SU889003A1

SU889003A1 - Method of producing diagnostic pseudotuberculosis serum

Info

Publication number: SU889003A1
Application number: SU792773922A
Authority: SU
Inventors: Валерия Евгеньевна Сидорова; Валентина Владимировна Колесникова; Майя Фоминична Дзадзиева
Original assignee: Владивостокский Научно-Исследовательский Институт Эпидемиологии И Микробиологии
Priority date: 1979-06-01
Filing date: 1979-06-01
Publication date: 1981-12-15

Description

II

Изобретение относитс к микробиологии и касаетс получени диагностических препаратов.This invention relates to microbiology and concerns the production of diagnostic products.

Известен способ получени диагностической псевдотуберкулезной сыворотки путем выращивани псевдотуберкулезных микробов на питательной среде с последующей иммунизацией животныхпродуцентов: и отделением сыворотки крови 0.A known method for obtaining diagnostic pseudotuberculosis serum by growing pseudotuberculosis microbes on a nutrient medium followed by immunization of animal producers: and separation of blood serum.

Однако известный способ не обеспечивает , получени сыворотки с высокой специфичностью.However, the known method does not provide high specificity serum.

Целью изобретени вл етс повышение специфичности сыворотки.The aim of the invention is to increase serum specificity.

Эта цель достигаетс тем, что способ получени диагностической псевдотуберкулезной сыворотки осуществл ют .путем выращиёани псевдотуберкулезных микробов на питательной среде с последующей иммунизацией животныхпродуцентов и отделением сыворотки крови, псевдотуберкулезный микроб выращивают при 10-12 С, выдел ют специфический поверхностный, антиген и иммунизацию провод т однократно в дозе 0,1-0,15 мл с содержанием белка 100 мкг/мл физиологического раствора .This goal is achieved by the fact that the method for obtaining diagnostic pseudotuberculosis serum is carried out. in a dose of 0.1-0.15 ml with a protein content of 100 μg / ml of saline.

Согласно предлагаемому способу получени псевдотуберкулезных сывороток дл иммунизации используют высокоспецифический поверхностный антиген , полученный из микробной клетки ;У. pseudotuberpulosiS без нарушени его природной структуры. Выделенный комплекс вл етс сильным антигенным раздражителем способным даже при однократной иммунизации вызывать ги1S периммунный ответ макроорганизма. Дл иммунизации кроликов выдел ют поверхностную субстанцию псевдотуберкулезного микроба наиболее щад щим способом - механической дезинтегра20 цией, что обеспечивает сохранение вещесТ:ва в нативной форме. Далее из поверхностной субстанции осаждают высокомолекул рную фракцию центрифугированием при 35000 q. Эту фракцию затем перераствор ют в небольшом, объеме низкомолекул рной фракции (супернатанте ). Иммунизаци кроликов смесью этих фракций с превалированием высокомолекул рного компонента обеспечивает острый иммунный ответ животных.According to the proposed method for producing pseudotuberculosis sera for immunization, a highly specific surface antigen derived from a microbial cell is used; pseudotuberpulosiS without disturbing its natural structure. The isolated complex is a strong antigenic irritant capable, even with a single immunization, to induce a gi1S perimmune response of the microorganism. For immunization of rabbits, the surface substance of a pseudotuberculosis microbe is isolated in the most gentle way - by mechanical disintegration, which ensures the preservation of the substance: in its native form. A high molecular weight fraction is then precipitated from the surface substance by centrifugation at 35,000 q. This fraction is then redissolved in a small, low molecular weight fraction (supernatant). Immunization of rabbits with a mixture of these fractions with the prevalence of the high molecular weight component provides an acute immune response to the animals.

