SU728720A3 - Method of preparing vaccine for hepatitis v control - Google Patents
Method of preparing vaccine for hepatitis v control Download PDFInfo
- Publication number
- SU728720A3 SU728720A3 SU762332953A SU2332953A SU728720A3 SU 728720 A3 SU728720 A3 SU 728720A3 SU 762332953 A SU762332953 A SU 762332953A SU 2332953 A SU2332953 A SU 2332953A SU 728720 A3 SU728720 A3 SU 728720A3
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- hepatitis
- hbsag
- particles
- vaccine
- antigen
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 16
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 title claims description 6
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 title claims description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 33
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 33
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 33
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 33
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 19
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 16
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 5
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 claims description 4
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 claims description 2
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 17
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 3
- SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N hepatitis b vaccine Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1N=CN=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N 0.000 abstract description 3
- 229940124736 hepatitis-B vaccine Drugs 0.000 abstract description 3
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 abstract description 2
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 abstract 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 abstract 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 abstract 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 11
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 7
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 7
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 7
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 5
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 238000012872 hydroxylapatite chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000001139 pH measurement Methods 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229960003127 rabies vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000007560 sedimentation technique Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- ULVBNYNCYNALAV-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecyl sulfate;prop-2-enamide Chemical compound [Na+].NC(=O)C=C.CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O ULVBNYNCYNALAV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N tris phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.OCC(N)(CO)CO JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
1one
Изобретение относитс к медицинской промышленности и касаетс производства бактерийных препаратов.This invention relates to the medical industry and concerns the production of bacterial preparations.
Известен способ получени вакцины против гепатита В путем выделени частиц HBsAg, содержащих е-антиген. на частицах или в растворе, из плазмы крови носителей антигена гепатита В, содержащей е-антиген с последующей инактивацией целевого продукта l . Однако вакцина, полученна . известным способом, не обладает высокой специфичностью.A method of preparing a hepatitis B vaccine is known by isolating HBsAg particles containing an e-antigen. on particles or in solution, from the blood plasma of carriers of the hepatitis B antigen containing the e-antigen, followed by inactivation of the target product l. However, the vaccine received. in a known manner, does not have high specificity.
Целью изобретени вл етс повышение специфичности вакцины.The aim of the invention is to increase the specificity of the vaccine.
Эта цель достигаетс тем, что плазму кровиобрабатывают 3,04 ,5 вес.% полиэтиленгликол при рН 4,4-4,7, полученный осадок, содержащий HBsAg частицы размером 30-50 нм, раствор ют при рН 4,9-5,1, затем рН надосадочной жидкости довод т до 4,4-4,7, повторно обрабатывают полйэтиленгликолем и полученный осадок раствор ют в физиологическом растворе .This goal is achieved by the fact that blood plasma is processed by 3.04, 5% by weight of polyethylene glycol at pH 4.4-4.7, the resulting precipitate, containing HBsAg particles 30-50 nm in size, is dissolved at pH 4.9-5.1 , then the pH of the supernatant is adjusted to 4.4-4.7, re-treated with polyethylene glycol and the resulting residue is dissolved in physiological saline.
Кроме того, целевой продукт инактивируют обработкой формалином или 1 -пропиолактоном или облучением рентгеновскими лучами.In addition, the target product is inactivated by treatment with formalin or 1-propiolactone or by X-ray irradiation.
Предлагаемым способом получают вакцину против вирусного гепатита, котора включает в свой состав антигенные частицы, имеющие размер частиц 20-50 нм, причем эти антигенные частицы содержат неосажденные свободные необъединенные гепатит р -поверхностные антигены. Вакцина имеет менее ДО единиц антител гепатит (Ь-поверхностного антигена на 1000 ед. гепатит |Ь-поверхностного антигена. 5% частиц и размером, лежащим в интервале 3-50 нм, содержат неосажденные е-антигены или специфичные антигены, аналогичные частицы Дана. Антиген гепатита и е-антиген содержатс в вакцине в количестве, достаточном дл образовани антител при введении их в организм животного.The proposed method produces a vaccine against viral hepatitis, which includes antigenic particles having a particle size of 20-50 nm, and these antigenic particles contain un-precipitated free non-combined hepatitis p-surface antigens. The vaccine has less than TO units of antibodies hepatitis (L-surface antigen per 1000 units of hepatitis | b-surface antigen. 5% of the particles and the size lying in the range of 3-50 nm contain non-precipitated e-antigens or specific antigens similar to Dan particles. Hepatitis antigen and e-antigen are contained in the vaccine in an amount sufficient to form antibodies when introduced into the animal.
Дл получени , вакцины против гепатита В используют материал, состо сций из плазмы, полученной из хронического носител , который содержит антигены. Така плазма также содержит большое количество частиц Дана и волокон, не содержащих объединенного анти-е-антитела. Плазма может быть получена от клинически здоровых человеческих хронических носителей нВ, а также от шимпанзе, которыхTo obtain, hepatitis B vaccines use material consisting of plasma derived from a chronic carrier that contains antigens. This plasma also contains a large amount of Dana particles and fibers that do not contain pooled anti-e-antibodies. Plasma can be obtained from clinically healthy human chronic carriers of nB, as well as from chimpanzees, which
естественно или искусственно инфицировали вирусом НВ и которые становились хроническими носител ми е-антиген положительного HBsAg.naturally or artificially infected with the HB virus and who became chronic carriers of the e-antigen of positive HBsAg.
