SU689643A1

SU689643A1 - Method of making a preparation of plant embryo sac

Info

Publication number: SU689643A1
Application number: SU772543332A
Authority: SU
Inventors: Маргарита Петровна Солнцева; Владимир Петрович Левковский
Original assignee: Solntseva Margarita P; Levkovskij Vladimir P
Priority date: 1977-11-09
Filing date: 1977-11-09
Publication date: 1979-10-05

Description

(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ЗАРОдаЩЕВЫХ МЕШКОВ РАСТЕНИЙ(54) METHOD OF MANUFACTURING PREPARATIONS OF PLANT ORIGINAL BAGS

Изобретение относитс к области микроскопической техники и может быть использовано при приготовлении нагл дных пособий дл школ, техникумов и вузов, а также в сельском хоз йстве дл интенсификации генетико-селекционных работ и в научных учреждени х ботанического профил дл ускорени научных исследований...The invention relates to the field of microscopic technology and can be used in the preparation of advanced aids for schools, technical schools and universities, as well as in agriculture to intensify genetic selection work and in scientific institutions of the botanical profile to accelerate scientific research ...

Известен способ выделени зародышевых мешков растений путем мацерации тканей. Его сущность сводитс к мацерации фиксированных сем почек ферментами желудочной железы улитки, нарушению целостности окружающих тканей путем использовани специальных мешалок и центрифуг, последующему окрашиванию взвеси в пробирках ацетокармином и изготовлению-врёТйённых препаратов 1.There is a method for isolating germinal bags of plants by macerating tissues. Its essence is reduced to the maceration of fixed seeds of the kidneys with enzymes of the gastric gland of the cochlea, disruption of the integrity of the surrounding tissues by using special agitators and centrifuges, subsequent staining of the suspension in test tubes with acetocarmine and preparation of essential drugs 1.

Этот способ изготовлени препаратов целых зародышевых мешков имеет р д недостатков:This method of making preparations of whole germinal bags has several disadvantages:

препараты вл ютс временными, т.е. пригодными лишь к кратковременному использованию (в течение 2-3 недель ) ;drugs are temporary, i.e. suitable only for short-term use (within 2-3 weeks);

требуетс применение специешьной аппаратуры - центрифуг, мешалок, электромоторов и т.п.;the use of special equipment — centrifuges, agitators, electric motors, etc .;

в процессе центрифугировани часть зародышевых мешков неизбежно подвергаетс механическим повреждени м и только несколько дес тков их остаютс целыми;during centrifuging, part of the germinal bags are inevitably subjected to mechanical damage and only a few tens of them remain intact;

на препарате получаетс суспензи соматических клеток и зародышевых мешков, что мешает изучению зародышевых мешков;the preparation produces a suspension of somatic cells and germ sacs, which interferes with the study of germ sacs;

препараты не вл ютс контрастно окрашенными.the drugs are not contrast colored.

Наиболее широко распространенным в эмбриологических исследовани х вл етс способ приготовлени микротомных (разрезанных на р д срезов), посто нных препаратов 2.The most widely used in embryological studies is the method of preparing microtome (cut into a series of sections), permanent preparations 2.

