TR201722817T1 - (r)- ve (s)-1-(3-(3-n,n-di̇meti̇lami̇nkarboni̇l)fenoksi̇l-4-ni̇trofeni̇l)-1-eti̇l-n,n?-bi̇s(eti̇len)fosforami̇tad, bi̇leşi̇mleri̇ ve bunlarin kullanimina i̇li̇şki̇n yöntemler ve bunlarin hazirlanmasi - Google Patents

Abstract

Formülün optik açıdan aktif formülleri temin edilmiştir: ve bunların farmasötik kompozisyonları. Ayrıca, bu bileşiklerin hazırlanması ve rasemik karışımın çözünmesi veya (R) - ve (S) -1- (3- (3-N, N-dimetilaminokarbonil) fenoksil-4-nitrofenil) -1-etil-N, N'-bis (etilen) fosforamidat verecek şekilde bunların enantiyomerlerden biriyle zenginleştirilmesine ilişkin ve bu tür bileşiklerin uygulanmasını içeren kanser tedavisine ilişkin yöntemleri sağlanmaktadır.

Description

TARIFNAME (R)- VE (S)-1-(3-(3-N,N-DIMETILAMINKARBONIL)FENOKSIL-4-NITROFENIL)-1-ETIL-N,N'- BIS(ETILEN)FOSFORAMITAD, BILESIMLERI VE BUNLARIN KULLANIMINA ILISKIN YÖNTEMLER VE BUNLARIN HAZIRLANMASI BU LUSUN ALANI Bu bulus, terapötik maddeler olarak mevcut olan 1-(3-(3-N,N-dimetiIaminokarbonil)fenoksiI-4- nitrofenil)-1-etil-N,N'-bis(ethilen)fosforamidat bilesiginin optik olarak aktif formlarini, bu gibi bilesiklerin farmasötik bilesimleri ve kanseri tedavi etme yöntemleri bunun yani sira (R,S)-1-(3-(3-N,N- dimetilaminokarbonil)fenoksi-4-nitrofenil)-1-etil-N,N'-bis(etilen)fosforamidat bilesiginin rasemik karisiminin enantiomerlerinden birinin çözünürlügü veya zenginlestirilmesine yönelik bir islem veya optik olarak saf (R) ve (S)-1-(3-(3-N,N-dimetilaminokarbonil)fenoksil-4-nitrofenil)-1-etiI-N,N'- bis(etilen)fosforamidation stero seçici sentezini temin etmektedir.

BULUSUN ARKA PLANI Kanser, insan morbidite ve mortalitesinin baslica nedenlerinden biridir. Kanser tedavisi zordur çünkü normal hücrelere zarar vermeden veya öldürmeden kanser hücrelerini öldürmek zordur. Kanser tedavisi sirasinda normal hücrelerin zarar görmesi veya öldürülmesi, hastalarda istenmeyen yan etkilerin bir sonucudur ve kanserli bir hastaya uygulanan anti-kanser ilaci miktarini sinirlayabilir.

Aldo-keto redüktaz aile 1 üyesi C3 (AKR1C3), insanlarda AKR1C3 geni tarafindan kodlanan bir enzimdir. Bu gen, 40'tan fazla bilinen enzim ve proteinden olusan aldo /keto redüktaz süper ailesinin üyesini kodlar. Bu enzimler, kofaktörler olarak NADH ve / veya NADPH 'yi kullanarak aldehitlerin ve ketonlarin karsilik gelen alkollere dönüsümünü katalizler.

Birçok kanser hücresi, normal hücrelere kiyasla AKR1C3 redüktazi asiri eksprese eder (Bakiniz ozNJîgym/weo3 PR 104 PR 104, AKR1C3 için zayif bir substrat olarak gösterilmistir ve klinik arastirmalarda test edilmistir. Bu bilesik, ayrica, hipoksik kosullar altinda aktive edilebildigi için, seçici bir AKR1C3 ile aktive edilmis ön ilaç degildir. PR l04, klinik arastirmalarda etkisizdi.

Buna göre, kanser hastalarini tedavi etmek için uygun seçici AKR1C3 redüktaz aktive ön ilaçlar dâhil olmak üzere, kanser hastalarinin tedavisine uygun bilesiklere ihtiyaç duyulmaktadir. Mevcut bulus, bu ihtiyaci karsilamaktadir.

BU LUSUN ÖZETI Bir özellige göre, formül la ve Ib 'ye ait bilesikler: NÄÜO I “NV veya izotopik varyant, solvat veya bunun hidrati temin edilmektedir.

Burada verilen bilesikler, enantiyomerlerin zenginlestirilmis karisimlarinin yani sira ayri ayri enantiyomerleri de içerir.

Baska bir yönüyle burada saglanan bir bilesigi ve en az bir farmasötik olarak kabul edilebilir eksipiyani içeren farmasötik bir kompozisyon saglanmaktadir. Bir baska yaninda, burada saglanan farmasötik bilesimin bir birim dozu saglanmaktadir.

Baska bir yönüyle, burada belirtildigi gibi, bilesimin veya farmasötik olarak kabul edilebilir bir bilesigin etkili bir miktarinin hastaya uygulanmasini içeren, hastada kanserin tedavi edilmesine yönelik bir yöntem saglanmaktadir. Bir uygulamada, böyle bir kanserde AKR1C3 redüktaz seviyelerinin yüksek veya daha yüksek oldugu bir kanserdir. Bir uygulamada, kanser karaciger kanseri ve daha spesifik olarak hepatoselüler karsinom (HCC) 'dur. Bir uygulamada, kanser, küçük hücreli disi akciger kanseri veya melanomdur. Bir uygulamada, kanser prostat kanseridir. Bir uygulamada, kanser gögüs kanseridir. Bir uygulamada, kanser, lösemidir. Bir uygulamada kanser, özofagiyal kanserdir. Bir uygulamada, kanser renal, gastrik, kolon, beyin, mesane, servikal, yumurtalik, bas ve boyun, endometriyal, pankreatik, sarkom veya rektal kanserdir. Bir baska yönüyle, sayet bahsedilen seviye, önceden belirlenmis bir degere esit veya daha büyükse, yöntem, AKR1C3 antikoru kullanilan yöntemlerle kanserin AKR1C3 redüktaz seviyesinin saptanmasini ve burada saglanan bir bilesigin veya farmasötik olarak kabul edilebilir bir bilesigin terapötik olarak etkili bir miktarinin anilan hastaya uygulanmasini içerir. Bir yönden yöntem, uygulama öncesi, hastadan izole edilen bir örnekte tümör içi AKR1C3 redüktaz seviyesinin belirlenmesini ve seviye, önceden belirlenmis bir seviyeye esit veya daha büyükse tedavi için hastanin seçilmesini içerir. Bazi uygulamalarda, burada saglanan bir bilesigin veya farmasötik olarak kabul edilebilir bir bilesimin uygulanmasini içeren bir tedaviden baska kanser tedavisinin terapötik olarak etkili bir miktari, sayet seviye, önceden belirlenen degeri geçmez veya önceden belirlenen seviyeden daha az ise, uygulanir. Tedavi edici etkili miktari, burada saglanan bilesiklerin ve bilesimlerin verilmesinin uygun modunu belirleme yöntemleri, bu tarifname ve bilinen diger yöntemlere dayanilarak teknikte tecrübeli bir kisi tarafindan kolayca anlasilacaktir. AKR1C3 seviyeleri, tecrübeli bir kisinin iyi bildigi rutin yöntemlerle ölçülür. ÇIZIMLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1A, siral kolon üzerinde siral yüksek basinçli sivi kromatografisiyle birlikte 1- (3- (3-N, N-dimetilaminokarbonil) fenoksiI-4-nitrofeniI-1-etil-N. N'-bis (etilen) fosforamidatin iki enantiyomerin çözünürlügü için LC kromatogramini tasvir etmektedir.

Sekil 18, siral kolon üzerinde siral yüksek basinçli sivi kromatografisiyle birlikte S-1- (3- (3-N, N-dimetilaminokarbonil) fenoksiI-4-nitrofeniI-1-etil-N. N'-bis (etilen) fosforamidatin S-enantiyomerin safligi için LC kromatogramini tasvir etmektedir.

Sekil 1C, siral kolon üzerinde siral yüksek basinçli sivi kromatografisiyle birlikte R-1- (3- (3-N, N-dimetilaminokarbonil) fenoksiI-4-nitrofeniI-1-etil-N. N'-bis (etilen) fosforamidatin R-enantiyomerin safligi için LC kromatogramini tasvir etmektedir.

Sekil 2, progesteron ile karsilastirildiginda aldoketo redüktaz, AKR1C3 tarafindan TH 2870'in aktivasyonunu göstermektedir.

Sekil 3, karaciger kanseri hücresi çizgilerinde AKR1C3 ekspresyonunu göstermektedir.

Sekil 4, prostat kanseri hücre çizgilerinde AKR1C3 ekspresyonunu göstermektedir.

SEKIL 5, her gruptaki ortalama vücut agirligini göstermektedir.

SEKIL 6, her gruptaki tümör yükünün tipik flüoresan görüntülerini göstermektedir.

SEKIL 7, her gruptaki tümör büyüme egrilerini göstermektedir.

SEKIL 8, her gruptaki tümör yükünün flüoresans görüntülerini göstermektedir.

SEKIL 9 farkli gruplardaki ortalama tümör agirligini göstermektedir.

SEKIL 10, farkli gruplardaki vücut agirligi degisimlerini göstermektedir.

SEKIL 11, periferik kandaki tümör yükü büyüme egrisini göstermektedir.

SEKIL 12, farkli gruplardaki sonlandirma noktasindaki kari, dalak ve kemik iligindeki insan CD45 antikorunun pozitif yüzdesini göstermektedir.

AYRINTILI TARIFNAME Tanimlar Asagidaki tanimlar, okuyucuya destek saglamak için temin edilmistir. Aksi belirtilmedigi sürece, tüm teknik terimlerin, formüllerin ve burada kullanilan diger bilimsel veya tibbi terimlerin veya terminolojinin kimyasal ve tibbi alanda uzman kisiler tarafindan yaygin olarak anlasilan anlamlara sahip olmasi amaçlanmistir. Bazi durumlarda, yaygin anlasilan anlamlara sahip terimler, açiklik ve /veya hazir referans olmasi için burada tanimlanmistir ve buradaki bu tür tanimlarin dâhil edilmesi, teknikte genel olarak anlasilan terimin tanimi üzerinde önemli bir fark olusturdugu seklinde yorumlanmamalidir.

Her birinin araliklari dahil olmak üzere, pH, sicaklik, zaman, konsantrasyon ve agirlik gibi tüm sayisal tanimlamalar, tipik olarak 0.1, 1.0 veya 10.0'luk artislarla tipik olarak (+) veya (-) degistirilebilen yaklasimlardir. Tüm sayisal tanimlamalar, "yaklasik" teriminin basinda oldugu gibi anlasilabilir. Burada tarif edilen reaktifler örnek teskil eder ve bu tür esdegerleri teknikte bilinebilir.

