem kikirdaginda bulunan tek hücre tipidir, ancak insan saglikli yetiskin dokusunda yas agirligin %2isinden daha az katkida bulunur. Hücre disi matris, yüksek oranda negatif yüklü sülfatlanmis glikozaminoglikan (GAG yan zincirleri ve ayrica tip II kollajen fibrilleri) ile kikirdak spesifik proteoglikon moleküllerinden olusur. GAG yan zincirleri, su moleküllerini baglayabilir, böylece kikirdak matrisi içinde su ayrilir ve bir dahili 02009-P-0001 sisme basinci olusturulur. Bu hidroje] benzeri Özellikler, kikirdagin fonksiyonel yüklenmesi sirasinda matris içinde gözlenen interstisyel sivi akis modelleri için gereklidir, bu noktada su, dokudan disariya, negatif yüklü GAG zincirlerinin birbirini itmesine izin veren bir miktarda zorlanir. Sikistirici yükün serbest kalmasi üzerine, su, doku matrisine geri emdirilir. Kollajen ag, sulanarak sikistirilmis GAG ile birlikte, eklem kikirdaginin, dokuya sinoviyal birlesme yerlerinde, pürüzsüz ve acisiz artikülasyon, uygulanan yükün subkondral kemik üzerine yayilmasi ve mekanik soklarin absorbe edilmesi olmak üzere benzersiz islevini veren büyük sikistirici yüklere dayanmasini saglar.

Olgun eklem kikirdagi matrisi, iskeletsel olgunluktan sonra bölünmeyen az sayida kondrosit içermek üzere, vaskülarize veya innerve edilmez. Eklem kikirdaginin kendiliginden veya sadece oldukça sinirli bir oranda onarilmamasinin nedeni kisinen budur. Kikirdak onarimina yönelik mevcut yaklasimlar, doku kalintisinin giderilmesi, subkondral kemik plakasinin delinmesi araciligiyla kemikteki yaranin iyilesmesi sistemine erisim ve doku transplantasyonu ve hücre bazli tedavilere dayanir. Mevcut klinik tedaviler, otolog kondrositlerin implantasyonu (ACI) ve mozaikplasti (otolog osteokondral graftlar olarak da bilinir) gibi otolog hücre bazli tedaviler ile sinirlidir. Siddetli dezavantajlara bagli olarak, her iki tedavi de mevcut durumda sadece kikirdak onarim piyasasinin sinirli bir kismini ele alabilir.

Mozaikplastiye yönelik olarak, büyük bir sorun, transplantasyona yönelik olarak donör dokunun sinirli uygunlugundan dolayi küçük kusurlar ile sinirlidir. AClaya yönelik olarak, sorunlar, iki cerrahi operasyon gerçeklestirme gerekliligi, hücrelerin in vitro kültürlenmesinin gerekmesinden dolayi yüksek maliyetler ve kikirdak hücrelerinin fenotipinin kaybini içerir. Kikirdak hücreleri, ACI prosesinin parçasi olan hücre genislemesi üzerine farklilasmaz. Dolayisiyla, bunlar, orijinal fenotiplerini geri kazanmadan önce ameliyattan sonra birkaç ay gerektirir. Ancak o zaman gerçek kikirdak onarimi baslayabilir.

Son zamanlarda, bir biyomateryal matriste otolog kondrositler içeren ikinci 02009-P-0001 jenerasyon ACI gelistirilmistir. Bu teknik, ACIlnin, özellikle ACI'da gerekli olan uzun ve açik cerrahi prosedürün bazi problemlerini çözer. Ancak, geriye üç önemli sorun kalir: gerçeklestirilmesi gereken iki cerrahi prosedür, yüksek maliyetler ve uzun rehabilitasyon.

Dolayisiyla, doku kusurlarinin onarimi alaninda, özellikle spontane sekilde onarilmayan veya yeterince spontane sekilde onarilinayan kusurlara yönelik olarak daha fazla gelismeye ihtiyaç vardir.

Bulusa uygun olarak, multipotent hücrelerin farklilasmasinin, bunlari primer hücrelere maruz birakarak indükleyebilecegi bulunmustur. Bu etki, primer hücreler, önemli ölçüde multipotent hücreler ile seyreltildiginde dahi gözlemlenmistir. Multipotent hücrelerin sayisina göre oldukça düsük sayidaki primer hücrelerde dahi, multipotent hücrelerin spesifik bir soya farklilasmasi gerçeklesir. Aslinda, doku onariminin, primer ve %75 multipotent hücre içeren multipotent hücre popülasyonu kullanildiginda, sadece primer hücre popülasyonu kullanildiginda oldugundan daha hizli ilerledigi bulunmustur.

Bu bulguya bagli olarak, oldukça uygun maliyetli olan ve önceki teknikteki yöntemlere yönelik olarak yukarida özetlenen dezavantajlari yasamayan, doku kusurlarinin onarilmasina yönelik bir yöntem gelistirilmistir. Bulus, ekli istemlerde tanimlanir. Özellikle, bulusa göre bir doku kusurunun onarilmasina yönelik bir kullanim, tercihen artik birden fazla cerrahi prosedür gerektirmez. Bir prosedürde, primer ve multipotent hücrelerin her ikisi hasat edilebilir ve bunlar, ayni prosedür boyunca doku kusuruna uygulanabilir. Sonuç olarak, bir hastanin tedavisi, operasyon tesislerinde zaman bakimindan ve saglik çalisani açisindan daha az kaynak gerektirir. Bu, öncesinden farkli olarak, yilda daha fazla sayida hastanin, ayni saglik çalisanlari ve operasyon tesisleri ile tedavi edilmesini mümkün hale getirecektir. Ayrica, sadece bir cerrahi prosedürün yeterli olacagi gerçegi, hastalar 02009-P-0001 tarafindan karsilasilan agri ve acinin yani sira, ameliyat sirasinda enfeksiyon ve diger komplikasyonlarin riskini de önemli ölçüde azaltacak ve ayni zamanda iyilesme ve rehabilitasyon sürecini hizlandiracaktir.

Prensipte, doku onarimina yönelik olarak mezenkimal kök hücreler gibi multipotent hücrelerin kullanildiginin bilindigi dikkate alinmalidir. Bu konuda, referans Mary Murphy v.d., Artrit & Romatizma, 48(12), Aralik 2003, sayfa 582'ye yapilabilir. Bu belgelerde açiklanan çalismalar, implante edilmis kök hücrelerin, kök hücrelerin bir preparatinin bir kusura uygulanmasi araciligiyla doku onariminda veya rejenerasyonunda oynayabilecegi rolü arastirir. Bu çalismalarda, bununla birlikte, kök hücreler, kendi kendilerine, diger bir deyisle primer hücreler olmadan implante edilmistir.

Uluslararasi patent basvurusu WO 03/078609, kök hücrelerin farklilastirilmasinin, spesifik hücre soyuna indüklenmesine yönelik bir yöntemi açiklar. Mevcut bulustan farkli olarak, açiklanan yöntem, her zaman, uygun bir ortamda doku numunelerinin varliginda kök hücrelerin bir kültürleme adimini gerektirir. Söz konusu uluslararasi patent basvurusunda açiklanan yöntemde, kök hücreler, tercihen respiratuar, prostatik, pankreatik, mamari, renal, intestinal, nöral, iskeletsel, vasküler, hepatik, hematopoyetik, kas veya kardiyak hücre soylarindan seçilen bir hücre soyuna farklilastirilir. Kikirdak dokusu olusturmak üzere kök hücrelerin, kondrositlere farklilastirilmasi açiklanmamistir. Ayrica, kök hücreler ile doku numunesindeki hücreler arasindaki uygun oran ile ilgili herhangi bir sey açiklanmainistir.

