SU624164A1

SU624164A1 - Method of apparatus for determining exogenetic substrate content in cultyre medium

Info

Publication number: SU624164A1
Application number: SU772468148A
Authority: SU
Inventors: Александр Акопович Аревшатян; Галина Анатольевна Гальцова; Валентина Петровна Ерохова; Сергей Кузьмич Манешин; Михаил Васильевич Кулаков
Original assignee: Московский Ордена Трудового Красного Знамени Институт Химического Машиностроения
Priority date: 1977-03-22
Filing date: 1977-03-22
Publication date: 1978-09-15

Description

Изобретение относитс к области микробиологии и может быть использовано в различных отрасл х народного хоз йства, св занных с выращиванием микроорганизмов, предпочтительно дрожжей.This invention relates to the field of microbiology and can be used in various sectors of the national household associated with the cultivation of microorganisms, preferably yeast.

Известен способ определени содержани экзогенного субстрата в питательной среде, предусматривающий экстракцию субстрата из суспензии микроорганизмов растворител ми с последующим спектрофотометрированием полученного экстракта в определ емой области спектра 1, 2.A known method for determining the content of an exogenous substrate in a nutrient medium involves extracting the substrate from a suspension of microorganisms with solvents, followed by spectrophotometry of the obtained extract in the determined spectral region 1, 2.

При определении субстрата из суспензии известными спирт-гексановым 1 и инфракрасным 2 спектрофотометрическим методами , основанными на экстракции субстрата из суспензии микроорганизмов соответственно спирт-гексановой смесью и четыреххлористым углеродом, фотометрирование провод т в инфракрасной области спектра.When determining a substrate from a suspension with known alcohol-hexane 1 and infrared 2 spectrophotometric methods based on extraction of the substrate from a suspension of microorganisms, respectively, with an alcohol-hexane mixture and carbon tetrachloride, photometry is carried out in the infrared region of the spectrum.

Однако известные способы позвол ют проводить определение субстрата только дискретно , путем экстракции из суспензии микроорганизмов различными токсичными растворител ми без учета физиологического состо ни попул ции микроорганизмов.However, the known methods allow the determination of the substrate only discretely, by extracting from the suspension of microorganisms various toxic solvents without taking into account the physiological state of the population of microorganisms.

. Известен также способ определени содержани экзогенного субстрата в питательной среде при непрерывном культивировании микроорганизмов.. There is also known a method for determining the content of an exogenous substrate in a nutrient medium with the continuous cultivation of microorganisms.

Известно устройство дл осуществлени указанного способа определени содержани экзогенного субстрата в питательной среде, содержащее измерительную и сравнительную камеры дл анализируемой питательной среды, источник света, двухлучевую осветительную систему, обтюратор, фильтры возбуждени и люминесценции и фоторегистрирующую систему с фотоумножителем 3.A device for implementing this method for determining the content of an exogenous substrate in a nutrient medium is known, comprising measuring and comparative chambers for the analyzed nutrient medium, a light source, a two-beam lighting system, a obturator, excitation and luminescence filters, and a photo-recording system with a photomultiplier 3.

Этот известный способ и устройство дл его осуществлени вл ютс наиболее близкими к описываемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату .This known method and device for its implementation are the closest to the described invention to the technical essence and the achieved result.

