(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОКСИПРОИЗВОДНЫХ ИНДОЛИЛ З-УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ Изобретение относитс к микробиопо- гической промышленности, а именно к спо собу получени оксипроизводных инцолил-3-уксусиой кислоты (ИУК), 5-Оксииндолил-З-уксусную кислоту {5НЭН-ИУК) используют в медицине в качестве тест-препарата дл диагностики нарушений метаболизма серотонина при различных заболевани х центральной нер& ной системы. Кроме того, 5-ОН-ИУК и 4-сжсиивдолил-З-уксусна кислота (4-ОН -ИУК) могут быть использованы в качестве полупродуктов Дл синтеза биол(гически активнь1х соединений, таких как серотонин, буфотенин, Мексамин, псилошш и др. Известен способ получени оксипроиз- водных ИУК путем микробиологичеокой трансформации. В качестве трансформирующей культуры используют грибы Asperq KEuS nitjjer . Используемые штаммы позвол ют проводить трансформацию только с низкой исходной концентрацией ИУК 1 Недостатками данного способа вл ютс НИЗКИЙ оксипроюводвых (25%) и длительность процесса траасформаайв (48ч).. Известен также способ окси« производных индолил-З-уксуснойкиспоГы, предусматривающий аэробное вырашвванве т инсформируютаей культуры AspercjiCe /s nicker ИБФМ F-212 на питательной среде, содержащей глюкозу в кагчестве источника углерода, и минеральные coim, отделение мицели с последующим его использованием дл микробнологнческой трансформации иидолил-З-уксусной киспоты . Выращивание ведут- , что соответствует середине логари||мшеской фазы роста гриба. Полученный Kfвцелий может быть использован дл трансформации один раз, после чего пшроксил рующа активность культуры резко свн жаетс . В результате Трансформации, котора проходит за 18-24 ч, образуетс 6О% 5-окси-ИУК и 40% 4-сжси-ИУК 2 Недостатком этого способа вл етс невысокий выход оксипроизводных ИУК Q на единицу биомассы трансформирующей культуры, что св зано с однократностью использовани дл трансформации мицели I Asperc iCEus nicjer ИБФМ F-212. Цель изобретени - увеличение выхода , конечных продуктов, на единицу биомассы трансформирующей культуры. Указанна цель достигаетс тем, что согласно способу получени оксипроизвод Hbix индоли;ь-3-уксусной кислоты, предусматривающему аэробное нырйщивание культуры flepercglEEus niofer ИБФМ П-21 на питательной среде, содержащей глюкозу в качестве источника углерода и М№ нёральные соли, отделение мицели с последующим его использованием дл микро биологической трансформации индолил-3-уксусной кислоты, предложено выращивание культуры вести до конца первой трети логари(}мической фазы роста крть- туры, при этом в питательную .среду вводить 2-4% белково-витаминного концентрата , а мицелий использовать дл микробиологической трансформации многократно . Способ осуществл ют следующим образом . Культуру / spErt iEEus ИБФМ F-212 выращивают на синтетической среде , содержащей белково-витаминный ковн центрат, до конца первой трети логарифмической фазы роста культуры; после отделени мицели от культуральной жидкости и отмывани его стерильной водой ресуспевдируют .в буферном растворе, добавл ют раствор ИУК в этаноле. Гидроксипирование проходит полностью за 8-12ч, количество 5-окси-ИУК в реакционной среде составл ет 5О-6О%, 4-окси-ИУК 40-50% от исходного количества ИУК. Затем мицелий отмывают и стадию гидрокс1шировани повтор ют многократно , добавл дл каждой трансфор мации раствор ИУК в этаноле. Пример. Культуру AsperciriCKus nicrer ИБФМ F-212 поддерживают на скошенном сусло-агаре. Колбы засевают суспензией спор, полученной смывом спор со скощенного сусло-агара стерильной водопроводной водой. Культуру выращивают в колбах емкостью 750 мл с 150мл среды следующего состава, г/л: глюкоза 15,0; БВК 3,0; Fe 5О4-7Н2О О,ОО5;. КСе О,5; 0,5; К2НРО4 1,0; (NH4)2HPO4 1,0; СаСО 3 3,0 на качалке 220 об/мин, при 28°С в течение 24ч. Полученной культурой в объеме 10% засевают инокул тор емкостью ЗО л с 20 л питательной среды того же состава и выSS ращивают инокуп т в течение 24 ч при леремещивании ЗОО об/мин, расходе воз духа 0,6 об/1 об, температуре . Выросшей культурой в объеме 20% засевают ферментер объемом 100 л, 7О л питательной среды того же состава. Выращивание