Данный способ Заключаетс в следующем . Исследуемый материал (чаще всего зав зи или сем почки) фиксируют , например ГАА (формапин, спирт, уксусна кислота), промывают от фиксатора 70%-ным спиртом, обезвоживают спиртами повышающейс концентрации от 70 до 100%, далее спирт замешают хлороформе или ксилолом дл последующей пропитки исследуемого материала парафином, которую провод т в термостате в течение суток Пропитанный парафином материал охлаждают , монтируют в парафиновые блоки и режут на микротоме на р д тонких срезов, которые монтируют на пpeд 1eтныx стеклах и сушат в термостате в течение 1-3 суток. Высушенные срезы, смонтированные на пред метном стекле, окрашивают, дл чего предварительно с них удал ют парафин ксилолом, ксилол спиртом и срезы про мывают водой. Окрашенные препараты обезвоживают 100%-ным спиртом, обрабатывают ксилолом, заключают в канад ский бальзам и закрывают покровным стеклом. К- недостаткам указанного способа относ тс чрезвычайна длительность и трудоемкость (при максимальной скорости работы готовый препарат мож но получить лишь через 16-18 суток) невозможность получени целых зародышевых мешков растений, так как при резке исследуемого материала на микротоме зародышевый мешок оказываетс разрезанным на несколько частей, что затрудн ет его исследование под микроскопом . Целью изобретени вл етс ускоре ние и упрощение изготовлени препа ратов целых зародышевых мешков растений (контрастно окрашенных в массовом количестве) Указанна цель достигаетс тем, что окрашивание исходного материала осуществл ют непосредственно после фиксации и промывки, а после мацера и;ии препарирование сем почек провод путем надрыва их кутику ы и извлечени зародышевых мешков, последние перенос т капилл ром на фильтровальную бумагу, помеща ее на предметное стекло, а обезвоживание этанолом Иобработку их ксилолом произ вод т путем прокапывани . Дл закреплени зародышевых мешков на месте во врем обезвоживани их кладут на отрезок фильтровальной бумаги, расположенной горизонтально на предметном стекле. Дл сохранени целостности пропи танных ксилолом зародышевых мешков при переносе на чистое предметное стеклозародышевые мешки собирают прикосновением к ним капли густого (т нущегос ) канадского бальзама , расположенной на конце тупой препаровальной иглы, и последующим погружением этой капли с объектом в ксилол, нанесенный на предметное стекло. Дл отделени зародышевых мешков из суспензии соматических клеток в цитазу помещают каплю воды и перевод т зародышевые мешки из цитазы а воду при помощи препаровальной иг Указанные отличи позвол ют исключить применение специальной аппаратуры - микротомов, термостатов, центрифуг и т.п., р д операций и часть реактивов (например, замену спирта хлороформом или ксилолом, пропитку материала парафином, резку на микротоме ) и, следовательно, ускорить процесс (не 16, а 4 суток), упростить его, снизить трудоемкость изготовлени препаратов, избежать нарушени целостности зародышевых мешков растений и освободить их от соматических клеток. Кроме того, эти отличи позвол ют обезвоживание и окраску проводить в пробирках, а не на предметных стеклах, что уменьшает расход реактивов и позвол ет одновременно обработать большое количество зародышевых мешков, которые могут монтироватьс на одном предметном стекле. Проведение окраски по Фельгену непосредственно после фиксгации и промывки исходного материала дает возможность окрасить зародышевые мешки внутри целых неразрушенных органов растений, что предотвращает возможность порчи и потери исследуемого объекта при его микроскопических размерах . Использование фильтровальной бумаги при обезвоживании и мацерации позвол ет закрепить микроскопические Зародышевые мешки на предметных стеклах без помощи специального кле щего веществао Пример. Материал фиксируют фиксатором ГАА, промывают и хран т в 70%-ном спирте. Фиксированные колоски или цветки в пробирках промывают 4-5 ч дистиллированной водой при комнатной температуре. Затем провод т колодный гидролиз, В первой пробирке в 1 н. сол ной кислоте материал выдерживают 1 ч и в 5 и. сол ной кислоте - 1,5 ч, во второй в 1 н, сол ной кислоте выдерживают 1 ч. После гидролиза материал помещают в реактив Шиффа и выдерживают 16-17 ч в холодильнике при 2-4°С, промывают водопроводной водой 3-4 ч, подкрашивают гематоксилином Эрлиха или другими красител ми (врем подкраски устанавливают опытным путем в зависимости от концентрации красител ) , промывают дистиллированной водой 1-2 ч, выдел ют зав зи (т.е. часть цветка, внутри которой располагаетс сем почка с зародышевьзм мешком и соматическими клетками) , помещают в концентрированный фермент литазу на предметное стекло с углублением и оставл ют на 24 ч во влажной камере чашки Петри при комнатной температуре. Мацерированный материал перенос т на предметное стекло Препарируют .