SU792116A1 - Способ количественного определени хлордиазепоксида в биологических объектах - Google Patents

Description

iio;i xpop.iaTory ielxin; длительность (до 2-х суток), невысока  чувствительность (граница обнаружени  0,2 мг в 100 г оОъекта). Целью изобретени   вл етс  упрощ ние способа и повышение чувствитель ности определени . Поставленна  цель достигаетс  описываемым способом количественног определени  хлордиазепоксида в биологических объектах путем гидролиза непосредственно анализируемой пробы раствором сол ной кислоты при 100110°С с последующей экстракцией пол ченного гидролизата органическим растворителем и хроматографировании полученного экстракта в тонком слое сорбента, элюировани  бензофенонов и проведени  азосочетани  с М-о(.-наф тилэтилендиамином и дигидрохлоридом и спектрофотометрировани  полученного при этом окрашенного раствора. Отличительным признаком способа  вл етс  то, что гидролизу подверга етс  непосредственно анализируема  проба при 100-110°С. Примеры иллюстрируют предлагаемый способ. Пример 1. К 25 г гомогенизата отдельного органа (печень , желудок с содержимым, кишечник , почки) в круглодонной колбе с притертой пробкой емкостью 140-200 прибавл ют lio 100 мл 6н раствора со л ной кислоты и гидролизуют в течение 2 ч при 100-110 С на глицериновой бане с обратным холодильником. По окончании гидролиза обратные холодильники промывают 3-5 мл 2н раст вора сол ной кислоты, присоедин   промывные воды к гидролизату, который фильтруют через, ватмановский (бумажный) фильтр (бела  лента} в делительную воронку. Фильтрат нейтрализуют, добавл   гранулированный едкий натр, и довод т рН раствора до 10 по универсаль ному индикатору. 2-ами1-;о-5-хлорбензофенон, полученный в результате гидролиза, экстрагируют и-гептаном трижды порци ми 20, 15, 15. Гептановые извлечени после расслоени  фаз перенос т в мерную колбу на 50 мл, пропуска  через воронку с безводным сульфатом натри  (1-1,5 г). В случае образова ни  эмульсии, с целью расслоени  фаз, провод т центрифугирование в течение 5-10 мин. при 5000 об/мин. Объем раствора в мерной колбе на 50 мл довод т гептаном до метки и тщательно перемешивают. Хроматографическое определение бензофенона хлордиазепоксида от бен зофенонов других производных 1,4бензодиазпенина и их обнаружение. По 10, мл полученных гептановых извлеченийвыпаривают при комнатной температуре или на роторном испарителе в выпаривательных колбах до объема 0,5-1 мл, остатки нанос т на стартовую линию хроматографической пластинки с тонким слоем силикагел  КСК (0,62 на 1 см, от 250 меш.), закрепленного гипсом (5% от веса силикагел ) в виде 2-х полос (в каждой 10 мл выпаренного экстракта) длиной в 1 см на рассто нии 2 см друг от друга. Р дом на ту же стартовую линию нанос т п тно метчика, состо щего из смеси 0,1% этаноловых растворов бензофенонов производных 1,4-бензодиавенина (диазепама, нитразепама, хлордиазепоксида ) в количестве 10-15 мкг каждого бензофенона. Хроматографируют в системе бензола. Пробег фронта растворител  10 см. Врем  хром.тографировани  20-25 мин. С хроматограммы удал ют органический растворитель под током теплого воздуха (феном) 5 мин . Часть хроматограммы, соответствующую первой полосе исследуемого раствора , предназначенной дл  элюирова- ни , закрывают сте л нной пластинкой. Ва открытой части хроматограммы с п тном метчика и 2-ой полосой исследуемого раствора провод т реакцию образовани  азокрасител . С этой целью хроматограмму опрыскивают последовательно 2н-ым раствором сол ной кислоты , 0,1%-ым раствором нитрата натри , через 5 мин избыток нитрита натри  удал ют обработкой пластинки 0,5% раствором сульфамата аммони  и через 1-2 минуты полученную соль диазони  сочетают с 0,1%-ым раствором N-ot-нафтилэтилендиамина . В случае присутстви  2-амино-5хлорбензофенона (продукта гидролиза хлордиазепоксида) на хроматограмме через 15 мин образовани  п