Claims (3)
Недостатки этого метода следующие. Предел детектировани при оптическом определении количества вещества в зоне зависит от соотношени пропущенного (отражённого) и поглощенного (рассе нного) излучени .В известных методах оптимизаци этого соотношени направлена на увеличение поглощени излучени веществом в зоне по от3 ношению к рассе нному на сорбенте из лучению. Однако не предпринимались попытки уменьшить рассе ние света сорбентом на готовой тонкослойной хроматограмме.Опрыскивание хроматограммы различными реактивами затрудн ет подчас идентификацию соединений в том числе по их спектрам при работе со спектрофотометром КМ-3. Кроме того, нет универсального про вл ющеjго реактива, что затрудн ет про вление обычными методами хроматограмм сложных смесей. Реактивы могут вступать во взаимодействие с примес ми и давать ложные зоны или снижать разность в экстинкции зон и свободных участков сорбента. В зависимости от выбранной системы растворителей .в качестве элюента зона вещества может локализироватьс у наружной поверхности сло , в его центральной части поперечного сечени и у поверхности , контактирующей с подложко В последнем случае эффективность опрыскивани про вл ющим реагентом может оказатьс низкой, в целом, KOI- да различные вещества локализуютс по-разному в поперечном сечении сло необходимы дополнительные процедуры калибровки, в противном случае резул таты анализа нельз считать достовер ными и представительными. Целью изобретени вл етс снижение повышени чувствительности и рас ширение возможностей идентификации веществ, разделенных на плоском сорбирующем слое. Поставленна цель достигаетс тем что согласно способу анализа в жидкостной хроматографии, включающем разделение смеси веществ на тонком сорбирующем слое, после окончани ра делени тонкий слой сорбента заполн ют жидкостью ,с коэффициентом преломлени , равным или близким коэффициен ту преломлени сорбента, и провод т оптическое детектирование полученной системы. Суть изобретени состоит в том, что при прозрачной подложке слой сорбента становитс оптически прозра ным (или близким к этому), в результате чего уменьшаетс рассе ние падающего света на слое сорбента. Этот вариант применим как в случае сканировани по пропусканию, так и по отражению . Применим он и в случае дете тировани с переменной длиной волны падающего света. Жидкость, иногда на зываемую иммерсионной,нанос т на слой опрыскиванием, окунанием пластинки или подводом за счет капилл рных сил, аналогично подводу элюента Детектирование можно также проводить в кассете из достаточно прозрачного стекла или полимерного материала , например,, покрыва пластинку сверху полиэтиленовой пленкой дл предотвращени испарени жидкости. Возможно также введение в ее состав добавок, снижающих общую летучесть системы. Возможно продувание над пластинкой инертного газа, например, азота, насыщенного парами жидкости. Дл снижени скорости испарени воз-можно охлаждение всей системы до температуры , когда испарение не вносит существенных погрешностей в измерени . Детектирование можно осуществл ть путем перемещени световодов по поверхности пластинки, смазанной компаундом , имеющим тот же коэффициент преломлени , что и световод, например , канадским бальзамом. В состав жидкости можно вводить незначительные добавки про вл ющих реактивов, не измен ющих существенно оптические свойства системы. Аналогичный способ можно использовать и в колоночной жидкостной хроматографии. Пример 1.В ходе -исследовани аминокислотного состава физиологических жидкостей из мозга и печени крыс, находившихс в момент операции в состо нии гипоксии и в нормальных физиологических услови х, соответстт вующие хроматограммы, полученные на пластинках фирмы Е.Мерк и на пластинках с незакрепленным слоем, изготовленных в лабораторных услови х, с силикагелем, обрабатывают метыреххлористым углеродом. Детектирование провод т на спектрофотометре фирмы Оптон КМ-3. Результаты исследовани показывают следующее. Соотношение поглощен .ного к рассе нному свету при использовании ртутной и ксеноновой ламп, а также вольфрамовой лампы, больше в раз (в зависимости от используемого сло сорбента), чем в известном методе; отпадает необходимость использовани кингидрина дл про влени р да аминокислот; в ходе идентифилации получены стабильные характеристические спектры разделенных веществ , что повышает надежность их идентификации дефекты поверхности сло силикагел без св зующего не сказываютс на результатах определени . Пример 2. Услови эксперимента аналогичны примеру 1, но в качестве жидкости используют толуол. Система получаетс менее оптически прозрачной, в св зи с чем указанное соотношение измен етс от 1,4 до 6. Толуол подают на пластинку как восход щим , так и нисход щим способом через листок фильтровальной бумаги. Над поверхностью пластинки продувают азот, который, барботируют через подо гретый толуол. Эксперименты показывают ., что направление газо-парового потока целесообразно выбирать таким же, что и дл элюента. Пример 3. Услови