под бинокул рной лупой Наружную оболочк сем почки осторожно нгщрывают тонко отточенными препаровальными иглаг-та и зародышевый -мешок ВЕЛЧлеи ют из сем почки вместе с частью соматических клеток. Затем в суспензию клеток в цитазе ввод т 1-2 капли дистиллированной воды. Соматические клетки удерживаемые остатками цитазы, остаютс на стекле. Зародышевый мешок с помощью иглы в капле воды перевод во взвешенное состо ние, затем перенос т капилл ром (диаметр 0,2 мм) на отрезок фильтровальной бумаги 2x2 см, лежащий на предметном стекле и предварительно увлажненный дистиллированной водой. Зародышевый мешок оказываетс на бумаге почти без суспензии соматических клеток. Перенес на бумагу несколько зародышевых мешков, их обезвоживают непосредственно На предметном стекле, расположенном горизонтально. Сначала с од ного кра бумаги нанос т несколько капель 40%-ного спирта, а с противоположной стороны подвод т сухую филь ровальную бумагу, котора всасывает избыток жидкости. В этом спирте выдерживают 10 мин. Таким же образом провод т операции с 50, 70, 96 и 100%-ным спиртом,выдержива объект п 10 мин в каждом из спиртов.Все работ по обезвоживанию на предметном стекл провод т в чашках Петри, Предметное стекло с материалом, заключенным в ксилол, перенос т под бинокул р и ту пой иглой, предварительно смоченной rycTbiM канадским бальзамом, осторожными прикосновени ми к зародьаневым мешкам собирают их на кончик иглы, перенос т в каплю ксилола на чистое предметное стекло и покрьгаают покров ным. Полученные препараты сушат в термостате при 42 С. Предлагаемыь1 способом изготавливают посто нные препараты, которые могут хранитьс длительное врем , что позвол ет вернутьс к их изучению и создать документированность эмбриологического исследовани . изобретени Способ изготовлени препг ратов зародышевых мешков растений, включающий фиксацию исходного материала, промывку, обработку его ферментом цитаза при мацерации зав зей или сем почек, препарирование, окрашивание , обезвоживание.этанолом, обработку ксилолом, заключение в канадский бальзам, помещение объекта на предметное стекло дл .последующего микроскопировани , отличающийс тем, что, с целью ускорени и упрощени изготовлени препаратов целых зародышевых мешков, окрашивание исходного материала провод т непосредственно после фиксации и промывки , а после мацерации препарирование сем почек провод т путем надрыва их кутикулы и извлечени зародьзшевых мешков, последние перенос т капилл ром на фильтровальную бумагу, помеща ее на предметное стекло, а обезвоживание этанолом и обработку их ксилолом провод т путем прокапывани . Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1.Бналаева Н.Х. и др. Цитологии и генетика, т.6, вы.п5, 1972. 2.Дженсен У. Ботаническа гистохими , Мир, 1965, с. 59-77 (про-тотип ).This method is as follows. The test material (most often the kidney seed or seed) is fixed, for example, GAA (formin, alcohol, acetic acid), washed from the fixer with 70% alcohol, dehydrated with increasing concentration from 70 to 100% alcohols, then the alcohol is mixed with chloroform or xylene subsequent impregnation of the material under study with paraffin, which is carried out in a thermostat for 24 hours. The material impregnated with paraffin is cooled, mounted into paraffin blocks and cut on a microtome into a series of thin sections, which are mounted on front glasses and dried in a thermostat. for 1-3 days. The dried sections mounted on the slide glass are stained, for which they are first removed from paraffin xylene, xylene with alcohol and washed with water. Painted preparations are dehydrated with 100% alcohol, treated with xylene, placed in Canadian balsam and covered with a cover glass. The disadvantages of this method are extremely time consuming and labor intensive (at maximum speed, the finished product can be obtained only after 16-18 days) the inability to produce whole germinal bags of plants, because when cutting the material under study on a microtome, the germinal bag is cut into several parts. which makes it difficult to study under a microscope. The aim of the invention is to accelerate and simplify the manufacture of preparations of whole germinal bags of plants (contrastingly colored in a mass amount). This goal is achieved by staining the starting material immediately after fixing and washing, and after macera and; and preparing this kidney seed wire by tearing their cuticles and removing the germ sacs, the latter being transferred by capillary onto filter paper, placing it on a glass slide, and dehydrating with ethanol. Processing them with xylene od out by dripping. To hold germ bags in place during dewatering, they are placed on a piece of filter paper placed horizontally on a slide. To preserve the integrity of embryonic sacs impregnated with xylene, when transferred to a clean specimen, embryo sacs are collected by touching a drop of thick (thick) Canadian balsam located at the end of a blunt dissecting needle and then immersing this drop with the object in xylene coated on a glass. To separate the germ bags from a suspension of somatic cells, a drop of water is placed in the cytase and the germ bags are transferred from the cytase and water using a dissecting needle. These differences allow the use of special