WO 00/27999, gözenekli kati matris içindeki lenforetiküler stromal hücreler ile hematopoyetik progenitör hücrelerin birlikte kültürlenmesi araciligiyla lenfoid soylu spesifik hücrelerin üretimini açiklar. Doküman, halihazirda tanimlandigi gibi doku onarimi veya priiner hücrelerin multipotent hücrelere spesifik oranlari ile ilgili herhangi bir sey ögretmez. 02009-P-0001 WO 02/46401, öncelikli olarak transplantasyona yönelik immünotoleransin indüklenmesi ile ilgilidir. Bu doküman, halihazirda tanimlandigi gibi primer hücrelerin multipotent hücrelere spesifik oranlari ile ilgili herhangi bir kilavuz saglainaz.

Bulusa göre, “multipotent hücreler” terimi, çesitli özel tipte doku elemanlarina farklilastirilabilen hücrelere refere eder. Multipotent hücrelerin örnekleri, embriyonik kök hücreler, progenitör hücreler, inezenkimal kök hücreler, kemik iligi hücreleri veya satelit hücreleri içeren kök hücrelerdir. Bulusa göre, fibroblastlarin da diger hücre tiplerine farklilastirilabilmelerinden dolayi multipotent hücreler terimi ile kapsandigi düsünülür. Kemik iligi hücreleri tercihe bagli olarak kullanilir.

Bulusa göre, “primer hücreler” teriminin, özel hücreler olan ve (bir diger) hücre tipine daha fazla farklilasma özelligini kaybetmis olan hücrelere refere etmesi hedeflenir. Insan veya hayvan vücudunda farkli tipte primer hücrelerin sayisiz örnegi mevcuttur. Bulusa göre primer hücreler gibi sinir hücreleri, osteoblastlar, osteoklastlar, hepatositler, kardiyomiyositler, miyositler, Schwann hücreleri veya ürotelyal hücrelerin kullanilmasi tercih edilir. Oldukça tercih edilen bir düzenlemede, bulus, kikirdak onariminin bir yöntemine yöneliktir ve primer hücreler, kondrositlerdir.

Bulus, multipotent hücrelerin bir numunesinin ve primer hücrelerin bir numunesinin hasat edilmesini içerir. Tipik olarak, bu numuneler, bir biyopsi olarak refere edilen bir prosedürde elde edilecektir. Bu prosedür, basli basina bilinir ve hücrelerin nuinunesinin alinacagi dokunun spesifik tipine uyarlanabilir. Örnek yoluyla, en az 100 mg (4 mm çapinda 5 ila 6 biyopsi dahil) kondrosit içeren bir kikirdak doku biyopsisi, artroskopi sirasinda tercihen dahil edilmemis düsük yük tasiyan bir yarali bölgeden alinabilir ve uygun bir ortam içeren bir tüpte toplanabilir veya dogrudan bir peroperatif hücre izolasyon protokolüne tabi tutulabilir. Kemik iligi otopsileri, pelvik kemik (iliak kanat) veya femurun 02009-P-0001 proksimal veya distal parçasindan elde edilebilir. Tüm biyopsiler, tercihen hedeflenen ameliyatin gerçeklestirilecegi veya buraya yakin bir alandan alinir.

Kemikteki açikliklar, prosedürün parçasi olarak olusturuldugunda, 8 ölçü kalinligindaki biyopsi ignesi sokulabilir ve 2-50 cc kemik iligi çekilebilir.

Tercihen, kullanilan igne ve siringa, iligin pihtilasmasini önlemek üzere el ile %1 heparin solüsyonu kullanilmadan önce temizlenir. Tüm kemik iliginin kullanilmasi durumunda, bu, tercihen heparin olmadan çekilir. Çekildikten sonra, kemik iligi, örnegin kemik iliginin her 10 ml”si gibi bir heparinize tüp içine steril kosullar altinda enjekte edilebilir.

Alternatif bir düzenlemede, özellikle multipotent hücrelerin bir biyopsisi olmak üzere bir biyopsi, kusurlu bölgede ameliyat sirasinda uygun multipotent hücrelerin olusturulmasini içerir. Bu düzenlemeye uygun olarak, doku kusurunda veya buna yakin olan multipotent hücreler kullanilir. Avantajli olarak, bu düzenleme, hastanin vücudundan multipotent hücrelerin izole edilmesini gerektirmez; bunlar, sadece kusurlu bölgedeki primer hücreler için uygun hale getirilir. Bu, örnegin subkondral kemik plakasi delme ile multipotent hücrelerin in situ iyilestirilmesi araciligiyla veya kusura sinoviyal orijinden multipotent hücreler çekmek üzere kemo atraktantlarin uygulanmasi araciligiyla yapilabilir.

Primer hücrelerin tipi ve kaynagi, onarilmasi hedeflenen dokunun tipine bagli olarak seçilecektir. Tercihen, primer hücreler, onarilacak olan dokuda dogal yollardan ortaya çikan bir hücreye sahiptir. Oldukça tercih edilen bir düzenlemede, kondrositler, kikirdak kusurlarinin onarimina yönelik olarak hasat edilir. Multipotent hücrelerin tipi ve kaynagi ayrica, onarilmasi hedeflenen dokunun tipine bagli olarak seçilir.

Asagidaki genel taslak, primer ve multipotent hücrelerin hücre tiplerinin, spesifik bir doku tipinin onarimi için bir bakis ile nasil seçilebildiginin örneklerini verir. 02009-P-0001 Kikirdak Karaciger kapakçiklari Idrar kesesi Bagirsaklar Ligamentler ve Tendonlar Primer hücre kaynagi uzun kemik, pelvik kemik, köprücük kemigi, subkondral trabeküler kemikten osteoblastlar Burun, diz veya kalça eklemi, dirsek, kulak, bilek veya soluk borusu kikirdagi, izole kondrondan türetilen kondrositler Karacigerden hepatositler Kalp kasindan kardiyomiyositler, kalpteki vasküler dokuyu olusturan vasküler miyofibroblastlar Düz kaslardan miyositler Schwann hücreleri, epinöral tüplerden nöral hücreler Ürolojik bölgeden ürotelyal hücreler J ejunum, duodenumdan hücreler Çapraz ligamentler veya tendondan hücreler Multipotent hücre kaynagi Kemik iligi, mezenkimal kök hücreler, diger bir deyisle yag, iskeletsel kastan kök hücreler, progenitör hücreler, göbek kordonu hücreleri, fibroblastlar, insan kemik vasküler iligi stromal hücreleri, türetilen hücreler, sinoviyal hücreler, dermal hücreleri ve periosteum veya perikondriyumdan hücreler 02009-P-0001 Onarma Primer hücre kaynagi Multipotent hücre kaynagi Kil Dermal papilla hücreleri, dis kök kilifi veya matris epitalyal hücreler gibi kil folikülünden hücreler Tercih edilen bir düzenlemede, hasat edilen hücreler, biyopside elde edilen numunelerden izole edilir. Bu, manyetik akis siniflandirma, floresan ile aktiflestirilen hücre siniflandirma (FACS), kolon filtrasyonu, santrifüjleme, percoll ayrimi veya doku kültür plastigine baglanma araciligiyla bir sividaki hücrelere yönelik olarak gerçeklestirilebilir. Dokudaki hücrelere yönelik olarak, bu, toz haline getirme, diger bir deyisle hafif pompalama islemi araciligiyla hücrelerin dagitilmasi araciligiyla, akabinde dokunun diseksiyonu ve enzimatik sindirimi ve kolon filtrasyonu ile izolayon, santrifüjleme, membran ayristirma veya jel ayristirma araciligiyla tamamlanabilir. Bu bakimdan kullanilacak olan enzimlerin uygun örnekleri, kollajenaz, dispaz, tripsin, elastaz, hiyalüronidaz ve papain içerir.