Указанный способ не позвол ет получать непрерывную информацию о физиологически необходимом содержании экзогенного субстрата в непрозрачной водной суспензии микроорганизмов по оксидоредукционным изменени м одного из компонентов дыхательной цепи митохондрий, а известное устройство дл осуществлени этого способа не обеспечивает получени непрерывной информации о характере исследуемой среды и не может быть использовано в непрерывном технологическом процессе, что в свою очередь не обеспечивает достаточно высокой производительности процесса культивировани и высокое качество биомассы. Целью изобретени вл етс повышение производительности процесса культивировани и улучшение качества биомассы. Поставленна цель достигаетс тем, что согласно предлагаемому способу определени содержани экзогенного субстрата в питательной среде при непрерывном культивировании микроорганизмов, предпочтительно дрожжей, исходную суспензию микроopгaн змoв облучают монохроматическим светом в интервале длин волн 330-370 нм и одновременно измер ют разность интенсивности люминесценции окисленной и восстановленной форм никотинамидадениндинуклеотида (НАД), содержащегос в клетках микроорганизмов, и в зависимости от получаемой величины по градуировочно.му графику определ ют физиологически необходимое количество субстрата, вводимого в питательную среду при данной степени аэрации . При этом устройство дл осуществлени предлагаемого способа снабжено емкостью с барботирующи.м приспособлением и подвод щими трубопроводами дл ввода анализируемой питательной среды и окислител , а также отвод щими трубопроводами, один из которых сообщает емкость со сравнительной камерой, а два других осуществл ют слив отработанной суспензии, при этом измерительна камера соединена подвод щим трубопроводом с источником снабжени анализируемой среды. Кроме того, дл повышени точности измерений измерительна и сравнительна камеры, фотоумножитель, а также фильтры осветительной и фоторегистрирующей систем размещены на интегрирующей сфере. На фиг. 1 изображена схема устройства дл осуществлени способа определени содержани экзогенного субстрата в питательной среде; на фиг. 2 -график зависимости между содержанием . парафина в среде (СПЗР) и величиной разности интенсивности флуоресценции восстановленной и окисленной формы НАД-(Д1). Устройство дл осуществлени предлагаемого способа (фиг. 1) содержит источник 1 света (ртутно-кварцевую ламп, двухлучевую осветительную систему 2, обтюратор 3, а также фильтр 4 возбуждени , измерительную и сравнительную камеры 5 и 6 и фильтр 7 люминесценции, размещенные на интегрирующей сфере 8, и фоторегистрирующую систему. Фоторегистрирующа система содержит фотоумножитель 9, усилитель 10, синхронный детектор 11, диффс;ренц.иа.пьный усилитель 12 и регистрирующий прибор 13. В устройстве имеетс емкость 14 с барботирующим приспособлением 15, подво-. д щие трубопроводы 16 и 17 дл ввода анализируемой питательной среды и окислител , а также отвод щие трубопроводы 18, 19. Отвод щий трубопровод 18 сообщает емкость со сравнительной камерой 6, а отвод щие трубопроводы 19 осуществл ют слив отработанной суспензии. Измерительна камера 5 соединена подвод щим трубопроводом 20 с источником снабжени анализируемой среды (на чертеже не показан). При определении экзогенного субстрата в питательной среде с помощью указанного устройства исходную суспензию дрожжей из ферментера пропускают через проточные светоизолированные измерительную и сравнительную камеры 5 и 6, причем перед подачей суспензии в сравнительную камеру 6 ее пропускают через емкость 14, где осуществл ют ее барботаж окислителем (кислородом воздуха) дл полного окислени внутриклеточного НАД. С помощью двухлучевой оптической системы 2 формируют два световых .модулированных монохроматических потока возбуждающего излучени , которыми поочередно облучают камеры 5 и 6. Возникающие при этом световые импульсы, обусловленные люминесценцией среды, воспринимаютс фотоумножителем 9, расположенным в отверстии сферы 8 перпендикул рно направлению возбуждающего излучени . Узкополосный фильтр 7 выдел ет вторичное излучение - люминесценцию на заданной длине волны в интервале 430-470 нм, фотоумножитель 9 при этом регистрирует монохроматическое излучение один раз от измерительной камеры 5 и второй раз от сравнительной 6. Последовательность импульсов усиливаетс усилителем 10 и поступает на вход синхронного детектора И, который обеспечивает разделение сигналов лю.минесценции от двух камер и преобразование их в уровни напр жени , соответственно пропорциональные этим сигналам. Два уровн напр жени поступают на вход диф- ференциального усилител 12. Сигнал на его выходе пропорционален разности этих двух уровней или же разности люминесценции от двух ка.мер 5 и 6, и регистрируюп1ий прибор 13 обеспечивает непрерывную запись этого сигнала. При выращивании дрожжей рода Candida guiliermondii исследуют вли ние различных концентраций экзогенного субстрата-п .