тно сиреневого цвета (бензофенон нитразепама дает п тно разового цвета с Rr 0,16) сравнивают величину R метчика хлордиазепоксида (0,27-0,3) и исследуемого раствора. Реакцией удаетс  обнаружить 1 мкг хлордиазепоксида в п тне . Из закрытой части пластинки зону селикагел , соответствующую расположению и тна метчика, собирают на стекл нный фильтр № 4 и элюируют двум  порци ми этанола по 5 мл в мерную пробирку. Элюат довод т этанолом до 10 мл. Снимают спектр 2-, амино-5-хлорбензофенона в УФ области (от 200-400 нм) в кювете с толщиной рабочей поверхности 1 см на СФ-16. Наличие характерных максимумов поглощени  в области 238 нм и 390 нм подтверждает п рисутствие соединени  в исследуемом растворе ( 980). Этаноловый раствор бензофенона после сн ти  спектра количественно перенос т в стекл нный бокс, тула же присоедин ют раствор, оставшийсч в мерной пробирке. Этанол упаривают под током теплого воздуха, а остаток раствор ют в 5 мл 2н-ой сол ной кислоты при посто нном помешивании в течение 10-15 мин. В зависимости от концентрации в полученном растворе 2.-амино-5-хлорбензофенона , которую ориентировочно рассчитывают после сн ти  спектра в УФ, на реакцию образовани  азокрасител  берут 0,5,1,0 или 3 мл и довод т (если это необходимо) до 3 мл 2 н-ым раствором сол ной кислоты. Далее последовательно добавл ют 0,5 мл 0,1% раствора нитрата натри , через 5 минут - 0,5 мл 0,5% раствора сульфамата аммони . Азокраситель сиреневого цвета образуетс  через 15 мин после добавлени  1 мл 0,1%-го раствора N-o -нафтилэтилендиамида дигидрохлорида. Окраска устойчива в течение cyToi:. Оптическую плотность окраииенного раствора измер ют на спектрофотометре СФ-16 при 550 нм в кювете с рабочей длиной поверхности 1 см. В качет стве раствора сравнени  используют контроль реактивов. Концентрацию хлордиазепоксида в органах определ  от по формуле: D У/- Уд -. 100 с -v. EVcA V; где X - содержание хлордиазепокс да, мг в 25 г органа; D - оптическа  плотность изм р емого раствора; V, - объем разведенного гидро лизата (50 мл); V - количество аликвоты гепт нового экстракта, вз тог дл  нанесени  на хромато графическую пластинку (10 мл); Vg- количество 2 н-го раствора сол ной кислоты, вз того на растворение сухого остатка; количество аликвоты, вз той на реакцию сол нокисл , лого раствора; Е /е/1/ удельный показ.атель поглощени ; С - навеска исследуемого органа . Количество хлордиазепоксида, выдел емого из 25 г органов, представлено в таблице. Методика: Из стандартного раство-, ра хлордиазепоксида в этаноле (1000 мкг/мп) готовили серию растворов в мерных колбах на 25 мл, содержащих 20,50,100,150,200 мкг/мп. К 0,5 мл этих растворов, помещенных в колбу дл  гидролиза, добавл ют по 3,0 мл 2 н-го раствора сол ной кислоты и гидролизуют 20-25 минут при 100110°С на глицериновой бане с обратным холодильником. Охлажденный гидролизах довод т в мерной пробирке до 5 мл. 2 н-ым раствором сол ной кислоты и 1 мл из этого раствора берут на реакцию образовани  азокрасител  (реакци  Браттои-Маршалла), описанную выше. После определени  плотности окрашенного раствора на спектрофотометре СФ-16 при 550 нм вычисл ют удельный коэффициент поглощени  по формуле: Е где D - оптическа  плотность; С - концентраци  раствора, вес % ; t - толщина поглощающего сло , Способ позвол ет упростить процесс и повысить чувствительность определени  с 0,2 мг в 100 г объекта до 0,05 мг в 100 г объекта.

Определение количества хлордиазепоксида

7921168

1/2

50

1/2

100

1/2

200

1/5

500

1/10 0,372930,0

1/10 0,000

х/п

Claims (1)

1.. Bernard А. Koeclilln and LucinsМ,Д, Швайковой,

)Arconte. Determination of Chlor-.. ..Изотов Б.Н. и др. Изолирование

liazepoxide and of а Metabolite ofхлордиазепоксида из внутренних орга .actam Character in Plasma of Humans,,нов трупа, 1977, с. 20-24 (прото )ogs and Rats by a specific spectro-тип). гически активных веществ и их мета