Hasat edilen hücreleri izole etmeden kullanmak ayrica mümkündür. Örnegin, kemik iligi fraksiyonlari veya kemik iliginin tamami, multipotent hücreler saglamak üzere dogrudan kullanilabilir. Ayni zamanda, dogranmis veya kesilmis doku (doku parçalari), primer hücre bileseni gibi baska hücre izolasyonu olmadan kullanilabilir.

Bulusa uygun olarak, elde edilen multipotent ve primer hücrele popülasyonlari, inultipotent hücrelerin farklilasmasini indükleinek amaciyla in vitro, in vz'vo veya in si'tu kombine edilir. Multipotent ve primer hücrelerin her ikisi, bunlari dogal ortamlarinda çevreleyecek olan doku bilesenleri ile veya bunlar olmaksizin birbiri ile kombine edilebilir. Bu tür bilesenlerin örnekleri, kemik iligi 02009-P-0001 ve kani içerir. Avantajli olarak, multipotent hücreler, priiner hücrelerin hücre tipine farklilastirilacaktir. Sasirtici bir sekilde, indüksiyonun istenen etkisini elde etmek üzere, multipotent hücrelerin sayisina iliskin, sadece az sayida primer hücrenin gerekli oldugu bulunmustur. Kombine edilecek iki popülasyon olmak üzere primer hücre popülasyonundaki hücrelerin sayisinin, multipotent hücre ve daha çok tercih edildigi üzere 1:50 ila 1:5”tir. iligi stromal hücrelerinin, yedi gün boyunca 1:1 praninda kardiyomiyositler ile birlikte ko-kültürlenmesi durumunda in vitro kardiyak soya girebildigini açiklamistir, Sasirtici bir sekilde, bulus ile uyumlu olarak, multipotent hücrelerin farklilasmasini indüklemek amaciyla, multipotent hücre sayisina iliskin olarak daha az sayida primer hücrenin yeterli oldugu bulunmustur. Ayni zamanda, bulus ile uyumlu olarak, kombine hücre popülasyonlarinin in vitro birlikte kültürlenmesi gerekli degildir. Aslinda, hücre popülasyonlarinin ikisinin kombine edilmesinden önce veya sonra, kombine hücre popülasyonlarinin, in vitro kültürlenmeden bir doku onarimina uygulanmasi tercih edilir.

Multipotent hücrelerden baslayan doku mühendisligi ile ilgili geleneksel yaklasimlar, multipotent hücreleri stimüle etmek ve bunlarin farklilastirilmasini saglamak amaciyla büyüme faktörü gibi kimyasal faktörlere dayalidir. Bu yaklasimlarda, multipotent hücreler, sadece farklilastiktan sonra in vitro iinplante edilecek olan kimyasal faktörlerin eylemine tabi tutulur. Halihazirda belirtildigi üzere, buna göre in vitro kültürleme gerekli degildir. Hasat edilen multipotent hücreler yerine, degistirilmemis durumdaki bir doku kusuruna uygulanabilir. Ayni zamanda, bulus ile uyumlu olarak, multipotent hücrelerin farklilasmasini saglamak amaciyla kimyasal faktörlerin kullanilmasi gerekli degildir. Bununla birlikte, farklilasma, bu tür faktörlerin kullanilmasi araciligiyla daha da gelistirilebilir, bu ayrica, bulus tarafindan kapsanir. Kullanilabilen kimyasal 02009-P-0001 faktörlerin bazi örnekleri, Vitronektin, tenascin, RGD peptitleri, hiyalüronan, laminin, pronektin veya fibronektin veya bunlarin parçalari, örnegin arginin- glisin-aspartat ve sitokinler veya bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF), dönüstürücü büyüme faktörü beta (TGF-beta), sinir büyüme faktörü (NGF), insülin benzeri büyüme faktörü-l (IGF-l), büyüme hormonu (GH), çogaltma stimüle edici aktivite (MSA), kikirdaktan türetilen faktör (CDF), kemik morfojenik proteinleri (BMP,ler), büyüme farklilastirrna faktörü-5 (GDF-S), deksametazon (deks) veya diger osteojenik faktörler, anti-anjiyojenez faktörler (anjiyostatin) ve platelet türetilen büyüme faktörü (PDGF) gibi diger salinabilir hücre stimüle edici faktörleri içerir.

Multipotent hücrelerin, kondrositlere farklilastirilmasinin indüksiyonuna yönelik olarak, fibronektin kullaniminin, özellikle avantajli olacagi bulunmustur.

Fibronektinin genel olarak kondrojenezi engelledigi bilinir (West, C.M., R. Lanza, J. Rosenbloom, M. Lowe, H. Holtzer, and N. Avdalovic, Fibronectin alters the phenotypic properties of cultured Chick embryo chondroblasts. Cell, 1979. 17(3): p. 491-501, Pennypacker, J.P., J.R. Hassell, KM. Yamada, and R.M. Pratt, The influence of an adhesive cell surface protein on chondrogenic expression in vitro. fibronektinin, bu noktada bulusa göre bir yöntemdeki kikirdak olusumunu (Sekil 4) gelistirdigi bulunmustur. Teoriye bagli kalinmaksizin, bu kikirdak olusumunun artmasinin nedenlerinden birinin, fibronektinin kondrositlerin, yuvarlak morfolojilerini muhafaza etmesine izin verebilmesi oldugu ileri sürülür.

Primer ve multipotent hücrelerin kombine edilmesinden önce veya sonra, bunlar, bir biyouyumlu iskele üzerine tohumlandirilabilir. Tercihen, popülasyonlar, kombine hücre popülasyonu üzerinden iki hücrenin homojen dagiliinini güvence altina almaya uygun bir sekilde kombine edilir. Bu baglamda, popülasyonlarin, iskele üzerine tohumlandirilmadan önce kombine edilmesi tercih edilir. Diger taraftan, bunun, iskele üzerinden bölümlü bir sekilde iki hücre tipini dagitmasi 02009-P-0001 uygulanabilir ve belirli kosullar altinda avantajlidir, böylece bir hücre tipinin büyük bir çogunlugu veya belirli hücrelerini içeren bölümler belirgindir.