Baglam aksini açikça belirtmedikçe, “ismin yalin hali” ve “i hali “ çogul referanslari içerir. Bu nedenle, örnegin, bir bilesige referansta bulunmak, bir veya birden fazla bilesige veya en az bir bilesige atifta bulunmaktadir. Bu nedenle, ”ismin yalin hali” , (”bir veya daha fazlasi”) terimleri ve " en az biri” terimleri, birbirlerinin yerine kullanilabilir. bagli olarak, teknikte siradan deneyime sahip bir kisi tarafindan belirlendigi üzere, belirli bir deger için kabul edilebilir bir hata anlamina gelir. Bazi uygulamalarda, "yaklasik" veya "yaklasik olarak" terimi, 1, 2, 3 veya 4 standart sapma anlamina gelir. Bazi uygulamalarda, "yaklasik" veya "yaklasik olarak" terimi, veya % 0.05 anlamina gelir.

Burada kullanildigi haliyle "kapsayan" terimi, bilesimlerin ve yöntemlerin, belirtilen unsurlari içerdigini, ancak digerlerini hariç tutmadigini kastetmek için düsünülmüstür. Bilesimleri ve yöntemleri tanimlamak için kullanildigi zaman " Esasiyla olusur" terimi, bilesim veya yönteme iliskin önemli unsurlarin diger unsurlarini hariç tutmayi ifade eder. ”Içeren" terimi, iddia edilen bilesimlerin ve önemli yöntem asamalarina iliskin diger muhteviyatlarin eser miktarlarinin daha fazlasinin hariç tutulmasi anlamina gelecektir. Bu geçis terimlerinin her biri tarafindan tanimlanan uygulamalar, bu bulusun kapsami dâhilindedir. Buna uygun olarak, sadece belirtilen yöntem basamaklarini veya bilesimlerini kastederek (bunlardan olusur), önemsiz olmayan asamalar ve bilesimler (esasen içeren) veya alternatif olarak dâhil olmak üzere, ilave asamalari ve bilesimleri (içermektedir) veya alternatif olarak yöntemleri ve bilesimleri dâhil etmeyi amaçlamaktadir. yer degistirebilen bir parçaciga atifta bulunmaktadir. Ayrilan gruplar, dâhil olmak üzere ancak bunlarla sinirli olmamak üzere, R20 lnin istege bagli olarak ikame edilmis alkil, aril, sikloalkil, heterosiklil veya heteroaril oldugu durumda, halo ve -OSOZ-R20 içerir.

Bir ilacin bir hastaya “Uygulanmasi” veya ”tatbik edilmesi” (ve bu cümlenin gramer esdegerleri) tibbi bir mesleki uzman tarafindan bir hastaya uygulanabilecek dogrudan uygulamaya atifta bulunmaktadir veya hastanin kendi kendine uygulamasiyla veya ilacin reçete edilmesiyle dolayli uygulanabilir. Örnegin ilaci hastanin kendisine uygulamasini isteyen ve/veya hastaya ilaç reçetesi veren doktor, hastaya ilaci uygulayabilir. olarak sinirsiz büyümeye iliskin kati tümörler dahil olmak üzere, lösemi, lenfomalar, karsinomlar ve diger malign tümörlerine atifta bulunmaktadir. Kanser örnekleri, dâhil olmak üzere ancak bunlarla sinirli olmamak üzere, adrenal bez, kemik, beyin, gögüs, brons, kolon ve /veya rektum, safra kesesi, bas ve boyun, böbrekler, larinks, karaciger, akciger, sinir dokusu, pankreas, prostat, paratiroid, deri, mide ve tiroid kanserlerini içermektedir. Bazi diger kanser örnekleri, akut ve kronik lenfositik ve granülositik tümörler, adenokarsinoma, adenom, bazal hücre karsinomasi, servikal displazi ve in situ karsinoma, Ewing sarkomasi, epidermoid karsinomalar, dev hücreli tümör, glioblastoma multiforma, killi hücreli tümör, bagirsak ganglionöromasi, hiperplastik korneal sinir tümörü, adacik hücre karsinomasi, Kaposi sarkomu, leyomiyoma, lösemiler, limfomalar, malign karsinoid, malign melanomlar, habis hiperkalsemi, marfanoid habitus tümörü, medüller karsinom, metastatik deri kanseri, mukozal nöroma, miyeloma, mikozis fungoides, nöroblastom, osteo sarkom, osteojenik ve diger sarkomlari, yumurtalik tümörü, feokromasitom, polisitemi vera, birincil beyin tümörü, küçük hücreli akciger tümörü, hem ülserlesmis hem de papiler tipteki skuamöz hücreli karsinom, hiperplazi, seminoma, yumusak doku sarkomu, retinoblastoma, rabdomyosarkom, böbrek hücresi tümörü, topikal cilt Iezyonu, vetikulum hücre sarkomu ve Wilm tümörünü içermektedir. getirilmesine atifta bulunmaktadir, böylelikle temas sonucu fizyolojik ve/veya kimyasal etki meydana gelir. Temas, in vitro, ex vivo veya in vivo gerçeklesebilir. Bir uygulamada, terapötik maddenin hücre üzerindeki etkisini belirlemek için bir terapötik madde hücre kültüründe (in vitro) hücre ile temas ettirilir. Baska bir uygulamada, terapötik maddenin hücre veya doku ile temas ettirilmesi, temas edilecek hücre veya dokuya sahip olan bir kisiye terapötik maddenin uygulanmasini içerir. yaklasik %20 'den az olmayan, yaklasik %30 'dan az olmayan, yaklasik %40 'dan az olmayan, yaklasik olmayan, yaklasik % 93 'den az olmayan, yaklasik % 94 'den az olmayan, yaklasik % 95 'dan az olmayan, yaklasik % 96 'dan az olmayan, yaklasik % 97 'den az olmayan, yaklasik % 98 'den az olmayan, yaklasik uygulamalarda, optik olarak enantiyomerik fazlalik veya enantiomerik açidan aktif bilesik, yaklasik yaklasik % 90 'dan az olmayan, yaklasik % 95 'den az olmayan, yaklasik % 98 'den az olmayan veya yaklasik % 99 'dan az olmayandir.

Optik olarak aktif bir bilesigin tanimlanmasinda, R ve S önekleri, molekülün kiral merkez (ler) i üzerindeki mutlak yapilandirmasini belirtmek için kullanilir. (+) ve H, bilesigin optik rotasyonunu, diger bir deyisle, polarize isigin düzleminin optik olarak aktif bilesik tarafindan döndürülen yönünü belirtmek için kullanilir. (-) öneki, bilesigin sola döndürüldügünü, diger bir deyisle bilesik polarize isik düzlemini sola veya saat yönünün tersine döndügüne isaret eder. (+) öneki, bilesigin saga dönük oldugunu gösterir, diger bir deyisle, bilesik polarize isigin düzlemini saga veya saat yönünde döndürür. Bununla birlikte, optik rotasyon isareti (+) ve H, R ve S molekülünün mutlak konfigürasyonu ile ilgili degildir. yaklasik % 90 'dan az olmayan, yaklasik % 91'dan az olmayan, yaklasik % 92 'den az olmayan, yaklasik az olmayan, yaklasik %97 'dan az olmayan, yaklasik % 98 'dan az olmayan, yaklasik % 99 'dan az olmayan, yaklasik % 99.5 'den az olmayan, yaklasik % 99.8 'den az olmayan, veya yaklasik % 99.9 'dan az olmayan enantiyomerik fazlaligi olan molekül toplanmasina karsilik gelir. Bazi uygulamalarda, optik veya enantiyomerik olarak saf bir bilesik için enantiomerik fazlalik, yaklasik %90'dan az degildir, yaklasik %95'den az degildir, yaklasik %98'den az degildir veya yaklasik %99'dan az degildir. Optik olarak aktif duragan faz, izotopik seyreltme, elektroforez, kalorimetre, polarimetri, kiral türetme ile NMR çözünürlük yöntemleri ve kiral solvat maddesi veya siral kayma reaktifi ile NMR yöntemleri kullanilarak, krospitik kromatografi (gaz kromatografisi, yüksek performansli sivi kromatografisi ve ince tabaka kromatografisi) dâhil olmak üzere ancak bunlarla sinirli olmamak üzere, teknikte siradan vasiflara sahip bir kisi tarafindan kullanilan herhangi bir standart yöntemle, bilesigin enantiomerik fazlaligi tespit edilebilir. elektroforezi, yüksek performansli sivi kromatografisi (HPLC), gaz kromatografisi (GC), nükleer manyetik rezonans (NMR) ve kütle spektrometresi (MS) de dahil olmak ancak bunlarla sinirli olmayan; sanayide siradan vasiflara sahip bir kisi tarafindan kullanilan standart analitik yöntemlerle saptanan, kolayca saptanabilir yabanci maddelerden arinmis görünmek için yeterince homojen oldugu veya yeterince saf olup, daha fazla saflastirmanin, maddenin enzimatik ve biyolojik aktiviteleri gibi fiziksel, kimyasal, biyolojik ve /veya farmakolojik özelliklerini belirgin bir sekilde degistirmedigi anlamina gelir.

Bazi uygulamalarda, "esas itibariyla saf" veya "esasen homojen", moleküllerin biriktirilmesine atifta bulunmakta olup, burada moleküllerin agirligi en az yaklasik % 50, en az yaklasik % 70, en az yaklasik % izotopun dogal olmayan bir oranini içeren bilesigi belirtir. Bazi uygulamalarda, bilesigin "izotopik varyanti", hidrojen (1H), döteryum (ZH), trityum (3H), karbon-11 (HC) karbon-12 (HC), karbon-13 (BC), sinirli olmamak üzere, bir veya daha fazla izotopun dogal olmayan oranini içerir. Bazi uygulamalarda, bir bilesigin "izotopik varyanti" stabil bir formda yani radyoaktif degildir. Belirli uygulamalarda, bir bilesigin "izotopik varyanti", hidrojen (1H), döteryum (ZH), karbon-12(12C), karbon-13 (BC), nitrojen-14 veya daha fazla izotopun dogal olmayan oranlarini içerir. Bazi uygulamalarda bir bilesigin "izotopik varyanti" dengesiz bir biçimde, yani radyoaktiftir. Bazi uygulamalarda, bilesigin ”izotopik varyanti", iodin-129 (mi) ve iodin-131 (ml) dahil olmak üzere ancak bunlarla sinirli olmamak üzere, bir veya daha fazla izotopun dogal olmayan oranlarini içerir. Burada temin edilen bir bilesikte, bir kisinin yargisina bagli olarak, herhangi bir hidrojenin, örnegin 2H olabilecegi veya herhangi bir karbonun, örnegin 13C olabilecegi veya herhangi bir nitrojenin, örnegin 15N olabilecegi ve herhangi bir oksijenin, örnegin 180, olabilecegi, anlasilacaktir. Bazi uygulamalarda bir bilesigin "izotopik varyanti", dogal olmayan döteryum miktarlarini ihtiva eder. ”izotopik bir varyant veya bunun farmasötik açidan kabul edilebilir tuzu, solvati, hidrati veya ön ilaci" burada adi geçen bilesigin izotopik varyanti veya burada referans olarak verilen bilesigin farmasötik açidan kabul edilebilir bir tuzu, solvati veya ön ilaci veya burada adi geçen bilesik bir izotopik varyant" anlamindadir. kullanilir. Genel olarak, hasta bir insandir. Genellikle, hasta kanser teshisi konan bir insandir. Bazi uygulamalarda, “hasta” veya “denek” insan olmayan bir primat, bir köpek, kedi, tavsan, domuz, fare veya siçan gibi ilaçlarin ve tedavilerin taranmasi, karakterizasyonu ve degerlendirilmesinde kullanilan insan olmayan bir memeliye atifta bulunmaktadir.

”Farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici”, "farmasötik olarak kabul edilebilir eksipiyan", veya kati dolgu maddesi, seyreltici madde, solvent veya kapsül Olusturucu materyal gibi farmasötik olarak kabul edilebilir bir materyal, kompozisyon veya araç anlamina gelir. Bir düzenlemede, her bilesen, farmasötik bir formülasyonun diger bilesenleri ile uyumlu olma anlaminda "farmasötik açidan kabul edilebilir" dir ve asiri toksisite, tahris, alerjik cevap, immünojenisite veya makul fayda/ risk orani ile orantili diger problemler veya komplikasyonlar olmaksizin insanlar ve hayvanlardaki doku veya organlarla temas halinde kullanim için uygundur. Bakiniz, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 215t ed.; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, Pa., 2005; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6th ed.; Rowe et al., Eds.; The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association: 2009; Handbook of Pharmaceutical Additives, 3rd ed.; Ash and Ash Eds.; Gower Publishing Company: 2007; and Pharmaceutical Preformulation and Formulation, 2nd ed.; Gibson Ed.; CRC Press LLC: Boca Raton, Fla., 2009. bilesige (veya ilaca) metabolize veya baska sekilde dönüstürülen bir bilesigi belirtir. Ilaca göre bir ön ilaç, kimyasal açidan ilacin daha az aktif veya inaktifolmasini saglayacak birtarzda modifiye edilir, ancak kimyasal degisiklik, ilgili ilacin ön ilaç verildikten sonra metabolik veya diger biyolojik islemlerle üretilecegi sekildedir. Ön ilaç, aktif ilaca göre, degismis metabolik kararlilik veya tasima özellikleri, daha az yan etki veya daha düsük toksisite veya gelistirilmis Iezzete sahip olabilir (örnegin, bakiniz, buraya referans yoluyla dahil edilen, the reference Nogrady, 1985, Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, pages 388-392). Bir ön ilaç, ilgili ilaç disindaki reaktifleri kullanarak sentezlenebilir.

”Kati tümör"; kemik, beyin, karaciger, akcigerler, lenf nodu, pankreas, prostat, deri ve yumusak dokuda (sarkoma) metastatik tümörler de dâhil olmak üzere ancak bunlarla sinirli olmayan kati tümörleri ifade eder. bir bilesikle stoikiometrik veya stoikiyometrik olmayan miktarda bulunan bir veya daha çok çözücü molekülden olusan bir kompleks veya agregaya deginmektedir. Uygun çözücüler su, metanol, etanol, n-propanol, izopropanol ve asetik asittir ancak bunlarla sinirli degildir. Bazi uygulamalarda çözücü, farmasötik olarak kabul edilir. Bir uygulamada kompleks veya agrega kristal halindedir. Bir baska uygulamada, kompleks veya agrega kristal olmayan bir formdadir. Çözücü su oldugunda, solvat bir hidrattir. Hidrat örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, bir hemihidrat, monohidrat, dihidrat, trihidrat, tetrahidrat ve pentahidrat bulunmaktadir.

”Bir ilacin ”terapötik olarak etkili miktari", kanserli bir hastaya uygulandiginda, örnegin kanserli hastalarda bir veya daha fazla kanser tezahürünün hafifletilmesi, iyilestirilmesi, hafifletilmesi veya yok edilmesi gibi amaçlanan terapötik etkiye sahip olacagi, anlamina gelen bir ilacin miktarina atifta bulunur. Terapötik etki, bir dozun uygulanmasiyla zorunlu olarak ortaya çikmaz ve yalnizca bir dizi dozun uygulanmasindan sonra ortaya çikabilir. Dolayisiyla, terapötik olarak etkili miktar bir veya daha fazla uygulamada uygulanabilir.

Bir durumun veya hastanin "tedavi edilmesi", i'tedavisi" veya "terapisi", klinik sonuçlar da dâhil olmak üzere faydali veya istenen sonuçlarin elde edilmesi için adimlarin atilmasi anlamina gelir. Bu bulusun amaçlari için faydali veya arzu edilen klinik sonuçlar, dahil olmak üzere ancak bunlarla sinirli olmaksizin, kanserin bir veya daha fazla semptomunun hafifletilmesi veya iyilestirilmesini; hastaligin derecesinin azaltilmasini; hastaligin ilerlemesinin geciktirilmesini veya yavaslatilmasini; hastalik halinin düzeltilmesini, iyilestirilmesini, hafifletilmesi veya iyilestirilmesini veya diger yararli sonuçlari içerir. Bazi vakalarda kanser tedavisi kismi yanit veya stabil hastaliklara neden olabilir. memelilerin tümör hücrelerine karsilik gelir.

Açiklayici Uygulamalar Formül la ve Ib'ye ait bilesikler: veya bunlarin izotopik bir varyanti, solvati veya hidrati saglanmaktadir.

Baska bir yönüyle formül I'e ait bir bilesigin hazirlanmasi için bir Oislem sunulmaktadir: Formül Il ye ait bilesigin: 02N Formül lII 'e ait bir bilesigin temin edilmesi için POCI3 HzNCHzCHzLZ' veya bunun bir tuzunun temas ettirilmesini içermektedir, III burada L1 ve L2 bagimsiz olarak ayrilan gruptur, ve daha sonra formül III bilesimi alinarak formül I'in bilesimi elde edilir.

Burada saglanan bilesikleri sentezlemek için bazi yöntemler burada saglanmaktadir. Bu ve burada saglanan diger bilesikleri sentezlemeye yönelik diger yöntemler, kendileri tarafindan iyi bilinen sentetik yöntemlerle reaktiflerin ve reaktantlarin uyarlanmasi ve degistirilmesi üzerine hazirlanmasi için yararli baslangiç malzemeleri ticari olarak temin edilebilir veya rutin yöntemler izlenerek hazirlanabilir. Tepkimeler genelde eylemsiz bir çözücü içinde gerçeklestirilir ve gerekirse isitilir. Teknikte tecrübeli bir kisi, bazi tepkimelerin bir koruma grubunun kullanilmasini gerektirebilecegini kolayca anlayacaktir. Koruma gruplari tecrübeli bir kisi tarafindan iyi bilinmektedir ve örnegin Organik Sentezde Greene 'nin Koruyucu Gruplari'nda açiklanmaktadir. Peter G. M. Wuts and Theodora W. Greene, 4th Edition or a later edition, John Wiley & Sons, Inc., 2007. Reaksiyon ürünleri, kristallestirme, çökeltme, damitma ve / veya kromatografi gibi rutin yöntemler izlenerek ayrilabilir. Bir bilesigin veya ara maddenin safligi, lH-NMR, HPLC, TLC ve benzerleri gibi iyi bilinen yöntemler kullanilarak saptanabilir.

Baska bir uygulamada, mevcut bulus, formül I 'e ait bir bilesigin optik çözülmesi için bir isleme iliskindir. Bu bulusun formül la ve Ib bilesiklerinin farmasötik Önemi göz önüne alindiginda, etkili bir endüstriyel islem kullanilarak ve özellikle de iyi bir verimle ve mükemmel kimyasal ve enantiomerik saflikla formül I bilesimini çözmek zorunlu olmustur.

Basvuru sahibi, iyi verim ve kimyasal ve enantiomerik saflik özelliklerine sahip formül la ve lb gelistirmistir. Bulusun islemi, formül I bilesiginin enantiomerinin, kullanilan çözücüler üzerinde tasarruf saglarken, yüksek üretkenlikle ve mükemmel bir verimle, formül I 'e ait bilesigin her iki enantiomerinin mükemmel bir enantiyomerik fazlalikta elde edilmesini mümkün kilar. Daha spesifik olarak mevcut bulus, formül I 'e ait bir bilesiogin optik çözülmesi için bir isleme iliskindir: (la) ve (lb) sirasiyla mutlak konfigürasyon (R) ve (S) enantiyomerlerini vermek üzere: burada formül I'in bilesiminin rasemik veya enantiomerik olarak zenginlestirilmis bir karisimi; siral kromatografiyle formül (la) lnin (R)-1-(3-(3-N,N-dimethilaminokarbonil)fenoksil-4-nitrofenil)-1-etil- N,N'-bis(ethilen)fosforamidatini ve formül (Ib) 'nin (S)-1-(3-(3-N,N-dimetilaminokarbonil)fenoksiI-4- nitrofeniI)-1-etil-N,N'-bis(ethilen)fosforamidat olmak üzere iki enantiyomeri ayrilir.

Optik çözünürlük, rasemik bir karisimin veya bu iki enantiyomerin herhangi bir karisiminin iki enantiyomerinin ayrilmasi anlamina gelir. anlamina geldigi anlasilmaktadir.

Enantiyomerik olarak zenginlestirilmis bir karisimin, 55:45 ila 90:10 arasinda degisen bir oranda enantiyomerlerin önemli ölçüde daha fazlasini içeren iki enantiyomerin bir karisimi anlamina geldigi anlasilmaktadir.

Kiral kromatografi, kiral sabit faz ve çözücü veya çözücü ve gaz karisimindan olusan mobil faz vasitasiyla bir karisimin enantiyomerlerinin ayrilmasini mümkün kilan düzenlemeyi ifade eder.

Bulusun uygulamalarindan birine uygun olarak, kiral kromatografi için kullanilan sabit faz, islevli polisakaritle emprenye edilmis silika jel içermektedir.

Bir uygulamada, kiral kromatografi için kullanilan mobil faz, bir alkol ve bir organik gaz karisimi içerir. Kiral kromatografi için kullanilabilen alkoller arasinda herhangi bir sinirlama olmaksizin izopropanol, etanol ve metanol sayilabilir. Bir uygulamada, kiral kromatografi için kullanilan alkol metanoldür.