арафина на изменение разности интенсивности флуоресценции восстановленной и окисленной форм НАД. Дрожжи выращивают в 30 л ферментере при температуре 32- 34°С. и рН 4,0-4,2 на синтетической среде, содержащей в качестве единственного источника углерода парафины, а в качестве источника кали ,- магни , цинка, марганца, железа , фосфора - их минеральные соли при степени аэрации 1200 об/мин мешалки. Концентрацию парафина в среде измен ют в диапазоне от 8 до 0,1 г/л. Контроль за содержаниемThis method does not allow obtaining continuous information about the physiologically necessary content of the exogenous substrate in an opaque aqueous suspension of microorganisms on the oxidation reduction changes of one of the components of the mitochondrial respiratory chain, and the known device for implementing this method does not provide continuous information about the nature of the test medium and cannot used in a continuous process, which in turn does not provide a sufficiently high producer Nost culturing process and high quality biomass. The aim of the invention is to increase the productivity of the cultivation process and improve the quality of the biomass. The goal is achieved by the fact that according to the proposed method of determining the content of exogenous substrate in a nutrient medium under continuous cultivation of microorganisms, preferably yeast, the initial suspension of microorganisms of the bruises is irradiated with monochromatic light in the wavelength range of 330-370 nm and simultaneously measured the difference in the luminescence intensity of the oxidized and reduced forms nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) contained in the cells of microorganisms and, depending on the value obtained, The schedule is used to determine the physiologically necessary amount of substrate introduced into the nutrient medium for a given degree of aeration. In this case, the device for carrying out the proposed method is provided with a container with bubbling m device and supply lines for entering the analyzed nutrient medium and an oxidizing agent, as well as discharge pipes, one of which reports capacity with a comparative chamber, and the other two carry out the spent suspension, in this case, the measuring chamber is connected by a supply pipe to the source of supply of the analyzed medium. In addition, to improve the measurement accuracy, the measuring and comparative cameras, the photomultiplier, as well as the filters of the lighting and photorecording systems are placed on the integrating sphere. FIG. 1 shows a diagram of an apparatus for carrying out a method for determining the content of an exogenous substrate in a nutrient medium; in fig. 2 is a graph of the relationship between content. paraffin in the medium (SPZR) and the magnitude of the difference in the fluorescence intensity of the reduced and oxidized form NAD- (D1). A device for implementing the proposed method (Fig. 1) contains a light source 1 (mercury-quartz lamps, a two-beam lighting system 2, a shutter 3, as well as an excitation filter 4, a measuring and comparative chambers 5 and 6, and a luminescence filter 7 located on the integrating sphere 8, and the photo-registration system. The photo-registration system contains a photomultiplier 9, an amplifier 10, a synchronous detector 11, Diff, a power amplifier 12 and a recording device 13. The device has a capacitance 14 with a bubbling device 15, under leading pipelines 16 and 17 for introducing the analyzed nutrient medium and oxidizing agent, as well as discharge pipes 18, 19. The discharge pipe 18 communicates the tank with the comparative chamber 6, and the discharge pipes 19 drain the spent suspension. 5 is connected by a supply pipe 20 to a source of supply of the analyzed medium (not shown in the drawing.) When determining the exogenous substrate in the nutrient medium using the specified device, the initial suspension of yeast from the fermenter is passed through There are separate light-insulated measuring and comparative chambers 5 and 6, and before the suspension is fed into the comparative chamber 6, it is passed through the tank 14, where it is bubbled with an oxidizing agent (air oxygen) to completely oxidize the intracellular NAD. Using a two-beam optical system 2, two light-modulated monochromatic fluxes of exciting radiation are formed, which are alternately irradiated by chambers 5 and 6. The resulting light pulses due to the luminescence of the medium are perceived by the photomultiplier 9 located in the aperture of the sphere 8 perpendicular to the direction of the exciting radiation. Narrowband filter 7 separates secondary radiation — luminescence at a given wavelength in the range of 430–470 nm; photomultiplier 9 then records monochromatic radiation once from measuring chamber 5 and a second time from comparative 6. The pulse sequence is amplified by amplifier 10 and fed to the synchronous input detector And, which provides separation of the luminescence signals from the two chambers and converting them into voltage levels, respectively proportional to these signals. The two voltage levels are fed to the input of the differential amplifier 12. The signal at its output is proportional to the difference between these two levels, or the luminescence difference from two ka measures 5 and 6, and the recording device 13 ensures the continuous recording of this signal. When growing the yeast of the genus Candida guiliermondii, the effect of various concentrations of exogenous substrate-paraffin on the change in the difference in fluorescence intensity of reduced and oxidized forms of NAD is investigated. Yeast is grown in a 30 l fermenter at a temperature of 32-34 ° C. and pH 4.0–4.2 on synthetic medium containing paraffins as a sole carbon source, and magnesium, zinc, manganese, iron, phosphorus — their mineral salts with a degree of aeration of 1200 rpm of a mixer — as a source of carbon — magnesium, zinc, manganese, iron. The concentration of paraffin in the medium is varied in the range from 8 to 0.1 g / l. Content control