Bir biyouyumlu iskele kullanmak istenip istenmesi, belirli bir durumda onarilmasi gereken dokunun tipi ve kusurun boyutuna bagli olarak teknikte uzman kisi tarafindan kolaylikla belirlenebilir. Örnegin yük mukavemeti gibi mekanik bir isleve sahip olan, kemik veya kikirdak gibi dokulardaki özellikle daha büyük kusurlarin onarimina yönelik olarak, iskele kullanimi faydalidir. Iskele için materyale yönelik seçim, ayrica ilgili doku tipine bagli olacaktir. Materyallerin uygun örnekleri, metaller ve metal alasimlar, seramikler, (biy0)camlar ve polimerik materyalleri içerir. Materyalin biyouyumlu olmasi elbette önemlidir, bu, materyalin, insan veya hayvanin kabul edilemez yanitlari olmaksizin insan veya hayvan vücuduna büyük ölçüde dahil edilebildigi anlamina gelir.

Bir iskelenin yapiminda kullanilan tercih edilen materyaller, haftalarca veya daha uzun süre biyouyumlu, biyo-emilebilirdir ve genel olarak, hücre baglanmasini destekler. “Biyo-emilebilir” terimi, burada materyalin, vücut tarafindan yeniden emilebilen ve ayrica biyolojik olarak parçalanabilir olabilen bilesenler halinde çözünmesi anlamina gelecek sekilde kullanilir. Biyolojik olarak parçalanabilir materyallerin, enzimatik klevaj gibi aktif biyolojik prosesler araciligiyla degeri düsürülebilir. Burada açiklanan cihazlarin üretiminde kullanilacak olan materyallere yönelik istenebilen diger özellikler, genel olarak kabul edilen güvenlik seviyelerine tasinabilen biyolojik olarak kabul edilebilir bir solventte çözünürlük ve elastisite ve basinç ve çekme dayanimi içerir.

Uygun olan dogal polimerler, selüloz, dekstranlar, kitin, kitosan, glikozaminoglikanlar gibi polisakkaritler; hiyalüronik asit veya esterler, kondroitin sülfat ve heparin; ve elastin, kollajen, agaroz, kalsiyum alginat, fibronektin, fibrin, laminin, jelatin, albumin, kazein, ipek proteini, proteoglikanlar, Prolastin, Pronektin veya BetaSilk gibi dogal veya sentetik proteinler veya proteinoidleri içerir. Söz konusu polimerlerin kimyasal olarak degistirilmis 02009-P-0001 türevlerinin yani sira herhangi bir polimer kombinasyonunun karisimlari da kullanilabilir.

Bir iskele olusturulmasina yönelik olarak özellikle uygun bulunan sentetik polimerler, polialkilen glikol ve aromatik esterler ve poli(laktik asit) (PLA) ve poli(DL-laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) gibi poli(alfa)esterlerin kopolimerlerini içerir. Diger uygun materyaller, poli(D-laktid) ve bir poli(L-1aktid) graft edilmis dekstranin pluronik veya blok kopolimerleri gibi, tercihen bir polyester veya bir poli-oi-amino asit omurga ve/veya heparin, poli(epsilon.-kaprolakton) (PCL), polianhidritler, poliarilatlar ve polifosfazen içeren isiltersinir veya isikla kürlenebilir jelleri içerir. Tercih edilen sentetik polimerler, poli(hidroksi alkanoatlar), polidioksanon, poliamino asitler, poli(gamma-glutamik asit), poli(vinil asetatlar), poli(vinil alkoller), poli(etilen-iminler), poli(ortoesterler), polifosfoesterler, poli(tirosin-karbonatlar), poli(etilenglikoller), poli(trimetilen karbonat), poliiminokarbonatlar, poli(oksietilen-polioksipropilen), poli(alfa- hidroksi-karboksilik asit/polioksialkilen), poliasetaller, poli(pr0pilen fümaratlar), ve karboksimetilselüloz içerir.

Oldukça tercih edilen bir düzenlemede, iskele, hidrojel özelliklere sahip olan spesifik sinif polimerik materyallerden olusturulur. Bu, polialkilen glikol ve bir aromatik polyesterin kopolimerlerinin sinifidir. Tercihen, bu kopolimerler, agirlikça %40-80, daha çok tercih edildigi üzere agirlikça %50-70 polialkilen glikol ve agirlikça %60-20, daha çok tercih edildigi üzere agirlikça %50-30 aromatik polyester içerir. Bulusa göre kopolimerlerin tercih edilen bir tipi, blok kopolimerler grubu araciligiyla olustuiulur. Tercih edilen polialkilen glikoller, polietilen glikol, polipropilen glikol ve polibütilen glikol ve poloksamerler gibi bunlarin kopolimerlerinin grubundan seçilir. Oldukça tercih edilen bir polialkilen glikol, polietilen glikoldur. Tercih edilen poliesterler, polietilen tereftalat, polipropilen tereftalat ve polibütilen tereiltarat grubundan seçilir. Oldukça tercih edilen bir polyester, polibütilen tereftalattir. 02009-P-0001 1500 ortalama moleküler agirlikta bir agirliga sahiptir. Aromatik polyester moleküler agirlikta bir agirliga sahiptir. Kopolimerin ortalama moleküler agirligi 120,000 arasinda uzanir. Ortalama moleküler agirlik, jel permeasyon kromatografisi (GPC) araciligiyla uygun bir sekilde belirlenebilir. Basli basina bilinen bu teknik, örnegin bir solvent olarak tetrahidrofüran ve dis standart olarak polistiren kullanilarak gerçeklestirilebilir.

Iskele, uygun mekanik stabilite ve proliferasyon ve farklilasma (her ikisi de in vi'vo) elde etmek üzere yapilandirilacaktir. Elbette, iskele, ayrica onarilacak olan kusura uyacak bir boyut ve biçimde olmalidir. Standart boyut ve biçim veya standart boyutlar ve biçimlerin bir kombinasyonunun, tedavi edilecek olan kusurun gerekliliklerine biçim ve boyutu kaliplayabilen veya uyarlayabilen bir cerraha saglanir. Iskelenin, belirli bir biçime sahip olmamasi, ancak örnegin enjekte edilebilir bir jel seklindeki multipotent ve primer hücrelerin kombine popülasyonlarinin enjekte edilmesini saglamasi ayrica mümkündür. Istenen bir etkiyi elde etmek üzere manipüle edilebilen degiskenler, inter alfa makro yapi, kimyasal bilesim, gözeneklilik, gözenek boyutunu (çap) içeren mikro yapi, yüzey aktif maddeler ve hücre baglama peptitleri gibi yüzey modifikasyonlari, biyoaktif ajanlarin dahil edilmesi, akis özellikleri (örnegin iskeleden ve bunun içindeki sivi akisini yönlendiren ve kontrol eden kanallar) ve iskele üzerindeki veya iskeledeki yapisal elemanlardir.

Genellikle, iskele, üzerine tohumlanan hücrelere besin maddelerinin tasinmasini kolaylastirmak amaciyla gözenekli veya lifli bir yapiya ve bunlarin üzerine ve/veya içine ekilmis hücrelerden gelen atik materyallere sahip olacaktir. Bir polimerik materyalin gözenekli bir yapisi, tuz kaplama veya sinterleme gibi herhangi bir bilinen yöntem araciligiyla elde edilebilir. Prensipte, faz ters çevirme, dondurarak kurutma ve tuz kaplama gibi tekniklerin herhangi bir kombinayonu 02009-P-0001 kullanilabilir. Serbest sekilde, hizli prototiplendirme veya 3D baski prosesinde üretilen bir iskeleyi kullanmak ayrica mümkündür.

