TH17821U - ไพรเมอร์สำหรับตรวจยีนอิมมูโนโดมิเนนท์ สแตฟิโลคอคคอล แอนติเจนเอ (Immunodominant staphylococcal antigen A (isaA) gene) สำหรับเชื้อสแตฟิโลคอคคัส ออเรียส ที่ดื้อต่อยาเมธิซิลลิน (methicillin-resistant Staphylococcus aureus) ด้วยเทคนิคเรียลไทม์พีซีอาร์ (real-time PCR) - Google Patents

Abstract

------14/06/2561------(OCR) หน้า 1 ของจำนวน 1 หน้า บทสรุปการประดิษฐ์ การประดิษฐ์นี้เป็นการประดิษฐ์ไพรเมอร์สำหรับตรวจยีนอิมมูโนโดมิเนนท์ สแตฟิโลคอคคอล แอนติเจน เอ (Immunodominant staphylococcal antigen A (isoA) gene) สำหรับเชื้อสแตฟิโลคอคคัส ออเรียส ทีดือต่อยาเมธิซิลสิน (methicillin-resistant Staphylococcus oureus) ด้วยเทคนิคเรียลไทม์พีซี อาร์ (real-time PCR) ประกอบด้วยไพรเมอร์ (primer) จำนวน 2 เส้น ซึ่งสามารถจับลำดับเบสของยีน isoA บนดีเอ็นเอเป้าหมายได้อย่างจำเพาะ ไข้ผสมกับนํ้ายาสำหรับผสมทดสอบกับคู่ไพรเมอร์ โดยผสมกับตัวอย่าง สารพันธุกรรม หรือดีเอ็นเอสายคู่สม (complementary DNA หรือ cDNA) จากสารพันธุกรรมอาร์เอ็นเอ (RNA) ที่แยกสกัดจากตัวอย่างเชื้อ แล้วทำการเพิ่มขยายปริมาณสารพันธุกรรมด้วยเทคนิคเรียลไทม์พีซิอาร์ (real-time PCR) สำหรับการประดิษฐ์นี้สามารถนำมาใช้ในการตรวจวิเคราะห์เชิงคุณภาพและเชิงปริมาณ สำหรับในการศึกษาการแสดงออกของยีนที่ให้ผลการศึกษาที่ถูกต้องแม่นยำ นำเชื่อถือ มีความไวและ ความจำเพาะสูง สามารถรายงานผลได้ในเวลาอันรวดเร็ว ------------ หน้า 1 ของจำนวน 1 หน้า บทสรุปการประดิษฐ์ การประดิษฐ์นี้เปีนการประดิษฐ์ไพรเมอร์และชุดนํ้ายาสำหรับตรวจยีนอิมมูโนโดมิเนนท์ สแตฟิโลคอค คอล แอนติเจน เอ (Immunodominant staphylococcal antigen A (1isoA) gene) สำหรับเชื้อสแตฟิโล คอคคัส ออเรียส ที่ดื้อต่อยาเมธิซิลสิน (ทาethicillin-resistant Staphylococcus aureus) ด้วยเทคนิค 5 เรียลไทม์พีซีอาร์ (real-time PCR) ประกอบด้วยไพรเมอร์ (primer) จำนวน 2 เส้น ซึ่งสามารถจับลำดับเบส ของยีน isaA บนดีเอ็นเอเป้าหมายได้อย่างจำเพาะ ชุดนํ้ายาสำหรับผสมทดสอบกับคู่ไพรเมอริ โดยผสมกับ ตัวอย่างสารพันธุกรรม หรือดีเอ็นเอสายคู่สม (complementary DNA หรือ cDNA) จากสารพันธุกรรมอาร์ เอ็นเอ (RNA) ที่แยกสกัดจากตัวอย่างเชื้อ แล้วทำการเพิ่มขยายปริมาณสารพันธุกรรมด้วยเทคนิคเรืยลไทม์พีซี อาร์ (real-time PCR) สำหรับการประดิษฐ์นี้สามารถนำมาใฃ้ในการตรวจวิเคราะห์เซิงคุณภาพและเซิงปริมาณ 10 สำหรับในการศึกษาการแสดงออกของยีนที่ให้ผลการศึกษาที่ถูกต้องแม่นยำ น่าเชื่อถือ มีความไวและ ความจำเพาะสูง สามารถรายงานผลได้ในเวลาอันรวดเร็ว

Claims (4)