Kiral kromatografi için kullanilabilen organik gazlar arasinda, herhangi bir sinirlama getirmeksizin, yüksek basinçta kullanilabilen organik gazlar belirtilebilir. Tercihen kullanilan organik gaz COz'dir. Bir uygulamada, kiral kromatografi için kullanilan mobil faz, metanol ve C02 karisimi içerir.

Bulusun bir uygulamasinda, kiral kromatografi için kullanilan mobil faz, 50:50 ila 2:98 arasinda degisen bir oranda metanol ve CO2 karisimi içerir.

Bulusun bir uygulamasinda, kiral kromatografi için kullanilan mobil faz geri dönüsümlüdür.

Bulusun bir uygulamasinda, kiral kromatografisi 15°C ila 40°C arasindaki bir sicaklikta gerçeklestirilir.

Bulusun bir uygulamasinda optik ayrisma, 1: 1 formül (I) 'e ait rasemik karisim üzerinde gerçeklestirilir.

Bulusun uygulamasinin birinde, 1- (3- (3-N, N-dimetilaminokarbonil) fenoksil -4-nitrofenil) -1-etiI-N, N'- bis (etilen) fosforamidatin (R) -enantiomeri kullanilir. Bulusun uygulamasinin birine uygun olarak, 1- (3- (3-N, N-dimetilaminokarbonil) fenoksil -4-nitrofenil) -1-etiI-N, N'-bis (etilen) fosforamidatin (S) - enantiomeri kullanilir.

Bulusun bir uygulamasina uygun olarak, sürekli bir çok sütunlu ayirma islemi kullanilir.

Bulusun bir baska uygulamasina uygun olarak, simüle edilmis hareketli yatakli kromatografi islemi kullanilir. Benzetimli hareketli yatak kromatografisi, mobil fazin hareketi ile ters yönde sabit fazin harekete geçirilmesini simgeleyen sürekli kromatografi islemi anlamindadir. Bu tür bir islem geleneksel kromatografi teknikleriyle ayrilmasi zor veya imkânsiz bilesiklerin ayrilmasini mümkün kilar. Kiral sabit bir faz kullanildiginda bu tür bir islem enantiyomerlerin ayrilmasi için özellikle yararlidir. Simüle hareketli yatak kromatografisinin kullanilmasi, bir enantiyomer karisiminin kesintisiz çözünürlügünü, yüksek verimlilikle ve kesikli kromatografi islemlerine kiyasla kullanilan sabit ve hareketli faz miktarlarini azaltarak mümkün kilmaktadir.

DMF: Dimetilformamid TEA: Trietilamin RT: Oda sicakligi THF: tetrahidrofuran DIAD: Diizopropil azodikarboksilat Asagidaki örnekler bulusu açiklamaktadir. ÖRNEKLER Örnek 1. Bilesik TH 2870'in Hazirlanmasi.

M ci ,TEA 02N 2 _\_Br F PPH3/DIAD 5 O_P\_Nj NaH, DMF 6 TH2870 Bilesikler 2-6, asagida tarif edildigi gibi sentezlendi. a. Bilesik 3'ün Sentezi: Bilesik 1 (3 g, ile geri akitildi ve daha sonra vakum altinda SOCIz çikarildi. Tortu toluen (5 mL) ile seyreltildi ve bir sonraki asamada daha fazla saflandirilmadan kullanildi. karisimi, oda sicakliginda 1.5 saat karistirildi, ardindan Bilesik 2'nin yukarida belirtilen toluen çözeltisi ilave edildi. Ortaya çikan karisim, oda sicakliginda 1.5 saat daha karistirildi ve daha sonra konsantre edildi. HC1 (4 mL) ilave edildi ve 5 dakika karistirildi. Karisim EtOAc (30 mL x 3) ile özütlendi, kurutuldu (Na2504), süzüldü ve indirgenmis basinç altinda konsantre edildi. Tortuya, 6N HC ilave edildi ve karisim gece boyunca geri akitildi. Karisim EtOAc (30 mL x 3) ile ekstrakte edildi, kurutuldu (Na2504), filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda konsantre edildi. Kalinti Bilesik 3'ü açik sari bir kati olarak (1.9 g,% 63 verim) elde etmek üzere FCC (silika jel, EtOAc/ Heksan) ile saflastirilmistir. 1H NMR (CDCI3, ppm. b. Bilesik 4'ün Sentezi seyreltildi, doymus NHACl sulu, solüsyon, tuzlu su ile yikandi ve kurutuldu (Na2504). Filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda konsantre edildi. Tortu, açik sari bir yag olarak Bilesik 4'ü (1.44g, %75 verim) elde etmek üzere FCC (silika jel, EtOAc/ Heksan) ile saflastirildi.10 c. Bilesik 5 'in Sentezi Bilesik 4'ün ( içinde Br-IPM (2.88 g, 9.34 mmol), PPh3 ( ilave edildi. Karisim, 0 ° C'de 1.5 saat karistirildi, azaltilmis basinç altinda konsantre edildi ve açik sari bir yag olarak Bilesik 5'i (1.0 g,% 27 verim) elde etmek için FCC (silika jel, EtOAc/ Heksan) ile saflastirildi. 1H NMR (CDCI3, , 552-560 d. Bilesik 6 'nin Sentezi Filtrelendi ve düsük basinç altinda konsantre edildi. Tortu, sari bir kati (0.6g, %90 verim) halinde Bilesik 6 verecek sekilde FCC (silika jel, Aseton / Heksan) ile saflastirildi. 1HNMR (cocig, , 7.31(d,J = 8.4 Hz, A020 I_ L_.L..›k l-'IZ [(2C03i'ITI'.'IJ'I.'-IJ_ Il i 0 O 2 O NMGZ 7-2 7 -3 7 Bilesik 7-2 'nin hazirlanmasi Ac20, 0°C 'de (562 ml, 1.5 eq) Pridin ( çözelti içine damla damla ilave edildi ve 6 saat boyunca oda sicakliginda karistirildi. Buharlastirildi, buzlu suya döküldü, filtrelendi, filtre çamuru beyaz bir kati olarak bilesik (150 g %74 verim) halinde 7-2 vermek üzere kurutuldu. 1H NMR (, 7.51^'7.47 (t,J = .10 Bilesik 7-3 'ün hazirlanmasi DCM ( ilave edildi, 0 ° C'ye sogutuldu, ardindan oksalil klorür ( eklendi, oda sicakliginda 4 saat karistirildi.

Buharlastirildi, tortu, 0 ° C'ye sogutuldu DCM ( içinde 2M dimetilamin çözeltisi eklendi, oda sicakliginda 20 saat karistirildi. HzO ( ile söndürüldü, DCM ( halinde ham bilesik , Bilesik 7 'nin hazirlanmasi ilave edildi, oda sicakliginda 5 saat karistirildi. Filtrelendi, filtrat buharlastirildi. Tortu, 4N HCI ila PH6.0 arasinda aközlestirilerek HzO ( içinde çözündürüldü, filtrelendi ve filtre çamuru, bilesik 7 'yi beyaz kati halinde verecek sekilde kurutuldu , (60 g, % 55 verim). f. TH 2870 sentezi mmol) ilave edildi. Bilesik 6 (2 g, 6.35 mmol) ilave edilmeden önce 0 C 'de 0.5 saat karisim karistirildi ve daha sonra 0 C 'de 2.5 saat karistirildi. Karisim EtOAc ( ile yikandi, Na2504 üzerinde kurutuldu, filtrelendi, indirgenmis basinç altinda konsantre edildi ve sari bir yag olarak TH ile saflastirildi.

TH 2870'in nihai ariti/masi: TH ile saflastirildi.

Kombine koleksiyonlar, nihai ürün olarak açik sari bir yag elde etmek üzere düsük basinç altinda konsantre edildi. Su uzaklastirmak için buharlastirma islemine bir azeotrop maddesi olarak asetonitril ilave edildi. 1H NMR (, 7.27”7.21(m, Örnek 2. Bilesik TH 2870'in Alternatif Hazirlanmasi.

M Cl ,TEA O2N 02N g 2 O2N 1 POCl 0 N H\N _' ON 2NHCHCHB.HB 2 2 F ) 2 2 2 F F _\-Br F '9 q 02“& 0 P\ N NaH,DMF 02N N _› 0 a. Bilesik 3'ün hazirlanmasi Bilesik 1 ( içerisinde geri akitildi ve daha sonra vakum altinda SOC12 çikarildi. Tortu, toluen ( ile seyreltildi ve daha fazla aritilmadan bir sonraki asamada kullanildi.

Yukarida adi geçen bilesik 2 toluen çözeltisi damla damla ilave edilmeden önce, MgClz (103g, oda sicakliginda 1.5 saat karistirildi. Ortaya çikan karisim oda sicakliginda 1.5 saat daha karistirildi. HzO (2 L) ile yikandi, EtOAc (2L x 5) ile ekstrakte edildi, buharlastirildi, 4N HC1, PH6.0'a kadar eklendi ve 5 dakika karistirildi. Karisim EtOAc (2L x 5) ile ekstrakte edildi, buharlastirildi.

Tortuya, 6N HC1 ( ilave edildi ve karisim gece boyunca geri akitildi.

Karisim EtOAc (2L x 5) ile ekstrakte edildi, konsantre edildi, sari bir kati olarak bilesik 3 (80 g,% 41 verim) verecek sekilde silika jel kolonu (petrol eteri: EtOAc = 20: 1) ile saflastirildi. b. Bilesik 4'Ün hazirlanmasi seyreltildi, tuz ile yikandi. NH4CI sulu solüsyonu, tuzlu ile yikandi, Na2504 üzerinde kurutuldu ve konsantre edildi. Tortu, sari bir yag (90 g,%60 verim) halinde bilesik 4 verecek sekilde silika jel kolonu (petrol eteri: EtOAc = 5: 1) ile saflastirildi. c. Bilesik 5 'in hazirlanmasi karistirildi. Daha sonra 2-Bromoetilamin hidrobromid ( içinde TEA (12ml, 86.8mmol) -40 ° C'de yukaridaki çözeltiye yavasça ilave edildi, 0.5 saat karistirildi. 3) ile ekstrakte edildi, buharlastirildi, sari bir yag halinde bilesik 5'i (2.3 g,% 43 verim) elde etmek üzere silika jel kolonu (EtOAc) ile saflastirildi. karistirildi, filtrelendi ve konsantre edildi. Kalinti, bilesik 6 sari bir yag verecek sekilde jel kolonu (EtOAc) ile saflastirildi (2.3g, <587verim). e. TH2870 bilesiginin hazirlanmasi eklendi, 30 dakika 0 ° C'de karistirildi.