Tercih edilen bir düzenlemede, iskelenin dis yüzeyi, kismen veya tamamen bir seramik kaplama ile saglanir. Tercihen, seramik kaplama, örnegin oktakalsiyuin fosfat, hidroksiapatit veya karbonat apatit gibi bir apatit, oi-trikalsiyum fosfat, ß- trikalsiyum fosfat, sodyum kalsiyum fosfat gibi bir whitlockite veya bunlarin bir kombinasyonunu içeren bir kaplama gibi bir kalsiyum fosfat kaplamadir. Bir seramik materyal ve bir polimerik materyalin bifazik kompozit yapisi olan bir iskeleyi kullanmak ayrica mümkündür. Seramik materyalin varliginin, kemik özelliklerini kopyalamak üzere kullanilabilmesi nedeniyle oldukça faydali oldugu bulunmustur.

Hücre popülasyonlarinin tohumlandirilmasi, örnegin bir tohumlandirma araci, statik, dinamik veya perfüzyon tohumlandirma veya bunlarin bir kombinasyonu kullanilarak, herhangi bir bilinen sekilde gerçeklestirilebilir.

Primer ve multipotent hücre popülasyonlarinin kombine edilmesinden sonra, kusura uygulanir. Bulusun avantajlarindan biri, hücrelerin in vitro kültürlenmesi ile herhangi bir genlesmenin dahil edilmemesidir. Primer ve multipotent hücreler, vücudun dogal onarim reaksiyonunu indüklemek ve desteklemek üzere kusurlu bölgeye uygun hale getirilecektir. Teoriye bagli kalinmaksizin, primer hücrelerin, dogal çevrelerine bir yanit olarak spesifik faktörler ürettigi ve sakladigina inanilir, bu faktörler, multipotent hücrelerin, bir doku spesifik soya farklilasmasini gelistirecek veya indükleyecektir. Böylece, primer hücrelerin uygulanmasi araciligiyla, multipotent hücre popülasyonu, doku onariminda dahil edilen büyüme ve diger faktörlerin dogal bir kaskadini belirleyen bir “fabrika, ile saglanir.

Halihazirda yukarida gösterildigi üzere, hücrelerin iki popülasyonunun, kusura uygulanmadan önce birbiri boyunca büyük ölçüde homojen olarak dagitilmasi 02009-P-0001 tercih edilir. Bu, tercihen uygulamadan hemen önce döndürme veya bosaltma araciligiyla hücrelerin iki popülasyonunun karisiminin yeniden süspansiyonu araciligiyla elde edilebilir. Hücrelerin kombine popülasyonlarinin, iskele ile birlikte kusura uygulanacak olmasi durumunda, bunlar, tercihen ilk olarak kombine edilir ve akabinde iskele üzerine tohumlandirilir. Kombine hücre popülasyonlarini içeren iskele, akabinde kusura uygulanabilir.

Hücrelerin kombine popülasyonlarinin kusura uygulanacagi durum, kusurun ortaya çiktigi dokunun tipine ve bir iskelenin kullanilip kullanilmamasina bagli olacaktir. Hücrelerin uygulanmasinin uygun durumlari, herhangi bir ani mekanik stabilite gerektirmeyen bölgelerde uygulamaya yönelik olarak temiz (diger bir deyisle sadece hücreler), dogrudan jel içi veya doku yapistiriciyi içerir.

Hücrelerin, bir iskele üzerine tohumlandirilmasi veya doku onarim bölgesine uygulanmalarina, fibronektin veya vitronektin gibi bir agregasyon faktörü kullanilarak yardim edilebilir. Hücreler, ayrica doku hasari üzerinde dikisli periosteum altindan uygulanabilir ve fibrin yapistirici ile kapatilabilir.

Hiyalüronan, glikozaminoglikanlar veya hücre apoptozunun inhibitörleri gibi faktörler, faydali sayildiginda implantasyondan sonra hücre yasamini gelistirmek üzere eklenebilir.

Bu, istege bagli olarak, yukarida açiklandigi üzere bir yöntemin gerçeklestirilmesine yönelik bir kit saglamak üzere tasarlanir. Kit, tercihen doku onarimina yönelik mevcut prosesi gerçeklestirmek üzere gereken saglik çalisani, materyaller ve ekipmanin tainamini saglar. Böylece, bir kit, primer hücre popülasyonunun bir biyopsisinin alinmasina yönelik araçlar, multipotent hücre popülasyonun bir biyopsisinin alinmasina yönelik araçlar ve her iki popülasyonun bir kombinasyonunun, bir doku kusuruna uygulaninasina yönelik araçlar içerir.

Tercih edilen bir düzenlemede, kit ayrica yukarida açiklandigi üzere bir biyouyumlu iskele ve multipotent ve primer hücrelerin kombine popülasyonlarinin, iskele üzerine tohumlandirilinasina yönelik araçlar içerir. Ayni 02009-P-0001 zamanda, kitin, bir biyopsiden hücrelerin izole edilmesine yönelik araçlar içermesi tercih edilir.

Multipotent hücrelerin bir popülasyonunun bir biyopsisinin alinmasina yönelik cihazlar veya ekipmanin örnekleri, tercihen kemik iligi biyopsilerine yönelik bir 8 ölçü kalinliginda biyopsi ignesini içermek üzere, çekme igneleri ve Siringalarini Primer hücrelerin tipine bagli olarak, primer hücrelerin bir popülasyonunun bir biyopsisinin alinmasina yönelik cihazlar veya ekipmanin örnekleri, küçük çapli bir halka küret (tercihen en fazla 6 mm) veya bir Notchplasty oyugu içerir.

Hücrelerin izole edilmesine yönelik olarka uygun araçlar ve aletler, diger bir deyisle bir biyopsiden multipotent ve primer hücreler, inter alfa kollajenaz, hiyalüronidaz, elastaz, papain, tripsin veya dispaz gibi enzimlerdir.

Kit, tercihen ayni zamanda inultipotent ve primer hücre popülasyonlarinin kombine edilmesi ve karistirilmasina yönelik araçlar içerir. Bu amaçla, bir hücre süzgeci, hücre islemine yönelik plastik esya, bir hücre filtre sistemi ve bir veya daha fazla pipet gibi aletler mevcut olabilir.

Hücrelerin, bir kit içinde mevcut olabilen bir iskele üzerine tohumlandirilmasina yönelik uygun araçlar, sinirlandirilmis veya sinirlandirilmamis bir hazne veya perfüzyon sistemi gibi basit tohumlandirina cihazlari içerir.

Multipotent ve primer hücrelerin kombine popülasyonlarinin uygulanmasina yönelik araçlar veya bir kit içinde mevcut olabilen bir doku kusuruna, üzerinde tohumlandirilan multipotent ve primer hücrelerin kombine popülasyonlari ile iskelenin örnekleri, doku yapistirici, jeller, hücre toplama faktörleri ve bir veya daha fazla siringa içerir. 02009-P-0001 Bulus bu noktada ayrica asagidaki örneklere benzerlik ile açiklanacaktir. Örnek 1 Farkli kosullar altinda pellet kültür analizinde primer ve genisletilmis kondrositlerin karistirilmasi araciligivla farklilastirmanin indüklenmesi.

