Изобретение относитс к усовершенствованному способу выделени и очистки аминокислот из белковых гидролизатов. Известен снособ выделени аминокислот из различных смесей, содержащих аминокислоты, ионообменной хроматографией. Сорбци и элюирование аминокислот с сорбента длительны , так как дл нолного выделени всей суммы аминокислот с хорошим выходом и высокой степенью чистоты необходимо примен ть несколько типов сорбентов и соответствующих растворителей. С целью упрощени процесса и повышени степени чистоты предлагаетс выдел ть аминокислоты из любых белковых гидролизатов в виде их силоксановых соединений. Способ основан на нревращении всей суммы аминокислот, содержащихс в гидролизатах , в смесь соответствующих гексаалкилдисилильных производных общей формулы R-Si-HN-CRR--G-0-Si R где R - низший алкил -метил, этил; R и R - водород или любой другой а-заместитель аминокислот природного происхождени , а также аминокислот, полученных химическим нутем. Получение производных аминокислот такого типа легко и просто осуществл етс при взаи .модействии аминокислот с силазанами, доступными промыщленными продуктами, в безводных услови х. Из-за высокого экранирующего вли ни триалкилсилильных группировок , св занных с амино- и карбоксильной грунна.ми аминокислот, полученные производные обладают, веро тно, наивысщей летучестью из всех производных аминокислот и хорошей растворимостью в большом числе непол рных растворителей. Благодар высокой чувствительности к гидролизу в сочетании с указаннылги свойствами дисилильные производные крайне ценны при иснользовании дл выделени и очистки аминокислот . На индивидуальных а.минокислотах найдено , что реакции силилнровани и гидролиза полученных производных идут с количественными выходами, с нолным сохранением оптической чистоты вз той дл силилировани аминокислоты. Дл силилировани можно использовать р д силазанов, таких как гексаметилдисилазан (СНз)з Si - HN--Si (СНз)з, триметилсилилдиэтиламин (СНз)з - Si - - N-(C2Hs)2, б«с-(триметилсилил) ацетамид сНз-С-0-81-( -(СНз)з Количественное замещение атомов водорода в обеих функциональных группах аминокислот происходит нри использовании триметилсилилдиэтиламина и быс-(триметилсилил)ацетамида , в случае гексаметилдисилазана реакци , в основном, заканчиваетс носле силилировани одной карбоксильной группы. Исходные силазаны получают с высоким выходом при взаимодействии триалкилхлорсилана с диэтиламином или ацетамидом. В случае триметйлсилилдиэтиламина силнлирование аминокислот идет с выделением диэтиламина , что обеспечивает простой контроль за ходом реакции. Очистка полученных дисилильных производных аминокислот от примесей достаточно просто осуществл етс фракционной дистилл цией или экстракцией непол рными растворител ми полученной после силилировани реакционной смеси. Превращепие выделенных дисилильных производных в смесь аминокислот легко осуществл етс гидролизом водой или спиртом при добавлении их к раствору производных в органических растворител х. Образующиес в результате гидролиза аминокислоты выпадают и легко отдел ютс от растворител , а второй продукт гидролиза - дисилоксан - остаетс в растворе. Дисилоксан представл ет собой целевой продукт в синтезе кремнийоргапических соединений и может быть достаточно просто превращен обратно в исходный силазан . Возможность регенерации исходных силазанов позвол ет создать замкнутый цикл использовани вспомогательных веществ, что увеличивает экономичность предлагаемого метода выделени и очистки аминокислот из белковых гидролизатов. Предлагаемым способом извлекают все аминокислоты из любых белковых гидролизатов и ферментолизатов практически с количественным выходом. Использу точную фракционную дистилл цию полученных производных , получают конечный продукт с высокой степенью чистоты. Способ выделени и очистки аминокислот заключаетс в следующем. Сухой гидролизат или ферментолизат белоксодержащих материалов обрабатывают силазаном, например триметилдиэтиламином , при нагревании до 80 - 120° С в течение 1 - 2 час. Температура реакционной смеси устанавливаетс несколько выше температуры кипени выдел ющегос диэтиламина, чтобы при кипении диэтиламина происходило достаточное перемещивание реакциониой массы. По мере заверщени реакции температура смеси постепенно повыщаетс в указанных пределах и реакци заканчиваетс с прекращением выделени диэтиламина . При этом часть силазана расходуетс на силилирование функциональных групп примесей , содержащих подвижные атомы водорода. Однако различна летучесть и растворимость образующихс производных аминокислот и сопутствующих примесей позвол ет выделить аминокислотную фракцию, как показано в приведенных ниже примерах. Пример 1. Суспензию 3 г L-валина в 9,65 г триметйлсилилдиэтиламина нагревали в инертной атмосфере при 120° С (температура бани) в течение 1 час до прекращени отгонки диэтиламина. После сто ни в течение ночи реакционную массу фракционировали в инертной атмосфере. Собирали фракцию с т. кип. 91 - 93° С/10 мм рт. ст. Выход 5,41 г (81%). Полученное производное крайне легко гидролизуетс в парах влагой воздуха. При гидролизе к 1,15 г дисилильпого производного добавл ли 0,08 мл воды в 1,5 мл эфира. После встр хивани выпавщий L-валин огфильтровывали и промывали два раза по 5 мл эфира. Выход 0,49 г (95%). Угол вращени исходного L-валина а равен -|-6,42° ( в воде), угол вращени выделенного после гидролиза L-валина +6,86° (С -0,5 в воде), что указывает на полное отсутствие рацемизации. Пример 2. Суспензию 3,33 г L-аспарагиновой кислоты в 14,2 г триметйлсилилдиэтиламина нагревали в инертной атмосфере в течение 1 час. При 135 - 145° С (температура бани ) отгон ли 7,3 мл диэтиламина. Из реакционной смеси фракционной перегонкой в инертной атмосфере выделили 6,24 г силилпроизводного аспарагиновой кислоты с т. кип. 80- 90° С/1 мм рт. СТ. В результате гидролиза с 97%-ным выходом получена аспарагинова кислота. Угол вращени исходной аспарагиновой кислоты равен +25,25° (С 1 в воде), дл кислоты, полученной после гидролиза , а 26,52° (С - 1 в воде). Пример 3. Суспензию 1,32 г L-триптофана в 2,4 г триметйлсилилдиэтиламина нагревали в инертной атмосфере. При достижении температуры бани (120° С) наблюдалось быстрое растворение триптофана, закончивщеес в течение 5 - 10 мин, отогнано 1,6 мл летучих. Разгонку реакционной смеси проводили при остаточном давлении 10 мм рт. ст, Отбирали 1,72 г фракции -с т. кип. 135 140° с;. После гидролиза выделили триптофан с выходом 95% с углом вращени равным + 10,93° С 0,4 в 1 н. НС1). Угол вращени исходного триптофана +10,93 (С 0,4 в 1 н. ПС1). Пример 4. 3 г ферментолизата дрожжей нагревали в инертной атмосфере с 11,45 г триметилсилилдиэтиламина 2 час при 100 - 105° С при перемешивании, при этом отгон лс весь диэтиламин. После окоичани реакции избыток тркметилсилилдиэтиламина отгон ли при 50° С/20 мм рт. ст. Смесь разбавл ли 40 мл сухого эфира и цептрифугировали при 3000 об/мин. Осадок промывали в 40 мл серпого эфира. К объединенному раствору производных аминокислот в эфире добавл ли 8 мл воды при перемешивании. Выпавший осадок аминокислот промывали эфиром и бензолом. Промытый осадок суспендировали в бензоле и лиофилизовали. Выход 2,34 г (76%).The invention relates to an improved method for the isolation and purification of amino acids from protein hydrolysates. A known method for the isolation of amino acids from various mixtures containing amino acids is ion exchange chromatography. The sorption and elution of amino acids from the sorbent is long, since several types of sorbents and appropriate solvents must be used to completely isolate the entire amount of amino acids in good yield and high purity. In order to simplify the process and increase the degree of purity, it is proposed to isolate amino acids from any protein hydrolysates in the form of their siloxane compounds. The method is based on the conversion of the entire amount of amino acids