HzO ile söndürüldü, EtOAc (100ml x 5) ile ekstrakte edildi, HzO (150ml), tuz ile yikandi, buharlastirildi, bilesik TH saflastirildi (2.3g,% 69 verim). Örnek. 3. TH2870 Enantiyomerlerinin Hazirlayici Kiral Kromatografi ile Ayri/masi 983 mg formül (I) bilesigini 36 mL metanol içinde eritin, 3.0 mI/dakika akis oraninda SFC-80 Yöntem istasyonunda (Thar, Waters) CHIRALPAK OZ-H 4.6X250mm, 5Im (Daicel) üzerine 1 ml enjekte 60/35-40) karisimi içinde elüte edilir. Formül (la) 'ya ait konfigürasyon (konfigürasyon (R)),% 86.5'Iik bir verimle ve% 100 bir enantiyomerik saflikla elde edilir. Formüle (lb) sahip enantiyomer (yapilandirma (5)),% 83.8 bir verimle ve %100 bir enantiomerik saflikla elde edilir. Sekil 1, LCMS ile kiral ayrildiktan sonra TH 'nin saflik kontrolünü göstermektedir.

TH 3423 ve 3424 'ün kira! sentezi OH SOCI2 Cl 0 O 02N MgCI2, TEA 02N 02N \7 02N \7 F 7 HO F 13 (R) O/PxigN (3) 0* PiN/> 02N `7 OZN \7 TH3423O TH3424 Bilesik 2 Bilesik 1 (65 g) berrak bir solüsyon elde etmek için 5 saat boyunca SOC12 ( içinde DMF ( ile seyreltildi ve çözücüler tekrar uzaklastirildi. Tortu, bir daha aritilmadan bir sonraki asamada kullanildi.

Bilesik 3 karisimi, THF (80 ml) içindeki bilesik 2 eklenmeden önce oda sicakliginda mekanik karistirma ile 2 saat karistirildi. Nihai karisim, konsantre hale getirilmeden önce oda sicakliginda 4 saat karistirildi. HC1 (90 mL) ilave edildi ve 30 dakika karistirildi. Karisim, EtOAc ( ile ekstrakte edildi, indirgenmis basinç altinda konsantre edildi. Tortuya, 6N HC1 ( ilave edildi ve karisim gece boyunca geri akitildi. Karisim EtOAc ( ile yikandi ve kurutuldu (NazSO4), filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda konsantre edildi. Tortu, açik sari bir kati (46 g) halinde bilesik 3 verecek sekilde AcOEt/ Hex = 1 / 3'den (V / V) yeniden kristallestirildi. 1H NMR Bilesik 5: Argon altinda, 0 ° C'de lM toluen (3 mL, 3 mmol) içinde bilesik 4 solüsyonuna BH3.THF (1M, 11 mL) ilave edildi. Solüsyon 30 dakika karistirildiktan sonra -40°C'ye sogutuldu. THF (40 mL) içindeki C'de 2 saat karistirildi (TLC, SM 'nin kayboldugunu gösterdi). -40 ° C'de yaklasik çözeltiye MeOH (20ml) ilave edildi ve çözelti, 30 dakika karistirildi. Çözücüler oda sicakliginda giderildikten sonra ve tortu, bilesik 5'i (1.6 g) elde etmek için kolon (Hex /AcOEt = . 1HNMR (CDCIa, .

Bilesik 6 Argon altinda -40 ° C'de DCM (10 mL) içinde POC13 ( solüsyonuna 10 mL DCM içerisinde bilesik 5 ( ilave edildi. Karisim -40 ° C'de 6 saat karistirildi ve daha sonra 2-Bromoetilamin hidrobromit (14.2g, 69.3 mmol) eklendi, DCM (10 mL) içindeki TEA ( damla damla ilave edildi. Reaksiyon karisimi gece boyunca -40 ° C 'da oda sicakliginda karistirildi. K2C03 (80 mL su içerisinde 8.3 g) ilave edildi ve karisim, 5 dakika karistirildi.

Karisim DCM ile ekstrakte edildi, Na2504 üzerinde kurutuldu. Bilesik 6, sari bir yag verecek sekilde Aseton/Heksan = 0-100%) ile filtrelendi, konsantre edildi ve daha sonra slika jel akitma kromatografisi ile elüte edildi (2.68g, verim: %65). 1H NMR (CDCI3, , 334-356 (m, Alternatif olarak TH3424 asagidaki prosedür ile sentez/enebilir: Nitrojen altinda dört boyunlu cam bir siseye toluen (11ml / g) ilave edildi. Çalkalanmaya baslandiginda, nitrojen altinda vehikül 1 'e POCl3 ilave edildi (1.025eq). Kabin içerigi -2~2 ° C'ye sogutuldu. Bilesik 1 solüsyonu ( -2^'2 °C derecede damla damla ilave edildi. Vehikül 1 içerikleri 1“2 saat boyunca -2~2 °C 'de çalkalandi.

Içindekiler, bilgi için HPLC analizleri için örneklendi. Vehikül 1'e 2-Bromoetilamin hidrobromid (3eq) ilave edildi. TEA (6eq) vehiküll'e -2~2 °C 'de damla damla ilave edildi. Kap 1'in içindekiler 0°C'de gece boyunca çalkalandi. Içerik HPLC analizleri için örneklendi. Çalisma prosedürü asagidaki gibidir: Kap l'e H20 (19ml / g) ilave edildi ve 5 N 10 dakika karistirildi. Karisim, üç kez EA (19ml / g) ile ekstrakte edildi.

Organik faz, Na2$04 üzerinde kurutuldu ve filtrelendi. Ana Iikör, 40~50°C 'de konsantre edildi. Ham ürün, saflastirilmis ürünü elde etmek için silika jel kromatografisiyle aritildi.

Alternatif olarak TH3424 asagidaki prosedür ile sentez/enebilir: Toluen (11mI / g) dört boyunlu cam siseye azot altinda ilave edildi. Çalkalanmaya baslandi ve bilesim vehikül 1 'e nitrojen altinda eklendi. Kap 1 içerigi -2^'2 ° C'ye sogutuldu. POCI3 (1.025eq) -ZNZ °C 'de nitrojen altinda vehikül 1 'e ilave edilir. Kabin 1 içindekiler, 1”2 saat boyunca -2'”2 °C'de çalkalandi. Içindekiler, bilgi için HPLC analizleri için örneklendi. Kap 1'e 2-Bromoetilamin hidrobromid (3eq) ilave edildi. TEA (6eq) ) -2^'2 °C 'de vehikül 1 'e ilave edilir. Kabl'in içindekiler, gece boyunca 0 ° C - oda sicakliginda çalkalandi. Içindekiler HPLC analizleri için örneklendi. Çalisma prosedürü yukaridaki ile ayniydi.

Alternatif olarak TH3424 asagidaki prosedür ile sentez/enebilir: Dört bogazli cam bir siseye azot altinda DCM ( ilave edildi. Çalkalamaya baslandi ve kabin 1 içerigi nitrojen altinda -35 °N-40 ° C'ye sogutuldu. Bilesik 1 (1.0 eq)/ DCM (4.5g / ml) solüsyonu, -35 °”-4O ° C'de damla damla azot altinda kaba 1 ilave edildi. Kabin içerigi, 4^'6 saat boyunca 35”-40 °C'de çalkalandi. Içindekiler, bilgi için HPLC analizleri için örneklendi. 2- damla damla kabin 1 içerisine ilave edildi. Kabin içerigi 1, 1-2 saat boyunca -30N-40°C'de çalkalandi.

HPLC analizleri için içerikler örneklendi. Tetkik prosedürü: H20 (15mI/g), vehikül 1 içerisine ilave edildi ve ile ekstrakte edildi. Organik faz, Na2504 üzerinde kurutuldu ve filtre edildi. Filtrat, 20”30 ° C'de konsantre edildi. Ham ürün, saflastirilmis ürünü elde etmek için kromatografi ile saflastirildi.10 Bilesik 7 karistirilmistir. Çözücünün vakum altinda ortadan kaldirilmasindan sonra, tortu, hafif bir sivi 1.0 g bilesik 7 verecek sekilde silis jel üzerinde flas kromatografisiyle ayrildi. 1H NMR (cocig, , 202-224 (m, gece boyunca karistirildi. Karisim su ile seyreltildi, DCM ile ekstrakte edildi, Nazsoa üzerinde kurutuldu.

Filtre edildi, konsantre edildi ve daha sonra sari yag (1.1 g) halinde bilesik 9 verecek sekilde flas kromatografisiyle islemden geçirildi. 1H NMR (cocig, , 5.59 Bilesik 11 Bilesik 5 ile ayni prosedür. Bilesik 3 yerine Bilesik 8 kullanildi. Verim:% 50 1H NMR (cocig, .

Bilesik 12 Bilesik 6 ile ayni prosedür (verim:% 35). 1H NMR (cocig, , 334-356 (m, Bilesik 13 Bilesik 7 ile ayni prosedür (verim:% 36). 1H NMR (CDCIg, , Bilesik 9 ile ayni prosedür (verim:% 68). 1H NMR (CDCIg, , 3H). 31P NMR: 31.25. Örnek 4. /n vitro insan tümör hücre çizgisi sitotoksisite testi H460 hücre disi akciger kanseri insan tümör hücre dizisinde in vitro proliferasyon verileri bilesik tabloda yukarida rapor edilmistir. IC50 degerleri mikromolar cinsinden rapor edilmistir ve 2 saat boyunca çesitli konsantrasyonlarda bilesigin maruz birakilmasindan, bunu takiben bir yikama adimindan sonra taze ortam eklenerek ve ardindan büyüme ve hücre yasayabilirligi boyanmasi ve sadece muamele edilmis bir ortamla karsilastirma sonucu olusur.

Spesifik olarak, katlanarak büyümekte olan hücreler, 96 kuyucuklu bir plaka içinde kuyu basina 4 x 103 hücre yogunluguna ekildi ve test bilesiklerinin ilave edilmesinden once 24 saat boyunca %5 edilen nihai test konsantrasyonunun 200 katinda çözündürüldü. Ilâç ilavesi esnasinda, bilesikler, komple ortam ile arzu edilen nihai konsantrasyonun 4 kati kadar seyreltildi. Belirtilen konsantrasyonlarda 50 ul bilesiminin alikotlari 150 ul ortam ihtiva eden mikrotiter oyuklarina ilave edildi ve nihai ilaç konsantrasyonu bildirildi. Ilaç ilave edildikten sonra, plakalar 37 ° C,% 5 C02,% 95 hava ve %100 bagil nemde 2 saat daha inkübe edildi, daha sonra ilaç yikandi ve yeni ortam eklendi ve inkubasyonun sonunda, canli hücreler AIamarBlue testi kullanilarak nicellestirildi. % 50 büyüme inhibisyonuyla sonuçlanan ilaç konsantrasyonu (ICso), Prism yazilimi (Irvine, CA) kullanilarak hesaplandi ve sonuçlar tabloda listelenmistir.