equipment - microtomes, thermostats, centrifuges, etc., to perform a number of operations and part of the reagents (for example, replacing alcohol with chloroform or xylene, impregnating the material with paraffin, cutting on the microtome) and, therefore, speeding up the process (not 16, but 4 days), simplify it, reduce the laboriousness of making preparations, avoid l violate the integrity of the germinal sacs of plants and release them from somatic cells. In addition, these differences allow dehydration and staining to be carried out in test tubes, rather than on slides, which reduces the consumption of reagents and allows you to simultaneously process a large number of germ bags that can be mounted on one slide. Conducting the Felgen staining directly after fixing and washing the source material makes it possible to stain the germinal bags inside entire intact plant organs, which prevents the possibility of damage and loss of the test object at its microscopic dimensions. Using filter paper for dewatering and maceration allows microscopic germ bags to be fixed on slides without the aid of a special adhesive. Example. The material is fixed with a GAA fixer, washed and stored in 70% alcohol. The fixed spikelets or flowers in the test tubes are washed for 4-5 hours with distilled water at room temperature. Then, well hydrolysis is carried out. In the first tube in 1N. hydrochloric acid material is kept for 1 hour and in 5 and. hydrochloric acid - 1.5 h, in the second in 1 n, hydrochloric acid is kept for 1 h. After hydrolysis, the material is placed in a Schiff's reagent and incubated for 16-17 h in a refrigerator at 2-4 ° C, washed with tap water 3-4 h, tinted with Ehrlich's hematoxylin or other dyes (the time of the tint is determined experimentally depending on the concentration of the dye), washed with distilled water for 1-2 h, isolated under the water (i.e. the part of the flower, inside which there is a seed bud and somatic cells), placed in a concentrated f rment litazu on a glass slide with a recess and allowed to stand for 24 hours in a humid chamber petri dishes at room temperature. The macerated material is transferred onto a glass slide. They are dissected. Under a binocular loupe, the outer sheath of the seed of the kidney is carefully picked up with finely honed dissecting needles and the germinal bag of the kidney seed along with part of the somatic cells. Then, 1-2 drops of distilled water are introduced into the cell suspension in cytase. The somatic cells retained by the cytase residues remain on the glass. The embryo sac is transferred into a suspended state with a needle in a drop of water, then transferred by a capillary (diameter 0.2 mm) to a 2x2 cm piece of filter paper lying on a glass slide and pre-moistened with distilled water. The germ sac appears on paper with almost no suspension of somatic cells. Transferred to the paper a few germ bags, they are dehydrated directly On a glass slide, located horizontally. First, a few drops of 40% alcohol are applied from one edge of the paper, and dry filter paper is fed from the opposite side, which sucks up excess liquid. In this alcohol, incubated for 10 minutes. In the same way, operations with 50, 70, 96, and 100% alcohol are carried out, keeping the object for 10 minutes in each of the alcohols. All dehydration works on the glass slide are carried out in Petri dishes. The glass slide with material enclosed in xylene. , transferred under a binocular and a needle, pre-moistened with a rycTbiM Canadian balsam, carefully touching the embryo bags collect them on the needle tip, transfer them to a drop of xylene on a clean glass slide, and cover the cover glass. The resulting preparations are dried in a thermostat at 42 ° C. The proposed method produces permanent preparations that can be stored for a long time, which makes it possible to return to their study and create a documented embryological study. of the invention. A method of making prepots of germinal bags of plants, including fixing the starting material, washing it, treating it with an enzyme cytase during maceration of the seed or seed of the kidney, preparing, staining, dehydrating. with ethanol, processing with xylene, placing it in a Canadian balm, placing the object on a glass slide . subsequent microscopy, characterized in that, in order to speed up and simplify the manufacture of preparations of whole germinal bags, the staining of the starting material is carried out directly after fixation and washing, and after maceration, the preparation of the seeds of the kidneys is carried out by tearing their cuticles and removing the embryo sacs, the latter are transferred by a capillary to filter paper, placed on a glass slide, and dehydration with ethanol and xylene treatment is carried out by digging. Sources of information taken into account in the examination 1. N. Bnalaeva. and others. Cytology and genetics, v.6, vy.p5, 1972. 2. Jensen W. Botanical histochem, Mir, 1965, p. 59-77 (pro-totype).