натной те шературе, отмывают дистилированной водой, затем осуществл ют взаимодействие полученного продук та с 2 вес.ч. вещества формулы (I) в присутствии 10 вес.ч. хлорида натри и 2 нес.ч. карбоната натри , тща тельно перемешивают и подвергают обработке при 10 ч. Вещество указанной формулы называетс цибакрон синим красителем. Сорбент предназначен дл аффинной хроматографии альфа-фетопрогеина итрофобластспецифического бета-глобул на, помимо этого сорбент может быть использован дл аффинной хроматографии тех белков, которые аффинны к голубой сефарозе Полученный .продукт представл ет собой мелкогранулированный гель сефа розы рко-голубого цвета, обладающий хорошими механическими и фильтрующиО УНг . MH $020 где R, - Н, S02.0Na; R - SQ2.0Na, Н; R - сефароза, выбранна из группы комерческих препаратов, например сефарозы 2В, сефароза CL 2В, сефароза 4В, . сефароза CL 4в, сефароза 6В, сефароза CL 6В. . В результате синтеза сначала получаетс дихлортриазиновое производное сефарозы, в котором оба атома хлора весьма активны в щелочной среде, поэтому реакцию провод т в избытке трихлортриазина в течение короткого промежутка времени - 10-15 мин (избыток трихлортриазина необходим, чтобы св зать все активные гидроксильные группировки сефарозы, а короткий промежуток времени, чтобы не успеть отгидролизовать лишние атомы хлора. Конъюгаци дихлортриазинового производного сефарозы с гептаметилендиамкном проводитс в присутствии би1 арбоната натри , что обеспечивает ||еобходимую щелочную буферную емкость среды. Избыток гептаметилендиамина и длительность процедуры коньюгации (2-10 4j обеспечивают полноту св зывани и отгидролизовывание третьего (последнего) атома хлора. Полученное производное сефарозы не содержит активных {стерически доступных) гидроксильных групп, они все блокированы триазином и содержат только активные ми свойствами, поэтому его можно использовать в колоночной хроматографии . Он выдерживает максимальное давление без нарушени фильтрующих способностей от 50 см вод. ст. дл сорбента, синтезированного на основе сефарозы 2В, до 150 см вод. ст. дл сорбента, синтезированного на базе сефарозы CL 6В. Количество св занного в сорбенте красител , определ ющеес путем гидролиза 1 мл сорбента в 0,1 М НС1 в течение 10 мин при с последующей спектрофотометрией при 610 нм, колеблетс от 0,85 мг цибакрона синего на 1 мл сорбента, синтезированного на базе сефарозы CL 2В, до 1,52 мг красител на 1 мл сорбента, синтезированного на основе сефарозы 6В. Полученный сорбент может быть изображен в виде формулы; V (CH2)7-NH-rnY о-в. аминогруппы, которые могу-г участвовать в дальнейших реакци х. На этом этапе синтеза полученное нами производное сефарозы с введенными в нее аминогруппами реагирует в присутствии карбоната натри с цибакрон синим красителем. Цибакрон .синий краситель вл етс производным трихлортриазина , в котором два атома хлора уже замещены, а один атом хлора остаетс реакционноспособным и момсет (реагировать со свободными (не аротическими аминогруппами. Так как это последний из атомов хлора молекулы трихлортриазина, он менее реакционноспособен и дл реакции необходим-рН около 1Q-11 и повышенна температура ( и выше). В данном случае реакци может идти только по свободной аминогруппе производного сефарозы и хлору цибакрон синего красител , в результате чего получаетс описанный сорбент. Концентраци раствора трихлортриазина не должна превышать 3%, потому Ч.ТО трихлортриазин плохо растворим в водных растворах ацетона и его избыток выпадет в осадок, а при добавлении раствора трихлортриазина в безводном ацетоне к суспензии сефарозы ацетон обводн етс . Концентраци гептаметилендиамина более 3% нежелательна из-за слишком большого повышени . рН среда (за 11 / и наступающего вследствие этого щелочного гидролиза се роэы и ухудшени ее фильтрующих и механических свойств. Уменьшение концентрации трихлор триазина { меньше 1% ) может привест к неполной блокаде всех реакционно способных гидроксильных групп сефа розы и тем самь1м последующее присоединение цибакрон синего красите л может произойти по этим группам Уменьшение концентрации гептаметилендиамина приводит к существенному понижению емкости получаемого со бента (примерно в 4-5 раз), в то врем как концентраци бикарбоната натри может быть понижена до 0,5% а увеличена