трансформирующей культуры провод т при , при перемешивании 500 об/мин (pOg - 75%). Через 12ч роста мицелий отдел ют от среды, промывают стерильной водопроводной водой и ресуспендируют в 70 л стерильного 1/15 М фосфатного буфера рН 5,5 (из расчета 30 г влажного мицели на 1 - л буфера). Дл трансформации внос т раотвор ИУК в этаноле (35г в 250мл этанола ) из расчета 0,5 г/л. Процесс гфовод т при 28°С и перемешивании 500 об/мин. Гидроксилирование полностью проходит за 1Оч, по окончании трансформации количество 5-ОН-ИУК составл ет 57%; 4-ОН-ИУК 43% от исходного количества ИУК. Мимелнй после трансформации отмывают стерильной водой и вновь используют дл трансформации индолигь-3-уксусной кислоты (из расчета О,5 г/л). Гидроксилирование полностью проходит за 12ч, количество 5-ОН-ИУК составл ет 5О% и 4-ОН-ИУК 5О%. Мицелий после проведени второй трансформации отмывают стерильной водой и Испол1:дуют дл проведе ш третьей трансформации . Количество 5-ОН-ИУК 56% и 4-ОН-ИУК 44% через 15ч трансформации. . После четвертого использовани гидроксилирующа активность значительно падает и составл ет 20% от первоначальной . . Контроль за ход см трансформации осуществл ют методом тонкослойной хроматографии на пластинах S- 6ufo€ UV254 хроматографическую пластинку нанос т . полосой культуральную жидкость (из расче,та 2О мкг вещества). Разделение продуктов трансформации провод т в системе; изопропанол-бензол кони. УНз (4:1:: :1 об/об). Хроматограммы просматривают в УФ свете. Дл количественного определени используют спектрофотомет- рический метод. Оптическа плотность элюированных этанолом продуктов при Лтат 278 ммк (5-ОН-ИУК) и 269 (4-ОН-ИУК). Количество ИУК и оксипроизводных определ ют по заранее построенным калибровочным кривым. Таким образом, описанный способ по с1иввеншо с известным позвол ет увеличить выход оксипро из водных ИУК на единицу биомассы трансформирующей куль-(54) METHOD FOR PRODUCING oxyderivatives H indol-ACETIC ACID The invention relates to mikrobiopo- cal industry, namely to obtain spo soba oxyderivatives intsolil-3-vinegar acid (IAA), 5-hydroxyindole-W-acetic acid {5NEN-IAA) is used in medicine as a test drug for diagnosing disorders of serotonin metabolism in various diseases of the central nerve & Noah system. In addition, 5-OH-IAA and 4-szhisivdolil-Z-acetic acid (4-OH-IAA) can be used as intermediates for the synthesis of biol (gically active compounds such as serotonin, bufotenin, Mexamin, psillosh and others. A known method for producing hydroxy derivatives of IAA by microbiological transformation. Asperq KEuS nitjjer mushrooms are used as a transforming culture. The strains used allow transformation only with a low initial concentration of IAA 1. The disadvantages of this method are low LOW oxygenated (25%) and Call duration traasformaayv process (48h) .. It is also known oxy "derivatives of indolyl-W-uksusnoykispoGy comprising aerobic culture vyrashvvanve m insformiruyutaey AspercjiCe / s nicker IBPM F-212 on a nutrient medium containing glucose kagchestve carbon source and mineral coim, separation Mycelium followed by its use for the microbological transformation of idolyl-3-acetic acid. The cultivation of the lead-, which corresponds to the middle of the logar || The resulting Kf aim can be used to transform once, after which the piercing activity of the culture abruptly collapses. As a result of the Transformation, which takes 18-24 hours, 6O% 5-hydroxy-IAA and 40% 4-squeeze-IAA 2 are formed. The disadvantage of this method is the low yield of hydroxy derivatives of IAA Q per unit biomass of the transforming culture, which is associated with single use for transformation of mycelium I Asperc iCEus nicjer IBPM F-212. The purpose of the invention is to increase the yield of the final products per unit of biomass of the transforming culture. This goal is achieved by the fact that, according to the method for producing oxy-production of Hbix, indoli; 3-acetic acid, which provides for aerobic diving of the culture of flepercglEEus niofer IBPM P-21 on a nutrient medium containing glucose as a carbon source and MNH, salt, separation of the micelle, followed by using it for micro