Kondrositler, kollajenaz tip II (Worthington) sindirimi araciligiyla tibiadan yetiskin sigir kikirdagindan izole edilmistir. Izole edilen hücreler, 3500 hücre/cm2 yogunlugunda tohumlandirilmistir ve 37°C/ %5 COzide, DMEM, 10 mM HEPES, 1x ikinci derece amino asitler, 0.2 mM AsAP, `100 U penisilin, 100 tig/ml streptomisin, 0.4 mM prolin ve %10 FBS içeren ortamda 3 pasajda alt- kültürlenmistir. Primer ve genisletilmis hücreler, asagidaki kosullar altinda pellet analizinde kültürlenmistir; primer hücre pelletleri içeren ortami paylasan genisletilmis hücre pelletleri (A) primer hücre pelleti araciligiyla kosullandirilmis ortamda kültürlenen genisletilmis hücre pelleti (B). Primer ve genisletilmis hücrelerin bir 50/50 karisiminin pelletleri (C). + Kontrol; primer hücre pelleti (D) -kontrol; genisletilmis hücre pelleti (E). Kültürde 2 haftadan sonra, pelletler, safraninO lekelemesine yönelik kakodilat tamponunda (0,14M / pH 72-74) %15 glutarik aldehid ile sabitlestirilmistir, immüno-lekelemeye yönelik OCT bileseninde (Tissue-Tek) yerlestirilmis ve dondurulmustur veya kantitatif GAG ve DNA analizine yönelik olarak -80°C”de dondurulmustur. Sülfatli Glikozaminoglikanlar (GAG), safraninO ile lekelenmistir ve çekirdekler ve sitoplazmaya yönelik olarak sirasiyla haemtoksilin ve fast green ile karsit lekelenmistir. Donuk kesitler, aseton ile sabitlestirilmistir ve kollajen tip II (1 : 100, lekelenmistir. Bloklama, %10 insan serumu ile tamamlanmistir ve sekonder olarak keçi anti-fare antikoru ( kullanilmistir. Lekeleme, 10 dakika DAB-solüsyonu (DAKO) ile gerçeklestirilmistir.

SafraninO ve kollajen tip II sonuçlari, C ve D grubundaki hücrelerin, A, B ve E grubu pelletlerinin, hiçbir sekilde GAG üretmedigi göz önüne alinarak pellet 02009-P-0001 boyunca kikirdak spesifik GAG ürettigini gösterir. Immünokimyasal sonuçlar, ayni zamanda sadece primer hücrelerin pelletindeki gibi karsilastirilabilir seviyelerde olmak üzere karistirilmis hücre pelletindeki (C) hücrelerin farklilastirilmasi dogrulanarak, sadece C ve D grubundan bir pelletin dis halkasindaki hücrelerin, Kollajen tip I°i ifade ettigini gösterir. A, B ve E grubundaki pelletleri lekeleyen kollajen tip [”in pelletler boyunca bulunmasi göz önüne alinarak, herhangi bir spesifik kollajen tip 11, bu gruplarin pelletinde bulanamaz. Böylece, genisletilmis kondrositlerin, degistirilmek üzere stimüle edilmedigi, dolayisiyla primer hücreler içeren paylasimli ortamda veya primer hücreler ile uygun hale getirilmis ortamda kültürlenerek, kikirdak spesifik hücre disi matris ürettigi sonucuna varilir. Bununla birlikte, primer hücreler ile hücre- hücre temasinda oldugunda, bu sonuçlar, farklilastirmanin, stimüle edildigini ve GAG'lerin, sadece primer hücrelere, karistirilmis primer ve genisletilmis hücrelerin pelletlerindeki karsilastirilabilir seviyelerde üretildigini gösterir. Bu sonuçlarla, hücre-hücre temasinin, farklilastirinayi indükledigi gösterilir. Örnek 2 Çesitli oranlarda bir primer ve genisletilmis hücre karisimindan olusan pelletlerde farklilastirma Deney, pellet analizindeki farkli primer/genisletilmis oranlarin farklilasma kapasitesini incelemek üzere tasarlaninistir.

Kondrositler, kollajenaz tip II (Worthington) sindirimi araciligiyla tibiadan yetiskin sigir kikirdagindan izole edilmistir. Izole edilen hücreler, 3500 hücre/cm2 yogunlugunda tohumlandirilmistir ve 37°C/ %5 C02”de, DMEM, 10 mM HEPES, 1x Temel olainayan amino asitler, 0.2 mM AsAP, 100U penisilin, 100 tig/ml streptomisin, 0.4 mM prolin ve %10 F BS içeren ortamda 3 pasajda alt- kültürlenmistir. Primer ve genisletilmis hücrelerin bir 50/50 karisiminin pelletleri, yukarida açiklanan ortamda kültürlenmistir. Kültürde 2 haftadan sonra, pelletler, safraninO lekeleinesine yönelik kakodilat tamponunda (0.14M / pH 7.2-7.4) %l.5 glutarik aldehid ile sabitlestirilmistir, immüno-lekelemeye yönelik OCT 02009-P-0001 bileseninde (Tissue-Tek) yerlestirilmis ve dondurulmustur veya kantitatif GAG ve DNA analizine yönelik olarak -80°C7de dondurulmustur. Sülfatli Glikozaminoglikanlar (GAG), safraninO ile pembe renkte lekelenmistir ve çekirdekler (kahverengi) ve sitoplazinaya (mavi) yönelik olarak sirasiyla haemtoksilin ve fast green ile karsit lekelenmistir. Donuk kesitler, aseton ile sabitlestirilmistir ve kollajen tip ll ( veya kollajen tip 1 (121000, Ab-l, Calbiochem) için lekelenmistir. Bloklama, %10 insan serumu ile tamamlanmistir ve sekonder olarak keçi anti-fare antikoru ( kullanilmistir. Lekeleme, 10 dakika DAB-solüsyonu (DAKO) ile gerçeklestirilmistir. Kantitatif GAG ve DNA analizine yönelik numuneler, 56°C3de >16 saat boyunca 50mg/ml proteinaz K (SIGMA) ile sindirilmistir. GAG içerigi PBE tamponunda ( lekelenen 9-dimetilmetilen mavi klorid (DMMB) ile sektrofotometre kullanilarak belirlenmistir ve DNA analizi, üretici açiklamasina göre CyQuant DNA analizi ile tamamlanmistir.

Sekil 2”ye referans olarak, primer/genisletilmis hücreler, gösterilen oranlarda karistirilmistir ve 2 hafta boyunca pellet analizinde (500.000 hücreler/pellet) kültürlenmistir. Kalitatif GAG ve kollajen tip II sonuçlari, sadece 0/100 primer/genisletilmis hücreli pelletlerde GAG veya kollajen tip II bulunamazken sadece 100/0 primer/genisletilmis hücreli kollajen tip I içeren pelletlerde bulundugunu gösterir. Bu sonuçlarla, azalan miktarlarda primer hücreler ile pellet boyunca farklilasma seviyesi korunur (A). Ayrica, kantitatif GAG/DNA sonuçlari (B), primer hücrelerin miktari %10,a düstügünde, farklilasmanin hala sadece pellet kültür analizinde primer hücrelerdeki ile karsilastirilabilir seviyede oldugunu gösterir. Ayrica, primer hücrelerin sayisi %2sye kadar düstügünde, GAG/DNA miktari, sadece ayni miktarda primer hücreden beklenenden yaklasik olarak x25 daha yüksektir. Sasirtici bir sekilde, hücre sayisi sonuçlari, sadece pellet içindeki primer hücrelerin miktari, %25 üzerine yükseldiginde proliferasyonun ortaya çiktigini gösterir. 02009-P-0001 Bu sonuçlarla, bir hücre karisiminda, primer/genisletilmis kondrositlerin farklilasmasinin, primer hücre miktari, toplam hücre popülasyonunun %2”sine düstügünde dahi stimüle edildigi gösterilir. Kantitatif GAG/DNA sonuçlari, aslinda %2 primer hücreler içeren peletlerde GAG miktarinin yaklasik olarak x25 daha yüksek oldugunu, daha sonra tek basina ayni miktarda primer hücreden beklenebildigini gösterir. Bu verilerle, farklilasmanin, kültürlenmis kondrositler gibi büyük ölçüde farklilasan hücrelerin varliginda az miktarda primer hücre tarafindan kuvvetlendirildigi gösterilir.