быть не может из-за плохой его растворимости в данной среде. Хлорид натри добавл ют дл того чтобы избежать расплавлени сефаро зы поэтому снижение концентрации нецелесообразно из-за ухудшени фил трующих свойств сорбента, а увеличение затруднительно, так как при Данных услови х он не раствор етс полностью. Повышение концентрации карбоната натри при температуре 55°С приводит к ухудшению фильтрующ свойств сорбента вследствие частичн го щелочного гидролиза сефарозы и ее расплавлени в св зи с этим, уменьшение же концентрации карбоната натри в смеси (меньше одной частиj приводит к уменьшению емкости сорбента примерно в 2 раза. Так как реакционна способность аминогрупп довольно высока, то тепловую обработку вполне можно приводить при , но в течение 10 ч или при 55С в течение 5 ч. Проведение коньюгации по наименьшим значени м признаков способа (концентраци , врем , температура}, которые приведены выше, дает возможность получит сорбент, емкость которого в 4-5 раз меньше, чем у получающихс в приведенных примерах. Пример 1. Сорбент общей фор мулы СП) г где R - сефароза 4В, представл ющий собой мелкогранулиро ванный гель сефарозы рко-голубого цвета, выдерживающий без нарушени фильтрующих способностей 120 см вод. ст. и содержаший на 1 глл гел 1,41 мг цибакрон синего красител , приготовл етс следующим образом. К 100 г гел сефарозы 4В добавл ют 100 мл ацетона, содержащего 2 г .трихлортриазина, смесь став т на магнитную мешалку и перемешивают, добавл по капл м 1 М раствор едкого натра, чтобы поддерживать рН 8,0. Такое титрование продолжаетс 5 мин, пока рН раствора не установи с на 8,0 и не перестанет снижатьс далее выдерживают.при перемешивании еще 5 мин и сефарозу отмывают последовательно 2 л 50%-ного водного ацетона и 2 л дистиллированной воды на бюхнеровской воронке. После отмывани сефарозу перенос т в химический стакан, добавл ют раствор в количестве 50 мл, в котором предварительно раствор ют по 3 г бикарбоната натри и гептаметилендиамина, и став т на магнитную мешалку на 2 ч, после чего полученное производное сефарозы отмывают на бюхнеровской воронке 2 л дистиллированной воды. Затем гель сефарозы перенос т в химический стакан, добавл ют к нему 2 г цибакрон синего красител в порошке, 10 г хлористого натри , тщательно перемешивают , добавл ют. 2 г карбоната натри , еще раз тщательно перемешивают и став т в суховоздушный термостат при 55°С на 10 ч. Полученный сорбент тщательно отмывают на бюхнеровской воронке дистиллированной водои до полного обесцвечивани промывной воды, в экспериментах по аффинной хроматограции данный сорбент помимо альбумина и некоторых других сывороточных белков при пропускании через него сыворотки плода человека обратимо св зывает альфа-фотопротеин, а при пропускании через него сыворотки крови беременной женщины обратимо св зывает .трофобластспецифический бета-глобулин. Пр име р 2. Сорбент общей формулы (II), где R - сефароза 2В, представл ющий собой мелкогранулированный гель сефарозы рко-голубого цвета , выдерживающий без нарушени фильтрующих способностей давление в 50 см вод. ст. и содержащий на 1 мл гел 0,89 мг цибакрона синего, приготавл етй следующим образом. К 100 г гел сефарозы 2В добавл ют 100 мл ацетона, содержащего 1 т трихлортриазина , далее продолжают по примеру 1, а конъюгацию с гептаметилендиамином провод т в течение 10 ч. Полученный сорбент в экспериментах по аффиной хроматографии св зывает альфа-фегопротеин.и трофобластспе-. цифический бета-глобулин, как и сорбент , описанный в примере 1. Примерз. Сорбент общей формулы (II), где R - сефароза 6В, представл ющий собой мелкогранулированный гель сефарозы рко-голубого цвета, выдерживающий без нарушени .фильтрующих способностей давление 130 см вод. ст. и содержащий на 1 мл гел 1,52 мг цибакрон синего красител , приготовл ют следующим образом. К 100 г гел сефарозы бВ добавл ют 100 мл ацетона, содержащего растворенным в нем 3 г трихлортриазина, далее перемешивают 15 мин, поддержива рН 8,5 добавлением 1 М едкого натра. и продолжают процедуру по примеру 1 Полученный сорбент по своей биоспеци фичности аналогичен сорбенту, описан ному в примере 1. П р и м е р 4. Сорбент общей формулы , (II), где R , - сефароза CL 2В, представл ет собой мелкогранулирован ный гель сефарозы, окрашенный в рко-голубой цвет, .