แก้ไข 26/10/2561 ข้อถือสิทธิ 1. ไพรเมอร์สำหรับตรวจยีนอิมมูโนโดมิเนนท์ สแตฟิโลคอคคอล แอนติเจน เอ (Immunodominant staphylococcal antigen A (isaA) gene) สำหรับเชื้อสแตฟิโลคอคคัส ออเรียส ที่ดื้อต่อยาเมธิซิลลิน (methicillin-resistant Staphylococcus aureus) ด้วยเทคนิคเรียลไทม์พีซีอาร์ (real-time PCR) ซึ่ง ประกอบด้วย คู่ไพรเมอร์ (primers) ที่ใช้เพิ่มสารพันธุกรรม สำหรับยีนอิมมูโนโดมิเนนท์ สแตฟิโลคอคคอล แอนติเจน เอ (Immunodominant staphylococcal antigen A (isaA) gene) จำนวน 2 เส้น ที่มีลำดับเบส ดังนี้ ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) เป็น 5'-GCA GTA TTA CCA TTG CTT A-3' รีเวิร์สไพรเมอร์ (reverse primer) เป็น 5'-GCA CAA TCA AGT AAC TCA-3' ------- ------14/06/2561------(OCR) หน้า 1 ของจำนวน 2 หน้า ข้อถือสิทธิ 1. ไพรเมอร์สำหรับตรวจยีนอิมมูโนโดมิเนนท์ สแตฟิโลคอคคอล แอนติเจน เอ (Immunodominant staphylococcal antigen A (isaA) gene) สำหรับเชื้อสแตฟิโลคอคคัส ออเรียส ที่ดื้อต่อยาเมธิซิลลิน (methicillin-resistant Staphylococcus aureus) ด้วยเทคนิคเรียลไทม์พีซีอาร์ (real-time PCR) ซึ่ง ประกอบด้วย คู่ไพรเมอร์ (primers) ที่ใช้เพิ่มสารพันธุกรรม สำหรับยีนอิมมูโนโดมิเนนท์ สแตฟิโลคอคคอล แอนติเจน เอ (Immunodominant staphylococcal antigen A (isaA) gene) จำนวน 2 เส้น ที่มีลำดับเบส ดังนี้ ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (forward primer) เป็น 5’-GCA GTA TTA CCA TTG CTT A-3’ รีเวิร์สไพรเมอร์ (reverse primer) เป็น 5’-GCA CAA TCA AGT AAC TCA-3’ 2.ไพรเมอร์สำหรับตรวจยีนอิมมูโนโดมิเนนท์ สแตฟิโลคอคคอล แอนติเจน เอ (Immunodominant staphylococcal antigen A (isaA) gene) สำหรับเชื้อสแตฟิโลคอคดัส ออเรียส ที่ดื้อต่อยาเมธิซิลลิน (methicillin-resistant Staphylococcus aureus) ด้วยเทคนิคเรียลไทม์พีซีอาร์ (real-time PCR) ตามข้อ ถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่ง ปริมาณไพรเมอร์และน้ำยาที่เหมาะสมที่สุดในการทดสอบและทำปฏิกิริยา คือ คู่ไพรเมอร์ (primers) สำหรับยีนอิมมูโนโดมิเนนท์ สแตฟิโลคอคคอล แอนติเจน เอ (Immunodominant staphylococcal antigen A {isaA) gene) ที่ไพรเมอร์แต่ละเส้นมีความเข้มข้น 4 ไม โครโมลาร์ปริมาตรอย่างละ 1.0ไมโครลิตร คู่ไพรเมอร์ (primers) สำหรับยีน 16S rRNA ที่ไพรเมอร์แต่ละเส้นมีความเข้มข้น 4ไมโครโมลาร์ ปริมาตรอย่างละ 1.0ไมโครลิตร น้ำยาพีซีอาร์รีแอกชั่นมิกซ์ (PCR reaction mix) ปริมาตร 20.0 ไมโครลิตร (สำหรับทำปฏิกิริยากับคู่ ไพรเมอร์ (primers) สำหรับยีน isaA และคู่ไพรเมอร์ (primers) สำหรับยีน 16S rRNA อย่างละ 10.0 ไมโครลิตร) น้ำกลั่นบริสุทธิ์ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ปริมาตร 12.0 ไมโครลิตร (สำหรับทำ ปฏิกิริยากับคู่ไพรเมอร์ (primers) สำหรับยีน isaA และคู่ไพรเมอร์ (primers) สำหรับยีน 16S rRNA อย่างละ 6.0 ไมโครลิตร) 3.