contained in the hydrolysates into a mixture of the corresponding hexaalkyldisilyl derivatives of the general formula R-Si-HN-CRR - G-0-Si R where R is lower alkyl-methyl, ethyl; R and R are hydrogen or any other α-substituent of naturally occurring amino acids, as well as amino acids obtained by chemical synthesis. Derivation of amino acid derivatives of this type is easily and simply carried out by the interaction of amino acids with silazanes, available industrial products, under anhydrous conditions. Due to the high shielding effect of the trialkylsilyl groups associated with amino and carboxyl primers. The resulting derivatives are likely to have the highest volatility of all amino acid derivatives and good solubility in a large number of nonpolar solvents. Due to their high sensitivity to hydrolysis in combination with the indicated properties, disilyl derivatives are extremely valuable when used for the isolation and purification of amino acids. On individual amino acids, it was found that the silylation and hydrolysis reactions of the resulting derivatives proceed in quantitative yields, with the optical purity preserved at the same time as the amino acid silylation. A number of silazans can be used for silylation, such as hexamethyldisilazane (CH3) s Si - HN - Si (CH3) s, trimethylsilyl diethylamine (CH3) s - Si - - N- (C2Hs) 2, b "c- (trimethylsilyl) acetamide CNS-C-0-81- (- (CH3)) Quantitative substitution of hydrogen atoms in both functional groups of amino acids occurs when using trimethylsilyl diethylamine and byb- (trimethylsilyl) acetamide, in the case of hexamethyldisilazane, the reaction basically ends after silylation of one carboxyl group. The initial silazan get high output during the interaction trialkylchlorosilane with diethylamine or acetamide. In the case of trimethylsilyldiethylamine, the amino acid is amplified with the release of diethylamine, which provides simple control over the course of the reaction. The conversion of the isolated disilyl derivatives into a mixture of amino acids is easily accomplished by hydrolysis with water or with when they are added to a solution of derivatives in organic solvents. The amino acids formed as a result of hydrolysis precipitate and are easily separated from the solvent, and the second hydrolysis product, disiloxane, remains in solution. Disiloxane is the target product in the synthesis of silicon-silicon compounds and can be simply converted back to the original silazane. The ability to regenerate the initial silazanes allows one to create a closed cycle of use of auxiliary substances, which increases the efficiency of the proposed method for the isolation and purification of amino acids from protein hydrolysates. The proposed method extracts all amino acids from any protein hydrolysates and fermentolizatov almost quantitative yield. Using the exact fractional distillation of the resulting derivatives, a final product with a high degree of purity is obtained. The method for isolation and purification of amino acids is as follows. Dry hydrolyzate or fermentolizat protein-containing materials are treated with silazane, for example, trimethylethylamine, when heated to 80-120 ° C for 1 to 2 hours. The temperature of the reaction mixture is set slightly above the boiling point of the liberated diethylamine, so that when the diethylamine boils a sufficient displacement of the reaction mass occurs. As the reaction is completed, the temperature of the mixture gradually rises within the indicated limits and the reaction ends with the termination of the release of diethylamine. In this case, part of silazane is spent on silylation of functional groups of impurities containing mobile hydrogen atoms. However, the varying volatility and solubility of the resulting amino acid derivatives and related impurities makes it possible to isolate the amino acid fraction, as shown in the examples