выдерживающий без нарушени фильтрующих способностей давление в 70 см вод. ст. и содержащий на 1 мл гел 0,85 мг цибакрона синего. Этот сорбент приготовл ют следующим образом. К 100 г гел сефарозы CL 2В добавл ют те же вещества , в той же последовательности ив тех же услови х/как в примере 2. Полученный сорбент обладает аффинность аналогичной дл . сорбента, полученног в примере 1. Примерз. Сорбент общей -формулы (II), где R- - сефароза CL бВ, представл ющий собой мелкогранулированный гель сефарозы, окрашенный в рко-голубой цвет, вьвдерживающий без нарушени Фильтрукндих способностей давление в 150 см вод. ст. и содержащий на 1мл гел 1,43 мг цибакрон синего красител получают следук дам . способом. К 100 г сефарозы CL 6В добавл ют равное количество 3%-ного ра створа трихлортриазина в безводном ацетоне, перемешивают в течение 15 мин, поддержива рН 8,5 добавлением по капл м 1 М раствора едкого натра, отмывают водным ацетоном и водой и далее добавл ют 50 г-ш водного раствора, содержащего по 2% гептаметилендиамина и бикарбоната натри , далее процедуру осуществл ют по примеру 1. Полученный сорбент в экспериментах по аффинной хроматографии ведет себ аналогично сорбен ,ту, описанному и полученному в примере 1. Свойства сорбентов, полученных в конкретных примерах следующие. Пример 1 - механические свойства: выдерживает без нарушени фильтрующих свойств 120 см вод. ст. (давление), емкость - способен св зать 10 мг альбумина , пример 2 - механические свойства: выдерживает без нарушени фильтрующих свойств давление в 50 см врд. ст., емкость - 8 мг альбумина на 1 мл гел , пример 3 - механические Свойства: выдерживает без нарушеЧИЯ фильтрующих способностей давлени в 130 см вод. ст., емкость - 12 мг альбумина; пример 4 - механические свойства; способен выдержать без изменени фильтрующих свойств давление в 70 см вод. ст., емкость - 7 мг альбумина; пример 5 - Ме.ханические свойства: выдерживает без нарушени Фильтрующих способностей давление & 150 см вод. ст., емкость - 10 мг альбумина на 1 мл сорбента. Фильтруюие свойства сравниваютс путем определени скорости протекани 0,1 М раствора хлористого натри через колонки , наполненные сорбентами, как путем свободного протекани , так и под действием перистальтического насоса . В последнем случае отсутствие нарушени фильтрующих свойств констатируетс , если скорость протекани (количество миллилитров за... единицу времени) через колонку с сорбентом совпадает с проспектными дан- . ными, характеристическими дл данного типа перистальтического на- coca. Емкость предложенного сорбента дл альфа-фетопротеина 2-5 мг на миллилитр, дл трофобластспецифического бета-глобулина 4-6 мг на миллилитр . Полученный таким образом сорбент обладает фильтрационными свойствами такими же, как импортный фирменный сорбент голуба сефароза, не уступа ей по стойкости и стабильности. Но самое главное, что этот сорбент имеет новые биоспецифические качества . Он способен адсорбировать в экспериментах по аффинной хроматографии некоторые новые белки, которые не способен адсорбировать фирменный сорбент голуба сефароза. Этими белками вл ютс альфа-фетопротеин и трофобластспецифический бета-глобулин, которые известны как раковоэмбриональные белки и используютс в ранней диагностике рака, а именно дл приготовлени иммунодиагностикумов. Сравнива емкость полученных нами сорбентов с фирменной голубой сефарозой по адсорбции сывороточного аль- бумина человека, получили следующие результаты. На 1 мл сорбента обратимо сорбировалось голуба сефароза 10 мг.альбумина, сорбент из примера 110 мг альбумина, сорбент из примера 2 - 8 МГ альбумина, сорбент из примера 3-12 мг альбумина, сорбент из примера 4 - 7 мг альбумина и сор бент из примера 5-10 мг альбумина . Таким образом, полученный нами сорбент, облада хорошими механическими , фильтрующими свойствами и емкостью , не уступающими фирменной голубой сефарозе, имеет по сравнению с ней преимущества по биоспецифичности и может быть применен в препаративной химии белка дл аффинной хроматографии таких раковоэмбриональных белков, как а.