Исходный материал должен быть бактериологически стерильным и должен быть свободным от присутстви , адвентициальных вирусов.The starting material must be bacteriologically sterile and must be free from the presence of adventitious viruses.
Очистку провод т обычным способомCleaning is carried out in the usual way.
Из антигенсодержащего вещества крови удал ют примеси путем подкислени до рН 4,4-4,7. Выпавший осадок вместе с клеточными остатками удал ют центрифугированием в течение 20 мин со скоростью 10000 об/мин. После этого материал смешивают с 2,5-4,5 вес.% полиэтиленгликол , предпочтительно с 3,0-4,5 вес.%. Более низкие концентрации, например 3:-4%, могут осаждать крупные фор1У1Ы ч;астиц и поэтому при определенных обсто тельствах вл ютс предпочтительными . Весовой процент полиэтиленгликол рассчитывают по. отношению к общему весу смеси. Таким образом, осаждают антигенный материал, содержащий гепатит В с более крупным размером частиц, например 30-50 нм, а также часть материала, содержащего оболочкоподобный гепатитный В поверхностный антиген. Осадок, содержа1дий HBsAg, регенерируют, и добавл ют некоторое количество воды при рН 4,95 ,1. Образуетс осадок, содержащий белковое вещество и полиэтиленгликоль , а жидка фаза - надосадочна жидкость, содержаща HBsAg, содержит частицы Дана или волокнистое веществ рН недостаточной Жидкости довод т до 4,4-4,7. Затем ее смешивают с 3,0-4,5 вес.% полиэтиленгдикол , счита на общий вес смеси, с образованием осадка, содержащего очищенные частицы, содержащие HBsAg поверхностный антиген, имеющие оболочкообразную конфигурацию с размером частиц 20-30 нм и волокнистые частицы, содержащие HBsAg и е-антиген, который не содержит какого-либо анти,-е-антитела , причем волокнистые частицы имеют диаметр 20-50 нм, а также частицы Дана со сферической конфигурацией , имеющие размер 40-50 нм и имеющие липопротеиновую внешнюю сферу , содержащую HBsAg и е-антигены, а также содержащие сердцевину, включающую ДНК, ДНК полимеразу и HBsAg.Impurities are removed from the antigen-containing blood substance by acidification to a pH of 4.4-4.7. The precipitated precipitate, along with cellular residues, is removed by centrifuging for 20 minutes at a rate of 10,000 rpm. After that, the material is mixed with 2.5-4.5 wt.% Polyethylene glycol, preferably with 3.0-4.5 wt.%. Lower concentrations, e.g. 3: -4%, can precipitate large formulations; asthins and are therefore preferred under certain circumstances. Weight percent polyethylene glycol calculated by. relative to the total weight of the mixture. Thus, an antigenic material containing hepatitis B with a larger particle size, for example 30-50 nm, as well as a portion of the material containing a shell-like hepatitis B surface antigen, is precipitated. The precipitate containing HBsAg is regenerated, and some water is added at a pH of 4.95, 1. A precipitate containing the protein substance and polyethylene glycol is formed, and the liquid phase, the supernatant containing HBsAg, contains Dana particles or fibrous substances. The pH of the insufficient Liquid is adjusted to 4.4-4.7. It is then mixed with 3.0-4.5% by weight of polyethylenegold and considering the total weight of the mixture to form a precipitate containing purified particles containing HBsAg surface antigen, having a shell-like configuration with a particle size of 20-30 nm and fibrous particles containing HBsAg and e-antigen, which does not contain any anti, -e antibodies, the fibrous particles having a diameter of 20-50 nm, as well as Dan particles with a spherical configuration, having a size of 40-50 nm and having a lipoprotein outer sphere, containing HBsAg and e-antigens, as well as containing core, including DNA, DNA polymerase and HBsAg.
В результате регенерируют очищенный антигенный материал. После этого его обрабатывают с целью инактивации вируса, а .полученный осадок раствор ют в физиологическом растворе .As a result, purified antigenic material is regenerated. After that, it is treated to inactivate the virus, and the precipitate obtained is dissolved in a physiological solution.
Температура каждой из смеси после каждой стадии смешивани поддерживают в интервале 0-80 С в ходе образован-и осадков. Стади очистки облегчаетс , если регенерацию усиливают врезультате центрифугировани сThe temperature of each mixture after each mixing stage is maintained in the range of 0-80 ° C during the formation of precipitates. The purification step is facilitated if regeneration is enhanced by centrifuging with
последующими стади ми осаждени . Полиэтиленгликоль используют в виде водного раствора, который содержит 30 вес.% полизтиленгликол . Такой Полиэтиленгликоль имеет мол. вес. 500-50000, предпочтительно около 60subsequent precipitation steps. Polyethylene glycol is used in the form of an aqueous solution which contains 30 wt.% Polyethylene glycol. Such polyethylene glycol has a mol. weight. 500-50000, preferably about 60
Дальнейшую очистку осуществл ют путем адсорбции очищенных антигенов на гидроксилаппатите с использованием хроматографии. Частично очищенные антигены пропускают через хроматографическую колднку, содержащую гидроксилапатит, на котором они адсорбируютс . Дополнительно очищенные антигены затем регенерируют с использованием многоступенчатого элюировани . Частицы с размером 2550 нм регенерируютс отдельно от фракций с частицами более мелкого размера (16-22 нм) и от основной масы сывороточных протеинов. После очистки фракци более крупных части может быть инфекционной. Дл этого осуществл ют инактивацию. Целевой продукт инактивируют обработкой формалином в концентрации 1:2000 в течение 4 дней при З7с с использованием обычных методик или облучением рентгеновскими лучами. Вакцину осветл ют путем фильтрации через Millipore 0,22 /J фильтр или эквивалентный фильтр переддобавлением формалина или р -пропиолактона.Further purification is carried out by adsorbing the purified antigens on hydroxylappatite using chromatography. Partially purified antigens are passed through a chromatographic rindna containing hydroxylapatite on which they are adsorbed. Additionally, purified antigens are then regenerated using multistep elution. Particles with a size of 2550 nm are regenerated separately from fractions with particles of a smaller size (16-22 nm) and from the main mass of whey proteins. After cleaning, a fraction of the larger portion may be infectious. For this purpose, inactivation is carried out. The target product is inactivated by treatment with formalin at a concentration of 1: 2000 for 4 days at 3 ° C using conventional techniques or by X-ray irradiation. The vaccine is clarified by filtration through a Millipore 0.22 / J filter or an equivalent filter before the addition of formalin or p-propiolactone.