эксперимента аналогичны примеру 2, нО детек тирование провод т при температуре от +28°С до -7°С, что несколько снижает скорость испарени толуола и че тыреххлористого водорода и облегчает услови проведени детектировани . Пример . При определении цитруллина, мочевины, триптамина и триптофана улучшают услови детектировани путем обработки хром тограммы Ц-ным раствором {-диметиламинобензальдегида в таноле, зате выдерживают хроматограмму 3-5 мин в парах сол ной кислоты, а затем обрабатывают четыреххлористым углеродом и провод т детектирование. Предел определени снижаетс в 2-8 раз. Реактив можно добавл ть сразу в жидкость . Пример 5. Услови определени как в примере 1. К четыреххлорис тому углероду добавл ют 3% четырехбромистого углерода, что снижает общую летучесть системы и п озвол ет . проводить определение при сравнитель но высоких температурах, что особенн важно при изучении динамики гипоксии детенышей-хлопковых крыс. Пример 6. Услови эксперимента аналогичны примеру 1, но детек тирование провод т по отражению с использованием зеркальной подложки. Жидкость нанос т опрыскиванием или окунанием. Пример 7. Услови эксперимента аналогичны примеру 1. После подведени жидкости к слою пластинку накрывают тонким листом полиэтилена или кварца и осуществл ют детектирование с одновременной регенерацией пластинки фирмы Е.Мерк (они доста7 точно дороги) путем непрерывного отвода жидкости аналогично тому, как это делают в БН-камере с одновременной непрерывной додачей жидкости к противоположному,концу сло сорбента. П ри м е р 3. Высушенную хроматограмму покрывают слоем канадского бальзама, по которому перемещают полированный торец световода, сплетемного из волоконной оптики с коэффициентом преломлени , равным коэффициенту преломлени бальзама. По слою пропускают поток жидкости. Результаты, полученные в ходе лабораторных испытаний, показывают, что предложенный способ позвол ет: снизить предел определени в 1,5-10 раз при прочих равных услови х; избежать ошибок,св занных с неоднородностью сло сорбента; упростить метод путем исключени дополнительных операций про влени } получить возможность надежной идентификации веществ на спектрофотометре КМ-3 при сн тии соответ-ствующих спектральных характеристик; ускорить проведение анализа; создать новое направление в ТСХ при подборе элюентов, когда учитывают не только элюирующую способность системы, но и ее оптические свойства, с тем, чтобы проводить разделение сразу иммерсионной жидкостью (например, разделение аминов на силикагеле в системе четыреххлористый углерод - этилацетат , когда описанный прием можно осуществл ть сразу в проточном варианте ) ; избежать дополнитель ных калибровок при различном распределении раздел емых веществ по поперечному сечению тонкого сло сорбента. Формула изобретени 1. Способ анализа а жидкостной хроматографии, включающий разделение смеси веществ на слое сорбента и оптическое количественное и качественное детектирование, отличаюийс тем, что, с целью снижени повышени чувствительности и расширени возможностей идентификации веществ, после разделени в слой сорента ввод т жидкость, сни : лющую бщую оптическую плотность сорбируюего сло по отношению к используемоу излучению. 2. Способ ПОП.1, отличаюийс тем, что жидкость имеет оэффициент преломлени равный или близкий коэффициенту прр.ломлени сор , бента. 3. Способ поп,1,отлича ю щ и и с тем, что в жидкость ввод т добавки, снижающие летучесть раствора. k. Способ по nil,отли чающий с тем, что над пластинкой в ходе детектировани продувают поток таза, насыщенного парами жидкости. 5.Способ поппЛи, отли ,4 а ю щ и и с тем, что продувку осуществл ют в направлении перемещени элюата по тонкому слою. 6.Способ поп.1,ртличающ и и с тем, что жидкость нанос т опрыскиванием или окунанием. 7.Способ ПОП.1, отличающийс тем, что жидкость подвод и отвод т от сло сорбента аналогичн элюенту (элюату) при непрерывном хро матографировании. 8.Способ по п.1, отли чающий с тем, что слой сорбента до 8 .8 полнительно обрабатывают про вл ющим реагентом. 9.Способ по пп.1 и 8, о т л и чающийс тем, что про вл ющий реагент ввод т в состав жидкости. 10.Способ по п.1, отли чающий с тем, что детектирование провод т при температурах в интервале от +28С до -7°С . 11. Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и и с тем, что слой сорбента покрывают пластинкой из оптически прозрачного материала. Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1 .