льфа-фетопротеин и трофобластспецифический бета-глобулин .They are washed with distilled water, then the obtained product is reacted with 2 parts by weight. substances of formula (I) in the presence of 10 weight.h. sodium chloride and 2 nes. sodium carbonate, mixed thoroughly and processed at 10 hours. The substance of this formula is called cybron blue dye. The sorbent is designed for affinity chromatography of alpha-fetoprogein and it has a trophoblast-specific beta-globulin; in addition, the sorbent can be used for affinity chromatography of those proteins that are affinity to blue sepharose. The resulting product is a fine-grained pink-blue sepha gel having good mechanical properties. filtering NOG. MH $ 020 where R, - H, S02.0Na; R - SQ2.0Na, H; R - sepharose, selected from the group of commercial preparations, for example, sepharose 2B, sepharose CL 2B, sepharose 4B,. Sepharose CL 4b, Sepharose 6B, Sepharose CL 6B. . As a result of the synthesis, a dichlorotriazine derivative of sepharose is first obtained, in which both chlorine atoms are very active in an alkaline medium, therefore, the reaction is carried out in an excess of trichlorotriazine for a short period of time — 10-15 minutes (an excess of trichlorotriazine is necessary to bind all active hydroxyl groups of sepharose , and a short period of time, in order not to have time to hydrate extra chlorine atoms. The conjugation of dichlorotriazine derivative of sepharose with heptamethylenediamine is carried out in the presence of bi1 arbon and sodium, which provides || the necessary alkaline buffer capacity of the medium. The excess of heptamethylenediamine and the duration of the conjugation procedure (2-10 4j ensure the complete binding and hydrolysis of the third (last) chlorine atom. The resulting sepharose derivative does not contain active (sterically available) hydroxyl groups, they are all blocked by triazine and contain only active properties, so it can be used in column chromatography. It maintains maximum pressure without disturbing the filtering ability from 50 cm of water. Art. for sorbent synthesized on the basis of sepharose 2B, up to 150 cm of water. Art. for the sorbent synthesized on the basis of sepharose CL 6B. The amount of dye bound in the sorbent, determined by hydrolysis of 1 ml of sorbent in 0.1 M HC1 for 10 minutes with subsequent spectrophotometry at 610 nm, ranges from 0.85 mg of cybacron blue to 1 ml of sorbent synthesized on the basis of sepharose CL 2B, to 1.52 mg of dye per 1 ml of sorbent synthesized on the basis of Sepharose 6B. The resulting sorbent can be represented as a formula; V (CH2) 7-NH-rnY Island. amino groups that can participate in further reactions. At this stage of the synthesis, the obtained Sepharose derivative with the amino groups introduced into it reacts in the presence of sodium carbonate with a cybacron blue dye. Blue dye is a derivative of trichlorotriazine, in which two chlorine atoms have already been replaced, and one chlorine atom remains reactive and momset (to react with free (not aromatic amino groups. Since this is the last of the chlorine atoms of the trichlorotriazine molecule, it is less reactive and for reaction the required pH is about 1Q-11 and an elevated temperature (and higher). In this case, the reaction can only take place on the free amino group of the Sepharose derivative and chlorine cybacron of the blue dye, resulting in The concentration of trichlorotriazine solution should not exceed 3%, therefore Ch.TO trichlorotriazine is poorly soluble in aqueous solutions of acetone and its excess will precipitate, and when adding a solution of trichlorotriazine in anhydrous acetone to a suspension of sepharose, acetone is surrounded by a concentration of heptamethylenediamine. undesirable because of a too high increase in the pH of the medium (for 11 / and the consequent alkaline hydrolysis of sulfur and the deterioration of its filtering and mechanical properties. A decrease in the concentration of trichloro triazine (less than 1%) can lead to an incomplete blockade of all reactive hydroxyl groups of sephacea and, thus, the subsequent addition of cybacron blue dye can occur in these groups. A decrease in the concentration of heptamethylenediamine leads to a significant decrease in the capacity of the resulting agent (approximately 4%). -5 times), while the concentration of sodium bicarbonate can be reduced to 0.5% and cannot be increased due to its poor solubility in this