После инактивации конечный продукт подвергают диафильтрации с использованием Aroicon РПЗО фильтра или эквивалентного фильтра против 0,9% NaCI, содержащей 1:10000 Thiomerasal и любой стабилизатор, дл удалени низкомолекул рных соединеНИИ , исп.ользуемЫх дл инактивации, затем стерильно фильтруют и соответствующим образом разливают в стерильные ампулы дл модификации или jзaмopaживaни . Вакцину используют на отсутствие инфекциозности, иммунологическую активность.After inactivation, the final product is subjected to diafiltration using an Aroicon PPSO filter or an equivalent filter against 0.9% NaCI containing 1: 10,000 Thiomerasal and any stabilizer to remove low molecular weight compounds used OX for inactivation, then sterile filtered and appropriately poured into sterile ampoules for modification or storage. The vaccine is used for the absence of infectivity, immunological activity.
Вакцину можно примен ть путем подкожной или внутримышечной инъекции . Примен ют обычно около двух до в мес ц с последующим введением вспомогательного вещества в период от 6 мес. до 1 года после первичной иммунизации. Первоначальна дозировка зависит от веса организма, а последующие дозировки - в зависимости от уровн антител в крови после первоначальной иммунизации.The vaccine can be administered by subcutaneous or intramuscular injection. Usually, about two to a month are used, followed by the administration of an adjuvant between 6 months. up to 1 year after primary immunization. The initial dosage depends on the weight of the organism, and the subsequent dosages depend on the level of antibodies in the blood after the initial immunization.
Использование получаемой вакцины против гепатита В предотвращает хроническое заболевание печени.The use of the resulting hepatitis B vaccine prevents chronic liver disease.
Пример 1. Очистка и определение НВ ассоциированных частиц из 7,8 л плазмы от одного шимпанзе-носител HBsAq.Example 1. Purification and determination of HB associated particles from 7.8 l of plasma from a single chimpanzee carrier HBsAq.
Вещества и методики. Источник HBsAg.Substances and techniques. HBsAg source.
Антиген очищают из объединенной плазмы носител шимпанзе, предварительно инокулированного человеческой HBsAg - положительной, плазмой, относ щейс к adn подтипу. е-Антиген присутствует на поверхности способных к идентификации частиц Дана и используемой плазме.The antigen is purified from the combined plasma of a chimpanzee carrier previously inoculated with human HBsAg — a positive, plasma belonging to the adn subtype. e-antigen is present on the surface of identifiable Dan particles and the plasma used.
Очистка HBsAg и е-антигена.Purification of HBsAg and e-antigen.
HBsAg и е-антиген выдел ют из плазмы путем осаждени с помощью полиэтиленгликол (PEG). Повторно суспендированный осадок HBsAg и е-антигена очищают хроматографированием на колонке с гидроксилапатитом. Конечные стадии очистки включает плотностное градиентное центрифугирование .HBsAg and e-antigen are isolated from plasma by precipitation with polyethylene glycol (PEG). The resuspended precipitate of HBsAg and e-antigen is purified by chromatography on a hydroxyapatite column. The final stages of purification include density gradient centrifugation.
Осаждение HBsAg и е-антигена с помощью PEG.Deposition of HBsAg and e-antigen using PEG.
На стадии, предшествующей очистке 7,800 МП HBsAg и на содержащей е-антигена плазмы, устанавливают рН 4,6 и добавл ют 30%-ный раст.вор PEG в дистиллированной, воде до приблизительно 2% концентрации. Раствор оставл ют на ночь при и осветл ют центрифугированием HBsAg во всплышем слое, осаждают увеличением концентрации PEG до 4%. Всплывший слой после сто ни в течение ночи при с декантируют и отбрасывают. Осадок HBsAg (содержащий е-антиген) ресуспендируют до 500 мл в дистиллированной воде. Основную часть PEG с некоторыми примес ми осаждают, устанавлива рН раствора равным 5,0 и осадок удал ют центрифугированием. Прозрачный верхний слой довод т до рН 4,6 и HBsAg и ассоциированный с частицей. е-А HBsAg (е) осаждают в результате добавлени 30% раствора PEG до конечной концентрации 4%. HBsAg/e удал ют центрифугированием после сто ни образца в течение ночи при 4°С. Наконец, осадок HBsAg/e ресуспендируют до 320 мл в дистиллированной воде.At the stage preceding the purification of 7,800 MP HBsAg and on plasma containing e-antigen, the pH is adjusted to 4.6 and 30% ravol PEG in distilled water is added to approximately 2% concentration. The solution is left overnight at and clarified by centrifuging the HBsAg in a supernatant, precipitated by increasing the concentration of PEG to 4%. The supernatant after standing for overnight is decanted and discarded. HBsAg pellet (containing e-antigen) is resuspended to 500 ml in distilled water. The main part of the PEG is precipitated with some impurities, setting the pH of the solution to 5.0 and the precipitate is removed by centrifugation. The transparent upper layer is adjusted to pH 4.6 and HBsAg and associated with the particle. e-A HBsAg (e) is precipitated by adding a 30% PEG solution to a final concentration of 4%. HBsAg / e was removed by centrifuging after standing the sample overnight at 4 ° C. Finally, the HBsAg / e pellet is resuspended to 320 ml in distilled water.