Шталь. Э. Хроматографи в тонких сло х. М., Мир, 1965, с.57. The disadvantages of this method are as follows. The detection limit in the optical determination of the amount of a substance in a zone depends on the ratio of the transmitted (reflected) and absorbed (scattered) radiation. In known methods, the optimization of this ratio is aimed at increasing the absorption of radiation by the substance in the zone relative to the radiation scattered by the sorbent radiation. However, no attempts were made to reduce the light scattering by the sorbent on the finished thin-layer chromatogram. Spraying the chromatogram with various reagents sometimes makes it difficult to identify compounds, including their spectra, when working with a KM-3 spectrophotometer. In addition, there is no universal developing reagent, which makes it difficult for conventional methods to show chromatograms of complex mixtures. Reagents can interact with impurities and give false zones or reduce the difference in extinction of the zones and free sites of the sorbent. Depending on the chosen solvent system. As an eluent, the substance zone can be localized at the outer surface of the layer, in its central part of the cross section and at the surface that comes in contact with the substrate. In the latter case, the spraying efficiency of the developing agent can be low. Yes, different substances are localized differently in the cross section of the layer, additional calibration procedures are necessary, otherwise the results of the analysis cannot be considered reliable and representative. The aim of the invention is to reduce the increase in sensitivity and enhance the identification of substances separated on a flat sorbent layer. This goal is achieved by the fact that according to the method of analysis in liquid chromatography, which involves separation of a mixture of substances on a thin sorbent layer, after the separation is completed, a thin layer of sorbent is filled with a liquid with a refractive index equal to or close to the refractive index of the sorbent, and the optical detection is performed system. The essence of the invention is that, with a transparent substrate, the sorbent layer becomes optically transparent (or close to it), as a result of which the scattering of incident light on the sorbent layer is reduced. This option is applicable both in the case of transmission scan and reflection. Apply it in the case of testing with a variable wavelength of incident light. Liquid, sometimes called immersion, is applied to the layer by spraying, dipping the plate, or feeding by capillary forces, similarly to the eluent. Detection can also be carried out in a cassette of sufficiently transparent glass or polymer material, for example, covering the plate on top with plastic wrap to prevent evaporation of liquid. It is also possible to introduce into its composition additives that reduce the overall volatility of the system. It is possible to blow an inert gas over the plate, for example, nitrogen saturated with liquid vapor. To reduce the rate of evaporation, it is possible to cool the entire system to a temperature when evaporation does not introduce significant errors in the measurements. Detection can be carried out by moving the light guides along the surface of a plate smeared with a compound having the same refractive index as the light guide, for example, Canadian balsam. Minor additives of developing reagents that do not significantly change the optical properties of the system can be added to the liquid composition. A similar method can be used in column liquid chromatography. Example 1. In the course of the study of the amino acid composition of physiological fluids from the brain and liver of rats, which at the time of the operation were in a state of hypoxia and under normal physiological conditions, the corresponding chromatograms obtained on E. Merk plates and on plates with a loose layer, made in laboratory conditions, with silica gel, treated with methylene chloride carbon. Detection is carried out on an Opton CM-3 spectrophotometer. The results of the study show the following. The ratio of the absorbed light to the scattered light when using mercury and xenon lamps, as well as a tungsten lamp, is more in times (depending on the layer of sorbent used) than in the known method; there is no need to use kinehydrin for the manifestation of a number of amino acids; during the identification, stable characteristic spectra of separated substances were obtained, which increases the reliability of their identification; surface defects of a silica gel layer without a binder do not affect the results of the determination. Example 2. Experimental conditions are similar to example 1, but toluene is used as a liquid. The system is less optically transparent, and therefore the ratio varies from 1.4 to 6. The toluene is fed to the plate either upstream or downward through a sheet of filter paper. Above the surface of the plate, nitrogen is purged, which is bubbled through the heated toluene. Experiments show that it is advisable to choose the direction of the gas-vapor stream in the same direction as for the eluent. Example 3. Experimental conditions are similar to example 2, but the detection is carried out at a temperature of from + 28 ° C to -7 ° C, which somewhat reduces the evaporation rate of toluene and fourfold hydrogen chloride and facilitates the detection conditions. An example. In the determination of