H460 akciger kanseri hücreleri üzerindeki anti-proliferasyon etkinligi de asagida tablolastirilmistir.

H460 hücrelerinde pro/iferasyon Bilesik - - Yapi testindeki IC50 (MM) numarasi TH 2870 (rasemik 0 i) \O_FI!-N1 karisim) ' OZN Ä TH3423 0 0.005 TH3424 0 0.004 Yukaridaki H460 verileri, çesitli bilesikler için düsük nanomolar seviyelerde inhibisyon ile sadece 2 saat maruz kalma için önemli bir anti-tümör etkisi sergilemektedir. Örnek 5. TH 2870'in a/doketo redüktaz tarafindan aktivasyonu, AKR1C3 Rekombinant insan AKR reaksiyon karisimina nihai konsantrasyon 5 pM olacak sekilde ilave edildi ve 37 ° C'de 120 dakika inkübe edildi. 120 dakikaya kadar çesitli zamanlarda 50 uL reaksiyon karisimi alindi ve iç standart olarak propranolol içeren 200 uL asetonitril ilave edildi, girdapla karistirildi ve 10 dakika boyunca santrifüjlendi. Elde edilen süpernatant (5 uL) TH 2870 ve progesterone miktarinin niceligi için LC/MS/MS içine enjekte edildi. Bilesikler, çift olarak test edildi.

SEKIL 2'deki veriler, bilinen substrat Progesteron yavasça azaltilirken AKR1C3 varliginda TH 2870'in hizli bir sekilde kayboldugunu göstermektedir. NADPH 'yi içeren ancak enzim içermeyen tampon kontrolleri, herhangi bir bilesikle hiçbir reaksiyon göstermedi (veriler gösterilmemistir). Örnek 6. In vitro insan tümör hücre çizgisi sitotoksisite testi prosedürler kullanarak test edildi. 10* hücre lizati tamponu (hücre sinyalleme teknolojisi, Cat.

No.9803); Memeli Dokulari Için Proteaz Inhibitör Kokteyli (Sigma, Cat. No.P8340); Alkali Fosfatazlarin Serin /Treonin Fosfatazlari ve L-Izozimleri (Sigma, Kat. No. P0044) için Fosfataz Inhibitörü Kokteylleri; Tirosin Proteini Fosfatazlari, Asit ve Alkali Fosfatazlar Için Fosfataz Inhibitörü Kokteylleri (Sigma, Cat.

N0.P; Birincil antikor, fare monoklonal AKR1C3 antikoru (clone NP6.GG.A6; Sigma-Aldrich); Birincil antikor, oi- tübülin (clone 8-5-1-2; Sigma-Aldrich); Ikincil antikor, Keçi anti-fare IgG HRP konjuge (A4416; Sigma-Aldrich) kullanildi. Hücreler, iyi durumda iki nesle geçirildi ve sindirildi. Uygun sayida hücre, 6 cm'lik hücre kültürü tabaklarinda inoküle edildi ve gece boyunca 37 C °,% 5 COZ'de inkübe edildi. Hücreler %80 yogunluga ulastiginda, kap inkübütörden çikartildi. Ortam aspire edildi, buzla sogutulmus PBS ile iki kez yikandi ve kalinti PBS çikarildi. Uygun bir hacimde buz soguklugunda 1* hücre lizazi eklendi ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edildi. Hücre lisat buzda sogutulmus mikrofüj tüplerine aktarildi, 4 ° C, 12.000 devirde ve 15 dakika santrifüje tabi tutuldu. Süpernatan baska bir mikrosantrifüj tüpüne aktarildi. 10*hücre lizati ile hücre lizatlari seyreltildi ve Memeli Dokular Için Proteaz Inhibitör Kokteyli (Sigma, # P8340), Serin / Treonin Fosfatazlari ve L-Izoksimler için Fosfataz Inhibitörü Kokteylleri, Alkali Fosfatazlar, Tirosin Proteini Fosfatazlari, Asit ve Alkali Fosfatazlar Için Fosfataz Inhibitörü Kokteylleri ilave edildi. Protein miktar tayini için BCA protein nicelik kiti, hücre lizatini ayni konsantrasyona kadar seyreltmek için 1* hücre lizati ile kullanildi. Karsilik gelen numuneler, 5* SDS yükleme tamponu üzerine ilave edildi, 10 dakika boyunca 85 ° C'ye kadar isitildi ve kisa bir süre santrifüj edildi. Numuneler -20 ° C 'de saklandi veya dogrudan protein elektroforezi için kullanildi. Numuneler -20 ° C 'de saklandi veya dogrudan protein elektroforezi için kullanildi. Bu numuneler, standart uygulamaya göre elektroforezlendi, bir membrana aktarildi, birincil antikorlar ve daha sonra ikincil antikor üreticinin talimatlarina göre uygulandi.

Sinyalleri taramak için Odyssey kizilötesi lazer görüntüleme sistemi kullanildi.

Sonuçlar asagida Sekil 3 ve 4'te gösterilmekte ve asagidaki tablolarda listelenmektedir: duyarliligi Karaciger _ . ,. , , . . Min Maks. kanserihucre Bi/esik Kimlik No . i _ . . . Re/IC50(uM) Abs/C50 (uM) . _ , Inhibisyon% Inhibisyon% KYSE TH3424 0.011 CCRF-CEM TH3424 0.0037 Jurkat TH3424 0.04 Jurkat, Clone TH3424 0.024 NOMO-l TH3424 0.011 P30/OHK TH3424 >1 K-562 TH3424 >1.0 Mono-Mac- TH3424 >1.0 Örnek 7. In vivo insan tümör ksenograft modelleri ve antitümör aktivite Küçük hücreli olmayan akciger H460, küçük hücreli disi akciger A549 ve melanoma A375 modellerini kullanan üç insan ksenograft anti-tümör modeli, burada verilen bilesiklerin etkililigini göstermek için kullanildi.

Spesifik patojen içermeyen homozigot disi çiplak fareler (nu / nu, Charles River Laboratories) kullanildi. Farelere ad Iibitum yiyecek ve su verildi ve mikro izolatör kafeslere yerlestirildiler. Dört ila alti haftalik hayvanlar, deneyler sirasinda mikroçiplerle (Locus Technology, Manchester, MD, ABD) tespit edildi. Tüm hayvan çalismalari, Threshold Pharmaceuticals, Inc.'de Kurumsal Hayvan Bakimi ve Kullanim Komitesi tarafindan onaylandi.

Tüm hücre hatlari, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonundan alindi (ATCC, Rockville, MD, USA).

Hücreler önerilen ortamda % 10 fetal sigir serumu ile kültürlendi ve 37°C'de %5 C02 nemlendirilmis ortamda muhafaza edildi.

Hücreler, Matrigel (H460'da %30) ile karistirildi ve her fare için 0.2 ml, hayvanlarin yan bölgesinde deri altindan implante edildi. Tümör boyutu 100-150 mm3'e ulastiginda, fareler, 10 fare/ grup ile deney ya da araç gruplarina randomize edildi ve tedaviye baslandi (1. Gün). Test edilen bilesikler, D5W içinde %5 DMSO içinde formüle edildi. Tüm bilesikler, toplam 2 döngü için bir döngü olarak IP, QDxS/hafta (5 gün, 2 gün yok) ile verildi. Tümör büyümesi ve vücut agirligi haftada 2 kez ölçüldü. Tümör hacmi (uzunluk x genislikz) / 2 olarak hesaplandi. Ilaç etkisi, Tümör Büyüme Inhibisyonu (TGI) ve Tümör Büyüme Gecikmesi (TGD) olarak degerlendirildi. TGI, tedavi edilen grubun ve kontrol grubunun tümör hacmi ortalama degisim orani olarak (veya grup içindeki varyasyon nispeten büyük ise ortanca) sunuldugunda (l-AT/AC) x 100 olarak tanimlandi. TGD, tedavi edilen tümörün kontrol grubu ile karsilastirildiginda 500 mm3'e erismesi için ek gün olarak hesaplandi. Bireysel tümör boyutu Veriler, ortalama ± SEM olarak ifade edildi. Dunnett sonrasi karsilastirma testi (GraphPad Prism 4) ile tek yönlü varyans analizi veya iki yönlü ögrenci t-testi analizi için kullanilmistir. A p <0.05 degeri istatistiksel olarak anlamli kabul edildi. Örnek 8. In Vivo Etkin/ik Sonuçlari: Bu çalisma, A375 melanoma insan tümörü ksenograft modelini kullandi ve burada verilen bilesikler, tiotepa ve onaylanmis anti melanom ilaci Abraxane ile karsilastirildi. Antitümör etkileri ve idare güvenligi asagida grafiksel olarak gösterilmektedir. Mpk, mg/ kg 'yi ifade eder. günler kadar günler Günler Günler (vehikül (vehikül Grup 1:Araç,qdx5x2,ip 15 25 2.5mpk,qdx5x2,ip Abraxane,30mpk,2x/wkx2,iv TH2870,20mpk,qdx5x2,ip Birlikte ele alindiginda, bu çalismalar, standart kemoterapötiklere göre 3 farkli tümör hücre hattinda önemli anti-tümör etkililigini ortaya koymaktadir. Örnek 9. Insan Karaciger Kanser/nin Fare Mode/inde TH3424 Bu çalismada disi atemik çiplak fareler (6 haftalik) kullanildi. Hayvanlar, Beijing HFK Bioscience, Co., Ltd 'den satin alindi ve kafesleri ve gida maddeleri olan filtrelenmis ve isinlama veya otoklav ile sterilize edilmis yatakli Yüksek Verimli Partikül Hava Filtreli (HEPA) bir ortamda ve tabaklamalarla isinlama veya otoklavlama ile sterilize edilmis ortamda muhafaza edilir. Çalisma için toplam 32 çiplak fare kullanildi. HepGZ-GFP insan hepatoselüler karsinom hücreleri (AntiCancer, Inc., San Diego, CA),% FBS içeren RPMI- ile inkübe edildi. Hücreler, 37 ° C'de ve % (:02 /% 95 hava atmosferi altinda muhafaza edilerek CO; Su Gömlekli Inkübütör (Forma Scientific) içinde yetistirildi. Hücre canliligi tripan mavisi dislama analizi ile belirlendi. Bes disi atimik çiplak fareye, tek bir doz 5 x 106 HepG2-GFP hücresi subkutanöz olarak enjekte edildi. Boylari 1 cm3'e ulastiginda tümörler hasat edildi ve daha sonra tümör dokulari 1 mm3'lük küçük fragmanlar halinde kesilmistir.