medium. Sodium chloride is added to avoid melting of sepharose, therefore, a decrease in concentration is impractical due to the deterioration of the filtering properties of the sorbent, and the increase is difficult, since it does not completely dissolve under these conditions. An increase in sodium carbonate concentration at 55 ° C leads to a deterioration in filtering properties of the sorbent due to partial alkaline hydrolysis of sepharose and its melting in connection with this, while a decrease in the concentration of sodium carbonate in the mixture (less than one part j reduces the sorbent capacity by about 2 times Since the reactivity of amino groups is rather high, heat treatment can be quite well carried out at, but for 10 hours or at 55 ° C for 5 hours. Conjugation by the lowest values of the characteristics of the method (concentration, time, temperature}, which are given above, makes it possible to obtain a sorbent, the capacity of which is 4-5 times less than that obtained in the examples given. Example 1. Sorbent of the general formula SP) g where R is Sepharose 4B, The fine granulated Sepharose gel is a bright blue color, which withstands 120 cm of water without disturbing the filtering capacity of 120 cm of water and contains 1.41 mg of cybacron blue dye per 1 g of gel, is prepared as follows. 100 ml of acetone containing 2 g of trichlorotriazine are added to 100 g of Sepharose 4B gel, the mixture is placed on a magnetic stirrer and stirred, adding 1 M sodium hydroxide solution dropwise to maintain pH 8.0. This titration is continued for 5 minutes until the pH of the solution is set to 8.0 and will not continue to decline. With stirring for another 5 minutes and the sepharose are washed successively with 2 liters of 50% aqueous acetone and 2 liters of distilled water on a bichner funnel. After washing, the sepharose is transferred to a beaker, 50 ml of the solution is added, in which 3 g of sodium bicarbonate and heptamethylenediamine are pre-dissolved, and put on a magnetic stirrer for 2 hours, after which the resulting sepharose derivative is washed on a Buchner funnel 2 l distilled water. Then, the Sepharose gel is transferred to a beaker, 2 g of cybacron blue dye in the powder, 10 g of sodium chloride are added to it, mixed thoroughly, and added. 2 g of sodium carbonate are again thoroughly mixed and placed in a dry-air thermostat at 55 ° C for 10 hours. The resulting sorbent is thoroughly washed on a Buchner funnel of distilled water until the complete bleaching of the washing water, in affinity chromatography experiments, this sorbent besides albumin and some others whey proteins by passing human fetal serum through it reversibly binds alpha-photoprotein, and by passing blood through a pregnant woman through it reversibly binds .trophoblastic Physical beta globulin. Primer 2. The sorbent of the general formula (II), where R is sepharose 2B, which is a fine-grained fine-blue gel of sepharose, which withstands a pressure of 50 cm of water without disturbing the filtering ability. Art. and containing on 1 ml of gel 0.89 mg of zibacron blue, prepared as follows. 100 ml of acetone containing 1 ton of trichlorotriazine are then added to 100 g of Sepharose 2B gel, then continued as in Example 1, and conjugation with heptamethylenediamine is carried out for 10 hours. The resulting sorbent in experiments on affinity chromatography binds alpha-fegoprotein and trophoblasts- . digital beta-globulin, as well as the sorbent described in example 1. Tritzy. The sorbent of the general formula (II), where R is sepharose 6B, which is a finely colored, lightly granulated Sepharose gel, which withstands a pressure of 130 cm of water without disturbing the filtration capacity. Art. and containing 1.52 mg of zibacron blue dye per 1 ml of gel, are prepared as follows. 