citrulline, urea, tryptamine and tryptophan, the detection conditions are improved by treating the chromatogram with a {-dimethylaminobenzaldehyde T-solution with a chromogram, then incubate the chromatogram for 3-5 minutes in hydrochloric acid vapors, and then treated with carbon tetrachloride and carbon detection. The limit of detection is reduced by a factor of 2-8. The reagent can be added directly to the liquid. Example 5. The conditions of determination as in Example 1. To carbon tetrachloride, 3% carbon tetrabromide is added to carbon, which reduces the overall volatility of the system and allows it. to carry out the determination at relatively high temperatures, which is especially important when studying the dynamics of hypoxia of baby cotton rats. Example 6. Experimental conditions are similar to example 1, but the detection is carried out by reflection using a mirror substrate. The liquid is applied by spraying or dipping. Example 7. Experimental conditions are similar to example 1. After the liquid is applied to the layer, the plate is covered with a thin sheet of polyethylene or quartz and detection is performed with simultaneous regeneration of the E. Merk plate (they are rather expensive) by continuously draining the liquid in the same way as in BN-chamber with simultaneous continuous delivery of fluid to the opposite end of the layer of sorbent. For example, a dried chromatogram is coated with a layer of Canadian balsam, along which the polished end of a fiber is intertwined, which is woven from fiber optics with a refractive index equal to that of the balsam. A layer of fluid is passed through the layer. The results obtained in the course of laboratory tests show that the proposed method makes it possible: to reduce the detection limit by 1.5-10 times, all other conditions being equal; avoid errors associated with heterogeneity of the sorbent layer; to simplify the method by eliminating additional processing operations} to obtain the possibility of reliable identification of substances on the KM-3 spectrophotometer while removing the corresponding spectral characteristics; speed up the analysis; to create a new direction in TLC when selecting eluents, when they take into account not only the eluting ability of the system, but also its optical properties, so as to carry out the separation immediately with immersion liquid (for example, separation of amines on silica gel in the carbon tetrachloride - ethyl acetate system, implement immediately in the flow version); avoid additional calibrations for different distributions of the substances to be separated over the cross section of a thin sorbent layer. Claims 1. Liquid chromatography analysis method, which includes separation of a mixture of substances on a sorbent layer and optical quantitative and qualitative detection, is characterized in that, in order to reduce the increase in sensitivity and enhance the identification of substances, a liquid is introduced into the layer of sorta. : The total optical density of the sorbed layer in relation to the radiation used. 2. Method POP.1, distinguished by the fact that the liquid has a refractive index equal to or close to the coefficient of fracture debris, bent. 3. Method pop, 1, distinguished by the fact that additives that reduce the volatility of the solution are introduced into the liquid. k. The method according to nil, which differs from the fact that a stream of a pelvis saturated with liquid vapors is blown over the plate during detection. 5. The method of priming, 4, 4, and the fact that the purge is carried out in the direction of movement of the eluate on a thin layer. 6. Method Pop.1, rlichlichat and the fact that the liquid is applied by spraying or dipping. 7. Method POP1, characterized in that the liquid is supplied and discharged from the layer of sorbent similar to the eluent (eluate) with continuous chromatography. 8. A method according to claim 1, characterized in that the sorbent layer, before 8. 8, is fully treated with a developing reagent. 9. The method according to claims 1 and 8, which is based on the fact that the developing agent is introduced into the composition of the liquid. 10. The method according to claim 1, characterized in that the detection is carried out at temperatures ranging from + 28 ° C to -7 ° C. 11. The method according to claim 1, about t l and h a and y and with the fact that the layer of sorbent is covered with a plate of optically transparent material. Sources of information taken into account in the examination 1. Stal. E. Chromatography in thin layers. M., Mir, 1965, p.57.
2.Ахрем А. и Кузнецова А. Тонкрлойна х-роматографи . М., Наука, 1964, c.if5. 2.Akhrem A. and Kuznetsova A. Tonkrloyna x-romatography. M., Science, 1964, c.if5.
3.Беленький Б.Г. и Виленчик Л.З. роматографи полимеров. М., Хими . 1Э78, С.27 (прототип).3. White BG and Vilenchik L.Z. romatography of polymers. M. Chem. 1E78, P.27 (prototype).