Дл иммунизации кроликов используют антиген в низких концентраци х по белку (10-15 мкг) дл одноразового внутривенного введени вещества. Антиген, вз тый в дозе менее 10 мкг, гуморального ответа не вызывает. .Использование же антигена в дозе, превышающей 15 мкг, вызывает иммунологический паралич. Дл получени специфических диагностических псевдотуберкулезных сывороток оптимальной дозой вводимого препарата вл етс 10-15 мкг в 0,1 мл физиологического раствора.For immunization of rabbits, antigen is used at low concentrations for a protein (10-15 µg) for a single intravenous administration of the substance. An antigen taken in a dose of less than 10 µg does not cause a humoral response. The use of an antigen at a dose in excess of 15 μg causes immunological paralysis. In order to obtain specific diagnostic pseudotuberculosis sera, the optimal dose of the injected preparation is 10-15 µg in 0.1 ml of saline.

Пример. Материалом дл иммунизации кроликов служит комплекс поверхностных антигенов псевдотуберкулезного микроба. Чтобы получить его культуру микроба выращивают в течение 2-3 суток на м со-пептонном агаре при 10-12 С, что позвол ет сохранить микроорганизмы в S-форме (в стабильном состо нии). Затем культуру смывают физиологическим раствором с фосфатным буфером (рН 7 , 2-7 ,) .центрифугируют при 5500-6000 g об/мин в течение 30 мин и двукратно отмывают этим же раствором, центрифугируют культуру по 30 мин. Надосадочну жидкость удал ют. Осадок ресуспендируют до концентрации 200 в физиолгическом растворе с фосфатным буфером (рН 7,,), а поверхностный антиген отдел ют на механическом дезинтеграторе в течение 15 мин, дающий 3000 колебаний в минуту. После отделени поверхностной субстанции бактерии осаждают центрифугированием при босо об/мин в течение 30 мин и удал ют. Суспернатант консервируют мертиолатом натри (1:5000-1:10000, экспозици 1 ч при 4°С) и вновь центрифугируют при 9000 об/мин (дл удалени единичных бактерий). Осадок удал ют, а супернатант центрифугируют при 37000 q в течение 2-х часов при 4°С. Полученный осадок (высокомолекул рную фракцию поверхностного антигена) перераст.вор ют в минимальном количестве (1/5 часть) суспер- нанта (низкомолекул рна фракци ), Example. A material for immunization of rabbits is a complex of surface antigens of a pseudotuberculosis microbe. To obtain its culture, microbes are grown for 2-3 days on mi-peptone agar at 10-12 ° C, which allows the microorganisms to be kept in the S-form (in a stable state). Then the culture is washed with physiological saline with phosphate buffer (pH 7, 2-7,). It is centrifuged at 5500-6000 g rpm for 30 minutes and washed twice with the same solution, and the culture is centrifuged for 30 minutes. The supernatant was removed. The pellet is resuspended to a concentration of 200 in phosphate-buffered physiological solution (pH 7 ,,), and the surface antigen is separated on a mechanical disintegrator for 15 minutes, giving 3000 oscillations per minute. After the surface substance has been separated, the bacteria are precipitated by centrifugation at 30 rpm for 30 minutes and removed. The supernatant is preserved with sodium mer-thiolate (1: 5000-1: 10000, exposure for 1 hour at 4 ° C) and centrifuged again at 9000 rpm (to remove single bacteria). The precipitate is removed, and the supernatant is centrifuged at 37000 q for 2 hours at 4 ° C. The precipitate obtained (the high molecular weight fraction of the surface antigen) is overpowered in the minimum amount (1/5 part) of the suspension (low molecular weight fraction),

определ ют количество белка по Лоури и развод т до концентрации 100 мкг белка в 1 мл физиологическим раствором .The amount of protein was determined according to Lowry and diluted to a concentration of 100 µg of protein in 1 ml of physiological saline.

