SU732276A1 - Способ модификации дезоксирибонуклеиновой кислоты - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к способам модификации нуклеиновых кислот, в частности к способу модификации: дез оксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) который может найти применение при структурном анализе нуклеиновых кис лот и в медицине, в частности при и готовлении вакцин. Известны способы химической моди фикации ДНК, например, путем обрабо ки ее раствором дифениламина в муравьиной кислоте, которые привод т к одновременному удалению пуриновых оснований из молекулы ДНК . Однако в литературе не описаны способы, которые привод т к селективному -отщеплению от ДНК аденина, что важно при структурном анализе нуклеиновых кислот. Целью изобретени   вл етс  полу чение препаратов ДНК с заданным со держанием в ней аденина. Цель достигаетс  тем, что ДНК инкубируют с соединением обшей фор мулы Е -СИ-NU-CHjOH где R. - СООН, ОН, Н; 2 - Н, СН,(СН2)п, где 0-5, R. -- - - - J при рН - 4-6 итемпературе 30-50 С в течение времени, которое определ ют по константе скорости реакции ; ,4 р„ 100 t К 10 где t - врем  от начала инкубации, мин ; X - количество отщепившегос  аденина , %; К - константа скорости реакции, значение которой определ етс  монометилольным производным амина, используемого дл  дезаденимизации ДНК, значением рН и температурой процесса . Предлагаемый Способ модификации ДНК, который приводит к получению препаратов ДНК с заданным содержанием аденина в ней, заключаетс  в том, что ДНК инкубируют с соединением форму.пы I при рН 4-6 и температуре 30-50 С в течение времени, которое определ ют по константе скорости реакции. Реакцию модификации предпочтительно провод т следующим образом.

ДИК инкубируют с соединением формулы 1, которое  вл етс  продуктом взаимодействи  формальдегида и амина , предпочтительно с 0,4 М раствором монометилолглицина (R -СООН, RJ-H), при рН 4-6, предпочтительно 5,5, и температуре ЗО-ЗО С, предпочтительно 50°С.

При значени х рН, меньших 4, резко возрастает скорость неспецифического отщеплени  от ДНК пуриновых оснований 1. При значени х рН, больших б, скорость отщеплени  аденина от ДНК под действием монометилольных производных аминов значительно уменьшаетс .

Увеличение температуры выше вызывает ускорение процесса неспецифического отщеплени  цитозина, а уменьшение температуры инкубации ниже 30° С - зз едление процесса отщеплени  аденина от ДНК под действием монометилольных производных аминов.

Пример . Ниже привод тс  ус .лови , в которых происходит избирательное отщепление аденина от ДНК, вплоть до практически полного его удалени , под действием монометилольных производных глицина 3-аланина и этаноламина.

Монометилольные производные амина получают при взаимодействии глицина, fb-аланина или этаноламина (х. ч, Reanal, Венгри ) с формальдегидом . Последний готов т из фармацевтического формалина (Merk, ФРГ) . Концентрацию формальдегида определ ют йодометрическим методом. Все растворы готов т на 0,1 М натрийфосфатно буфере с таким рН, чтобы после добавлени  всех компонентов и завершени 

реакции формальдегида с амином рН реакционной смеси был равен 4-6,

Мол рна  концентраци  амина в реакционной смеси превышает мол рную концентрацию формальдегида в 3 раза, что обеспечивает полное св зывание альдегида амином с образованием моном тилольного производного амина в концентрации, равной исходной концентрации добавленного к раствору формальдегида.

Дл  анализа препаратов ДНК, полученных при обработке монометилольным производными глицина Ь -аланина или этаноламина, используют метод ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе в сочетании с хроматографией на бумаге.

Термоденатурированную ДНК в концентрации 2,5 мг/мл инкубируют в течение 3 суток, 1,2,3,6 недель в 0,1 М натрийфосфатном буфере с 0,4 М монометилольным производным глицина/ |3 1 -аланина или этаноламина при 30, 36 или 50°С и при рН 4,0; 5,5 или 6,0, Полученный препарат (1 мл) нанос т на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (VlOO см) и элюируют 0,01 М натрийфосфатным буфером. В элюате присутствует только аденин. Кроме него определ емые количества других оснований не обнаруживаютс . За по влением аденина след т спектрофотометрически .

Спектрофотометрические характеристики вещества,снимаемого с ДЭАЭ-целлюлозой 0,1 М натрийфосфатным буфером (рН 6,8) при хроматографии ДНК, обработанной монометилольным производным глицина (ММГ), приведены в табл. 1 .

