SU994555A1

SU994555A1 - Process for producing cellulolytic enzymes

Info

Publication number: SU994555A1
Application number: SU813307215A
Authority: SU
Inventors: Олег Николаевич Окунев; Евгений Леонидович Головлев; Ирина Дмитриевна Свистова; Сергей Якубович Абсалямов
Original assignee: Институт Биохимии И Физиологии Микроорганизмов Ан Ссср
Priority date: 1981-06-25
Filing date: 1981-06-25
Publication date: 1983-02-07

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ Изобретение относитс к микробиологической промышленности, а именно к способу получени целлюлолитических ферментов, используемых в процессе оса харивани целлюлозы. Известен способ получени целлюпблитических ферментов, предусматривающих культивирование гриба Aspercg Pgus ierreus 17 Р на измельченных до раснмероБ 1-60 мкм целлюлозосодержащих субстратах. В качестве субстрата используют солому и гузапаю Clj . Известен способ получени целлюлоаитических ферментов, предусматривающий культивирование грибов вида Д5регч Cus -terreus на питательной среде, содержащий органический источник азота, минеральные соли и древесные опилки в качестве источника углерода. Исполь зуют штамм AsperofiPEos terreusl7 P. С и Су - активности составл ют при этом 6,2 и 2,4 мг глюкозы / мл-ч 2(54) METHOD FOR OBTAINING CELLULOLYTIC The invention relates to the microbiological industry, and specifically to a method for producing cellulolytic enzymes used in the process of pulping the pulp. A known method for the production of celluplastic enzymes involves the cultivation of the fungus Aspercg Pgus ierreus 17 P on cellulose-containing substrates that have been ground to 1-160 microns of rummers. Straw and guzapayu Clj are used as a substrate. A method of producing celluloaitic enzymes is known, involving the cultivation of D5regch Cus -terreus fungi in a nutrient medium containing an organic nitrogen source, mineral salts and sawdust as a carbon source. The strain AsperofiPEos terreusl7 P. C is used. The C and Cy activities are 6.2 and 2.4 mg of glucose / ml-h 2.