Хроматографирование на колонке с гидроксилапатитом.Chromatography on a hydroxylapatite column.
50 мл ресуспендированного .PEG осадка HBsAg/e пропускают через колонку 6,5Х 16,5 с гидроксилапатитом и элюируют прерывистым градиентом фосфатного буфера. В следующем эксперименте 200 мл образца под.вергают частичной очистке на колонке 6,5х 35 см с гидроксилапатитом. HBsAg, элюированный совместно с первым протеиновым пиком, пропускают через колонку с гидроксилапатитом во второй раз.50 ml of the resuspended .PEG HBsAg / e precipitate are passed through a 6.5X16.5 column with hydroxylapatite and eluted with a discontinuous gradient of phosphate buffer. In the next experiment, 200 ml of the sample is subjected to partial cleaning on a 6.5 x 35 cm column with hydroxylapatite. HBsAg eluted together with the first protein peak are passed through a hydroxylapatite column a second time.
Плотностное градиентное центрифугирование .Density Gradient Centrifugation.
Фракции HBsAg, выделенные хроматографированием на колонке, очищают скоростным зональным центрифугированием . Прерывистый градиент получают при использовании 3 мл 60% и 7 мл 40% сахарозы в 0,02 М натрийфосфатном буфере при рН 7,2 (содержащем 0,02% NaH) .The HBsAg fractions isolated by column chromatography are purified by high-speed zonal centrifugation. An intermittent gradient is obtained using 3 ml of 60% and 7 ml of 40% sucrose in 0.02 M sodium phosphate buffer at pH 7.2 (containing 0.02% NaH).
В каждую пробирку загружают по 20 мл образца и центрируют на Spinso SW 25,1 роторе при 18000 об/мин в течение 18 ч.Фракции объемом l мл собирают по капл м со дна пробирок и анализируют на содержание HBsAg. A 20 ml sample is loaded into each tube and centered on a Spinso SW 25.1 rotor at 18,000 rpm for 18 hours. Fractions of 1 ml are collected dropwise from the bottom of the tubes and analyzed for HBsAg content.
O Фракции, содержащие максимальное количество антигенной активности, объедин ют , тщательно диализируют и концентрируют ультрафильтрацией с использованием мембраны с 30000 MW O Fractions containing the maximum amount of antigenic activity are pooled, dialyzed thoroughly and concentrated by ultrafiltration using a 30,000 MW membrane.
s от жимным рантом (Амикон РМ-30) .- Концентрированные фракции HBsAg подвергают конечным стади м очистки изопикническим св зыванием в линейном градиенте CsCI и скоростному зональ0 ному центрифугированию в прерывистом градиенте сахарозы при обычно используемых услови х.s from the press welt (Amikon RM-30) .- Concentrated HBsAg fractions are subjected to final purification steps with isopycnic binding in a linear CsCI gradient and speed zonal centrifugation in a discontinuous sucrose gradient under commonly used conditions.
Методы детектировани .Detection methods.
За содержанием HBsAg след т ме5 тодом встречного электрофореза (СЕР) или твердо-фазной радиоиммунопробой Ausria 1 или II, Abbott Laboratories. Концентрацию протеина устанавливают при 280 нм сиспользованием микроме- тодики Kjehldahl.The content of HBsAg is followed by a counter electrophoresis (CEP) method or Ausria 1 or II solid-phase radioimmunoassay, Abbott Laboratories. The protein concentration is set at 280 nm using a Kjehldahl micromethod.
00
Критерий чистоты HBsAg.HBsAg purity criterion.
Образцы после каждой стадии очистки анализируют методами целлюлозоацетатного электрофореза, иммуноэлектрофореза и испытани ми диффузии Samples after each purification step are analyzed by cellulose acetate electrophoresis, immunoelectrophoresis and diffusion tests.
5 в системе агарового гел по отношению к поливалентной антинормальной человеческой плазмапротеиновой антисыворотке .5 in an agar gel system with respect to a polyvalent antinormal human plasma-protein antiserum.
Полиакриламидный гелевый элект6 рофорез.Polyacrylamide gel electrophoresis.
Аликвоты образцов, содержащие 0,01 натрий фосфатный буфер прирН ,2, 1% натрий додецилсульфата, 1% 5-меркаптоэтанола и 10% глицерина, нагревают в течение 2 мин на кип щей вод ной бане, обрабатывают 7,510%i найтрийдодецилсульфатакриламидными гел ми.Aliquots of samples containing 0.01 sodium phosphate buffer priNH, 2, 1% sodium dodecyl sulfate, 1% 5-mercaptoethanol, and 10% glycerol are heated for 2 minutes in a boiling water bath, treated with 7.510% i sodium dodecyl sulfate acrylamide gels.