ไพรเมอร์สำหรับตรวจยีนอิมมูโนโดมิเนนท์ สแตฟิโลคอคคอล แอนติเจน เอ (Immunodominant staphylococcal antigen A (isaA) gene) สำหรับเชื้อสแตฟิโลคอคคัส ออเรียส ที่ดื้อต่อยาเมธิซิลลิน (methicillin-resistant Staphylococcus aureus) ด้วยเทคนิคเรียลไทม์พีซีอาร์ (real-time PCR) ตามข้อ ถือสิทธิที่ 1 หรือ 2 ที่ซึ่ง การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมและตรวจสอบผลผลิตพีซีอาร์ด้วยเครื่องเรียลไทม์พีซี อาร์ (real-time machine) มีเงื่อนไขของการตั้งโปรแกรมอุณหภูมิ ดังนี้ ขั้นที่ 1 โปรแกรมพรีดีเนเจอร์ (pre-denature) ใช้อุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส นาน 10 นาที หน้า 2 ของจำนวน 2 หน้า ขั้นที่ 2โปรแกรมแอมพลิฟิเคชั่น (amplification) ประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอ เรชั่น (denaturation) ใช้อุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส นาน 20 วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (annealing) ใช้ อุณหภูมิ 53 องศาเซลเซียส นาน 20 วินาที และขั้นตอนเอ็กเท็นชั่น (extension) ใช้อุณหภูมิ 72 องศา เซลเซียส นาน 30 วินาที ตรวจวัดสัญญาณการเรืองแสง (fluorescence signal) หนึ่งครั้ง ทำซํ้าทั้งหมด 45 รอบ (cycles) โดยกำหนดอัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (temperature transition rate) เป็น 20 องศา เซลเซียสต่อวินาที ขั้นที่ 3 โปรแกรมเมลติ้งเคิฟ (melting curve) ประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ การเพิ่มอุณหภูมิถึง 95 องศาเซลเซียส นาน 15 วินาที แล้วลดอุณหภูมิถึง 60 องศาเซลเซียส นาน 60 วินาที โดยใช้อัตราการ เปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียสต่อวินาที จากนั้นเพิ่มอุณหภูมิขึ้นจนถึง 95 องศาเซลเซียส นาน 15 วินาที โดยใช้อัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ 0.1 องศาเซลเซียสต่อวินาที และตรวจวัดสัญญาณการเรืองแสง อย่างต่อเนื่อง ขั้นที่ 4โปรแกรมคูลลิ่ง (cooling) ลดอุณหภูมิลงถึง 40 องศาเซลเซียส เน้นเวลา 30วินาทีโดยใช้ อัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียสต่อวินาที ------------ หน้า 1 ของจำนวน 2 หน้า ข้อถือสิทธิ