below. Example 1. A suspension of 3 g of L-valine in 9.65 g of trimethylsilyldiethylamine was heated in an inert atmosphere at 120 ° C (bath temperature) for 1 hour until termination of the distillation of diethylamine. After standing for overnight, the reaction mass was fractionated in an inert atmosphere. Collected fraction with t. Kip. 91 - 93 ° C / 10 mm Hg. Art. Yield 5.41 g (81%). The resulting derivative is extremely easy to hydrolyze in vapor with moisture in the air. On hydrolysis, to a 1.15 g disilyl derivative, 0.08 ml of water was added to 1.5 ml of ether. After shaking, the precipitated L-valine was filtered off and washed twice with 5 ml of ether. Yield 0.49 g (95%). The angle of rotation of the initial L-valine a is - | -6.42 ° (in water), the angle of rotation of L-valine selected after hydrolysis is + 6.86 ° (С -0.5 in water), which indicates the complete absence of racemization. Example 2. A suspension of 3.33 g of L-aspartic acid in 14.2 g of trimethylsilyl diethylamine was heated in an inert atmosphere for 1 hour. At 135-145 ° C (bath temperature), 7.3 ml of diethylamine was distilled off. From the reaction mixture by fractional distillation in an inert atmosphere, 6.24 g of the silyl derivative of aspartic acid with a bale were isolated. 80-90 ° C / 1 mm Hg. ST. As a result of hydrolysis, aspartic acid was obtained in 97% yield. The rotational angle of the initial aspartic acid is + 25.25 ° (C 1 in water), for the acid obtained after hydrolysis, and 26.52 ° (C - 1 in water). Example 3. A suspension of 1.32 g of L-tryptophan in 2.4 g of trimethylsilyldiethylamine was heated in an inert atmosphere. When the bath temperature (120 ° C) was reached, a rapid dissolution of tryptophan was observed, which lasted 5–10 minutes, 1.6 ml of volatiles were distilled off. The distillation of the reaction mixture was carried out at a residual pressure of 10 mm RT. Art., 1.72 g of the fraction was taken out with-t. bales. 135 140 ° C .; After hydrolysis, tryptophan was isolated with a yield of 95% with a rotation angle of + 10.93 ° C 0.4 in 1 n. HC1). The angle of rotation of the original tryptophan is + 10.93 (C 0.4 in 1 n. PS1). Example 4. 3 g of yeast fermentinizate were heated in an inert atmosphere with 11.45 g of trimethylsilyl diethylamine for 2 hours at 100–105 ° C with stirring, while all diethylamine was distilled off. After the reaction was coagulated, an excess of three methylmethylsilyl diethylamine was distilled off at 50 ° C / 20 mm Hg. Art. The mixture was diluted with 40 ml of dry ether and filtered at 3000 rpm. The precipitate was washed in 40 ml of sulfuric ether. 8 ml of water was added to the combined solution of amino acid derivatives in ether with stirring. The precipitated amino acid was washed with ether and benzene. The washed precipitate was suspended in benzene and lyophilized. The output of 2.34 g (76%).
Пример 5. Суспензию 2,04 г сухого ферментолизата в 7,67 г триметилсилилдиэтиламина нагревали в инертной атмосфере при 100 - 105° С 2 час при перемешивании. После отгонки избытка триметилсилилдиэтиламина (50° С/20 мм рт. ст.) реакционную смесь перегон ли в вакууме 10 мм рт. ст. Получили 4,73 г светлого прозрачного продукта, который смешивали с 50 мл эфира и гидролизовали добавлением 6 мл воды. Выпавший белый осадок смеси аминокислот обрабатывали аналогично примеру 4. Выход 1,07 г.Example 5. A suspension of 2.04 g of dry fermentolysate in 7.67 g of trimethylsilyl diethylamine was heated in an inert atmosphere at 100 - 105 ° C for 2 hours with stirring. After distilling off the excess of trimethylsilyl diethylamine (50 ° C / 20 mmHg), the reaction mixture was distilled under vacuum of 10 mm Hg. Art. Got 4.73 g of a bright transparent product, which was mixed with 50 ml of ether and hydrolyzed by adding 6 ml of water. Fallen white precipitate of a mixture of amino acids was treated analogously to example 4. The output of 1.07 g