Результаты очистки HBsAg/e поло0 жительных сывороток осаждением с помощью полиэтиленгликол представлены в таблице. Около 87% первоначального протеина плазмы удал ютс на первой стадии осаждени HBsAg (котора включает предочистку при концентрации The results of HBsAg / e purification of positive serums by precipitation with polyethylene glycol are presented in the table. About 87% of the original plasma protein is removed in the first stage of HBsAg precipitation (which includes pretreatment at a concentration of
5 PEG 2%). Конечный выход после двух последовательных стадий осаждени с помощью PEG jipKa3HBaeT количественную регенерацию HBsAg в присутствии лишь 4% первоначальных протеинов.5 PEG 2%). The final yield after two successive stages of precipitation with PEG jipKa3HBaeT is the quantitative regeneration of HBsAg in the presence of only 4% of the original proteins.
Очистка объединенного HBsAg шимпанзе осаждением с помощью PEG-6000. Первоначальна HBsAg-плазма 7,800 512 Первое осаждение 4% PEG Второе осаждение 10,QQO 4% PEGPurify the combined HBsAg of chimpanzees by precipitating with PEG-6000. Initial HBsAg plasma 7,800 512 First precipitation 4% PEG Second deposition 10, QQO 4% PEG
50 мл ресуспендированного PEG осадка HBsAg фракционируют хроматографированием на гидроксилапатите. Элюат группируют на семь фракций, которые диализируют по сравнению с 0,02 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,2 (содержащим 0,02% азиданатри ) и концентрируют ультрафиль/грацией . Концентрированные образцы авализирутот на. протеины при 280 нм и на присутствие HBsAg методом СЕР.50 ml of PEG-resuspended HBsAg precipitate are fractionated by hydroxylapatite chromatography. The eluate is grouped into seven fractions, which are dialyzed compared to 0.02 M sodium phosphate buffer at pH 7.2 (containing 0.02% azidate) and concentrated by ultrafilm / grace. Concentrated samples are avalized to. proteins at 280 nm and for the presence of HBsAg method CEP.
200 мл ресуспендированного PEG осадка HBsAg фракционируют на 1000 колонке с гидроксилапатитом. Фракции HBsAg из первого протеинового пика (группа 1: фракции 38-83) и оставшийс элюат (группа 11: фракци 84-110) объедин ют и концентрируют до 75 мл ультрафильтрацией.200 ml of PEG resuspended HBsAg precipitate are fractionated on a 1000 column with hydroxyapatite. The HBsAg fractions from the first protein peak (group 1: fractions 38-83) and the remaining eluate (group 11: fraction 84-110) are combined and concentrated to 75 ml by ultrafiltration.
Концентрированный образец из группы 1 повторно хроматографируют на колонК объемом 1000 мл с гидроксилапатитом .A concentrated sample from group 1 is re-chromatographed on a 1000 ml column with hydroxylapatite.
Элюат объедин ют на росемь фракций . Объединенные образцы концентрируют ультрафильтрацией и промывают 0,02 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,2 (содержащим 0,02% азида натри ) . Эти образцы анализируют на протеин и HBsAG.The eluate is pooled into eight fractions. The combined samples are concentrated by ultrafiltration and washed with 0.02 M sodium phosphate buffer at pH 7.2 (containing 0.02% sodium azide). These samples are analyzed for protein and HBsAG.
Анализ образцов на содержание прмесей методом иммуноэлектрофореза обнаружил очень слабую линию преципитации во фракции I, более сильную линию во фракции ti-Vi и сильно вырс1женную широкую линию в объединенных фракци х Vlf-VIII , которые мигрируют между альфа2 и альбуминной област ми .The analysis of samples for the content of mixtures by the method of immunoelectrophoresis revealed a very weak precipitation line in fraction I, a stronger line in the ti-Vi fraction and a strongly elevated wide line in the combined Vlf-VIII fractions that migrate between the alpha2 and the albumin regions.
Электронна микроскопи образцов обнаружила в основном сферические частицы с диаметром 22-28 нм во фракци х 1-ш , сферические частиць и волокна, во фракци х W -Vl , главны образом небольшие сферические частицы и некоторое количество волокон .во фракци х ill М wКонцентрированные образцы из пре )зыдущих стадий подвергали полной очистке плотностным градиентным ценрифугированием .Electron microscopy of the samples revealed mainly spherical particles with a diameter of 22-28 nm in fractions 1-W, spherical particles and fibers, in fractions W –Vl, mainly small spherical particles and a certain amount of fibers. In fractions of ill M w Concentrated samples from the previous stages, they were thoroughly purified by density gradient centrifugation.
Очищенные препараты HBsAg, состо щие главным образом из сферических частиц диаметром 20-22 нм, сферических частиц диаметром 22-28 м. 429 7,080Purified preparations of HBsAg, consisting mainly of spherical particles with a diameter of 20-22 nm, spherical particles with a diameter of 22-28 m. 429 7,080
волокон, различного размера и частиц Дана, содержащих по 100 мг протеина, анализируют на полипептидный состав полиакриламид гелевым электрофорезом. Количественную разницу наблюдают в Протеиновых пиках индивидуальных образцов.fibers of various sizes and Dan particles containing 100 mg of protein each are analyzed for polypeptide composition of polyacrylamide by gel electrophoresis. Quantitative difference is observed in the protein peaks of the individual samples.