1. ไพรเมอร์และขุดน้ำยาสำหรับตรวจยีนอิมมูโนโดมิเนนท์ สแตทิเโลคอคคอล แอนติเจน เอ (Immunodominant staphylococcal antigen A (isaA) gene) สำหรับเซือสแตฟิโลคอคคัส ออนรียส ที่ดือ ต่อยาเมธิซิลสิน (methicillin-resistant Staphylococcus aureus) ด้วยเทคนิคเรียลไทม์พีซีอาร์ (real-time PCR) ซึ่งประกอบด้วย คู่ไพรเมอร์ (primers) ที่ใข้เพิ่มสารพันธุกรรม สำหรับยีนอิมมูโนโดมิเนนท์ สแตฟิโลคอคคอล แอนติเจน เอ (Immunodominant staphylococcal antigen A {isaA) gene) จำนวน 2 เส้น ที่มีลำดับเบส ดังนี้ ฟอร์เวิร์ด'ไพรเมอร์ (forward primer) เป็น 5’-GCA GTA TTA CCA TTG CTT A-3’ รีเวิร์สไพรเมอร์ (reverse primer) เป็น 5’-GCA CAA TCA AGT AAC TCA-3’

2. ไพรเมอร์และขุดน้ำยาสำหรับตรวจยีนอิมมูโนโดมิเนนท์ สแตฟิโลคอคคอล แอนติเจน เอ (Immunodominant staphylococcal antigen A {isaA) gene) สำหรับเซือสแตฟิโลคอคดัส ออเรียส ทีดือ ต่อยาเมธิซิลสิน (methicillin-resistant Staphylococcus aureus) ด้วยเทคนิคเรียล1ไทม์พีซีอาร์ (real-time PCR) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่ง สามารถประกอบเพิ่มเติมด้วย ขุดน้ำยาสำหรับตรวจยีนอิมมูโนโดมิเนนท์ สแต พัโลคอคคอล แอนติเจน เอ (Immunodominant staphylococcal antigen A {isaA) gene) สำหรับเซือ สแตทีโลคอคดัส ออเรียส ที่ดื้อต่อยาเมธิซิลสิน (methicillin-resistant Staphylococcus aureus) ซึ่ง ประกอบด้วย ก. คู่ไพรเมอร์ (primers) สำหรับยีน 16S rRNA ซึ่งเปีนยีนที่ใข้โนการปรับค่าทำให้เป็นบรรทัดฐาน (normalize) จำนวน 2 เส้น ที่มีลำดับเบสดังนี้ ฟอร์เวิร์ด'ไพรเมอร์ (forward primer) เป็น 5’-GCC TAA TAC ATG CAA GTC-3’ รีเวิร์สไพรเมอร์ (reverse primer) เป็น 5’-CCA GTC TTA TAG GTA GGT TA-3’ ข. น้ำยาพีซีอาร์รีแอกซั่นมิกซ์ (PCR reaction mix) ซึ่งเป็นยี่ห้อทางการค้าคือ พาวร์เวอร์ไซเบอร์ กรีนพีซีอาร์มาสเตอร์มิกซ์ {Power SYBR? Green PCR Master Mix) ค. น้ำกลั่นบริสุทธี้ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ที่มีความบริสุทธึ๋ระดับพีซีอาร์ (PCR grade) ใช้สำหรับปรับปริมาตรน้ำยาทดสอบให้ได้ปริมาตรสุดท้าย

3. ไพรเมอร์และขุดนี้ายาสำหรับตรวจยีนอิมมูโนโดมิเนนท์ สแตท้โลคอคคอล แอนติเจน เอ (Immunodominant staphylococcal antigen A {isaA) gene) สำหรับเซือสแตพัโลคอคดัส ออเรียส ทีดือ ต่อยาเมธิซิลสิน (methicillin-resistant Staphylococcus aureus) ด้วยเทคนิคเรียลไทม์พีซีอาร์ (real-time PCR) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 หรือ 2 ที่ซึ่ง ปริมาณไพรเมอร์และน้ำยาที่เหมาะสมที่สุดในการทดสอบและทำ ปฏิกิริยา คือ หน้า 2 ของจำนวน 2 หน้า คู่ไพรเมอร์ (primers) สำหรับยีนอิมมูโนโดมิเนนท์ สแตทิเโลคอคคอล แอนติเจน เอ (Immunodominant staphylococcal antigen A (isoA) gene) ทีไพรเมอร์แต,ละเส้นมีความเข้มข้น 4 ไม โครโมลาร์ปริมาตรอย่างละ 1.0 ไมโครลิตร คู่ไพรเมอร์ (primers) สำหรับยีน 16S rRNA ที่ไพรเมอร์แต่ละเส้นมีความเข้มข้น 4 ไมโครโมลาร์ ปริมาตรอย่างละ 1.0ไมโครลิตร