Т а

лица

260 285 0,77 0,128 0,77 0,37 0,63 0,59 0,76 0,12 0,76 0,37. 0,57 0,60

Результаты, полученные в опыте.

ч

Литературные данные дл  аденина в этих услови х.

Св завшуюс  с ДЭАЭ-целлюлозой ДНК снимают 1 М хлоридом натри  с 7 М мочевиной, обессоливают и гидролизуют 85%-ной муравьиной кислотой (175°С, 90 мин). Гидролизат хроматографируют на бумаге в кислом растворителе Кирби (метанол: концентрированна  ВСЕ: Н20- 7:2:1) и анализируют нуклёотил ный состав гидролизата, Результаты приведены в табЛо.2-6.

Результаты по кинетике выщепленип аденина из ДНК под действием монометилольных производных аминов позвол ют рассчитать кор1станту скорости этого процесса. Например, в услови х опыта, результаты которого приведены в табл. 6 (0,4 М монометилолглицин, рН 5,5, температура 36°С), К « 7,5 10 мин , Така  скорость в 1000 раз превышает скорость неспецифического

отщеплени  аденина от ДНК в соответ- ствующих опыту услови х, но в отсуттвии ММГ.

Данные о скорости процесса деза- денинизации ДНК под действием монометилольных производных аминов поз-j вол ют заранее рассчитывать врем  инкубации дл  получени  препаратов ДНК с заданным соедржанием аденина в ней по формуле (1). Величины К дл  тех случаев обработки ДНК, которые приведены в примерах, представлены в табл. 2-6.

Процентное содержание оснований в молекуле ДНК после инкубации ДНК с 0,4 М монометилолэтаноламином в 0,1 М натрийфосфатном буфере при рН 4,0 и температуре 36°С дано в табл. 2.

Таблица 2

3 суток 10,6 37,4 23,9 28,1 63 1 недел  3,6 39,8 24,2 32,4 89

Примечание : ,0

Процентное содержание оснований в молекуле ДНК после инкубации ДНКс 0,4 М монометилол-р)-аланином в 0,1 М натрийфосфатном буфере при рН 4,0 и температуре 30 С дано в табл. 3.

Т а

лица

7,0.

Примечание

К

Процентное содержание оснований в молекуле ДНК после инкубации ДНК с 0,4 М мономотилолглицином в 0,1 М натрийфосфатном буфере при рН 5,5 J5 температуре 50°С дано в табл. 4,

Т   блица

3 суток .14,4 34,4 26,0 25,2 50 д 1 недел  5,0 40,2 28,6 26,2 85

Примечание: Кг 1,3.

Процентное содержание оснований в молекуле ДНК после инкубации ДНК с 0,4 М монометилолглицином в 0,1 М натрийфосфатном буфере при рН 6,0 и температуре 50 С дано в табл. 5.

Таблица

3 суток 20,0 31,5 24,5 24,0 29

1 недел  13,5 34,2 26,4 25,9 53

3 недели 2,9 41,6 30,0 25,5 90

Примечание: Кж2,9. Процентное содержание оснований в молекуле ДНК после инкубации ДНК с 0,4 М монометилолглицином в 0,1 М натрийфосфатном буфере при рН 5,5 и температуре дано в табл. 6.

т а б л иц а

eg Исходна 

Claims (2)

1. Способ модификации дезоксирибонуклеиновой кислоты, отличающ и и с   тем, что, с целью получени  препаратов деэоксирибонуклеиновой кислоты с заданным содержанием аденина в ней, дезоксирибонуклеиновую кислоту инкубируют с соединение общей формулы

RJ-CH-WH-CH OH RI

где R - СООН, ОН, Н;

Rg - Н, CH(CHj,)f,, где п 0-5, при рН 4-6 и температуре ЗО-ЗО С в течение времени, которое определ  по константе скорости реакции , „ ,f. п 100

t К- 10 .Eg -foo::

где t - врем  от начала инкубации, мин ;

X - количество отщепившегос  аденина , %;

К - константа скорости реакции,

2. Способ ПОП.1, отличающийс  тем, что в качестве исходного реагента используют соединение формулы 1, где. R - СООН, R Н.

Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе

1. Кочетков Н.К., Будовский Э.И., Свердлов Е.Д., Симукова Н.А., Турчинский М.Ф., Шибаев В.Н. Органическа  хими  нуклеиновых кислот. М., Хими , 1970, с. 500-503 (прототип ) .