Пики карбогидратов низкого молекул рного веса представл ют собой гликолипйды, поскольку они не про вл ютс при голубом окрашивании по Coomassie. Peaks of low molecular weight carbohydrates are glycol lipids because they do not appear on Coomassie blue staining.
Вакцину готов т из фракций крупных частиц, полученных в результате добавлени человеческого сывороточного альбумина с концентрацией 0,5 мг/мл с последующей инактивацией по сери м облучением от кобальтового источника (2,5 миллиона ращ) инактивацией формалином с использованием общеприн тых методик ( , 96 ч, концентраци 1:2,000), с последующим использованием р-пропиолактона по методикам, обычно используемым при производстве вакцин против бешенства.The vaccine is prepared from fractions of large particles obtained by adding human serum albumin with a concentration of 0.5 mg / ml, followed by inactivation in batches by irradiation from a cobalt source (2.5 million rasters) by inactivation with formalin using conventional techniques (, 96 h, concentration 1: 2,000), followed by the use of p-propiolactone according to methods commonly used in the manufacture of rabies vaccines.
Пример 2. Модифицированна .усовершенствованна PEG методика дл выделени HBsAg/e.Example 2. A modified PEG-enhanced technique for isolating HBsAg / e.
Модифицированную методику дл осаждени PEG используют на 2,6 л смешанной HBsAg, содержащей плазмы от одного шимпанзе-носител , содержащего е-антиген в необъединенном, неосажденном виде. рН плазмы устанавливают равным приблизительно 4,6 и немедленно добавл ют 30%-кый раствор PEG до конечной концентрации 2%. Раствор вымораживают на льду в течение 30 мин (вместо сто ни в течение ночи при 4°С, как в предыдущем примере ) и осадок удал ют центрифугированием .The modified PEG sedimentation technique is used on 2.6 L of mixed HBsAg containing plasma from a single chimpanzee carrier containing the e-antigen in an unconjugated, non-precipitated form. The plasma pH is adjusted to about 4.6 and a 30% PEG solution is immediately added to a final concentration of 2%. The solution is frozen on ice for 30 minutes (instead of standing overnight at 4 ° C, as in the previous example) and the precipitate is removed by centrifugation.
Во Ъсплывшем слое, содержащем HBsAg, устанавливают концентрацию PEG, равную 4% (вместо 4,5% в предыдущем примере) в результате добавлени 6,6 ч на 100 30%-ного раствора PEG при комнатной температуре, Сус0 пенэию снова вымораживают на льду в течение 30 мин и осажденный HBsAg/e удал ют центрифугированием. Осадок ресуспендируют до 200 мл в дистиллированной воде. Основную часть 5 PEG и сопутствующих примесей удал ют 00In a floating layer containing HBsAg, a PEG concentration of 4% is set (instead of 4.5% in the previous example) by adding 6.6 hours to 100% of a 30% PEG solution at room temperature. Suspended again is frozen on ice. for 30 minutes and the precipitated HBsAg / e is removed by centrifugation. The pellet is resuspended to 200 ml in distilled water. The main part of the 5 PEG and related impurities are removed 00
путем установлени рЫ, равным 5,0, вымораживанием раствора на льду в течение 30 MiK и удалением полученного в результате осадка центрифугированием . рН прозрачного всплывшего сло из предыдущей стадии вновь устанавливают равным 4,6 и добавл ют 30% PEG до конечной концентрации пор дка 3% (вместо 4,0-4,5%, как это делали ранее). Вещество вновь выморакивают на льду в течение 30 мин и осадок HBsAg/e удал ют центрифугированием .by setting the PRY to 5.0, freezing the solution on ice for 30 MiK and removing the resulting precipitate by centrifuging. The pH of the clear supernatant from the previous step is again set to 4.6 and 30% PEG is added to a final concentration of about 3% (instead of 4.0-4.5%, as was done previously). The material is frozen again on ice for 30 minutes and the HBsAg / e pellet is removed by centrifugation.
Осадок из предыдущей стадии,- содержа ций HBsAg/e, суспендируют в 10 мл дистиллированной воды. Основную массу PEG осаждают в результате устаьовлени рН равным 5,0. После сто ни в течение ночи при 4С суспензию осветл ют центрифугированием. Прозрачный верхний слой, содержашд й HBsAg/e, дополн ют 0,5 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,2 до конечной концентрации пор дка 0,02 М и устанавливают конечный объем, равный 120 мл. с помощью дистиллированной воды.The precipitate from the previous stage, the HBsAg / e contents, is suspended in 10 ml of distilled water. The bulk of the PEG is precipitated by adjusting the pH to 5.0. After standing overnight at 4 ° C, the suspension is clarified by centrifugation. The transparent top layer, containing HBsAg / e, is supplemented with 0.5 M sodium phosphate buffer at pH 7.2 to a final concentration of the order of 0.02 M and a final volume of 120 ml is established. using distilled water.
Результаты такой очистки показывают более чем 33-кратную очистку HBsAThe results of this purification show more than 33-fold purification of HBsA.
Пример 3. Фракционирование HBsAg/e периодической обработкой гидроксилапатитом.Example 3. Fractionation of HBsAg / e by periodic treatment with hydroxylapatite.