парафина в среде осуществл ют спектрофотометрическим методом. По результатам полученных испытаний стро т график (фиг. 2).paraffin in the medium is carried out by spectrophotometric method. According to the results of the obtained tests, a graph is constructed (Fig. 2).

Как видно на графике, существует обратно пропорциональна зависимость между содержанием парафина в среде (Спар) и величиной разности интенсивности флуоресценции восстановленной и окисленной форм НАД (Л I ). Следует также, что при уве .щчении конце}гграции парафина выше 6 г/л при данной степени аэрации дрожжи не могут окислить полностью субстрат, что приводит к накоплению его в клетках микроорганизмов и ухудшению качества продукта с одновременным снижением скорости роста микроорганизмов. Предварительно построенный градуировочный график обеспечивает определение физиологически необходимого количества субстрата в суспензии следующим образом. Суспензию микрооргаиизмов с концентрацией сухих веществ не выше 25 г/л наливают в измерительную кювету , которую помещают в светоизолированную ка.меру прибора, облучают с помощью ртутной лампы монохроматическим светом и измер ют интенсивность флуоресценции в области 430-470 нм. Во вторую сравнительную камеру номендают такую же суспензию, но предварительно нробарботированную,которую также облучают монохроматическим светом и из.мер ют интенсивность флуоресценции в области 430-470 нм. При этом следует следить, чтобы суспензи не расслаивалась . Построив график зависи.мости А, ., определ ют участок, где клетки могут потребл ть добавл емый субстрат , и уровень насыщени , т. е. количество субстрата, физисхтогически необходимое и достаточное дл нормального метаболизма K.ieTOK. По показани м регистрирующего прибора и абсолютно сухому весу микроорганизмов в-суспензии определ ют нормированную величину интенсивности флуоресценции НАД, но которой с помощью калибровочного графика определ ют физиологически необходимое содержание субстрата в среде.As can be seen in the graph, there is an inverse proportion to the relationship between the paraffin content in the medium (Spar) and the magnitude of the difference in the fluorescence intensity of the reduced and oxidized forms of NAD (L I). It should also be noted that when the end of grains of paraffin increases above 6 g / l with a given degree of aeration, the yeast cannot completely oxidize the substrate, which leads to its accumulation in the cells of microorganisms and deterioration of the product with a simultaneous decrease in the growth rate of microorganisms. Pre-built calibration curve provides a definition of the physiologically necessary amount of substrate in suspension as follows. A suspension of microorganisms with a dry matter concentration not exceeding 25 g / l is poured into a measuring cuvette, which is placed in a light-isolated instrument cage, irradiated with a mercury lamp with monochromatic light, and the fluorescence intensity is measured in the region 430-470 nm. In the second comparative chamber, the same suspension is obtained, but previously bubbled, which is also irradiated with monochromatic light and the fluorescence intensity in the region 430-470 nm is measured. It should be ensured that the suspension does not stratify. By plotting the dependencies A,., Determine the area where the cells can consume the added substrate, and the level of saturation, i.e., the amount of substrate physically necessary and sufficient for normal K.ieTOK metabolism. According to the readings of the recording instrument and the absolutely dry weight of the microorganisms in the suspension, the normalized value of the NAD fluorescence intensity is determined, but which, using a calibration graph, determine the physiologically necessary substrate content in the medium.

При этом разность люминесценции восстановленного (измерительна камера) и окисленного (сравнительна камера) никоти нами.даденнндинуклеотида составл ет 4,5 мв нрн концентрации абсолютно сухих дрожжей 15 r/j,. Ве.1ичина интенсивности люминесценции в пересчете иа единицу абсолютно сухих дрожжей равна 0,3 мв на 1 г/л относительных единицах).At the same time, the difference between the luminescence of the reduced (measuring chamber) and the oxidized (comparative chamber) nicotine nam dadnindinucleotide is 4.5 mV nrn of absolutely dry yeast concentration 15 r / j ,. The magnitude of the luminescence intensity in terms of the unit of absolutely dry yeast is 0.3 mV per 1 g / l relative units).