น้ำยาพีซีอาร์รืแอกขั้นมิกซ์ (PCR reaction mix) ปริมาตร 20.0 ไมโครลิตร (สำหรับทำปฏิกิริยากับคู่ ไพรเมอร์ (primers) สำหรับยีน isoA และคู่ไพรเมอร์ (primers) สำหรับยีน 16S rRNA อย่างละ 10.0 ไมโครลิตร) น้ำกลั่นบริสุทธี้ปราศจากอิออน (deionized distilled water) ปริมาตร 12.0ไมโครลิตร(สำหรับทำ ปฏิกิริยากับคู่ไพรเมอร์ (primers) สำหรับยีน isoA และคู่ไพรเมอร์ (primers) สำหรับยีน 16S rRNA อย่างละ 6.0 ไมโครลิตร)

4. ไพรเมอร์และขุดน้ำยาสำหรับตรวจยีนอิมมูโนโดมิเนนที สแตทิเโลคอคคอล แอนติเจน เอ (Immunodominant staphylococcal antigen A {isoA) gene) สำหรับเชือสแตทิเโลคอคคัล ออเรียส ทีดือ ต่อยาเมธิซิลลิน (ทาethicillin-resistant Staphylococcus aureus) ด้วยเทคนิคเรียล'ไทม์พีซีอาร์ (real-time PCR) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 - 3 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่ง การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมและตรวจสอบผลผลิตพีซีอาร์ ด้วยเครื่องเรียลไทม์พีซีอาร์ (real-time machine) มีเงื่อนไขของการตั้งโปรแกรมอุณหภูมิ ดังนี้ ขั้นที่ 1 โปรแกรมพรีดีเนเจอร์ (pre-denature) ใช้อุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส นาน 10 นาที ขั้นที่ 2 โปรแกรมแอมพลิทิแคขั้น (amplification) ประกอบด้วย 3ขั้นตอน คือ ขั้นตอนดีแนทเจอ เรซั่น (denaturation) ใช้อุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส นาน 20 วินาที ขั้นตอนแอนเนียลลิง (annealing) ใช้ อุณหภูมิ 53 องศาเซลเซียส นาน 20 วินาที และขั้นตอนเอ็กเท็นขั้น (extension) ใช้อุณหภูมิ 72 องศา เซลเซียส นาน 30 วินาที ตรวจวัดสัญญาณการเรืองแสง (fluorescence signal) หนึ่งครั้ง ทำซํ้าทั้งหมด 45 รอบ (cycles) โดยกำหนดอัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ (temperature transition rate) เป็น 20 องศา เซลเซียสต่อวินาที ขั้นที่ 3 โปรแกรมเมลติ้งเคิฟ (melting curve) ประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ การเพิ่มอุณหภูมิถึง 95 องศาเซลเซียส นาน 15 วินาที แล้วลดอุณหภูมิถึง 60 องศาเซลเซียส นาน 60 วินาที โดยใช้อัตราการ เปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียสต่อวินาที จากนั้นเพิ่มอุณหภูมิขึ้นจนถึง 95 องศาเซลเซียส นาน 15 วินาที โดยใช้อัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ 0.1 องศาเซลเซียสต่อวินาที และตรวจวัดสัญญาณการเรืองแสง อย่างต่อเนื่อง ขั้นที่ 4 โปรแกรมคูลลิ่ง (cooling) ลดอุณหภูมิลงถึง 40 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 วินาที โดยใช้ 30 อัตราการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียสต่อวินาที