Ресуспендированный PEG осадок HBsAg/e (пример 2) обрабатывают периодически гидроксилапатитом вместо процесса хроматографировани на колонке , .500 мл объем насадочного гидроксилапатита (Bio-Rad-Labs) суспендиру: .т в 800 мл 0,02 М натрий-фос фатном буфере при рН 7,2 и после добавлени препарата HBsAg/e перемешивают магнитной мешалкой в течение 30 мин при комнатной температуре. Шлам дел т на две равные аликвоты и центрифугируют в чашах емкостью 1 л на центрифуге Sorvall RC-3 со скоростью 4,000 в течение 10 мин. Верхний слой декантируют и осадок последовательно промывают порци ми в 1 л с 0,02 М и 0,05% ,на|Трий-фосфатного буфера при рН 7,2, Элюаты объедин ют, концентрируют ультрафильтрацией с использованием мембраны РМ-ЗО и диафильтруют 0,02 М фосфатным буфером с рИ 7,2, 0,02% МаН-з и довод т до объема 60 мл тем е буфером.The PEG resuspended HBsAg / e pellet (Example 2) is treated periodically with hydroxylapatite instead of column chromatography, .500 ml volume of packed hydroxylapatite (Bio-Rad-Labs) suspending: t in 800 ml 0.02 M sodium phosphate buffer at pH 7.2 and after adding the drug, the HBsAg / e is stirred with a magnetic stirrer for 30 minutes at room temperature. The slurry is divided into two equal aliquots and centrifuged in 1 liter dishes using a Sorvall RC-3 centrifuge at a speed of 4,000 for 10 minutes. The upper layer is decanted and the precipitate is successively washed in portions in 1 l with 0.02 M and 0.05%, in a Tris-phosphate buffer at pH 7.2, the Eluates are combined, concentrated by ultrafiltration using a PM-30 membrane and diafiltered 0 , 02 M phosphate buffer with a pI of 7.2, 0.02% MaN-3 and brought to a volume of 60 ml with that buffer.
Концентрированный образец далее очищгиот скоростным зональным центрифугированием в прерывном градиенте сахарозы.The concentrated sample is further purified by speed zonal centrifugation in a discontinuous sucrose gradient.
Отделенные частицы HBsAcj/e раздел ют на три фракции, диалиэируют и концентрируют ультрафильтрацией, Образцы,- исследованные методом электронной Г/икроскопии, обнаружили главным образом крупные волокна и частицы Дана во фракции 1; волокна, частицы Дана и сферические частицы дйс1метром 22-28 нм во фракции и и сферические частицы ДJ aмeтpoм 20-28 нм во фракции 1.The separated HBsAcj / e particles are divided into three fractions, dialylated and concentrated by ultrafiltration. The samples, which were studied by the method of electronic G / Icroscopy, revealed mainly coarse fibers and Dan particles in fraction 1; fibers, Dana particles and spherical particles with a diameter of 22-28 nm in the fraction and and spherical particles with a J meter of 20-28 nm in fraction 1.
Пример 4 .-; Дисаггрегаци HBsAg/e частиц с помощью ионных и неионных детергентов.Example 4 .-; Disaggregation of HBsAg / e particles using ionic and non-ionic detergents.
HBsAg/e дастицы обрабатывают при комнатной температуре (в течение 5 1чмн - 2 ч) следующими детергентами: 0,5-2% Nohidett NP (детергент) (Shell Oil Co.), 0,5-2% Твина 80 HBsAg / e Dastitsy is treated at room temperature (for 5 1 hm - 2 h) with the following detergents: 0.5-2% Nohidett NP (detergent) (Shell Oil Co.), 0.5-2% Tween 80
0 ( поверхностно-активный агент), 5-10% Тритона Х-100 (органический поверхностно-активный агент), 0,1-1,0% додецилсульфата натри и т.д. Целью обработки вл етс усиление антиген5 ной активности в образцах, обработанных детергентом, и инактиваци инфекциозности этих образцов.0 (surface-active agent), 5-10% Triton X-100 (organic surface-active agent), 0.1-1.0% sodium dodecyl sulfate, etc. The aim of the treatment is to enhance the antigenic activity in the samples treated with detergent and to inactivate the infectivity of these samples.
Оптимальные услови обработки определ ют путем анализа образцов Optimal processing conditions are determined by analyzing samples.
0 перед и после обработки детергентом с использованием тонкослойной и изоэлектрической фокусировки. Индивидуальные компоненты дисаггрегированных образцов могут быть выделены с использованием различных методик 0 before and after treatment with detergent using thin-layer and isoelectric focusing. Individual components of disaggregated samples can be isolated using various techniques.
5 разделени , например молекул рным исключением, адсорбцией, способами ионообменного хроматографического ультрацентрифугировани , различнымк методами электрофореза и т.д. 5 separation, for example, molecular exclusion, adsorption, ion exchange chromatographic ultracentrifugation methods, various electrophoresis methods, etc.
0 Одним из наиболее высокоэффективных способов вл етс метод зонного конвекционного изоэлектрического фокусировани , описанный ниже.0 One of the most highly efficient methods is zone convection isoelectric focusing, described below.
Изоэлектрическое фокусирование.Isoelectric focusing.