Ornek 3. Pellet analizinde sirasiyla I“ibroblast/primer kondrosit ve kemik iligi hücreleri/primer kondrositlerin farklilasmasi Deney, pellet analizindeki primer kondrositler ile karistirilan farkli multipotent hücre tiplerinin farklilasma kapasitesini incelemek üzere tasarlanmistir.

Fibroblast, 3T3 fibroblast hücre hattindan elde edilmistir ve DMEM uLg/ml streptomisin ve %5 PES ve kemik iligi hücreleri, insan keiriik iligi biyopsisinden izole edeilmistir ve %10 PES, lOOU/ml penisilin, 100 tig/m1 streptomisin velû mM AsAP ve 1 ng/ml bFGF içeren &MEM (Gibco #22571- 020) içinde kültürlenmistir Kondrositler, dizden insan eklem kikirdaginin bir biyopsisinden izole edilmistir. Pelletler karistirildiktan sonra, DMEM (Gibco U penisilin, 100 tig/ml streptomisin, 0.4 mM prolin ve %10 FBS içeren ortamda 37°C/%5 COfde kültürlenmistir. Sekil 3,e referans olarak, %50 primer hücre ve pelletler olusturmak üzere santrifüjlenmistir ve 3 hafta boyunca kültürlenmistir.

Pelletlerin kesitleri, safraninO (pembe) ile Sülfatli Glikozaminoglikanlara (GAGiler) yönelik olarak lekelenmistir. Sonuçlar, kondrositler veya 3T3- fibroblast veya kemik iligi hücreleri ile karistirildiginda, ancak sadece fibroblast veya kemik iligi hücrelerinin pelletleriyle karistirilmadiginda pelletler boyunca GAGSIerin üretimini gösterir. Primer kondrositler ile karistirildiginda fibroblast 02009-P-0001 veya kemik iligi hücreleri (multipotent hücreler) ile bir kikirdak soyuna farklilasmanin stimülasyonu gösterilir. Örnekler 4 & 5. PEGT/PBT 300/55/45 iskeleler üzerinde primer/genisletilmis hücre karisiminin in Vivo farklilastirilmasi.

Deney, farkli primer/genisletilmis hücre karisimlarinin, hücrelerin toplanmasinda (fibronektin) yer alan bir faktörün varliginda veya in Vivo olarak bir gözenekli iskele üzerinde farklilasma kapasitesini incelemek üzere tasarlanmistir.

Kondrositler, kollajenaz tip II (Worthington) sindirimi araciligiyla dizden insan eklem kikirdaginin bir biyopsisinden izole edilmistir. Izole edilen hücreler, 3500 hücre/cm2 yogunlugunda tohumlandirilmistir ve 37°C/ %5 COfde, DMEM, 10 mM HEPES, 1x ikinci derece amino asitler, 0.2 mM AsAP, 100 U penisilin, 100 ug/ml streptomisin, 0.4 mM prolin ve %10 PES içeren ortamda 3 pasajda alt- kültürlenmistir. Primer hücreler, olgun sigir kikirdagindan izole edilmistir ve asagidaki oranlarda genisletilmis hücreler ile kombine edilmistir: 0/100, 100/0 ve boyunca 300 ug/ml fibronektin ile inkübe edilmistir ve kültür ortaminda 37°C/%5 C02”de bir gaz degistirme filtresi ile eppendorf tüplerinde 24 saat boyunca gözenekli iskeleler üzerine dinamik olarak tohumlandirilmistir. Gözenekli iskeleler, 55/45 PEGT/PBT agirlik oranina ve PEG için 300 moleküler agirliga sahip olan poli (etilen glikol) tereftalat (PEGT) ve poli (bütilen tereftalat) (PBTYden parçalanmis kopolimerlerinden olusturulmustur. Yukarida açiklanan kültür ortami içinde 7 gün statik kültürlemeden sonra, çiplak farelere tohumlanmis iskeleler subkütanöz olarak implante edilmistir. Her bir deney grubu için, 8 ve kontroller için 6 iskele iinplante edilmistir. 4 hafta sonra iskeleler, eksplante edilmistir ve her bir iskelenin tamami veya 1/2”sinin agirlik orani, kantitatif glikozamino glikan (GAG) ve DNA analizine yönelik olarak belirlenmistir.

Iskelenin yarisi, 56°C*de >16 saat boyunca 50 mg/ml proteinaz K (SIGMA) ile sindirilmistir. GAG içerigi PBE tamponunda (14.2 g/l Na2HPO4 and 3.72 g/l 02009-P-0001 NaZEDTA, pH ile spektrofotometrede (540nm) belirlenmistir ve DNA analizi, üretici açiklamasina göre CyQuant DNA analizi ile tamamlanmistir.

Sekil 4”e referans olarak, 50/50 primer/ genisletilmis orana sahip hücre karisimlari, gözenekli (MW PEG)/(agirlikça PEGT/PBT) 300/55/45 iskeleler üzerine tohumlandirilmistir. Muamele edilmemis hücre karisimi, muamele edilmemis iskele üzerine tohumlandirilinistir (kontrol), Muamele edilmemis hücre karisimi, fibronektin (300 ug/ml) kapli iskele (FN kapli iskele) üzerine tohumlandirilmistir veya fibronektin ile muamele edilmis hücre karisimi (300 tig/ml), tedavi edilmemis iskeleler (FN toplanan hücreler) üzerine tohumlandirilmistir. Iskeleler, çiplak farelerde subkütanöz olarak implante edilmistir ve 4 hafta sonra numuneler eksplante edilmistir ve GAG/iskele ölçülmüstür. Sonuçlar, fibronektin varliginda hücrelerin toplanmasinin, 50/50 primer/genisletilmis hücre karisiininin GAG/DNA üretimini artirdigini gösterir.

Sekil 5,e referans olarak, farkli primer/genisletilmis oranlara sahip hücre karisimlari, 300 tig/ml fibronektin varliginda toplanmistir ve risirnlari, gözenekli (MW PEG)/(agirlikça PEGT/PBT) 300/55/45 iskeleler üzerine tohumlandirilmistir. Iskeleler, çiplak farelerde subkütanöz olarak implante edilmistir ve 4 hafta sonra numuneler eksplante edilmistir ve GAG/iskele ölçülmüstür. Sonuçlar, %20 primer hücre varliginda, GAG/iskele içeriginin, %100 primer hücreler içeren iskeleye esit oldugunu gösterir. Ayrica, %50 primer hücre, Sekil 5,te, gösterilen ug GAG/iskele, bir sabit deger çikarilarak 0/ 100 hücre oranina normallestirilir. Primer hücreler ile uygun duruma getirilen ortam, multipotent hücrelerdeki kondrojenezlerin indüklenmesinde etkisiz gösterilmistir.