С помощью калибровочной шкалы регист.рирующего прибора определ ют концентрацию субстрата в среде, котора равна дл данного конкретного случа 0,8 г/л. Согласно калибровочному графику данна концентраци ниже функционально необходимой дл клеток, поэтому дл оптимальногоUsing the calibration scale of the registering instrument, the concentration of the substrate in the medium is determined, which for this particular case is equal to 0.8 g / l. According to the calibration graph, this concentration is lower functionally necessary for the cells, therefore, for optimum

ведени процесса биосинтеза содержание парафина в среде надо увеличить до 6 г/л (см. фиг. 1), что соответствует максимальным физиологическим потребност м клетки. Таким образом, предлагаемый способ определени физиологически необходимого содержани экзогенного субстрата и устройство дл его реализации позвол ют не только быстро и с достаточной точностью (до ±5%) контролировать содержание субстрата в среде , но и с учетом физиологического состо ни попул ции микроорганизмов, определ емого по оксидоредукционны.м изменени м внутриклеточного фермента НАД, регу.пировать в зависимости от степени аэрации содержание субстрата в среде, необходимое дл обеспечени максимальной скорости роста микроорганизмов и улучшени качества продуктов, т. е. предлагаемый способ и устройство позвол ют вести процесс в оптимальных услови х.the process of biosynthesis paraffin content in the medium should be increased to 6 g / l (see Fig. 1), which corresponds to the maximum physiological needs of the cell. Thus, the proposed method for determining the physiologically necessary content of an exogenous substrate and a device for its implementation allow not only to control the content of the substrate in the medium quickly and with sufficient accuracy (up to ± 5%), but also taking into account the physiological state of the microorganism population determined by oxidative-reductive changes in the intracellular enzyme NAD, regulating, depending on the degree of aeration, the substrate content in the medium necessary to ensure the maximum growth rate of microorganisms. -organisms and improve product quality, t. e. the proposed method and apparatus allow to conduct the process under optimum conditions.

Технико-экономический эффект при использовании предлагаемого способа и устройства дл его выполнени создаетс благодар ведению процесса при оптимальных услови х с получением продукта высокого качества, экономии сырь и точного и объективного измерени содержани субстратаThe technical and economic effect of using the proposed method and device for its implementation is created by conducting the process under optimal conditions with obtaining a high-quality product, saving raw materials and accurately and objectively measuring the content of the substrate.

В суспензии микроорганизмов.In suspension of microorganisms.

Claims

1. A method for determining the content of an exogenous substrate in a nutrient medium under continuous cultivation of microorganisms, preferably yeast, characterized in that, in order to increase the efficiency of the cultivation process,

improving the quality of the biomass, the initial suspension of microorganisms is irradiated with monochromatic light in the wavelength range of 330-370 nm and simultaneously the difference in luminescence intensities is measured

oxidized and reduced forms of nicotinamide adenine dinucleotide, contained in the cells of microorganisms, and depending on the value obtained, determine the physiologically necessary amount of the substrate administered

in a nutrient medium at a given degree of aeration.

2. An apparatus for carrying out the method of claim 1, comprising measuring and comparative chambers for analyzing

a nutrient medium, a light source, a two-gage illumination system, a shutter, excitation and luminescence filters, and a photo-recording system with a photomultiplier, characterized in that it is provided with a container with bubbling gear and supply lines for introducing the analyzed nutrient medium and oxidant, as well as the discharge pipes, one of which communicates the tank with the reference chamber, and the other two carry out the discharge of the spent suspension, while the measuring chamber is connected to the feed pipe the wire with the source of supply of the analyzed medium.

3. The device according to claim 2, characterized in that in order to increase the accuracy of measurements, 01 pp. 0.5 o, 0, 3pc., The measuring and comparative cameras, photomultiplier, as well as filters of the lighting and photo-logging systems are located on the integrating sphere.

Sources of information taken into account in the examination:

1. P. I. Sanin, N. N. Tsipugina, A. A. Suchkova, R. Ya. Sushchik, “Microbiological Industry, No. 1, 1972, p. 38-40.

2. Andreev N. S., Sidorova I. P., Naidin A. V. “Microbiological industry, No. 4 1976, p. 14-17.

3. US patent number 3249754, class. 250-83.3, 1966.

fS

PU2.1