5five
Тонкие слои получают на Sephadex75 гель целлюлозного носител в 1%ном растворе амфолина при рН 4,0-6,0 или рН 3f5-10,0. Пластины помещают в м льтипоровое устройство. Отпечатки делают на хроматографической -бумаге . Отпечатки раздел ют вдоль линии отделенных образцов и разрезают ка зоны 0,5-1 см. Индивидуальные зоны далее разрезают на более мелкие части, смачивают 0,2 мл буферного солевого раствора и элюируют 0,2 мл нормальной (не содержащей HBsAg и анти-КВ) человеческой сыворотки. Ллилсвоты в 200 мл из каждого элюата используют дл радиоиммуноанализа. Полоски между разделенными образцамг: также разрезают, элюируют 0,4 мл дегазированной дистиллированной воды и используют дл измерени рН. Если берут два отпечатка, то первый ис5 пользуют дл окрашивани на протеин а второй разрезают дл радиоиммуноанализа на HBsAg и измерений рН. АЛИквоту из каждого образца обрабатывают 5-10% неионного детергента Thin layers are obtained on Sephadex75 cellulose carrier gel in 1% ampholin solution at pH 4.0-6.0 or pH 3f5-10.0. Plates are placed in a miter device. Prints are made on chromatographic paper. The prints are divided along the line of the separated samples and cut into zones of 0.5-1 cm. The individual zones are then cut into smaller pieces, moistened with 0.2 ml of buffer saline and eluted with 0.2 ml of normal (not containing HBsAg and anti-KB). a) human serum. 200 ml of lilyweed from each eluate is used for radioimmunoassay. The strips between the separated samples: are also cut, eluted with 0.4 ml of degassed distilled water and used to measure pH. If two prints are taken, the first one is used for protein staining and the second is cut for radioimmunoassay for HBsAg and pH measurements. An aliquot of each sample is treated with 5-10% non-ionic detergent.
) (Тритон ) в течение 20 мин при комнатной температуре перед контактированием с гелем и выдерживают при описанных выше услови х при сравнении с образцом, который еще не обра5 батывали детергентами.) (Triton) for 20 minutes at room temperature before contacting with the gel and kept under the conditions described above when compared with a sample that has not yet been treated with detergents.
Claims (2)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US05/631,961 US4118479A (en) | 1975-03-14 | 1975-11-17 | Vaccine for active immunization containing hepatitis B surface antigen and associated antigen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU728720A3 true SU728720A3 (en) | 1980-04-15 |
Family
ID=24533494
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU762332953A SU728720A3 (en) | 1975-11-17 | 1976-03-12 | Method of preparing vaccine for hepatitis v control |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2331354A2 (en) |
| GB (1) | GB1518582A (en) |
| SU (1) | SU728720A3 (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4102996A (en) * | 1977-04-20 | 1978-07-25 | Merck & Co., Inc. | Method of preparing hepatitis B core antigen |
| ZA792485B (en) * | 1978-06-07 | 1980-06-25 | New York Blood Center Inc | Vaccine for active immunization containing hepatitis b surface and/or e-antigens |
-
1976
- 1976-03-09 GB GB9299/76A patent/GB1518582A/en not_active Expired
- 1976-03-12 SU SU762332953A patent/SU728720A3/en active
- 1976-03-30 FR FR7609168A patent/FR2331354A2/en active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB1518582A (en) | 1978-07-19 |
| FR2331354B2 (en) | 1979-01-19 |
| FR2331354A2 (en) | 1977-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US3636191A (en) | Vaccine against viral hepatitis and process | |
| US4216205A (en) | Process of preparing a serum protein composition for intravenous application | |
| US4113712A (en) | HBsAG Particle composed of single polypeptide subunits and the preparation procedure | |
| CA1066191A (en) | Hepatitis b vaccine | |
| CA1069822A (en) | Preparation of a hepatitis b immune globulin and use thereof as a prophylactic material | |
| US4174388A (en) | Method for preparing hepatitis B immune globulin | |
| JPH0331691B2 (en) | ||
| US4164565A (en) | Vaccine for active immunization containing hepatitis B surface antigen and associated antigen | |
| KR900002651B1 (en) | Process for preparing hepatitis b surface antigen containing particles in novel forms which are highly immunogenic | |
| US4118478A (en) | Vaccine manufacture for active immunization containing hepatitis B surface antigen and associated antigen | |
| US4118479A (en) | Vaccine for active immunization containing hepatitis B surface antigen and associated antigen | |
| EP0112506B1 (en) | A process for producing a hepatitis b infection preventing vaccine | |
| KR910008643B1 (en) | Method for purification of hbs antigen | |
| US4639371A (en) | Hepatitis B antigenic compositions and vaccines against hepatitis B derived therefrom | |
| WO1981000050A1 (en) | Process for producing hepatitis b vaccine | |
| SU728720A3 (en) | Method of preparing vaccine for hepatitis v control | |
| RU2122430C1 (en) | Method of purification of hepatitis b surface antigen containing pre-s2-peptide from recombinant yeast cells, vaccine for immunization against hepatitis b | |
| EP0005864B1 (en) | Antigenic composition useful as a vaccine or vaccine intermediate, and process for preparing same | |
| US5242812A (en) | Method for production and purification of hepatitis B vaccine | |
| US4118477A (en) | Hepatitis B antigen | |
| EP0179485B1 (en) | A process for the purification of hbsag | |
| US4558011A (en) | Method for preparation of pure hepatitis B surface antigen from human plasma | |
| US4129646A (en) | Isolating hepatitis B Dane particles | |
| EP0408742B1 (en) | Method for production and purification of hepatitis b vaccine | |
| CA1306689C (en) | Method of preparing a vaccine against hepatitis b and the vaccine thus obtained |