ФЕРМЕНТОВ. . Недостатком данного способа 5тл етс невысока активность целлюлолитических ферментов. Цель изобретени - увеличение акти1 кости ферментов. Указанна цель достигаетс тем, что согласно способу получени целлюлоли- тических ферментов, предусматривающему культивирование грибов вида /i|sf)evtri€Cu5 terreus на питательной среде, содержащей органический источник азота, минеральные соли и древесные опилки в качестве источника углерода, предложено в качестве продуцента использовать штамм flspertfieeosterreos ВКМ F 222О Д, древесные опилки измельчать до размера частиц 0,2-1,0 мм. Штамм sperofi BEos ierreos ВКМ JF-222P Д выделен из лесной почвы Серпуховского района Московской области. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов. Штамм Asperj iRftus terreosBKM F 2 2 2ОД имеет следующую характеристику. 399 Культуральные признаки. Среда Чапека . На 9 сут при колони достигает в диаметре 7 см; край колени ров ный, поверхность бархатиста , центральна часть сморщенно-приподн та ; цвет колонии светло-коричневый, обратна сто рона коричневого цвета, пигмент в среду не диффундирует. Сусло-агар. Рост культуры на суслоагаре отличаетс от роста на среде Чапека наличием скудного эксудата, центр колонии приподн т в месте укола, обратна сторона цвета среды. Морфолстические признаки. Среда Чапека . Конидиальные головки длинные, колончато-компактные ЗО-5Оч8О-150 yU конидиеносцы отход т от субстрата гладкие , бесцветные 5-8 110140yU-} верхушечный пузырь полусферический 14- 18 / в диаметре, покрыт стеригмами на 2/3 своей поверхности; стеригмы двур дные, первичные стеригмы 2-2,5) .x7-8yu; , вторич|&1е - 2-2,5.7,5-8,5уЫ.; конидии эллиптические, гладкие 1,62 ,2уа в диаметре. Сусло-агар. На сусло-агаре наблюдаютс отличи в размерах некоторых .структур: конидиальна головка 30-5О Х80-20О/Х-; конидиеносец 5-8 11О180/XJ диаметр верхушечного пузыр 10-16 д, первичные стеригмы 2-2,5 У х5,5-7д1- , вторичные - 2-2,5 6-8/х ; диаметр конидий 1,6-2,2 уи. . Триб А5рего |№У5 terreus ВКМ П-222б Д способен расти на средахс минеральными источниками азота, использу древесные опилки в качестве единственного источника углерода Шташ не нуждаетс в витаминах и других биологически-активных ватцествах. При- использовании органических добавок активность целлюлаз в культуральной среде увеличиваетс . Измельчение опилок до размеров 0,1-1,0 мм оказывает стимулирующее действие на синтез целлюлаз .: Пример . Гриб spert ieeus ierreu ВКМ F-222О Д выращиваютна среде, содержащей , г/л: измельченные на шаровой мельнице до размеров 0,2-1,0 мм березовые опилки 20,0; NO N03 2,5; КН2РО4 2,0; Сс(Се20,3; М 804-7Н2О О,3; дрожжевой автолизат - 0,5; рН 5,5-6,0. Посевной материал выращивают предварительно в течение 2 сут при 40С в колбах на 75О мл с объемом среды 100 мл на качалке при 180 об/мин на среде, содержащей, г/л: лактоза 54 . lp,0| NUNOj 2,5; КН2Р04 2 Oj Cbce/j 0,3; -MtfSO THjO 6,3; дрожжевой автолизат ;0,5; рН 5,5-6,О. Посевной материал в количестве 10% добавл ют в среду ферментации и инкубируют при на качалке 180 об/мин в колбах на 750 мл с объемом среды 1ОО мл в течение 3 сут. Культуральна среда, отделенна от био массы гриба и неиспользованного субстрат, та центрифугированием (5ООО об/мин, 15 мин), содержит активный комплекс целлюлйа С и Сц. - активность культуральной жидкости составл ет соотвеТственно 1,5 и 40 мг глюкозы / мл.ч (активность . измер ют по методу Мапбейз et e.,eiotechnoe. ап Bioeno;. Samp., 6, 21-33, 1976; редуцирующие сахара определ ли по методу Somoc vi M-J. BioB. Cliem. 195, 19-23, 1952). Эндоглюканазна и целлобиазна активность культуральной жидкости составл ет соответственно 1,0 и 0,05 мкмоль/млмин (активность измер ют по методу А. А. Кле. сова и сотр.Биоорг. хими , 6, № 8, 1980, 1225-1242). П р и м е р 2 ,Гриб spertfie u5 tert-eus ВКМ F -222ОД выращивают на среде, содержащей, г/л: измельченные на шаровой мельнице до размеров 0,2-1,0 мм березовые опилки 2О,О; NaNO 2,5; KHgPOij 2,0; белково-витаминный концентрат 5,0. Посевной материал выращивают и добавл ют в среду ферма 1тации аналогично примеру 1. Культуральна среда, отделенна через 2 сут выращивани , содержит более активный комплекс целлюлаз: С и С активности составл ют соответственно 3,5 и 100 мг ГЛЮКОЗЫ/МЛ1 ч, эндоглюканазна и целлобиазна активность 4,0 и О,1 МКМОЛЬ/МЛМИН, Таким образом, описанный способ поэ вол ет повысить выход целлюлаз при использовании древесных опилок в качестве источника углерода в 1О-20 раз по С -активности и в 15-4О раз по Cj( -активности. ормула изобретени Способ получени целлюлолитических ферментов, предусматривающий культивирование грибов вида flsperc iCBus terreus на питательной среде, содержащей органический источник азота, минеральные соли и древесные опилки в качестве источника углерода, отличающий5 .994555 6 ENZYME. . The disadvantage of this method is the low activity of cellulolytic enzymes. The purpose of the invention is an increase in the activity of enzymes. This goal is achieved by the fact that according to the method of producing cellulolytic enzymes, involving the cultivation of fungi species (i | sf) evtri € Cu5 terreus on a nutrient medium containing an organic nitrogen source, mineral salts and sawdust as a carbon source, it was proposed as a producer use the strain flspertfieeosterreos VKM F 222O D, chop wood chips to a particle size of 0.2-1.0 mm. The strain sperofi BEos ierreos VKM JF-222P D isolated from forest soil Serpukhov district of the Moscow region. The strain deposited in the All-Union collection of microorganisms. The strain Asperj iRftus terreosBKM F 2 2 2OD has the following characteristic. 399 Cultural characteristics. Wednesday Capek. On day 9, when the colony reaches 7 cm in diameter; the edge of the knee is even, the surface is velvety, the central part is wrinkled-raised; the colony color is light brown, the opposite is brown, the pigment does not diffuse into the medium. Wort agar. The growth of the culture on the wort is different from the growth on the апapek medium by the presence of scant exudate, the center of the colony is raised at the injection site, the reverse side of the color of the medium. Morphological signs. Wednesday Capek. Conidial heads are long, column-compact ZO-5Och8O-150 yU conidiophores deviate from the substrate smooth, colorless 5-8 110140yU-} apical hemispheric bubble 14-18 / diameter, covered with sterigms 2/3 of its surface; double stigma, primary sterigma 2-2.5) .x7-8yu; , secondary | & 1E - 2-2,5.7,5-8,5Y; conidia elliptic, smooth 1.62, 2ua in diameter. Wort agar. On wort agar, there are differences in the sizes of some structures: conidia head 30-5O X80-20O / X-; conidiophore 5-8 11О180 / XJ diameter of apical bladder 10-16 d, primary sterigms 2-2.5 U х5.5-7d1-, secondary - 2-2.5 6-8 / х; diameter of conidia is 1.6-2.2 ui. . Tribe A5Rego | NoU5 terreus VKM P-222b D is able to grow in minerals with nitrogen sources using sawdust as the sole carbon source. Stasch does not need vitamins and other biologically active cotton. When organic additives are used, the activity of cellulases in the culture medium increases. Grinding of sawdust to the size of 0.1-1.0 mm has a stimulating effect on the synthesis of cellulases. Example. The mushroom spert ieeus ierreu VKM F-222O D is grown on a medium containing, g / l: birch sawdust crushed to a size of 0.2–1.0 mm; birch sawdust 20.0; NO N03 2.5; KH2PO4 2.0; Cc (Ce20.3; M 804-7H2O O, 3; yeast autolysate - 0.5; pH 5.5-6.0. Seeds are grown for 2 days at 40 ° C in flasks per 75O ml with a medium volume of 100 ml on a rocking chair at 180 rpm on a medium containing, g / l: lactose 54. lp, 0 | NUNOj 2.5; KH2P04 2 Oj Cbce / j 0.3; -MtfSO THjO 6.3; yeast autolysate; 0, 5; pH 5.5-6, O. The seed in the amount of 10% is added to the fermentation medium and incubated with a rocking chair at 180 rpm in 750 ml flasks with a volume of 1OO ml for 3 days. The culture medium is separated from the biomass of the fungus and the unused substrate, the centrifugation (5O OO rpm, 15 min), contains an active complex of cellulose C and Sc. - the activity of the culture liquid is, respectively, 1.5 and 40 mg of glucose / ml / h (activity is measured by the method of MapBase et e., Eiotechnoe. An. Bioeno; Samp., 6, 21-33, 1976; reducing sugars were determined by the method of Somoc vi MJ. BioB. Cliem. 195, 19-23, 1952). The endoglucanase and cellobiasis activity of the culture fluid is respectively 1.0 and 0.05 µmol / mlmin (activity measured by A.A. Kle method. owl and assoc. Bioorg. Chem., 6, No. 8, 1980, 1225-1242). PRI me R 2, the Mushroom spertfie u5 tert-eus VKM F -222OD is grown on a medium containing, g / l: birch sawdust crushed to a size of 0.2-1.0 mm, birch sawdust 2O; NaNO 2.5; KHgPOij 2.0; protein-vitamin concentrate 5.0. The inoculum is grown and farm 1cation is added to the medium as in Example 1. The culture medium separated after 2 days of cultivation contains a more active complex of cellulases: C and C activities are respectively 3.5 and 100 mg Glucose / ML1h, endoglucanase and cellobiasis activity 4.0 and 0, 1 μMOL / MLMIN. Thus, the described method will increase the yield of cellulases when using sawdust as a carbon source by 10-20 times in C-activity and 15-4O in Cj (- activity formulas of the invention lyuloliticheskih enzymes, comprising culturing fungi flsperc iCBus terreus species on a culture medium containing an organic nitrogen source, mineral salts and sawdust as a carbon source, otlichayuschiy5 .994555 6