Схема иммунизации животных. Кроликов весом 2, кг однократно иммунизируют внутривенно в краевую ушную вену в дозе 0,1 мл (10-15 мкг белка) препарата, растворенного в 0,1 мл физиологического раствора. Через 8 дней провод т пробное вз тие крови и определ ют титр гемагглютининов . 8 зависимости от индивидуальной чувствительности животных титры антител колеблютс в пределах 1/6 00-1/51300. Дл иммунизации животных используют антиген, приготовленный согласно предлагаемому способу , который развод т физиологическим раствором до концентрации 100 мкг белка, определенного методом Лоури. После установлени титра антител животных обескровливают, отдел ют сыворотку , лиофильно сушат и хран т в холодильнике при °С. Срок хранени (срок наблюдени ) более года.The scheme of immunization of animals. Rabbits weighing 2 kg are once immunized intravenously into the marginal ear vein at a dose of 0.1 ml (10-15 μg of protein) of the preparation dissolved in 0.1 ml of physiological saline. After 8 days, blood is sampled and the hemagglutinin titer is determined. Depending on the individual sensitivity of animals, antibody titers range from 1/6 00-1 / 51300. For immunization of animals, an antigen prepared according to the proposed method was used, which was diluted with saline to a concentration of 100 µg of protein, determined by the Lowry method. After the antibody titer is established, the animals are drained, the serum is separated, lyophilized, and stored in a refrigerator at ° C. The shelf life (observation period) is more than a year.

Специфичность сывороток проверили в реакции непр мой гемагглютинации с чумным антигенным диагностикумом и в реакции агглютинации с живыми культурами S. enteritidis, S. paratyphi Е, Е. coli 0-12, с вакцинным штаммом чумного микроба (EV) и диагностикумом брюшного тифа.The specificity of the sera was tested in the reaction of indirect hemagglutination with the plague antigenic diagnosticum and in the agglutination reaction with living cultures of S. enteritidis, S. paratyphi E, E. coli 0-12, with the vaccine strain of the plague microbe (EV) and the diagnosis of typhoid fever.

Сыворотки, приготовленные по известному способу, давали положительные РИГА и РА с чумным эритроцитарным антигенным диагностикумом и вакцинным штаммом чумного микроба (EV/) в разведении 1:50. Сыворотки,приготовленные предложенным способом, имеют положительные РИГА и РА с указанными диагностикумами в разведени х 1:АО и 1:20 соответственно. С остальными культурами реакции оказались отрицательными .Serum prepared by a known method, gave a positive RIGA and RA with plague erythrocyte antigenic diagnosticum and the vaccine strain of the plague microbe (EV /) at a dilution of 1:50. The sera prepared by the proposed method have positive RIGA and RA with the indicated diagnostics in dilutions 1: AO and 1:20, respectively. With the other cultures, the reactions were negative.

Полученные диагностические превдотуберкулезные сыворотки обладают до.статочной чувствительностью, высокой специфичностью, имеют высокую концентрацию антител и найдут широкое применение в баклаборатори х санэпидстанций с целью диагностики псевдотуберкулеза и установлени серологической принадлежности возбудител заболевани . Сроки получени этих сывороток в 2раза короче известного ранее способа, что экономически более выгодно.The obtained diagnostic predotuberculosis sera have a sufficiently sensitive sensitivity, high specificity, have a high concentration of antibodies and will find wide application in the laboratory of sanitary and epidemiological stations for the diagnosis of pseudotuberculosis and the establishment of the serological identity of the causative agent of the disease. The timing of the preparation of these sera is 2 times shorter than the previously known method, which is more economically advantageous.

5889003458890034

Claims

The claims are grown at 10-12 ° C, isolated

The method of obtaining diagnostic and immunization is carried out once by pseudotuberculosis serum by means of a dose of 0.1-0.15 ml with a content of protein cultivation of pseudotuberculosis microbes of 100 µg / ml of physiological gutters on a nutrient medium with a follow-up.

immunization of animal products, information sources,

cents and separation of blood serum, taken into account in the examination of which, 1, Korolyuk A.M. Serological with the aim of increasing the specificity of sy- (in the diagnosis of pseudotuberculosis. Cand. Vorotka, pseudotuberculosis microbe dis. L., 1971.

specific surface antigen