Fibronektinin, genel olarak kondrojenezi inhibe ettigi bilinir. Bunun tersine ve 02009-P-0001 sasirtici bir sekilde, söz konusu indüksiyon sisteminde fibronektin ile kikirdak olusumunun (Sekil 4) gelisinis oldugu bulunmustur. Özellikle bir interoperatif ve otolog prosedüre yönelik olarak, kusurlu bölgedeki hücreleri tutmak üzere, tercihe bagli olarak, spesifik önlemler alinir veya gereklidir, diger bir deyisle, hücrelerin önemli bir zaman periyodu gerektiren bir substrat üzerine dayanmadan hücrelere immobilize edilmesi için jeller veya diger araçlar kullanilir.

Hücreleri, ameliyat sonrasi ekleme binen yükten korumak üzere, tercihe bagli olarak, hücreler, biraz veya tam mekanik destek saglayan, bir iskele veya jel veya diger araçlar ile çevrelenecektir. Kikirdak onarimina yönelik olarak tercihen kullanilan iskele mekanik olarak islevseldir, diger bir deyisle kikirdagin mekanik özelliklerine benzerlikler gösterir.

Bu sonuçlardan, gözenekli iskelelerde 20/80 in vivo primer/genisletilmis hücre karisimlarinin farklilasma kapasitesinin, tek basina primer hücrelere esit oldugu açiktir.

Bu örneklerde, hücreler, hücrelerin toplanmasi araciligiyla desteklenebilen farklilasmayi göstermek üzere fibronektin ile tedavi edilmistir. Hücreleri toplamak üzere, Vitronektin, laminin, hiyalüronan gibi diger doku spesifik faktörler kullanilabilir. Bu çalisma için seçilen iskele, implantasyondan hemen sonra, bu durumda kikirdaktaki spesifik bir dokunun mekanik Özelliklerini desteklemek üzere uygun bir iskele örnegidir. Bu örnekte, seçilen iskele, ayrica bir hücre karisimini kusura uygulamak üzere bir araç olarak kullanilir.

Claims (1)

1. ISTEMLER . Multipotent hücre popülasyonunun, in vitro istenen hücrelerin primer hücre popülasyonuna maruz kalinasi ile multipotent hücrelerin, istenen bir hücre tipine farklilastirilmasinin indüklenmesine yönelik bir yöntemdir, burada primer hücre popülasyonundaki hücrelerin sayisinin, multipotent hücre popülasyondaki hücrelerin sayisina orani 12200 ila 2:3,tür. . Doku onarimina yönelik bir ilacin üretimine yönelik olarak multipotent hücre popülasyonu ve primer hücre popülasyonunun bir kombinasyonunun kullanimidir, burada primer hücre popülasyonundaki hücrelerin sayisinin, multipotent hücre popülasyondaki hücrelerin sayisina orani 1:200 ila 2:3”tür, . Multipotent hücre popülasyonu ve primer hücre popülasyonunu içeren bir bilesimdir, burada primer hücre popülasyonundaki hücrelerin sayisinin, multipotent hücre popülasyondaki hücrelerin sayisina orani 1:200 ila 2:3”tür. . Istem 1”e göre yöntem, istem 2,ye göre kullanim veya istem 3”e göre bilesimdir, burada primer hücreler, onarima ihtiyaci olan dokuda dogal yollardan ortaya çikan bir hücre tipindedir. . Istem 1”e göre yöntem, istem 23ye göre kullanim veya istem 3 veya 4,e göre bilesimdir, burada primer hücreler, sinir hücreleri, osteoblastlar, osteoklastlar, hepatositler, kardiyomiyositler, miyositler, Schwann hücreleri, ürotelyal hücreler, jejunum duodenumdan hücreler, çapraz baglar veya tendondan hücreler veya kil folikülünden hücrelerdir. . Istem l°e göre yöntein, istein 2sye göre kullanim veya istem ?Ve göre bilesim veya istem 4 veya 5'e göre bilesimin yöntemi, kullanimidir, burada multipotent hücre popülasyonu ve/veya primer hücre popülasyonu, bir biyopsiden izole edilmistir. Istem lle göre yöntem, istem 2”ye göre kullanim, istem 3°e göre bilesiin veya istem 4, 5 veya 6lya göre yöntem, kullanim veya bilesimdir, burada multipotent hücreler ve primer hücreler, insan hücreleridir. Istem l'e göre yöntem, istem 2,ye göre kullanim, istem 3,e göre bilesim veya istem 4 ila 7”e göre yöntem, kullanim veya bilesimdir, burada multipotent hücreler, kök hücreler, progenitör hücreler, mezenkimal kök hücreler, kemik iligi hücreleri, fibroblastlar veya satelit hücrelerdir. Istem 8'e göre yöntem, kullanim veya bilesimdir, burada multipotent hücreler, kemik iligi hücreleridir. Istem 1”e göre yöntem, istem 23ye göre kullanim, istem 3”e göre bilesim veya istemler 4 ila 9°dan herhangi birine göre yöntem, kullanim veya bilesimdir, burada primer hücre popülasyonundaki hücrelerin sayisinin, multipotent hücre popülasyonundaki hücrelerin sayisina orani, 11100 ila 1:3'tür. Istem 10,31 göre yöntem, kullanim veya bilesimdir, burada primer hücre popülasyonundaki hücrelerin sayisinin, multipotent hücre popülasyondaki hücrelerin sayisina orani 1:50 ila 1:5,tir. Istem l,e göre yöntem, istem 27ye göre kullanim, istem ?Ve göre bilesim veya istemler 4 ila 11,den herhangi birine göre yöntem, kullanim veya bilesimdir, burada multipotent hücre popülasyonu ve primer hücre popülasyonu, in vitro kültürlenmeden kombine edilir. Istem l”e göre yöntem, istem 23ye göre kullanim, istem ?Ve göre bilesim veya istemler 4 ila 12,ye göre yöntem, kullanim veya bilesimdir, burada kombine multipotent ve primer hücre popülasyonlari, in vitro birlikte kültürlenmemistir. Istem lle göre yöntem, istem 2”ye göre kullanim, istem 3”e göre bilesim veya istemler 4 ila `l3`ten herhangi birine göre yöntem, kullanim veya bilesimdir, burada multipotent hücre popülasyonu ve primer hücre popülasyonu, bir biyouyumlu iskele üzerinde saglanir. .Istem 14,e göre yöntem, kullanim veya bilesimdir, burada biyouyumlu iskele, metaller, metal alasimlar, seramikler, (biy0)camlar, dogal ve sentetik polimerik materyaller ve bunlarin kombinasyonlarinin grubundan seçilen bir materyalden üretilir. Istem 15,e göre yöntem, kullanim veya bilesimdir, burada biyouyumlu iskele, bir polietilen glikol ve bir polibütilen tereftalatin bir kopolimerinden üretilir. Istem 167ya göre yöntem, kullanim veya bilesimdir, burada biyouyumlu iskele, bir kalsiyum fosfat kaplama ile kismen veya tamamen kaplidir. Istemler 14 ila 179den herhangi birine göre yöntem, kullanim veya bilesimdir, burada multipotent hücre popülasyonu ve primer hücre popülasyonu, in vitro kültürlenmeden biyouyumlu iskele üzerinde saglanir.