SU740234A1 - Способ определени активности изоферментных фракций адеаминникотинамиддинуклеотидфосфатзависимой изоцитратдегидрогенозы - Google Patents

Description

-изобретение относитс  к области медицинской биохимии, а именно определению активности ферментов, , Известен способ определени  активности изоферментных фракций ад енинникотинамиддинуклеотидфосфат-еависимой изо цитратдегидрогенааы (АНАДФ-ИДГ) путе электрофоретического разделени  исследу емого материала в полиакриламидном геле с последующей инкубацией гел  в рас воре, содержащем феназинметасульфат и тетразолий, и определением отдельных изоферментных фракций по оптической плотнрсти окрашенных зон гел  l. Однако, этот рпособ.  вл етс  недостаточно чувствительным и не позвол ет с достаточной степенью достоверности судить об активности минорных иаоферментных фракций (1, 3, 4 и ) и их изменени х при различных воздействи х, а также требует длительной инкубации, необходимой дл  по влени  окрашивани . Целью изобретени   вл етс  повышени точности и ускорение способа. Это достигаетс  тем, что в инкубационную среду дополнительно внос т раствор ретинола или ретинил ацетата в концентрации 2-3 мг/мл. Предлагаемый способ осуществл ют следующим образом. С помощью зонального электрофореза в полиакриламидном геле в стандартном аппарате дл  электрофореза осуществл ют разделение изофермёнтов АНАДФ-ИДГ, Исследуемый материал (вместе с Сефа- дексом G -25) внос т с помощью пипетки в трубки, содержащие ступенчатый градиент гел  (10%; 7,5%; 3,5%) в расчете на акриламид, .В .качестве-концентрирующего сло  используют суспензию Софадекса - 20О. Исследуемый материал внос т в трубку из расчета . 2-3 мг белка на трубку. Электродным буфером служит раствор трис-НС1 буфера (рН 8,3| 0,5 М). Длительность .электрофореза , с оставл ет около 4 ч при силе тока 2 мА на трубку. Об окончании электрофореза суд т но продвижению инцика- тоцюй краски-бромфенолового синйго. Дл  очистки гал  провод т првдваритель .ный электрофорез в режиме, соогветствуищем режиму основного электрофореза. После окончани  электрофореза гели извлекают из трубок .и помещают в пробир-ки , заполненные инкубационной средой дл  вы вленна  активности НАДФ-ИДГ, включающей 0,.05М г-лйцйл-Глйцйновый буфер рН8,6 НАДФ-1,7 мМ, .5мМ MaCN-2 мМ, 15 мМ, тринатрие вую coJjb иарлименной кислоты - . 0,015 мМ, нитросиний тетразол:ий -: 0,36 мМ, раствор ретинола или ретинил- ацетата в концентрации 2-3 мг/мл. Про .бирки помещают в термостат и инкубируют в тенение lO мин при . Затем .в каждую пробирку внос т феназинмёТа-. сульфа в концентрации 0,06 мМ и инкубируют пробы в течение 5-20 мин при Той же Температуре. Интенсивность окрашивани  в зонах локализации изсфермент- ных фракций регистрируют с помощью ден ситометра. Активность изоферментных фракций НАДФ-ИДГ выражают в условных единицах оптической плотности (пропорциональной плошади окрашенных зон) в пересчете на 1 мг балка в исследуемом образце за 1 мин времени Инкубации при .

740234 Предлагаемый способ значительно повышает актйЁность изофермэнтных фракций НАДФ-ИДГ. При этом наиболее значительно возрастает активность 1-й (в среднем в 17 раз) и 5-й фракции (в среднем в 5 раз). Активность остальных фракций (2,3,4-й) повышаетс  в 3-5 раз. При этом внесение в среду витамина А позвол ет в р де случаев вы вить активность так называемых минорных (1, 3, 4 и 5-й) фракций, не вы вл ющуюс  (или выраженную в чрезвычайно малой степени) при использовании известного способа. При внесении в инкубациойную среду витамина А развитие интенсивности окраски происходит уже на 10 - 2О-й минутах инкубации, тогда как при использовании существующего метода дл  развити  выраженной окраски требуетс  не менее 30-40, а в р де случаев и 60 мин. Средние результаты исследований по Сопостаблению определени  активности . изофврме,нтных фракций НАДФ-еависимой Йзоцитратдегидрогеназы с помощью известного и предлагаемого способов приведены в таблице.

AKTHiBHocTb изоферментных

Claims (1)

1. Формула изобретен и  

   Способ определени  активности изофер- ,, ментных фракций аденинникотИнамиддинук- пеотидфосфат...ависимой иэоцитратдегидро-: геназы (НАДФ-ИДГ) путём электрофореf йчесКёгу раёйёЯёШй исгслёдуёШгб мат е -- s dK5«e ci; -i -J фракций НАДФ-ИДГ, единица оптической плотности в мин

   риала в полиакриламидном геле с последующей инкубацией гел  в растворе, содержащем феназинметасульфат и тетразолий , и определением отдельных изоферментных фракций по оптической гшотности окрашенных зон гел , отличающийс , тем,, что, с целью повышени 

   57402346

   точности и ускорени  способа, в инкуба-Источники информации,

   ционную среду дополнительно внос т раст- прин тые во вн гмание при вкспертиае вор ретинола или рвтинип-ацетата в ко-1. Вестник АМН СССР, MJ 11, о.51,

   нечной концентрации 2-3 мг/мл.197й,.