100 ml of acetone containing 3 g of trichlorotriazine dissolved in it is added to 100 g of gel Sepharose bV, then stirred for 15 min, maintaining the pH at 8.5 by adding 1 M sodium hydroxide. and continue the procedure of Example 1. The resulting sorbent is similar in its biospecificity to the sorbent described in Example 1. EXAMPLE 4 The sorbent of the general formula, (II), where R, is the sepharose CL 2B, is finely granulated Sepharose gel, painted in a bright blue color. Withstanding a pressure of 70 cm of water without disturbing the filtering ability. Art. and containing on 1 ml of gel 0.85 mg of zibacron blue. This sorbent is prepared as follows. The same substances are added to 100 g of gel of sepharose CL 2B, in the same sequence and under the same conditions / as in example 2. The resulting sorbent has an affinity similar to that for. sorbent obtained in example 1. Tritzy. The sorbent of the general formula (II), where R- is a sepharose CL bV, which is a finely granulated Sepharose gel, painted in a bright blue color, holding a pressure of 150 cm of water without disturbing the Filtruck ability. Art. and 1.43 mg containing 1 ml of zibacron blue dye, should be followed by ladies. in a way. An equal amount of 3% solution of trichlorotriazine in anhydrous acetone is added to 100 g of Sepharose CL 6B, stirred for 15 min, maintaining pH 8.5 by adding dropwise 1 M sodium hydroxide solution, washed with aqueous acetone and water, and then adding 50 g-l of an aqueous solution containing 2% heptamethylenediamine and sodium bicarbonate, the procedure is then carried out as in example 1. The sorbent obtained in experiments on affinity chromatography behaves similarly to sorben, as described and obtained in example 1. The properties of sorbents obtained in to Specific examples are as follows. Example 1 - mechanical properties: withstands, without disturbing the filtering properties, 120 cm of water. Art. (pressure), capacity - capable of binding 10 mg of albumin, example 2 — mechanical properties: it withstands a pressure of 50 cm bard without disturbing the filtering properties. Art., capacity - 8 mg of albumin per 1 ml of gel, Example 3 - mechanical Properties: can withstand pressures of 130 cm of water without disturbing the filtering ability. Art., capacity - 12 mg of albumin; example 4 - mechanical properties; capable of withstanding a pressure of 70 cm of water without changing the filtering properties. Art., capacity - 7 mg of albumin; example 5 - Mechanical properties: maintains pressure & 150 cm of water. Art., capacity - 10 mg of albumin per 1 ml of sorbent. The filtration properties are compared by determining the flow rate of a 0.1 M solution of sodium chloride through columns filled with sorbents, both by free flow and by the action of a peristaltic pump. In the latter case, the absence of a violation of the filtering properties is ascertained if the flow rate (the number of milliliters per ... unit of time) through the column with the sorbent coincides with the prospect data. characteristic of this type of peristaltic acid. The capacity of the proposed sorbent for alpha-fetoprotein 2-5 mg per milliliter, for the trophoblast-specific beta-globulin 4-6 mg per milliliter. The sorbent obtained in this way has filtration properties that are the same as the imported branded sorbent blue sepharose, which is not inferior to it in durability and stability. But the most important thing is that this sorbent has new biospecific qualities. He is able to adsorb in the experiments on affinity chromatography some new proteins that are not capable of adsorbing the corporate sorbent blue sepharose. These proteins are alpha-fetoprotein and trophoblast-specific beta-globulin, which are known as cancer embryonic proteins and are used in the early diagnosis of cancer, namely for the preparation of immunodiagnostics. Comparing the capacity of the sorbents obtained by us with the company blue sepharose by adsorption of human serum albumin, we obtained the following results. Blue sepharose 10 mg of albumin, the sorbent from example 110 mg of albumin, the sorbent from example 2 to 8 mg of albumin, the sorbent from example 3 to 12 mg of albumin, the sorbent from example 4 to 7 mg of albumin, and the sorbent from Example 5-10 mg albumin. Thus, the sorbent obtained by us, possessing good mechanical, filtering properties and capacity that are not inferior to branded blue sepharose, has compared with it advantages in biospecificity and can be applied in preparative protein chemistry for affinity chromatography of such cancer embryonic proteins as a. fetoprotein and trophoblastic beta-globulin.