Kirk disi çiplak fareye ortotopik olarak HepGZ-GFP insan hepatoselüler karsinomasinin subkutan tümör modelinden türetilen tek bir parça tümör fragmani yerlestirildi. Tümör dokusu, her farede karacigerin sag Iobuna ortopedik olarak SOI (Cerrahi Ortotopik Implantasyon) ile implante edildi. Kisaca, anestezi altinda 1 cm 'lik üst abdominal insizyon yapildi. Karacigerin sag Iobu açiga çikti ve karaciger yüzeyinin bir kismi makasla mekanik olarak yaralandi. Daha sonra bir parça tümör fragmani karaciger dokusunda tespit edildi, karaciger periton bosluguna geri döndü ve karin duvari nihayetinde kapatildi. Fareler, belirli patojen içermeyen kosullar altinda Iaminer akisli bölmelerde tutuldu.

Tümör implantasyonundan üç gün sonra, implante edilen tümörler ortalama 1 mm2 civarinda bir boyuta ulastiginda tedavi baslatildi. 32 tümör tasiyan fare, rasgele her biri 8 fareden olusan dört deney grubuna bölündü. Kafeslerin her biri, her kafes basina dört fareli grup için açikça isaretlenmistir.

Her fare taninmasi için bir kulak damgasina sahipti. Asagidaki tablo çalisma tasarimini göstermektedir.

Tab/0. Gruplar ve tedavi protokolü Gruplar Doz Hacim Dozlama Izlenen Yol Hayvan (Madde) çizelgesi (sayisi) Saline (C) 0.9% 200III Qdx35 IP. 8 Sorafenib (S) 30mg/kg 100III Qdx35 Gavages 8 Not : Tedavi, tümör implantasyonu sonrasi 3. günde baslatildi. Çalisma süresince, tüm deney farelerinin ölüm oranlari veya morbidite bulgulari günlük olarak kontrol edildi. Hayvanlar, tümör implantasyonundan sonra 38. güne kadar gözlendi. Farelerin vücut agirliklari çalisma süresi boyunca haftada iki kez ölçülmüstür. FIuorVivo görüntüleme sistemi Model ile çalisma süresi boyunca haftada iki kez tümör büyümesi ve ilerleme görüntüleri elde edildi. Tüm deney hayvanlari, tümör implantasyonundan sonra 38. günde asiri doz pentobarbital sodyum enjeksiyonu ile ötenazi edildi. Karaciger görüntülemeye maruz birakilmistir ve bundan sonra tümörler çikarilmis ve elektronik balans (Sartorius BS 124 S, Almanya) ile tartilmistir.

Tümör dokulari daha ileri analiz için formalinde tutuldu. Farkli gruplardaki vücut agirligi ve tümör yükü karsilastirmalari, OL = 0.05 (iki tarafli) Ögrenci t-testi kullanilarak analiz edildi. Test maddeleri intravenöz olarak enjekte edildikten sonra, fareler uzanmadi, özerk aktivite azalmasi yoktu. Deney hayvanlari genellikle iyi durumda idi. Her gruptaki vücut agirligi degisiklikleri Sekil 5 ve asagidaki Tablo 'da gösterilmektedir.

Tablo. Çalismanin sonunda ortalama fare/erde vücut agirliginin karsilastirilmasi . ,, Vücut Agirligi Gruplar agirligi (g) agir ligi (g) P degeri Büyüme Hizi (%) 2.5mg/kg) Sekil 5'de ve yukaridaki tabloda gösterildigi gibi, çalismanin 35. gününde, her bir gruptaki farelerin ortalama vücut agirligi % 21 artarak % 41'e yükselmistir.TH2870-2 ve negatif kontrol grubu arasinda istatistiksel olarak anlamli fark yoktu. Bu, TH2870-2'nin düsük veya yüksek dozunun intra- peritoneal uygulanmasiyla deney farelerine bariz bir akut toksisite olmadigini ileri sürdü. Bununla birlikte, sorafenib ile tedavi edilen grupta ortalama vücut agirligi, negatif kontrol grubundakinden istatistiksel olarak daha düsüktü. Test edilen dozajda sorafenib'in uygulanmasiyla deney farelerine bir miktar toksisite oldugu ileri sürüldü.

Her gruptaki tümör progresyonu.

Ortotopik HepGZ-GFP hepatoselüler karsinomun farkli gruplardaki ilerlemeleri gerçek zamanli görüntüleme ile izlendi. Görüntüler haftada iki kez alindi. Her grupta çalismanin sonunda tipik tümör görüntüleri ve Power Station yazilimi (INDEC Biosystems, CA, ABD) kullanilarak analiz edilen tümör floresans sinyallerinden elde edilen tümör büyüme egrileri sekil 6 ve sekil 7'de sirasiyla gösterilmistir.

Tablo. Her gruptaki ortalama tümör boyutu (mmz) Gruplar Tümör alani (mmz) P degeri (ortalama ± sd) Saline(C) 13.5 ± 2.7 Sorafenib (S) 8.2 ± 5.3 P=0.0577 vs C ; 1.2 ± 1.1(35. Gün) 2.0 ± 2.2(49. Gün) ..

TH3424 (5mg/kg) 0.0 ± 0.0 Sekil 6, sekil 7 ve yukaridaki tabloda gösterildigi gibi, pozitif kontrol grubundaki ortalama tümör boyutu, negatif kontrol grubundakinden yaklasik% 39 daha düsüktü, ancak 2 kontrol grubu arasinda istatistiksel olarak anlamli fark yoktu (P = 0.0577). okuma alanlari, negatif kontrol grubundakinden anlamli derecede daha azdi ve güçlü inhibitör etkiler ve belirgin bir doz-etki iliskisi vardi. Bunlarin arasinda floresan görüntüleme okuma alani TH3424 (5mg / kg) grubunda O'di. Bu grupta, 3 kez tedavi sonrasinda doz kesildi; tümör floresan görüntüleme okumasi deneyin sonuna kadar hala 0 idi. Bununla birlikte, TH3424 (2.5 mg/ kg) grubunda, ilaç tedavisi, 3 islemden sonra 1 hafta durduruldu ve daha sonra 3 kez daha tedaviye baslandi. 35. gündeki ortalama flüoresans görüntüleme okuma alani, negatif kontrol grubundakinin yaklasik% 8'inde olan 1.2 ± 1.1 idi ve tedavi sonrasi 49. günde negatif kontrol grubuna kiyasla 2.0 ± 'siydi. Sekil 8, çalismanin sonunda tüm tümörleri göstermektedir ve sekil 9, deney gruplarinin her birindeki tümör agirliginin ortalama degerini göstermektedir.

Her gruptaki ortalama tümör agirligi Gruplar P degeri TH3424 (2.5mg/kg) TH3424 (5mg/kg) Sekil 8, sekil 9 ve yukaridaki tabloda gösterildigi gibi, pozitif kontrol grubunun ortalama tümör agirligi, pozitif kontrol ilacinin (sorafenib), ortotopik HepGZ-GFP insan hepatoselüler karsinoma fare modelinde test edilenler üzerinde engelleyici etkisi oldugunu gösteren negatif kontrol grubununkinden daha düsüktü (P = 0.0159). ve 0 g'di. Hepsi negatif kontrol grubundakinden istatistiksel olarak daha düsüktü. Bunlarin arasinda, kontrol grubunda sirasiyla % 0 ve % 5.2'di. Bu, TH3424'in test edilen dozlarda ortotopik HepGZ-GFP insan hepatosellüler karsinoma fare modelinde çok güçlü bir inhibitör etkiye sahip oldugunu ve ayni zamanda net bir doz-etki iliskisi oldugunu ortaya koymustur.

Tümör IR, asagidaki formülle sonuçlanan nihai ortalama tümör agirliklarina dayanilarak hesaplandi: Her tedavi grubu için IR : NC negatif kontrol grubunu temsil eder PC pozitif kontrol grubu Sorafenib ile tedavi edilen grupta tümör inhibisyon orani %58,7'di (P = 0.0159 vs kontrol ) ve test edilen dozda ortotopik HepGZ-GFP insan hepatoselüler karsinom fare modeli üzerinde güçlü inhibisyon etkisi gösteriyordu. Bununla birlikte, bu grupta, deney farelerinin ortalama vücut agirligi, negatif kontrol grubundakinden istatistiksel olarak daha düsüktü. Test edilen dozajda sorafenib'in uygulanmasiyla deney farelerinde bir miktar toksisite oldugu ileri sürüldü. TH3424(2.5 mg/kg) ve TH3424(5mg/kg) tümör inhibisyon orani, ortotopik HepGZ-GFP insan hepatoselüler karsinoma fare modelinde çok güçlü bir tümör önleyici etki ve açik doz-etki iliskisi göstererek, sirasiyla %948 ve %100 idi. Test edilen TH3424 dozajindaki deney farelerinde belirgin bir toksisite yoktu. Örnek 10. T-HÜcre/i Lösemi Hayvan Mode/lerinde TH3424 eritilerek hazirlandi ve bunlari hizli bir sekilde 379CIik su banyosuna yerlestirdi. Tüm hücreler, 40 ml önceden isitilmis komple ortami olan 50 ml falkon tüpüne aktarildi. Hücreler, 1200 devirde 5 dakika süreyle santrifüje tabi tutuldu. Hücreler, 40 ml RPMI1640 ile yeniden askiya alinmistir. Daha sonra hücreler sayildi. Hücreler, 1200 devirde 5 dakika süreyle santrifüje tabi tutuldu ve 100 uI PBS basina 2 milyon hücreye buz soguklugunda PBS ile yeniden süspanse edildi. Yukarida hazirlanan 2x106 hücre ihtiva eden 100 ul salin, her fareye IV ile enjekte etmek için kullanildi. Numunelerin FACS tüplerine aktarilmasi, insan CD45 FlTC ve izotiplerini tüm örnekler için ilgili tüplere ilave edilmesi ve hücrelerin buz üzerinde 30 dakika inkübe edilmesi yoluyla deney periyodu boyunca haftalik kan için FACS analizi yapildi. Her bir tüpe 2 ml kirmizi kan hücresi lizan tamponu ilave edildi ve karanlikta 30 dakika daha buz üzerinde inkübe edildi. Bütün numuneler, bu islem sirasinda birkaç kez vortekslendi ve numuneler dakika süreyle 1500 devirde 4 ° C'de santrifüj edildi. Süpernatanlar atildi ve 2 ml buz soguklugundaki yikama tamponu her tüpe ilave edildi. Numuneler 5 dakika boyunca 1500 devirde 4 ° C'de santrifüje tabi tutuldu ve bu adimlar tekrar edildi. Hücreler, FACS edinimi için 150 ul yikama tamponu / PBS 'ye yeniden süspanse edildi. Örnekler BD Calibur'da Cell Quest veya Flowjo kullanilarak analiz edildi ve sonuçlar Prism 5.0 kullanilarak analiz edildi.

FACS için kan örnekleri, grup öncesi hücre inokülasyonunun 26, 33, 42. günlerinde toplandi.