biological transformation of indolyl-3-acetic acid, it has been proposed to cultivate the culture until the end of the first third of the logarians (} the growth phase of the cream, while introducing 2–4% protein-protein into the nutrient medium the amine concentrate and the mycelium to be used for microbiological transformation multiple times. The method is carried out as follows: Culture / spErt iEEus IBFM F-212 is grown on synthetic medium containing protein-vitamin forn centrate until the end of the first third of the logarithmic growth phase of the culture; after separation of the mycelium from the culture fluid and washing it with sterile water are resuspended. In a buffer solution, a solution of IAA in ethanol is added. Hydroxyping takes place completely in 8-12 hours, the amount of 5-hydroxy-IAA in the reaction medium is 5 0-6%, 4-hydroxy-IAA 40-50% of the initial amount of IAA. Then, the mycelium is washed and the hydroxy expansion step is repeated several times, adding a solution of IAA in ethanol for each transformation. Example. Culture AsperciriCKus nicrer IBFM F-212 support on beveled wort agar. The flasks are inoculated with a spore suspension obtained by flushing the spores from the wort agar with sterile tap water. The culture is grown in 750 ml flasks with 150 ml of medium of the following composition, g / l: glucose 15.0; BVK 3.0; Fe 5О4-7Н2О О, ОО5; КСе О, 5; 0.5; K2HPO4 1.0; (NH4) 2HPO4 1.0; CaCO 3 3.0 on the rocking chair 220 rpm, at 28 ° C for 24 hours. The obtained culture in a volume of 10% is inoculated with an inoculum with a capacity of 30 liters with a 20 l nutrient medium of the same composition, and the inoculum is inoculated for 24 hours while lengthening the ZOO rpm, air consumption 0.6 rev / 1 rev, temperature. The grown culture in the amount of 20% seeded a fermenter with a volume of 100 l, 7O l of nutrient medium of the same composition. Growing a transforming culture is carried out at, with stirring, 500 rpm (pOg - 75%). After 12 hours of growth, the mycelium is separated from the medium, washed with sterile tap water and resuspended in 70 l of sterile 1/15 M phosphate buffer pH 5.5 (from 30 g of wet mycelium per 1 - l buffer). For the transformation, IOK is used in ethanol (35 g in 250 ml of ethanol) at the rate of 0.5 g / l. The process is guided at 28 ° C and stirred at 500 rpm. Hydroxylation is completely completed in 1Oh; at the end of the transformation, the amount of 5-OH-IAA is 57%; 4-HE-IAA 43% of the original amount of IAA. After transformation, the mimelny is washed with sterile water and used again for the transformation of indolig-3-acetic acid (at the rate of 0, 5 g / l). Hydroxylation takes place completely in 12 hours, the amount of 5-OH-IAA is 5O% and 4-OH-IAA 5O%. The mycelium after the second transformation is washed with sterile water and Use1: is blown to perform the third transformation. The amount of 5-HE-IUK is 56% and 4-ON-IUK is 44% after 15 h of transformation. . After the fourth use, the hydroxylation activity drops significantly and is 20% of the original. . Monitoring the progress of the cm transformation is carried out by thin layer chromatography on S-6ufo-UV254 plates and a chromatographic plate is applied. strip culture liquid (from the calculation, that 2O mkg substances). The separation of the transformation products is carried out in the system; isopropanol-benzene horses. UNS (4: 1 ::: 1 v / v). Chromatograms are viewed under UV light. A spectrophotometric method is used for quantification. Optical density of ethanol-eluted products at Ltate 278 MMK (5-OH-IAA) and 269 (4-OH-IAA). The amount of IAA and hydroxy derivatives is determined by pre-constructed calibration curves. Thus, the described method according to a method with a known one allows to increase the yield of hydroxyproducts from aqueous IAA per unit of biomass of the transforming culture.
туры, так как делает возможным многократное нспользованне мнцепи . При этом также в два {юза сокращаетс врем трансформации.tours, as it makes possible repeated use of the chain. At the same time, the transformation time is also reduced by two.