с тем. что, с целью повышени акги&- i. Авторское свидетельство СССРwith that. that, in order to increase the aqgi & - i. USSR author's certificate

юхуги ферментов, в качестве продуцента№ 77222О, кл. С 12 N 9/42Yuhugi enzymes, as producer No. 77222O, cl. C 12 N 9/42

STpppr r reus.2. Зелтинь P. П.,Витола Г/А.. ЭдBKM-F-2220 Д. при этом древесныежинь И. М. Биосинтад целлюлолитичесопилм нзкюльчают да размера частицs ких ферментов грибом pev ifeos ierr««sSTpppr r reus.2. P. Zeltin, P., Vitola, G / A. .. EDBKM-F-2220 D. In this case, tree crops I. M. Biosynthad cellulose smelting and particle size by the fungus pev ifeos ierr «« s

17 Р при культивировани его в Bonjw 17 P when cultivated in Bonjw

Источники инфоршции,производственных усЛовн зс. - В га, Ферприн тые во внимание при экспертизементаци , Рига, -Зи атне. .5-1оГSources of information, production conditions - In hectares, Ferprintye into account in the examination, Riga, -Zi Atne. .5-1оГ

Claims

Claim

A method for the production of cellulolytic enzymes, involving the cultivation of Asper <^ i8Kus F'eggee mushrooms in a nutrient medium containing an organic nitrogen source, mineral salts and wood sawdust as a carbon source, distinguishing 994555 with the fact that, in order to increase the activity of enzymes, producer use a strain of AspercpCCus terreus VKM F-222O D, while sawdust is crushed to a particle size of 0.2-1.0 mm