Grup örneklerinden sonra, FACS çalisma bitene kadar haftalik olarak yapildi (Gün 50, 57, 64 hücre inokülasyon sonrasi). 10 ll plazma numuneleri, her bir fare için toplandi ve hücre inokülasyonundan her birinden 3 kan smeari yapildi. Numuneler listesi asagida özetlenmistir.

Tablo: Tüm hayvanlar için bitis noktasindaki örnek toplama.

Numune Kaynagi Kullanim Açiklama/ar Kan FACS (insan CD45) Tüm fareler FACS (insan CD45) Tüm fareler Kemik iligi formaline sabitlenmis, parafin içine gömülmüs Her grupta 3 fare FACS (insan CD45) Tüm fareler formaline sabitlenmis, parafin içine gömülmüs Her grupta 3 fare Farelerde vücut agirligi degisikliklerinin sonuçlari Sekil 10'da gösterilmektedir. Tedavi, hücre inokülasyondan sonra 43. günde basladigindan, tedavi sirasinda tespit edilen insan CD45 antikoru FACS grup 2) hücre sonrasi inokülasyonda dozlandi. Gruplamadan sonra tümör yükü büyüme egrisi Sekil 11'de gösterilmektedir. Her bir grubun periferik kandaki insan CD45 + lösemi hücrelerinin yüzdeleri hastalik ilerledikçe artmis ve birinci dozdan sonra 7 günlük grup egrileri düsmüstür (P> 0.05).Ikinci dozlamadan sonra, tedavi grubu (grup 2-4) araç grubundan (grup 1) anlamli derecede düsüktü (P <0.001). Tüm fareler (toplam 4 grup, her grupta 10 fare) dördüncü doz uygulamasindan 6 gün sonra sakrifiye edildi. Saptanan insan CD45 FACS'si için tüm farelerin kan, dalak ve kemik iligi toplanmistir.

Her grupta 3 fare dalagi ve kemigi FFPE için toplandi. Sonlandirma noktasindaki ayrintili veriler ve numuneler listesi Ek 10.3 'te özetlenmistir. Çalisma bitim noktasindaki farelerin periferik kan, dalak ve kemik iligindeki tümör yükü Sekil 12'de gösterilmektedir. Grup 2 'deki kemik iligi hariç, Grup 1'deki kan, dalak ve kemik iligi ile karsilastirildiginda, çok az fark gösterdi (P <0.05) tüm tedavi grubu (gruplar 2-4) anlamli farkliliklar gösterdi (P <0.01). Örnek 10. Tedavi görmemis maymun/arda farmakokinetik ve akut toksisite çalismasi dakikalik intravenöz infüzyon ile hiçbir tedavi görmemis maymunlarda (her bir bilesik için 2 mg/ kg'da gün, 8. gün (ön doz), 15. gün (ön doz), 22. gün ve 28. gün. Klinik gözlem: Çalisma boyunca günlük, toplam 35 gün. Gida tüketimi: Çalisma boyunca günlük, toplam 35 gün. Vücut agirligi ölçümü: Haftalik iki kez, bes hafta.

TK parametreleri asagidaki tablolarda listelenmistir: 2 mg/ kg'da erkek ve disi Sinomolgus maymunlarina 30 dakika IV infüzyon sonrasi TH3423'ün plazma konsantrasyonu Dozaj Zaman noktalari konsantrasyon (ng/mL) Ortalama (saat) erkek_#1 disi_#2 (ng/mL) 2 mg/kg 2 1.03 BQL 1.03 TK . Birim #1- #2 Ortalama parametreleri CL L/saat/kg 2.59 2.61 2.60 AUCIast saat *ng/mL 773 758 766 2 mg/ kg'da Erkek ve disi Sinomolgus maymunlarina 30 dakikalik IV infüzyon sonrasi TH3424'ün plazma konsantrasyonu Dozaj noktalari konsantrasyon (ng/mL) Ortalama TK . Birim #3 #4 Ortalama parametreleri CL L/saat/kg 1.16 1.67 1.42 örnekleme Hayvan ALT AST ALP v-GT TBIL TP ALB BUN Glu Cinsiyet _ ...

Kimligi süresi (U/L) (U/l) (U/L) (U/L) (iiM) (8/L) (g/L) (PM) (mM) Serum kimyasi asagidaki tabloda gösterilmektedir: Cinsi et Hayvan Örnekleme TC TG Ca P CK GLB CREA y Kimligi Süresi (mM) (mmoI/L) (mmoI/I.) (mmoI/L) (U/L) (g/L) (uM) TH3423 Cinsi et Hayvan Örnekleme A /G Na K Cl y Kimligi Süresi (mmol/L) (mmoI/L) (mmoI/L) TH3423 Hematoloji verileri asagidaki tabloda gösterilmektedir: Cinsiyet , ___ __ _ (x Kimligi Suresi /Ll (%) (%) (%) (x TH3423 Örnekleme Cinsi et Hayvan abs_monos abs_eos abs_basos (318022 HGB HCT MCV MCH y Kimligi .. . (xlog/L) (xlog/Ll (xl09/ L) (3/ L) (%) (fL) (ps) Suresi /L) Örnekleme RDW- RDW- PLT . . Hayvan MCHC 9 MPV PCT Cinsiyet Kimli“i ( /Ll CV SD (xlO (fL) PDW (W) g Süresi g (%) 00 /L) Vücut agirligi degisiklikleri asagidaki tabloda listelenmistir: Grup No. Hayvan Kimligi 1. Gün 4. Gün 8. Gün 11. Gün Grup 1 TH3423 Grup 2 TH3424 Mevcut bulus, spesifik olarak belirli yönleri, uygulamalari ve istege bagli özellikleri, tadilleri, gelistirmeleri ve bu yönlerin ve uygulamalarin çesitlendirilmesi ile ifsa edilmesine karsin, ve istege bagli özelliklerin bu alanda uzman olanlar tarafindan basvurulabilecegi ve bu tür degisikliklerin, gelistirmelerin ve varyasyonlarin bu açiklamanin kapsami dahilinde dikkate alinacagi seklinde anlasilmalidir.

Buluslar burada genel ve kapsamli olarak tarif edilmistir. Genel açiklamada yer alan daha dar türlerin ve alt-jenerik gruplarin her biri bulusun bir parçasini olusturmaktadir. Buna ek olarak, bulusun özelliklerinin veya görünümlerinin Markush gruplari açisindan tarif edildigi durumlarda, teknik alanda yetkin kisiler bulusun ayni zamanda Markush grubunun üyelerinin herhangi bir bireysel üyesi veya alt grubu açisindan tarif edildigini bilecektir.

Claims (17)

ISTEMLER

1. Bilesim (R) -1- (3- (3-N, N-dimetilaminokarbonil) fenoksil -4-nitrofenil) -1-etil-N, N'-bis (etilen) fosforamidat: veya bunlarin izotopik varyanti, solvati veya hidratidir.

2. Bilesik (S) -1- (3- (3-N, N-dimetilaminokarbonil) fenoksil -4-nitr0fenil) -1-etiI-N, N'-bis (etilen) fosforamidat: O 5 î3| veya bunun izotopik bir varyanti veya farmasötik olarak kabul edilebilir bir solvati veya hidratidir.

3. Istem 1 veya 2'ye göre bilesik olup, burada bilesik en az %80 bir enantiomerik fazlalik içerir.

4. Istem 3'e göre bilesik olup, burada %90'dan az olmayan bir enantiomerik fazlaliga sahiptir.

5. Istem 4'e göre bilesik olup, burada %95'ten az olmayan enantiomerik fazlaliga sahiptir. 15

6. Istem 1 veya 2'ye göre bilesik olup, burada bilesik esasiyla saftir.

7. Istem 6' ya ait bilesik olup, burada bilesik, en az %50 safliga sahiptir.

8. Istem 7' ye göre bilesik olup, burada bilesik en azindan %90 safliga sahiptir.

9. Istem 1 veya 2'ye göre bilesik ve farmasötik olarak kabul edilebilir eksipiyandan olusan farmasötik bir bilesimdir.

10. Bir denekte proliferatif hastaligin bir veya daha fazla semptomunun tedavi edilmesi veya hafifletilmesi maksadiyla istem 1 veya Z'ye göre bir bilesigin hastaya verilmesini içeren bir yöntemdir.

11. Istem 10' a göre yöntem olup, burada hastalik karaciger kanseri, hepatoselüler karsinom (HCC), küçük hücreli disi akciger kanseri, melanoma, prostat kanseri, gögüs kanseri, lösemi, özofagus kanseri, 5 böbrek kanseri, gastrik kanser, kolon kanseri, beyin kanseri, mesane kanseri, rahim agzi kanseri, yumurtalik kanseri, bas-boyun kanseri, endometriyal kanser, pankreas kanseri, sarkom kanseri ve rektal kanserini içeren kanserdir.

12. Hücre ile istem 1 veya 2 'ye göre olan bilesigin temas ettirilmesini içeren, hücre büyümesini inhibe etmeye yönelik bir yöntemdir. 10

13. Istem 12' ye göre yöntem olup, burada hücre kanserli bir hücredir.

14. Formül I'e ait bilesigin hazirlanmasi için islem: formül ll' ye ait bir bilesikle: 15 OZN POCI3 ve HzNCHzCHzLZ veya bunun bir tuzunun formül III bilesigini verecek sekilde temas ettirilmesi, 20 burada L1 ve L2, bagimsiz olarak ayrilan gruptur ve formül III bilesigini formül I bilesigine dönüstürür, X; F, CI, Br, MeSOB'tür.

15. Istem 1 'in bilesiminin rasematinin enantiomerlerinden birine çözünmesi için veya a) formül (I) adi geçen bilesigin herhangi bir enantiyomerik fazlaligi ile zenginlestirilmesine yönelik bir islem olup, burada 1- (3- (3-N, N-dîmethilaminokarbonil) fenoksi-4-nitrofenil) -1-etiI-N, N'-bis (etilen) fosforamidatin rasemik eantiomerik olarak zenginlestirilmis karisimi, sabit faz ve seyyar faz içeren siral kromatografi ile (S) -1- (3- (3-N, N-dimethilaminokarbonil) fenoksi-4-nitr0fenil) -1-etil-N, N'-bis (etilen) fosforamidat ve (R) -1- (3- (3-N, N-dimetilaminokarbonil) fenoksi] -4-nitrofenil) -1-etil-N, N'-bis (etilen) fosforamidat olarak iki enantiomere ayrilir, burada duragan faz, fonksiyonellestirilmis polisakaritle emdirilmis silika jel ihtiva eder ve mobil faz alkol ve bir baska çözücü içerir.

16. Istem 15'e ait bir islem olup, burada alkol metanoldür.

17. Istem 15'e ait bir islem olup, burada bir baska çözücü COz'dir.